专利名称：具有减少的结合赖氨酸能力的血纤维蛋白溶酶原激活剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及血纤维蛋白溶酶原激活剂的有利用途并申明德国专利申请103 42 518.7的优先权，所述专利的内容在这里通过引用作为参考。
确立溶栓法作为与多种血栓性疾病相关的治疗选择被认为是已经基本得出了结论的。因此溶栓法研究中的主要目的是瞄准于进一步发展和修饰已知的血栓溶解剂和/或改进并用疗法。
对作为发展新的血栓溶解剂的起点重要的一种血栓溶解剂是组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)，其具有更高的纤维蛋白选择性并且与链激酶或尿激酶相比具有高活性。缺失型突变体瑞替普酶(Reteplase)和拉诺替普酶(Lanoteplase)以及替奈普酶(Tenecteplase)是这种血纤维蛋白溶酶原激活剂的进一步开发的药物。
组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(rt-PA)是由527个氨基酸组成的单链糖蛋白。最初为单链(sct-PA)的该分子经蛋白质水解切割为双链形式(tct-PA)。t-PA具有明确的结构和功能结构域。因此，N-端组成链包含指形结构域(F，Ser1-Lys49)、表皮生长因子结构域(E，Ser50-Asp87)和两个环饼结构域(kringle domains)(K1，Thr88-Gly176；和K2，Asn177-Cys261)。包括丝氨酸蛋白酶结构域(P)的C-端链包含Ser262至Pro527氨基酸。通过氨基酸His322、Asp371和Ser478，C-端链形成活性区。
t-PA及其重组突变体，以及它们的制备是例如美国专利4,766,075及大量出版物(例如Bode和RenatusTissue-type plasminogenactivatorvariants and crystal/solution structures demarcatestructural determinants of function，Current Opinion inStructural Biology 1997，7865-872)的主题。
图1是t-PA结构的图示。
如多数其它类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶，通过切割将sct-PA转化为tct-PA。切割在Arg275和Ile276之间的键进行。此后，双链仅通过264号丝氨酸和395丝氨酸之间的单二硫桥的方式联系在一起。
t-PA切割位点的编号方式与Bode和Renatus(如上文引用)选择的编号方式一致。然而，其它的作者使用一种不同的编号方式作为根据并定义切割点或活性位点为R15-I16或R310-I311。然而，以这种方式定义的位点在功能或结构上没有不同。
组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA；阿替普酶)能够激活血纤维蛋白溶酶原，使其转化为血纤维蛋白溶酶。然而，从动力学常数看显然t-PA只能够微弱地激活血纤维蛋白溶酶原的循环。t-PA的这两种形式，即单链分子和双链分子，表现出那些是大体上相同的药理学特性。然而，纤维蛋白结合的血纤维蛋白溶酶原以高的催化力被活化，这种催化力是用以激活自由状态的血纤维蛋白溶酶的催化力的103。因此，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂的溶解血栓的特性由于纤维蛋白的存在而增强很多。
从500到1000倍的t-PA的相对纤维蛋白选择性都有报道。催化效果也能通过血纤维蛋白溶酶原激活剂与β-淀粉样蛋白或纤维蛋白原的相互作用而增强。t-PA由纤维蛋白原激活的能力与它由β-淀粉样蛋白激活的能力相当。
血纤维蛋白溶酶原激活剂的效果通过抑制剂在生理学上受到控制，其中血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂I(PAI-1)是重要的拮抗剂。PAI-1结合至t-PA分子的轻组成链上改变了催化中心的结构因而激活血纤维蛋白溶酶原的反应不再发生(Bennet WF、Paoni NF、Keyt BA、Botstein D、Jones AJS、Presta L、Wurm FM、Zoller M的Highresolution analysis of functional determinants in humantissue-type plasminogen activator.Journal of BiologicalChemistry 1991；2665191-5201)。
组织血纤维蛋白溶酶原激活剂经由肝脏快速地代谢。因此患者的肝功能不全延长了这些物质的血浆半衰期(Emeis JJ、van den HoogenCM、Jense D等人的Hepatic clearance of tissue-type plasminogenactivator in rats，Thomb Haemostas 1985；54661-664；Tiefenbrunn AJ、Robison AK、Kurnik PB、Ludbrook PA、Sobel BE.的Clinical pharmacology in patients with evolving myocardialinfarction of tissue plasminogen activator produced byrecombinant DNA technology Circulation 1985；71110-116)。
血纤维蛋白溶酶原激活剂被开发用于治疗血栓形成病如心肌梗塞和中风。t-PA目前是仅有的并由美国食品和药物管理局(FDA)批准用以治疗中风的血栓溶解剂。
然而，在过去一段时期怀疑已经增加，就是t-PA一方面表现出所期望的与治疗中风相关的积极的溶解血栓效果的同时，另一方面也引起不理想的组织破坏。因而，将t-PA灌注至t-PA-缺陷的小鼠内引起更大梗塞出现(Wang YF、Tsirka SE、Strickland S、Stieg PE、Soriano SG、Lipton SA等人的Tissue plasminogen activator(tPA)increases neuronal damage after focal cerebral ischemia inwild-type and tPA-deficient mice.Nat Med 1998；4(2)228-231)。怀疑这种扩大的损伤是由于刺激了NMDA-依赖的谷氨酸受体(Liberatore GT、Samson A、Bladin C、Schleuning WD、Medcalf RL等人的Vampire bat salivary plasminogen activator(desmoteplase)a unique fibrinolytic enzyme that does notpromote neurodegeneration.Stroke 2003；34(2)537-543)。由t-PA进行的NMDA受体的蛋白水解切割应该是产生这种效果的原因(Nicole O、Docagne F、Ali C、Margaill I、Carmeliet P、MacKenzieET等人的The proteolytic activity of tissue plasminogenactivator enhances NMDA receptor-mediated signaling.Nat Med2001；7(1)59-64)。
因此本发明的目标是提供新颖的治疗剂治疗血栓形成疾病，特别是中风。
通过使用血纤维蛋白溶酶原激活因子达到了该目标，其中所述的血纤维蛋白溶酶原激活因子表现出比天然的血纤维蛋白溶酶原激活剂要弱的与赖氨酸结合的能力。在一特别有利的实施方案中，血纤维蛋白溶酶原激活剂显示一个经修饰的环饼结构域，优选与天然的t-PA相比经过修饰的环饼2(K2)结构域。后面的这个结构域能全部或部分删除掉，因而减少了结合赖氨酸的能力。
可将K2结构域，或功能上或结构上基本与它同源的区域有利地进行修饰，这样赖氨酸残基不再与其结合或仅以低的亲和性结合。
在一特别有利的实施方案中，根据本发明可采用的血纤维蛋白溶酶原激活剂是经修饰的t-PA。
K2结构域的重要性，包括t-PA K2缺失型突变体的制备在Horrevoets AJ、Smilde A、de Vries C、Pannekoek H(The specificroles of finger and kringle 2 domains of tissue-type plasminogenactivator during in vitro fibrinolysisJournal of BiologicalChemistry，269，17，12639-12644，1994)中详细描述。
由于它们结合赖氨酸的能力缺乏或降低，根据本发明能使用的血纤维蛋白溶酶原激活因子表现出提高的纤维蛋白选择性和降低的被纤维蛋白原或β-淀粉样蛋白激活的能力。这种降低的被纤维蛋白原激活的能力可能是由于所述纤维蛋白选择性。拥有高的纤维蛋白选择性的血纤维蛋白溶酶原激活因子对治疗中风相当重要，特别是因为，例如，天然的t-PA能由纤维蛋白原激活，纤维蛋白原越过受损的血-脑屏障并且之后通过随后激活NMDA受体而刺激谷氨酸介导的兴奋性毒性。因此，根据本发明，血纤维蛋白溶酶原激活因子受纤维蛋白原激活的能力的降低也导致神经毒性的减少。
特别是根据通过对t-PA与DSPA的结构和功能结构域的比较研究的结果，在t-PA环饼2上的赖氨酸结合位点的重要性变得明显。DSPA是最初从吸血蝙蝠(Vampire bat)唾液中分离的血纤维蛋白溶酶原激活剂(就这一点，参见美国专利6,008,019；EP 0 383 417)。DSPA分离出四类异构体，其中DSPAα1能用CHO细胞通过重组方法制备。
与t-PA相比，DSPA仅有环饼结构域。该结构域在功能和结构上更接近于t-PA K1结构域而不是K2结构域，并且不具有任何赖氨酸结合位点(Bringmann P、Gruber D、Liese A、Toschi L、Kr_tzschmar J、Schleuning WD、Donner P的Structural features mediating fibrinselectivity of vampire bat plasminogen activators；Journal ofBiological Chemistry 1995；270(43)25596-25603)。因此在文献中有一些声明表明DSPA不具有任何环饼2结构域。
而且，因为与t-PA一样缺少血纤维蛋白溶酶活化位点，DSPA总是表现为单链分子。与t-PA比较，DSPA的活性在纤维蛋白存在时受的刺激提高约45 000倍，然而根据Gardell SJ、Duong LT、Diehl、York JD、Hare TR、Register RB、Jacobs JW、Dixon RA、FriedmanPA(Isolation，characterization and c-DNA cloning of a vampirebat salivary plasminogen activatorJournal of BiologicalChemistry 1989；264(30)17947-17952)，该值是205。
图2是DSPA结构的图示。图2b显示t-PA与DSPA(SEQ ID Nos.1+2)的氨基酸序列的比较。
过去，t-PA结合纤维蛋白的能力在功能上归因于指形结构域和环饼2(van Zonnenfeld AJ、Veerman H、Pannekoek H(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，834670-4674)。然而，更多最近的出版物也认为蛋白酶结构域P在这一点上可能有某种关联(Bennett，如上引用)。各个结构域的功能也由Bakker AHF、Jacoline E.、Weening-Verhoeffet D.、Verheijen JH(The role of Lysyl-Bindingsite of tissue type plasminogen activator in the interactionwith a forming fibrin clodJournal of Biological Chemistry 270，21，12355-12360，1995)做了研究。
Bakker等制备了不同的t-PA修饰体，例如两种缺失型突变体，其缺少环饼2、指形结构域或表皮生长因子结构域。也可将这些突变体进行组合并且它们中的一些额外在环饼2中具有点突变，即涉及取代D236N。这种选择性氨基酸取代导致在位置236用天冬酰胺酸替代Asp并因此删掉了赖氨酸结合位点(K2结构域中的LBS)。对于突变体的制备，读者应特别参考上述的Bakker等的出版物，包括这里引用的参考文献。
在他们的研究中，Bakker等证明由EACA(ε-氨基己酸)占据在K2结构域中的赖氨酸结合位点明显地削弱了天然t-PA对纤维蛋白的结合。通过D236N取代对LBS同样进行了修饰，只是削弱程度要小。甚至所述仅由K2结构域和蛋白水解C端组成的缺失型突变体仍然与纤维蛋白结合，即使只有轻微的程度。只有其中删除了LBS的K2P突变体不再表现出任何纤维蛋白结合。
虽然这些结果一方面表明F和K2结构域及K2中的LBS的重要性，它们也表明t-PA与纤维蛋白的相互作用不是仅由F和K2结构域调节。而是，K2结构域中的LBS也有其功能，就是LBS大概是负责稳定有利于结合纤维蛋白的t-PA的构象。
K2结构域，包括其赖氨酸结合位点的重要性通过Stewart RJ、Fredenburgh JG和Witz JI(Characterization of the interactionsof plasminogen and tissue and vampire bat plasminogenactivators with fibrinogen，fibrin，and the complex of D-dimernoncovalently linked to fragment EJournal of BiologicalChemistry 273，29，18292-18299，1998)完成的研究也已变得清楚。
在结合研究中，Stewart等尤其研究了t-PA和DSPA对纤维蛋白和纤维蛋白原的亲和性。在该研究中，在存在或不存在赖氨酸类似物EACA时研究亲和力以便分析环饼结构域-依赖的相互作用的重要性。他们从其研究中断定，由于环饼结构域中缺少赖氨酸结合位点DSPA不能结合纤维蛋白原。因此他们将t-PA结合纤维蛋白的能力所必需的功能归因于与t-PA环饼结构域2中的LBS与指形结构域的联合。
实施例1中报导的实验结果证实了DSPα1和重组人t-PA对辅因子β-淀粉样蛋白(1-42)、纤维蛋白原及纤维蛋白的不同的亲和力。为获得这些数据，测定了每种血纤维蛋白溶酶原激活剂/辅因子联合的动力学参数kcat和Km，以及kcat/Km比率。辅因子不存在时，DSPAα1比t-PA激活血纤维蛋白溶酶原的效率低约100倍，而在纤维蛋白存在时这两种化合物效率相等。在存在纤维蛋白原或β-淀粉样蛋白辅因子时DSPAα1比t-PA的效率低约30倍。在2μM的生理学血纤维蛋白溶酶原浓度时，这些数据给出纤维蛋白作为辅因子的效率相比纤维蛋白原或β-淀粉样蛋白作为辅因子时的效率的比率，在DSPAα1的情况下是480而在人t-PA的情况下是16。
与上面已经说明的一样，根据本发明采用的血纤维蛋白溶酶原激活因子的特征在于其环饼结构域2赖氨酸结合位点缺少或经修饰。在一个实施方案中，删除了环饼2。然而，在另一个实施方案中也可能保留环饼2并在位置236用天冬酰胺代替天冬氨酸。因此，经修饰的t-PA根据本发明缺少环饼结构不是至关重要的，而仅需修饰赖氨酸结合位点而使之与辅因子之间的增强t-PA活性的相互作用不再可能发生。
在另一个有利的实施方案中，使用的血纤维蛋白溶酶原激活剂特别是经修饰的t-PA能通过删除环饼1进行修饰，这样t-PA就不再能够结合受体。因此，组织血纤维蛋白溶酶原激活剂不再以原来的方式经由肝脏代谢，使得体内半衰期得以延长(Rijken DC、Otter M、KuiperJ、von Berkel TJC的Receptor-mediated endocytosis oftissue-type plasminogen activator(t-PA)by liver cells.Thromb.Res.1990；Supel.X63-71)。已知从瑞替普酶中删除环饼1并且由例如Martin U、Bader R、B_hm E、Kohnert U、von M_llendorf E、Fischer S、Sponder G(BM 06.022A Novel recombinant plasminogenactivator.Cardiovascular drug reviews 1993；11299-311)描述。为此，使用删除了氨基酸4-176的突变体。延长半衰期使得能够将血纤维蛋白溶酶原激活剂一次性推注(Bolusapplication)。
在一优选的实施方案中，根据本发明能使用的血纤维蛋白溶酶原激活剂基于在图3、11或13中显示的氨基酸序列之一。每种这些氨基酸序列构成经修饰的t-PA，该t-PA中删除了环饼2并且改变了t-PA激活切割位点的序列区的结构。这种变化可仅在于活性切割位点中氨基酸R和I的替代(如用HS替代；见图3中序列SEQ ID No.3)或额外影响邻近的氨基酸(如用图11中的序列SEQ ID No.4的LHST替代FRIK)。后面的修饰在这一点上对应天然DSPA的结构。
根据本发明，优选为治疗中风生产和采用一种血纤维蛋白溶酶原激活剂，所述血纤维蛋白溶酶原激活剂特别恰当地联合了天然t-PA和DSPA的优势，即天然t-PA的特别是当用于人类患者时的低免疫原性和即DSPA的缺少神经毒性。在本发明的一个实施方案中，因此选择删除t-PA环饼2，这样使得产生下游结构的过渡区，所述过渡区对应于DSPA中的相应的结构。在经修饰的t-PA的保留的环饼1结构域和下游半胱氨酸桥之间的过渡区从而有利地由序列SKAT形成。在DSPA中，序列SKAT位于环饼结构域和半胱氨酸桥之间。例如，如图11显示的序列SEQ ID No.4中实现了这种有利的结构。
图12(多序列比对)显示t-PA和根据本发明的两个描述的实施方案之间的比较。
根据本发明另一个实施方案，使用如图13(SEQ ID No.5)描述的血纤维蛋白溶酶原激活剂。
根据本发明使用具有与图3、11和13中描述的氨基酸序列同源或部分地一致的序列的蛋白质自然也是可能的。优选至少有70％，优选地在80％和95％之间的同源性或一致性。这些同源的或相同的蛋白质表现出血纤维蛋白溶酶原激活因子的活性(优选地表现为pNA的释放)并且在体外引起血块溶解(见实施例3)。
根据本发明可使用的血纤维蛋白溶酶原激活剂的特征在于缺少指形结构域和表皮生长因子结构域。这种删除实质性地减少了其与肝脏受体结合并再次延长了半衰期(Larson GR、Timony GA、Horgan PG、Barone KM、Henson KS、Angus LB、Stoudemire JB的Proteinengineering of novel plasminogen activators with increasedthrombolytic potency in rabbits relative to activase.Journalof biological Chemistry 1991；2668156-8161；Smalling RW的Molecular biology of plasminogen activatorswhat are theclinical implications of drug design？Am J Cardiol.1996；78(suppl.12)2-7)。
除缺失型突变体之外，根据本发明采用的血纤维蛋白溶酶原激活剂也能通过定点突变的方式仅进行点修饰。因此，例如由rt-PA-TNK(替奈普酶)得知，一方面在血纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂结合位点，另一方面在t-PA用以结合至肝细胞的结合位点处的三个突变导致催化活性增加，同时受PAI失活的能力降低。这从而引起替奈普酶的催化转换常数Kcat/Km增强了100倍(就这一点，也参见Paoni NF、Keyt BA、Refino CJ、Chow AM、Nguyen HV、Berleau LT、Badillo J、Pena LC、Brady K、Wurm FM、Ogez J、Bennett WFA slow clearingfibrin-specific，PAI resistant variant of t-PA(T103N，KHRR296-299 AAAA).Thromb Haemostas 1993；70307-312以及CannonCP、Love TW、McCabe CH、Kirshenbaum JM、Henry T、Sequira R、Schweifer M、Breed J、Cutler D、Tracy R，for the TIMIinvestigators.TNK-tissue plasminogen activators in myocardialinfarction(TIMI)10Results of the initial patients in theTIMI 10 pilot-a phase 1，pharmacokinetics trial.Circulation1995；92(suppl.)1-415))。
实施例11.由DSPAα1和重组人t-PA激活血纤维蛋白溶酶原的情形下用作为辅因子的β淀粉样蛋白(1-42)、纤维蛋白原和纤维蛋白的比较分析。
材料和方法使用以下物质-DSPAα1(由Paion公司制备，批号2DSA01，2002年12月12日，样品10)。将10mg该物质溶解于10ml无菌水中以便获得1mg/ml的终浓度。
-重组t-PA(Actilyse_，由Paion公司制备，批号102572)。将10mg溶解于10ml无菌水中得到1mg/ml的终浓度。
-人Glu-血纤维蛋白溶酶原，从人血浆中纯化(由Paion公司制备)并将其溶解于浓度为25μM的PCLA缓冲液中。
-人纤维蛋白原，基本无血纤维蛋白溶酶原，从Sigma公司获得(产品分类号F4883，批号12K7620)。将25mg溶解于25ml PCLA缓冲液中得到1mg/ml的终浓度。
-人凝血酶(Sigma公司；产品分类号T7009；批号61K7603)。将100U溶解于10ml PCLA缓冲液中以得到10U/ml的浓度。
-购自Biopool公司(产品分类号101353，批号1512016)的Flavigen.pli显色剂(D-but-CHT-Lys-p-nitroaniline-DHCL)。将100μM溶解于50ml PLCR缓冲液中得到2mM的终浓度。-购自Bachem公司的β-淀粉样蛋白(1-42)(产品分类号H-1368，批号0535120)。将4mg溶解于4ml 0.1％的氢氧化铵中得到1mg/ml的终浓度。
将所有的试剂分成等分并在-20℃下储存不超过两周。
PLC缓冲液(Jones 1990年)0.1M NaCl.2H2O(Acros，产品分类号20779)；0.03M NaHCO3(Acros，产品分类号21712)；4mMKCl(Fluka，产品分类号60130)；1mM CaCl2.2H2O(Acros，产品分类号207780)；1mM Na2HPO4.2H2O(Fluka，产品分类号71638)；0.3mM MgCl2.6H2O(Acros，产品分类号197530)；0.4mM MgSO4.7H2O(Fluka，产品分类号63140)；20mM HEPES(Applichem，产品分类号A1969)；0.01％聚山梨醇酯80(Fluka，产品分类号93781)。
血纤维蛋白溶酶原的激活的检测血纤维蛋白溶酶原的激活的检测在总体积为0.15ml的微孔板上，按照Bringmann等的描述(如上引用)进行。如下添加试剂50μl的血纤维蛋白溶酶原(0-24μM)；15μl的辅因子(1mg/ml)；10μl 7.5nM的血纤维蛋白溶酶激活剂和75μl Flavigen(2mM)。
总浓度如下血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA或DSPAα1)0.5nM；Glu-血纤维蛋白溶酶原0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4和8μM；FlavigenPli1mM和辅因子100μg/ml。
将辅因子β-淀粉样蛋白(1-42)、纤维蛋白原和纤维蛋白与没有辅因子的对照比较。对于对照，反应混合物含有另外的0.13单位人凝血酶/ml。
添加试剂后，立刻将微孔板于25℃导入至分子装置ThermoMax微板计读器中。
从时间t＝0开始搅拌。
以有规律的间隔测定405nm和490nm下的光密度。将490nm下的光密度从405nm下的光密度中减去以消除由于液体移动引起的差异。用每种血纤维蛋白溶酶原浓度和血纤维蛋白溶酶原激活剂浓度将所有的试验重复进行三次。
测定Km值和kcat值(图4-6)。
图4a)测定pNA的摩尔消光系数。
b)通过以10nM血纤维蛋白溶酶作为Flavigen.pli浓度(μM)的函数转化Flavigen.pli。
c)由10nM血纤维蛋白溶酶转换的Flavigen的Michaelis-Menten绘图。将Fig.4b的初始比率转换为pNA/s。
图5血纤维蛋白溶酶原激活剂和辅因子的四种不同的组合的相对于时间的光密度曲线。为此使用了8；4；2；1；0.5；0.25；0.125和0.0625μM浓度的血纤维蛋白溶酶原。
a)无辅因子的t-PAb)以β-淀粉样蛋白(1-42)为辅因子的t-PAc)以纤维蛋白原为辅因子的t-PAd)以纤维蛋白为辅因子的t-PAe)无辅因子的DSPAα1f)以β-淀粉样蛋白(1-42)为辅因子的DSPAα1g)以血纤维蛋白溶酶原为辅因子的DSPAα1h)以血纤维蛋白溶酶为辅因子的DSPAα1图6a{＝ks.kcat.PA.E.P./(Km+P)}相对于血纤维蛋白溶酶原浓度的绘图a)无辅因子或以β-淀粉样蛋白、纤维蛋白原或纤维蛋白为辅因子的t-PA的曲线b)无辅因子的DSPAα111.38的绘图结果表1
表1通过用β-淀粉样蛋白(1-42)、纤维蛋白原和纤维蛋白为辅因子的重组人T-PA或DSPAα1激活血纤维蛋白溶酶原的kcat/Km值。
结果以三个独立的试验的平均值±标准差给出。
因为Km值高于可能使用的最大的血纤维蛋白溶酶原浓度(8(M)，测定kcat和Km的精确值是不可能的。
因为在血纤维蛋白溶酶原浓度接近或低于Km值下的反应率取决于血纤维蛋白溶酶原浓度，动力学常数的演算本身不足用以比较不同的辅因子的效率。为此，在2(M的生理血浆血纤维蛋白溶酶原浓度下用Michaelis-Menten动力学计算反应率，以此为基础，用于通过t-PA和DSPAα1激活血纤维蛋白溶酶原的不同辅因子的相对效率得以测定(表2)。
表2
在2μM的生理血纤维蛋白溶酶原浓度下血纤维蛋白溶酶原激活的相对比率，如使用表1中动力学参数计算。DSPA对照的组合是1。
实施例2朊病毒疾病即海绵状脑病是致命的神经退化现象，所述的这种神经退化现象特征在于，在淀粉样蛋白沉淀物中朊蛋白的非正常同种型(PrPsc)的积聚。正常的朊蛋白(PrPc)在许多组织中表达，特别在脑内集中于突触上。PrPc构象变化产生PrPsc的机制以及通过PrPsc的形成导致神经退化的机制仍然不是十分清楚。一种可能的机制可能在于与血纤维蛋白溶酶原被t-PA激活相关对PrPsc的影响。
我们已经表明，使用重组蛋白质，PrP能使t-PA-催化的血纤维蛋白溶酶原的激活增加300倍(Ellis V、Daniels M、Misra R、Brown DR(2000)Plasminogen activation is stimulated by prion proteinand regulated in a copper-dependent manner，Biochemistry 416891-6896)。
PrP刺激血纤维蛋白溶酶原激活的能力取决于PrP的构象，该构象受Cu2+的存在或不存在的影响。后一情况下的形式包含大量β结构，其对应与PrPsc同种型并刺激血纤维蛋白溶酶原激活。这些数据与早先的观察结果一致，当血纤维蛋白溶酶原结合至从搔痒病感染的小鼠脑中分离的PrPsc时，它不像正常脑细胞那样与PrPc结合(Fischer M、Roeckl C、Rarizek P、Schwarz HP、Aguzzi A(2000)Binding ofdisease-associated prion protein to plasminogen.Nature 408479-483)。
因此，我们的实验已经表明PrP-刺激的血纤维蛋白溶酶原激活的机制也包括t-PA与apoprP(即无Cu2+的PrP)的结合。这种结合所需的结构还没有详细的评估。然而，因为受到DFP-失活的t-PA的阻碍，这种结合是特定的。
其它方法这些研究中使用的PrP批次，在每种情况下都源于从E.coli分离出的重组鼠科动物的PrP。纯化His-标记的PrP后，蛋白质在缺乏或存在氯化铜时再一次折叠以便形成holo-PrP或apo-PrP。在每种情况中这些蛋白质的聚积形式通过在水中快速溶解产生。通过离心过滤收集蛋白质。这种材料耐受蛋白酶K的消化。以同样的方式制备不包含Cu2+结合位点的Δ51-90型突变体。通过使用赖氨酸-血纤维蛋白溶酶原(25nm)和DSPA(0.25nm)孵育PrP(0-100μg/m)研究了PrP的这些不同形式对于DSPA激活血纤维蛋白溶酶原的影响。用SPECTRAmaxGemini-lourescence微板计读器通过血纤维蛋白溶酶-特异性染料H-d-Val-Leu-Lys-7-氨基-4-甲基香豆素在37℃时的水解测定血纤维蛋白溶酶原的激活。这些试验的对照包括作为PrP对血纤维蛋白溶酶原激活的影响的正对照的sc-t-PA，和作为刺激t-PA和DSPA激活的正对照的纤维蛋白片断。
血纤维蛋白溶酶原结合的特异性通过其与DFP-失活的t-Pa的竞争测定。赖氨酸类似物EACA也可以用做竞争性抑制剂。
结果试验的结果在表3和图7-10中展示。
图7特别提供了实质性说明。该图表明PrP只特定地活化t-PA而不是DSPA。此外表明环饼2的赖氨酸-结合位点必定与DSPA和t-PA之间的本质区别相关。表3反应率，M-1s-1
折叠刺激
实施例3a)制备和纯化人源化DSPA(humDSPA)(如图11中描述的氨基酸序列)使用Bac-to-Bac系统(Invitrogen公司)制备重组人DSPA杆状病毒DNA并且将纯化的病毒DNA转染至Sf9昆虫细胞。用Sf9细胞扩增生产的重组杆状病毒。用无血清培养基中的High Five昆虫细胞在悬浮培养基中表达HumDSAP。将含有重组蛋白质的细胞培养基上清液在-20℃冷冻直到将其用于进一步工作。
在震荡器上于室温将细胞培养物上清液缓慢地解冻并随后于4000×g离心1小时。将蛋白质溶液(1.5l)用50mM醋酸氨平衡至pH 6.0，上样至SP-琼脂糖凝胶XL(Amersham)离子交换柱(350ml柱床体积)上并用5柱体积50mM醋酸氨溶液洗涤。将结合蛋白用0-100％的1M的醋酸氨梯度，pH 6，多于10柱体积洗脱。
含有HumDSPA的级分通过蛋白质印迹(Western blotting)鉴定；检测蛋白后，将这些级分接受活性测试，于-80℃冷冻并随后冻干。
与标准活性检测法相比，在这种试验中使用50μl洗脱液(＝含有humDSPA的级分)、50μl 0.2M的Tris，pH 8.0及100μl PBS中的2mM的S-2288。
b)DSPA活性的检测使用的活性检测法是检测血纤维蛋白溶酶原激活剂将无色底物S-2288转变为有色产物的比率。检测法是用于测定血纤维蛋白溶酶原激活因子的蛋白水解活性的标准方法。通过测定由测试物释放的发色团(p-硝基苯氨，pNA)而使活性可见。Chromogenix公司提供用于此目的的发色团S-2288。
在这种检测法中，反应速率不是直接地测定(如用catal为单位)；而是与定义为100％活性的标准相比较。
在有以下组成25mM Tris-HCl pH 8/0.1％清蛋白/100mMNaCl/1.1mM甘氨酸/1.2mM甘露醇/2.5mM S-2288的缓冲液中测定反应速率。
使用空白值、标准品和含有不同蛋白质浓度的样品在96孔板中进行测量。
使用光度计纪录在405nm时吸收度随时间的增加量。使用Excel测定曲线的线性部分的斜率。这样可得出活性。
图14表示级分的活性(表现为S-2288活性)。在图15a和15b中可以看到银染色胶凝。图16a和16b显示蛋白质印迹。在蛋白质印迹中检测出的蛋白质对应于银染色胶凝中用箭头标记的蛋白质。
实施例4凝块溶解(血栓溶解剂活性)将含有humDSPA的级分B6的残余溶解于15ml PBS中并将该溶液于4000×g离心15分钟。因为表现出最高的纯度而选择该级分。移出一等分用于活性测定。该样品的催化活性与5μg活化酶(activase)/ml的催化活性大概相当。
使用的血块源自提前24小时获取的正常血液样品并且在每一试验中是由2ml转移至聚丙烯试管的且在自然条件下凝结的血液形成的。溶解在PBS中进行。
首先将含有humDSPA的级分B6(来自SPXL-琼脂糖凝胶捕获步骤)冻干。将残余溶解于15ml PBS中并以4000g离心15分钟。在加入血块之前将该溶液的样品移出以测定S-2288活性。该样品的催化活性与5μg活化酶/ml的催化活性基本一致。
图17a-17d显示在加入humDSPA后0h、3h、4h和24h凝块溶解随时间数列进行的结果。每一试验中的左侧检测显示对照。在上述数量的包含humDSPA的PBS在右侧检测中显示。
血细胞慢慢地在分解的凝块外沉积。一种在4小时后已经可以辨别的网状物在24小时后保持不变。在该检测中，4小时后用注射器将分离的血细胞吸出以便观察剩余的凝块的结构。
必须考虑的事实是当凝块不再悬浮于自身的溶解产物中时纤维蛋白的溶解慢了下来。这就是为什么24小时后任何凝块全部仍然存在的原因。
定量这种反应是不可能的。然而，humDSPA与天然DSPA相比在活性上表现出显著的增强，因为必须使用至少4倍数量的DSPA以便溶解同样体积的凝块。
权利要求
1.血纤维蛋白溶酶原激活剂治疗血栓形成病特别是中风的用途，所述的血纤维蛋白溶酶原激活剂与天然t-PA相比赖氨酸结合能力减弱。
2.如权利要求1中所述的用途，其特征在于，血纤维蛋白溶酶原激活剂在环饼2或在功能上或结构上与之同源的结构域上的修饰。
3.如权利要求2中所述的用途，其特征在于，环饼2或在功能上或结构上与之同源的结构域的删除。
4.如权利要求2中所述的用途，其特征在于，环饼2赖氨酸结合位点或在功能上或结构上与之同源的结构域上的修饰。
5.如权利要求4中所述的用途，其特征在于，D236N或与之同源的氨基酸的取代。
6.如前述的权利要求之一中所述的用途，其特征在于，血纤维蛋白溶酶原激活剂表现出与t-PA至少75％的同源性。
7.如权利要求6中所述的用途，其特征在于，通过删除或取代修饰t-PA活性位点以致不发生蛋白水解切割。
8.如权利要求7中所述的用途，其特征在于，氨基酸位置R15-I16的修饰。
9.如权利要求8中所述的用途，其特征在于，活性位点具有LHST序列。
10.如前述的权利要求之一中所述的用途，其特征在于，在环饼结构域和半胱氨酸桥之间的过渡区中，血纤维蛋白溶酶原激活剂具有包含SKAT的氨基酸序列片段。
11.包含如图3、11和13之一中描述的氨基酸序列的血纤维蛋白溶酶原激活剂。
12.血纤维蛋白溶酶原激活剂，其特征在于，与如权利要求10中所述的血纤维蛋白溶酶原激活剂具有至少70％的同一性，优选地具有80-90％的同一性，特别优选具有95％的同一性。
13.如权利要求10-12之一中所述的血纤维蛋白溶酶原激活剂，其特征在于，与天然DSPA相比溶解血栓活性增强。
全文摘要
结合赖氨酸的能力降低的血纤维蛋白溶酶原激活剂对治疗血栓形成疾病的用途。
文档编号A61K38/49GK1849394SQ200480026081
公开日2006年10月18日 申请日期2004年9月13日 优先权日2003年9月12日
发明者W·泽恩根, O·科普斯, V·埃利斯 申请人:帕昂德国有限公司