使用放射性标记的抗纤连蛋白ed－b的抗体l19靶向肿瘤血管的制作方法

专利名称：使用放射性标记的抗纤连蛋白ed－b的抗体l19靶向肿瘤血管的制作方法
技术领域：
本发明涉及使用放射性标记的抗体分子靶向肿瘤血管。特别地，本发明涉及与纤连蛋白的ED-B结合的抗体分子的应用，所述抗体分子在肿瘤靶向中具有被论证的有效性。在本发明的不同实施方案中，抗体分子以不同分子形式应用。在某些实施方案中，所述抗体分子包括人IgG1。在其它实施方案中，所述抗体分子是小免疫球蛋白(mini-immunoglobulin)，例如通过将scFv抗体分子与分泌性IgE同种型的CH4恒定区融合而产生，所述分泌性IgE同种型在其COOH末端天然含有一个用于形成共价连接的二聚体的半胱氨酸。血液清除率、体内稳定性及其它有利性质被用于本发明的不同方面和实施方案中，例如用于肿瘤靶向中。根据临床需要和疾病情况，不同抗体分子形式的不同体内行为可用于不同的诊断和/或治疗目的。
尽管非人源的单克隆抗体(mAb)具有作为治疗剂的巨大潜力，但由于其免疫原性(1 Shawlert et al.，1985；2 Miller et al.，1983)、不良的药代动力学性质(3 Hakimi et al.，1991；4 Stephens et al.，1995)及在恢复效应器功能中的无效性(5 Riechmann et al.，1988；6 Junghens et al.，1990)而很少进行临床实验。近来从噬菌体展示文库中分离人抗体片段的展望(7McCafferty et al.，1990；8 Lowman et al.，1991；综述见9 Nilsonn et al.，2000和10 Winter et al.，1994)解决了这些问题，复兴了用这些试剂治疗主要疾病的研究并重新点燃了使用这些试剂治疗主要疾病的希望。确实，这些分子应作为新的诊断和治疗工具的理想构架(building block)(11Reichert，2001；12 Huls et al.，1999)。另外，这些抗体可以“成熟”以达到在皮摩尔(picomolar)范围内的亲和性(13 Pini et al.，1998)，这对于其临床应用即使不是必需的，至少也是所希望的。
但是对用于诊断或治疗剂的选择性送递，人抗体片段的临床应用需要高度特异性靶位。在肿瘤的情况中，最常用的靶位是细胞表面抗原，其通常既不丰富也不稳定。然而，在肿瘤进展期间，肿瘤细胞周围的微环境进行广泛的修饰而产生“肿瘤环境”，这个肿瘤环境是基于抗体的肿瘤治疗方法的一种靶位(14 Neri and Zardi，1998)。事实上，改变的肿瘤微环境本身是可以靶向的致癌原这一观点愈加获得共识。能将治疗剂有效送递至肿瘤微环境的分子因此代表癌症治疗的有希望的及重要的新工具(15 Bissel，2001；14 Neri and Zardi，1998)。
纤连蛋白(FN)是一种胞外基质(ECM)成分，其在各种正常组织和体液中广泛表达。不同的FN同种型可以通过FN前mRNA的可变剪接而产生，这是由细胞因子和胞外pH调节的一个过程(16 Balza etal.，1988；17Carnemolla et al.，1989；18 Borsi et al.，1990；19 Borsi et al.，1995)。也称作外型(extratype)III型重复B(EIIIB)的完整III型重复ED-B可以完全包括或者不包括在FN分子中(20 Zardi et al.，1987)。ED-B在不同物种中是高度保守的，在迄今研究的所有哺乳动物(人、大鼠、小鼠、狗)中具有100％同源性，与鸡的相似结构域具有96％同源性。含有ED-B的FN同种型(B-FN)在正常成体组织中不能用免疫组织化学检测到，除了在进行生理学重塑(physiological remodelling)的组织中(例如子宫内膜和卵巢)及在伤口愈合期间的组织中(17 Carnemolla et al.，1989；21ffrench-Constant，et al.，1989)。相反，其在肿瘤和胚胎组织中高度表达(17Camemolla et al，1989)。另外，已经证实B-FN是血管发生的标记物(22Castellani et al.，1994)，并且侵入肿瘤组织的内皮细胞沿着含有B-FN的ECM纤维迁移(23 Tarli et al.1999)。
已经描述了使用特异于B-FN同种型(24 Carnemolla et al.，1996；23Tarli et al.，99；25 Viti et al.，99；26 Neri et al.，97；27 Demartis et al.，2001)的人重组抗体scFv(L19)(13 Pini et a1.，98)进行的肿瘤血管的选择性靶向。所述抗体可用于将治疗性放射性核素或毒性物质选择性送递至肿瘤血管的体内诊断(免疫闪烁扫描术(immunoscintigraphy))及治疗方法中。另外，Birchler et al.(281999)示出与光敏剂化学偶联的scFv(L19)选择性积聚在血管生成性兔角膜模型的新形成的血管中，并且在经近红外线光照射后介导眼部新血管的完全和选择性阻塞。
更最近的，Nilsson et al.(292001)报道了在不同类型鼠肿瘤模型中scFV(L19)与组织因子的胞外结构域的免疫缀合物介导选择性梗塞。此外，scFv(L19)与IL-2或IL-12的融合蛋白已经示出增强这两种细胞因子的治疗效力(30 Halin et al.，submitted；31 Carnemolla et al.，2002)。对于融合物在治疗病理性血管发生损害(包括肿瘤)中的应用的描述也见于WO01/62298。最后，由于L19与小鼠和人ED-B同等好地反应，因此其可用于前临床研究和临床研究中。
也参见PCT/GB97/01412、PCT/EP99/03210、PCT/EP01/02062和PCT/IB01/00382所述。
不同抗体形式示出在体内稳定性、清除率和肿瘤靶向性能方面的不同表现(32 Wu et al.，2000)。小免疫球蛋白或小免疫蛋白(smallimmunoprotein，SIP)在(33 Li et al.，1997)中描述。
本发明基于不同形式的L19人抗体分子(即scFv、小免疫球蛋白和完整IgG1)的制备、鉴定和体内生物分布的研究，及用放射性同位素标记。
附图简述

图1示出了例证不同蛋白质结构的模型。AFN亚基的结构域结构模型。进行可变剪接的蛋白质序列以灰色表示。如图所示，重组抗体L19的表位位于重复ED-B中。B-D分别用于表达L19(scFv)(B)、L19-SIP(C)和L19-IgG1/K的构建体示意图。
图2示出了在裸鼠中SK-MEL-28肿瘤的生长曲线(三角形所示)及在129小鼠品系中F9肿瘤的生长曲线(圆形所示)。体积(mm3)以与时间(天)的关系作图。每个数据点是六只小鼠的平均值±SD。
图3示出对不同L19形式的大小排阻层析结果。在A、B和C组中分别示出在放射性碘标记后scFv、小免疫球蛋白和IgG1形式的L19的大小排阻层析(Superdex 200)图示。D、E和F组分别示出在静脉内注射放射性碘标记的scFv、小免疫球蛋白和IgG1形式的L19后，在所示时间血浆的大小排阻层析(Superdex 200)图示。当注射后在不同时间对血浆进行上样时，未检测到L19-SIP或L19-IgG1曲线图的改变，而在注射L19(scFv)2后3小时，观测到具有更高分子量的第二个峰。
图4示出使用不同放射性碘标记的L19抗体分子形式在携带SK-MEL-28肿瘤的小鼠中的生物分布实验结果。报道了静脉内注射后在所示时间在肿瘤(图4A)和血液(图4B)中％ID/g的变化。在图4C中，对％ID/g的肿瘤-血液比作图。L19(scFv)的曲线以菱形表示，L19小免疫球蛋白以正方形表示，L19IgG1以三角形表示。
图5示出使用放射性碘标记的L19(scFv)(正方形)和L19小免疫球蛋白(菱形)，在携带F9肿瘤的小鼠中的生物分布实验结果。报道了在静脉内注射后在所示的不同时间肿瘤(A)和血液(B)中％ID/g的变化。
图6示出分别注射生理盐水和I-131-L19-SIP后，随着时间(天)推移U251肿瘤面积(平方毫米)的变化。
本发明涉及结合人纤连蛋白的ED-B的特异性结合构件(specificbinding member)，其中所述特异性结合构件用选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的一或多种同位素放射性标记。本发明还提供了产生这种特异性结合构件的方法，及其在诊断和治疗中的应用。
本发明的特异性结合构件在动物实验中示出有益的性质，如相对于红骨髓以较高剂量送递至肿瘤，及高度肿瘤积聚性质。
一方面，本发明提供了一种特异性结合构件，其与人纤连蛋白的ED-B结合并包含L19VH结构域和VL结构域，任选地L19VL结构域，其中所述特异性结合构件包含一种包括与εS2-CH4融合的所述抗体VH结构域和抗体VL结构域并二聚体化的小免疫球蛋白，或者所述构件包含完整的IgG1抗体分子，并且其中所述特异性结合构件用选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的同位素放射性标记。优选所述放射性同位素是123I或131I，最优选是131I。
放射性标记物或放射性标记的分子可以与所述特异性结合构件附着，可以在例如酪氨酸、赖氨酸或半胱氨酸残基进行标记。
L19VH结构域和L19VL结构域序列在Pini et al.(1998)J.Biol.Chem.27321769-21776中列出，通过引用Pini等的论文而完全引入本文的那些序列视为在此被列出。
通常地，VH结构域与VL结构域配对以提供抗体抗原结合位点。在一个优选实施方案中，L19VH结构域与L19VL结构域配对，由此形成包括L19VH和VL结构域的抗体抗原结合位点。在其它的实施方案中，L19VH与除L19VL之外的其他VL结构域配对。本领域充分确定了轻链的杂乱性(promiscuity)。
可以从L19VH或VL结构域中取一或多个CDR并掺入至合适的框架中。这种操作在下文进一步讨论。L19VH CDR 1、2和3分别示于SEQID NO1、2和3。L19VL CDR1、2和3分别示于SEQ IDNO1、2和3。
在一个优选的实施方案中，所述特异性结合构件是L19-SIP，最优选的是123I-标记的L19-SIP(本文称作I-123-L19-SIP)或者131I-标记的L19-SIP(本文称作I-131-L19-SIP)。
序列在本文列出并可用于针对ED-B的特异性结合构件的VH和VL结构域及其CDR的变体可以通过序列变更或突变及筛选的方法获得。
根据本发明所论述，可以应用序列在本文特别公开的任何VH和VL结构域的可变结构域氨基酸序列变体。特定变体可包括一或多个氨基酸序列改变(添加、缺失、取代和/或插入氨基酸残基)，可以少于大约20个改变、少于大约15个改变、少于大约10个改变或者少于大约5个改变、4、3、2或1个改变。可以在一或多个框架区域和/或一或多个CDR中进行改变。
本发明的特异性结合构件可以是与既结合ED-B又包含由L19VH结构域和L19VL结构域形成的抗原结合位点的特异性结合构件竞争与抗原的结合的构件。结合构件之间的竞争可以容易地在体外分析，例如使用ELISA和/或通过将一个结合构件用特异性报道分子标记，所述结合构件在存在其它未标记的结合构件的情况下可以检测到，从而使得可以鉴别结合相同表位或重叠表位的特异性结合构件。
因此，本发明的进一步的方面是应用包含人抗体的抗原结合位点的特异性结合构件，其与L19竞争结合ED-B。
本发明的特异性结合构件可以以至少L19的结合亲和性结合ED-B，不同特异性结合构件的结合亲和性在适当条件下对比。
除了抗体序列之外，本发明的特异性结合构件可以包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽(如折叠的结构域)，或者赋予分子除了结合抗原的能力之外的其他功能特性。本发明的特异性结合构件可以携带一个可检测的标记，或者可以与毒素或酶缀合(例如通过肽键或接头缀合)。
在病理性血管发生所致疾病或损害的治疗中，本发明的特异性结合构件可以与一种毒性分子缀合，例如与选自白细胞介素-2(IL-2)、阿霉素、白细胞介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)和组织因子(优选截短的组织因子，例如截短至残基1-219)的生物杀灭性或胞毒性分子缀合。见例如WO01/62298所述。
本发明的特异性结合构件可用于人体或动物体的治疗或诊断方法，如人患者的疾病或病症的治疗(可包括预防性治疗)方法，所述方法包括将有效量的本发明特异性结合构件给予所述患者。优选地，本发明的特异性结合构件通过非肠道给予途径给予患者。根据本发明可治疗的病症包括肿瘤(特别是实体瘤)及其它病理性血管发生所致损害，包括风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性、及血管瘤。
特异性结合构件非常适于用选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的同位素标记，并随后用于放射诊断和放射治疗中。
本发明再一方面提供了一种产生本发明的特异性结合构件的方法，包括用选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的放射性同位素标记特异性结合构件。
为直接放射性标记特异性结合构件，可以靶向分子中的酪氨酸组分。在这个特殊程序中，将卤化物例如Br-、I-、At-在存在活性药物成分(API)的情况下用合适的氧化剂氧化，例如iodogen(包被的管)、iodo-Beads、氯胺-T(Chloramine-T)(N-氯-p-甲基苯磺酰胺的钠盐)等。
可以通过预先标记一种双功能卤素载体而用例如溴、碘或砹进行间接标记，所述卤素载体优选衍生自例如安息香酸衍生物、Bolton-Hunter衍生物、苯衍生物等等。可以将所述载体转化进激活的物种中与赖氨酸残基的ε-氨基基团或者与API的N末端缀合。这种间接方法还提供了一种合成途径以在半胱氨酸组分的巯基基团化学选择性地放射性标记肽化合物。半胱氨酸桥连的分子首先可以由合适的还原剂例如氯化锡(二价)、Tris(2-羧乙基)膦(TCEP)还原而产生可与所述卤素载体反应的游离的半胱氨酸SH基团。作为结合的功能基团，可以应用马来酰亚胺和α-溴乙酰胺衍生物。
产生本发明的特异性结合构件的方法可包括在标记所述特异性结合构件之前表达编码该特异性结合构件的核酸。因此，作为早期步骤，产生所述特异性结合构件的方法可任选地包括引起或使得编码核酸(即包含编码所述特异性结合构件的序列的核酸)表达。这种方法可包括在产生所述特异性结合构件的条件下培养宿主细胞。
产生方法可包括产物的分离和/或纯化步骤。所述特异性结合构件可以在从核酸中表达后分离和/或纯化，和/或从宿主细胞中回收。所述分离和纯化可以在标记之前进行。或者或另外，所述特异性结合构件可以在标记后分离和/或纯化。
产生方法可包括将所述产物配制成为包括至少一种额外成分如药物可接受的赋形剂的组合物。因此，所述(标记的)特异性结合构件可以配制成为包括至少一种额外成分如药物可接受的赋形剂的组合物。
本发明的这些及其它方面在下文进一步详细描述。
术语特异性结合构件(specific binding member)这个术语描述了彼此具有结合特异性的一对分子的构件(member)。特异性结合对的构件可以是天然产生的或者是完全或部分合成产生的。一对分子的一个构件具有在其表面上的区域或者空穴，所述区域或空穴与该分子对的另一个构件特异性结合并因此与该另一个构件特殊的空间和极性构成互补。因此成对的构件具有彼此特异性结合的性质。特异性结合对的类型例如是抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本申请与抗原-抗体类型的反应相关。
抗体分子这个术语描述了天然产生的或者部分或全部合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖了包含抗体结合结构域的任何多肽或蛋白质。包含抗原结合结构域的抗体片段是例如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；及微型双功能抗体(diabody)。本发明涉及完整的IgG1抗体分子及如所述的包含εS2-CH4的小免疫球蛋白。
重组DNA技术可用于从初始抗体分子中产生保留原始抗体分子特异性的其他抗体分子。这些技术可包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或者互补决定区(CDR)的DNA导入不同免疫球蛋白的恒定区，或者恒定区加上框架区。见例如EP-A-184187、GB 2188638A或EP-A-239400所述。
由于抗体可以许多方式修饰，因此术语“抗体分子”应该被理解为涵盖具有需要的特异性的抗体抗原结合结构域的任何特异性结合构件或者物质。因此，这个术语涵盖了抗体片段和衍生物，包括包含免疫球蛋白抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是完全或部分合成的多肽。因此该术语包括包含与另一种多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等价物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达在EP-A-0120694和EP-A-0125023中描述。
抗原结合结构域这个术语描述了抗体分子的特定部分，其包含特异性结合并互补于一种抗原的部分或全部的区域。在抗原较大的情况中，抗体可以仅结合抗原的特定部分，该部分称作表位。抗原结合结构域可以由一或多个抗体可变结构域(例如所谓的由VH结构域组成的Fd抗体片段)提供。优选地，抗原结合结构域包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
特异性这个术语可用于描述特异性结合对的一个构件与除了其特异结合配体之外的分子无任何显著的结合的状态。该术语还可用于例如抗原结合结构域特异于多种抗原携带的特定表位的状态，在这种情况中携带抗原结合结构域的特异性结合构件能结合携带该表位的各种抗原。
包含这个术语通常的含义是包括，即允许存在一或多种特征或成分。
分离的这个术语是指本发明的特异性结合构件或者编码这些结合构件的核酸通常处于本发明指定的状态。所述构件及核酸没有或基本没有其天然伴随物质，如在其天然环境或者当这种制品是通过重组DNA技术在体外或体内制备时在其制备环境(例如细胞培养物)中发现的材料。所述构件及核酸可以用稀释剂或佐剂配制并因为实践目的仍认为是分离的，例如所述构件如果用于包被微量滴定平板以用于免疫分析时，通常与明胶或其它载体混合，或者当用于诊断或治疗时，与药物可接受的载体或稀释剂混合。特异性结合构件可以是天然或通过异源真核细胞系统(例如CHO或NSO(ECACC 85110503)细胞)糖基化的，或它们可以是非糖基化的(例如如果通过在原核细胞中表达而产生)。
“基本如所列出的”是指本发明的相关CDR或VH或VL结构域与序列在本文列出的特定区域相同或高度相似。“高度相似”涵盖了在CDR和/或VH或VL结构域中可以产生1-5个，优选1-4个如1-3个或1或2或3或4个取代。
携带本发明的CDR的结构通常是抗体重链或轻链序列或者其基本部分，其中CDR位于相应于重排的免疫球蛋白基因编码的天然发生的VH和VL抗体可变结构域的CDR的位置。免疫球蛋白可变结构域的结构和位置可以参考(Kabat，E.A.et al，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest.5th Edition.US Department of Health and Human Services.1991，及其Internet(http//immuno.bme.nwu.edu或使用任何搜索工具查找″Kabat″)上可获得的更新资料所述确定。
优选地，基本如本文所列出的CDR氨基酸序列作为人可变结构域或其基本部分中的CDR而被携带。基本如本文所列出的L19VH CDR3和/或L19VL CDR3序列可用于本发明的优选实施方案中，优选每个序列在人重链或轻链可变结构域(根据可能的情况)或者其基本部分中作为CDR3被携带。
免疫球蛋白可变结构域的基本部分包含至少3个CDR区域，以及它们之间的框架区。优选地，该部分还包括第一个和第四个框架区的任一个或两者的至少大约50％，该50％是第一个框架区的C-末端50％及第四个框架区的N末端50％。可变结构域的基本部分的N末端或C末端的其它残基可以是与天然发生的可变结构域区域通常不相关的那些残基。例如，通过重组DNA技术产生的本发明的特异性结合构件的构建可以导致引入由为了便于克隆或其它操纵步骤而导入的接头编码的N或C末端残基。其它操纵步骤包括导入接头以将本发明的可变结构域与另外的蛋白质序列包括免疫球蛋白重链、其它可变结构域或者蛋白质标记物连接在一起，如下文更详细的论述。
在本发明的IgG1抗体分子中，VL结构域可以以C末端附着到包括人Cκ或Cλ链，优选Cκ链的抗体轻链恒定区。
除了用76Br、77Br、123I、124I、131I和/或211At标记之外，本发明的特异性结合构件可以用另一种可检测的或功能性标记物进行标记。可检测的标记物如下所述，包括放射性标记物如放射性同位素锝、铟、钇、铜、镥或铼，特别是94mTc、99mTc、186Re、188Re、111In、86Y、88Y、177Lu、64Cu和67Cu，其可以使用如本文所述的抗体成像领域的常规化学方法附着于本发明的抗体。可以使用的其它放射性同位素包括203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、110mIn、97Ru、62Cu、68Cu、86Y、88Y、90Y、121Sn、161Tb、153Sm、166Ho、105Rh、177Lu、72Lu和18F。
标记物也包括酶标记物如辣根过氧化物酶。标记物还包括化学成分如生物素，其可以通过结合特异性关连的可检测成分例如标记的抗生物素蛋白而检测。
一个标记方案实例如下为直接放射性标记特异性结合构件，首先通过合适的还原剂例如氯化锡(二价)、Tris(2-羧乙基)膦(TCEP)还原半胱氨酸桥连的分子，产生可与同位素例如Tc或Re反应的游离半胱氨酸SH基团。在这个特定程序中，得自即时发生器系统的permetalate由还原剂例如氯化锡(二价)在存在辅助配体例如酒石酸钠和API的情况下还原(详见下文实验章节所述)。
用例如铟、钇、镧系元素或锝和铼进行的间接标记可以通过将一种螯合配体与所述特异性结合构件的胺或硫醇基团预先结合而进行，所述螯合配体优选地衍生自乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己基1，2-二胺四乙酸(CDTA)、乙二醇-O，O′-二(2-氨乙基)-N，N，N′，N′-二乙酸(HBED)、三乙烯四胺六乙酸(TTHA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″-四乙酸(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-N，N′，N″-tetraacetic acid，DOTA)、1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(1，4，7-triazacyclononane-N，N′，N′-triacetic acid，NOTA)、1，4，8，11-四氮杂环十四烷-N，N′，N″，N-四乙酸(1，4，8，11-tetraazacyclotetradecane-N，N′，N″，N-tetraacetic acid，TETA)、巯基乙酰二甘氨酸(mercaptoacetyl diglycine，MAG2)、巯基乙酰三甘氨酸(mercaptoacetyl triglycine，MAG3)、巯基乙酰甘氨酰半胱氨酸(meicaptoacetyl glycyl cysteine，MAGC)、半胱氨酸甘氨酰半胱氨酸(cysteinyl glycyl cysteine，CGC)。螯合配体具有合适的偶联基团，例如活性酯、马来酰亚胺、硫代氨基甲酸盐或者α-卤化的乙酰胺成分。为了将螯合配体与胺基团例如赖氨酸残基的ε-NH2-基团结合，不需要预先还原L-19-SIP化合物。
标记特异性结合构件的方法可包括将含有选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的一种放射性同位素的激活的双功能卤素载体与所述特异性结合构件的赖氨酸残基或N末端，以及半胱氨酸残基缀合。所述方法可包含将所述卤素载体与所述特异性结合构件的赖氨酸或半胱氨酸残基缀合，或与所述特异性结合构件的N末端缀合。(i)半胱氨酸残基和(ii)赖氨酸残基或N末端其中之一或二者可以根据本发明用相同或不同的放射性同位素标记。
本发明的特异性结合构件设计为用于人或动物对象优选人的诊断或治疗方法中。所述特异性结合构件特别适用于放射治疗和放射诊断方法中。
因此，本发明进一步提供了包括给予本发明提供的特异性结合构件的治疗方法、包含这种特异性结合构件的药物组合物、以及这种特异性结合构件在生产用于给予的药物中的应用，例如在生产药物或药物组合物的方法中的应用，包括用所述特异性结合构件与药物学可接受的赋形剂一起配制。
本发明的特异性结合构件可用于提供治疗益处的临床适应证包括肿瘤如任何实体瘤，以及病理性血管发生所致其他损害，包括风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、年龄相关的黄斑变性及血管瘤。
本发明的特异性结合构件可用于人体或动物的治疗方法中，如治疗(包括预防性治疗)人患者的疾病或病症的方法，所述方法包括将有效量的本发明的特异性结合构件给予所述患者。优选地，所述治疗是放射治疗。根据本发明可治疗的病症在本文别处论述。
本发明的特异性结合构件可用于SPECT成像、PET成像和治疗中。用于SPECT成像优选的同位素包括123I和131I。用于PET的优选同位素是124I。131I是用于治疗的优选同位素。
由于使用对于成像和治疗的一个元件的的不同同位素，因此各自的免疫缀合物的生物分布是相同的。这与使用111In标记的衍生物进行成像以预测各自的90Y标记的治疗衍生物的生物分布的其它方案相比是有利的，因为相应的111In和90Y标记的衍生物的生物分布可以不同。见Carrasquillo J.A.et al.(1999)J Nucl Med 40268-276。
因此，本发明进一步提供了包括给予本发明提供的特异性结合构件的治疗方法、包含这种特异性结合构件的药物组合物、以及这种特异性结合构件在生产用于给予的药物中的应用，例如在生产药物或药物组合物的方法中的应用，包括用所述特异性结合构件与药物学可接受的赋形剂一起配制。
根据本发明，所提供的组合物可以给予个体。给予优选是以“治疗有效量”给予，这是足以示出对患者有益处的量。这种益处可以是至少改善至少一种症状。实际给予量及给予速度和时程依赖于治疗的疾病的性质和严重程度而定。治疗处方，例如剂量等的确定，在普通医生和其它医生的职责范围内。抗体的合适剂量为本领域所熟知；见Ledermann J.A.et al.(1991)Int J.Cancer 47659-664；Bagshawe K.D.et al.(1991)Antibody，Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4915-922所述。
根据需治疗的病症，组合物可以单独或者与其它治疗进行组合同时或相继给予。
本发明的特异性结合构件，包括包含抗体抗原结合结构域的那些构件，可以通过任何合适途径给予需要治疗的患者，通常通过注射进血流中和/或直接注入治疗部位例如肿瘤中。优选地，所述特异性结合构件是通过非肠道给予的。精确剂量依赖于许多因素而定，如治疗途径、治疗区域(例如肿瘤)的大小和位置、抗体的精确性质(例如完整的IgG1抗体分子、小免疫球蛋白分子)，及与抗体分子附着的任何可检测的标记物或其它分子的性质。典型的的抗体剂量是10-50mg。
这是单次治疗成人患者的剂量，对于儿童和婴幼儿可以适当调整，也可以根据分子量按比例调整其它抗体形式的剂量。根据医生的判断可以每天一次、每周两次、间隔一周或一个月重复治疗。
本发明的特异性结合构件通常以药物组合物的形式给予，其除了特异性结合构件之外可包含至少一种成分。
因此本发明的药物组合物根据本发明的应用除了活性成分之外，还可包含一种药物学可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂及本领域技术人员熟知的其它材料。这些材料应是无毒的并且不应干扰所述活性成分的效力。载体或其它材料的精确性质依赖于给药途径而定，可以是口服的或者注射例如静脉内注射途径。
对于静脉内注射或者在病变部位注射，活性成分是肠道外给予可接受的水溶液形式，其无热原并且具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员可以使用例如等渗介质如氯化钠注射液、Ringer′s注射液、乳酸盐Ringer′s注射液制备合适的溶液。根据需要可包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其它添加剂。
根据需治疗的病症，组合物可以单独或者与其它治疗进行组合而同时或相继给予。其它治疗可包括给予合适剂量的止痛药物如非甾体抗炎药物(例如阿司匹林、扑热息痛、布洛芬或酮洛芬)或者鸦片制剂如吗啡，或者止吐剂。
本发明提供了一种包括促使或使得本发明提供的特异性结合构件与ED-B结合的方法。正如所述，这种结合可以在体内发生，例如在给予特异性结合构件或者编码特异性结合构件的核酸之后发生，或者这种结合可以在体外发生，例如在ELISA、Western印迹、免疫细胞化学、免疫沉淀或亲和层析中发生。
可以确定特异性结合构件与ED-B的结合的量。定量可以是关于测试样品中抗原的量，这对于诊断有意义。
抗体对样品的反应性可以通过任何方式确定。可以通过放射免疫测定法(RIA)确定。将放射性标记的抗原与未标记的抗原(测试样品)混合并使其与抗体结合。将结合的抗原通过物理方法从未结合的抗原中分离，确定与抗体结合的放射性抗原的量。测试样品中抗原越多则结合抗体的放射性抗原越少。也可以使用与报道分子连接的抗原或类似物进行非放射性抗原的竞争结合分析。所述报道分子可以是具有光谱分离吸光和发光特性的荧光染料、磷或激光染料。合适的荧光染料包括荧光素、罗丹明、藻红蛋白和得克萨斯红。合适的生色染料包括二氨基联苯胺。
其它报道分子包括大分子胶状颗粒或者微粒物如有色的、磁性或顺磁性的乳胶珠，及可以直接或间接引起可目测的、可电子检测的或可另外记录的检测信号的生物或化学活性剂。这些分子可以是例如催化产生或改变颜色或引起电子性质改变的反应的酶。它们可以是分子可激发的，由此能量状态之间的电子跃迁导致特征性光谱吸收或发射。它们可包括与生物传感器结合使用的化学实体。可以应用生物素/抗生物素蛋白或者生物素/链霉抗生物素及碱性磷酸酶检测系统。
由单个抗体-报道分子缀合物产生的信号可用于得到样品(正常和测试样品)中相关抗体结合的可量化的绝对或相对数据。
本发明进一步涉及一种特异性结合构件，其与既结合抗原又包含包括具有基本如本文所列出的氨基酸的CDR的V结构域，优选包含SEQ IDNO3所示VH CDR3的VH结构域的任何特异性结合构件竞争结合ED-B。结合构件之间的竞争可以简便地在体外分析，例如通过将一个结合构件用一个特异性报道分子标记，所述结合构件在存在其它未标记的结合构件的情况下可以检测到，从而使得可以鉴别结合相同表位或重叠表位的特异性结合构件。竞争可以例如使用如Carnemolla et al.(24 1996)所述ELISA确定。
如上所述，产生本发明的特异性结合构件的方法可包括表达编码核酸，及可以任选地包括在产生所述特异性结合构件的条件下培养宿主细胞。根据本发明的或者本发明使用的特异性结合构件及编码核酸分子及载体可以基本纯或均一形式分离自和/或纯化自例如其天然环境，在核酸的情况中，没有或基本没有源自编码具有所需功能的多肽的序列之外的核酸或基因。
本发明使用的核酸可包括DNA或RNA，并且可以是全部或部分合成的。本文列出的核苷酸序列涵盖了具有特定序列的DNA分子，及具有特定序列的RNA分子，除非特别说明，否则其中U取代T。
本领域熟知在各种不同的宿主细胞中克隆和表达多肽的系统。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中可利用的表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞及许多其它细胞。通常优选的细菌宿主是大肠杆菌。
本领域充分确定了抗体及抗体片段在原核细胞如大肠杆菌中的表达。综述参见例如Pluckthun，A.Bio/Technology 9545-551(1991)。本领域技术人员也可利用在培养的真核细胞中的表达以产生特异性结合构件，见最近的综述例如Ref，M.E.(1993)Curr.Opinion Biotech.4573-576；Trill J.J.et al.(1995)Curr.Opinion Biotech 6553-560。
可以选择或构建含有适当调节序列的合适载体，所述调节序列包括启动子序列、终止子序列、聚腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因及其它合适序列。载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒。进一步详述参见例如Molecular Cloninga Laboratory Manual3nd edition，Sambrook et al.，2001，Cold Spring Harbor Laboratory Press。关于核酸操纵例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA导入细胞中和基因表达、及蛋白质分析的许多已知技术和方案详见于Current Protocols in MolecularBiology，Second Edition，Ausubel et al.eds.，John Wiley&Sons，1992。Sambrook等及Ausubel等所论述并入本文作参考。
产生本发明的特异性结合构件的方法可进一步包括将编码核酸导入宿主细胞中。所述导入可利用任何可利用的技术进行。对于真核细胞，合适的技术可包括磷酸钙转染、DEAE-Dextran、电穿孔、脂质体介导的转染及使用逆转录病毒或其它病毒例如痘苗病毒的转导，或者对于昆虫细胞使用杆状病毒的转导。对于细菌细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔及使用噬菌体转染。
在导入后可以引起或使得所述核酸表达，例如通过在使得所述基因表达的条件下培养宿主细胞进行。
在一个实施方案中，本发明的核酸整合进宿主细胞的基因组(例如染色体)中。整合可以根据标准技术通过将促进重组的序列包含于基因组中而促进。
本领域技术人员根据包括如下实施例的本发明公开可显而易见本发明的其它方面和实施方案。本发明的特异性结合构件的合成和标记方法在如下实施例中充分例证。这些实施例仅是例证本发明而无限制之意。本说明书中所提及的所有文献均并入参考。
本发明各方面和实施方案的实施例1.本发明的特异性结合构件的制备和鉴定如下实施例使用放射性标记的肽化合物L19-SIP。
1.1I-131-L19-SIP的合成(氯胺-T方法(Chloramine-T method))将含有200μg L19-SIP的230μl PBS(0.2M PBS，pH 7.4)置于反应瓶中，与185MBq[131I]NaI混合，并与30μL新鲜制备的在0.2M PBS(pH7.4)中的氯胺-T溶液(2mg/mL)反应。1分钟后，加入50μL的Na2S2O5溶液(10mg/mL于PBS 0.2M，pH 7.4中)。131I标记的L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用预先用5ml在PBS中的0.5％牛血清白蛋白封闭的NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率45.7％。
放射性化学制品纯度88.3％(SDS-PAGE)。
比活性31.7MBq/nmol。
免疫反应性76％。
1.2I-131-L19-SIP的合成(iodogen方法)将溶于800μl PBS(0.2M PBS，pH 7.4)中的800μg L19-SIP与500MBq[131I]NaI混合并置于反应瓶(iodogen管，Pierce Inc.)中。将混合物在室温轻轻摇动30分钟。131I标记的L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用预先用5ml在PBS中的0.5％牛血清白蛋白封闭的NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率93.2％。
放射性化学制品纯度91.1％(SDS-PAGE)。
比活性46.6MBq/nmol。
免疫反应性78％。
1.3I-123-L19-SIP的合成(iodogen方法)将含有200μg L19-SIP的230μl PBS(0.2M PBS，pH 7.4)与200MBq[123I]NaI混合并置于反应瓶(iodogen管，Pierce Inc.)中。将混合物在室温轻轻摇动30分钟。123I标记的L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用预先用于PBS中的5ml 0.5％牛血清白蛋白封闭的NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率81.6％。
放射性化学制品纯度89.6％(SDS-PAGE)。
比活性61.2MBq/nmol。
免疫反应性84％。
1.4I-124-L19-SIP的合成(iodogen方法)将含有200μg L 19-SIP的230μl PBS(0.2M PBS，pH 7.4)与50MBq[123I]NaI混合并置于反应瓶(iodogen管，Pierce Inc.)中。将混合物在室温轻轻摇动30分钟。124I标记的L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用预先用于PBS中的5ml 0.5％牛血清白蛋白封闭的NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率84.5％。
放射性化学制品纯度89.6％(SDS-PAGE)。
比活性22.8MBq/nmol。
免疫反应性86％。
1.5(3-(4-羟基-3-[131I]碘-苯基)-丙酸酯)-L19-SIP的合成将500μg(3-(4-羟基-苯基)-N-(sulfonato-琥珀酰亚氨基)丙酸酯)溶解于1mL的DMSO中。将10μl氯胺-T(5mg/ml于PBS中)与74MBq[131I]NaI混合，用15μL PBS(0.2M，pH 7.4)中和。将1μl的(3-(4-羟基-苯基)-N-(sulfonato-琥珀酰亚氨基)丙酸酯)溶液加入氯胺-T/[131I]NaI溶液中并使该混合物反应1分钟。加入40μL的Na2S2O5(10mg/mL于PBS 0.2M，pH 7.4中)，随后立即加入含有200μg L19-SIP的230μl硼酸盐缓冲液(0.2M PBS，pH 8.5)而结束反应。
(3-(4-羟基-3-131I)碘-苯基)-丙酸酯)-L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用预先用5ml含有0.5％牛血清白蛋白的PBS封闭的NAP-5层析柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率37.2％。
放射性化学制品纯度94.6％(SDS-PAGE)。
比活性10.3MBq/nmol。
免疫反应性69％。
1.6I-131-L19-SIP的MIRD计算基于在携带肿瘤的小鼠中的生物分布数据，I-131标记的L19-SIP的吸收剂量可以通过MIRD公式(MIRD formalism)计算。生物动力学建模使用携带人成胶质细胞瘤(U251)的小鼠中I-131-L19-SIP的％ID数据进行。停留时间通过对双指数和单指数函数曲线下从零至无限大求积分所得的面积计算，包括所述化合物的生物学和物理学半衰期。
考虑到小鼠器官既作为放射源又作为放射靶位，因此可以使用MIRDOSE 3.1软件的S值估计I-131-L19-SIP的作为自身对自身的器官吸收剂量(无放射性交叉发射)。
小鼠器官剂量(mGy/MBq)肝 50肾 160脾 50肺 220卵巢 180-410(依赖于排卵周期状况和ED-B表达)子宫 600(依赖于排卵周期状况和ED-B表达)睾丸 55血液 130红骨髓 50(基于血液剂量计算)肿瘤 940(对于100mg肿瘤计算)使用MIRDOSE 3.1程序中计算的停留时间，可以估计I-131-L19-SIP的人体吸收剂量。
人体器官剂量(mGy/MBq)肾上腺9.46E-02
脑1.64E-02乳腺 7.33E-02胆囊 1.00E-01LLI壁 4.47E-01小肠 1.10E-01胃9.45E-02ULI壁 2.11E-01心脏壁6.22E-02肾1.86E-01肝7.46E-02肺7.04E-02肌肉 8.71E-02卵巢 8.07E-01胰腺 1.15E-01红骨髓9.11E-02骨表面9.74E-02皮肤 7.20E-02脾7.11E-02睾丸 2.38E-01胸腺 8.55E-02甲状腺8.54E-02膀胱壁7.19E-01子宫 4.72E-01全身 8.78E-02EFF DOSE EQUIV3.60E-01EFF DOSE 3.21E-01推断红骨髓和生殖器官(卵巢/子宫和睾丸)是剂量限制器官。然而，基于剂量测定计算的治疗窗看起来有利及有希望。发现肿瘤剂量与红骨髓剂量比值为18。因此，I-131-L19-SIP显示送递至肿瘤的剂量是送递至红骨髓的剂量的18倍，这是很显著的。
1.7在将I-131-L19-SIP单次静脉内注射进携带肿瘤的裸鼠后的肿瘤治疗研究将I-131-L19-SI单次静脉内注射进携带U251(成胶质细胞瘤)的裸鼠(体重为大约27g)中。研究剂量分别为37MBq和74MBq。另外，研究一组对照动物(单次注射生理盐水)。在注射后的时间内，使用测径器测定肿瘤大小(mm2)。
在分别单次静脉内注射生理盐水和I-131-L19-SIP后监测的裸鼠中肿瘤的生长情况示于图6。
每只动物单次注射74MBq I-131-L19-SIP的动物示出对U251肿瘤生长的显著作用，使其停滞18天。对于低剂量组(37MBq)也如此，除了低剂量组在最后5天开始轻微的肿瘤生长。相反，对照组的肿瘤在整个观测期间持续生长。
这个研究结果示出I-131-L19-SIP对于治疗实体瘤的极佳潜力。
1.8I-123-L19-SIP单次静脉内注射进携带肿瘤的裸鼠后的成像将本发明的物质以大约9.25MBq的剂量静脉内注射进携带F9(畸胎癌)的裸鼠(体重大约25g)中。在给予该物质后的不同时间进行γ照相机成像。
通过在注射后4小时和24小时对携带F9(畸胎癌)的裸鼠中I-123-L19-SIP进行平面闪烁扫描(planar scintigraphy)，可以明确描述肿瘤。在注射后4小时，除了肿瘤强烈吸收之外，在机体其它部位仅可检测到微弱的背景(未与特定器官结合，而是得自血液)。尽管肿瘤中信号保持，但随着时间推移，机体其它部位的背景信号消失。因此，在注射后24小时，仅可检测到肿瘤。
这个研究结果示出I-123-L19-SIP对于实体瘤成像的极佳潜力。
2.进一步的实施例和实验材料和方法scFv、小免疫球蛋白(SIP)和IgG1构建体scFv的制备和表达scFv(L19)(图1A)是特别针对纤连蛋白ED-B结构域的亲和性成熟的(Kd＝5.4×10-11M)抗体片段(13 Pini et al.，1998)。将scFv(D1.3)(7 McCaffertyet al.；26 Neri et al.，1997)用作对照，这是一种小鼠抗鸡卵清溶菌酶scFv。根据Pini et al.(34 1997)所述，将这些scFv在大肠杆菌菌株HB2151(Maxim Biotech，San Francisco CA)中表达。
小免疫球蛋白为构建L19小免疫球蛋白(L19-SIP)基因(图1C)，将编码scFv(L19)的DNA序列通过聚合酶链反应(PCR)使用Pwo DNA聚合酶(Roche)根据厂商指导进行扩增，引物是分别含有ApaLI和BspE I限制位点的引物BC-618(gtgtgcactcggaggtgcagctgttggagtctggg-SEQ ID NO8)和引物BC-619(gcctccggatttgatttccaccttggtcccttggcc-SEQ ID NO9)。扩增产物插入pUT-εSIP载体ApaLI/BspEI中，这样提供了具有在胞外介质中分泌蛋白质所需的分泌信号的scFv基因。pUT-εSIP载体得自先前所述的pUT-SIP-long(33 Li et al.，1997)，是用人IgE分泌同种型IgE-S2的CH4结构域(εS2-CH4；35 Batista et al.，1996)取代人恒定的γ1-CH3结构域产生的。CH4是使得IgE分子二聚体化的结构域，εS2同种型在羧基末端含有一个半胱氨酸，其通过链间二硫键稳定IgE二聚体。在最终的SIP分子中，ScFv(L19)与εS2-CH4结构域通过一个短GGSG接头连接。然后用HindIII和EcoR限制酶将SIP基因从质粒pUT-εSIP-L19中切离并克隆进含有巨细胞病毒(CMV)启动子的哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen，Groningen，The Netherlands)中，以获得构建体pcDNA3-L19-SIP。
编码scFv(D1.3)的DNA序列使用引物BC-721(ctcgtgcactcgcaggtgcagctgcaggagtca-SEQ ID NO10)和BC-732(ctctccggaccgtttgatctcgcgcttggt-SEQ ID NO11)扩增并插入pUT-εSIP载体ApaLI/BspEI中。然后将D1.3-SIP基因用HindIII和EcoRI限制酶从pUT-εSIP-D1.3中切离并克隆进pcDNA3中，获得构建体pcDNA3-D1.3-SIP。
这些构建体用于使用FuGENE 6转染试剂(Roche)转染SP2/0鼠骨髓瘤细胞(ATCC，American Type Culture Collection，Rockville，MD，USA)，根据厂商优化的针对粘着细胞的方案进行。将转染瘤在补加了10％FCS的DMEM中生长，并使用750μg/ml Geneticin(G418，Calbiochem，SanDiego，CA)选择。
IgG1为制备完整的IgG1，将L19重链的可变区(L19-VH)与其分泌肽序列一起用HindIII和XhoI从先前所述的L19-pUTεSIP中切离并插入进含有完整人γ1恒定重链基因的pUC-IgG1载体中。然后将重组的IgG1基因用HindIII和EcoRI从pUC-IgG1-L19-VH中切离并克隆进pcDNA3中，获得构建体pcDNA3-L19-IgG1。
为制备完整的L19轻链，将L19-VL通过PCR从L19-pUT-εSIP(如上述)中扩增，使用分别含有ApaLI和BsiWI限制性位点的引物BC-696(tggtgtgcactcggaaattgtgttgacgcagtc-SEQ ID NO12)和BC-697(ctctcgtacgtttgatttccaccttggtcc-SEQ ID NO13)进行。在用ApaLI和BsiWI消化后，将扩增产物插入含有分泌信号序列和人恒定区κ轻链序列的载体pUT-SEC-hCκ中。然后将重组轻链基因用HindIII和XhoI从pUT-SEC-hCκ-L19-VL中切离并插入pCMV2Δ哺乳动物表达载体(通过除去抗G418的抗性基因而得自pcDNA3载体)中，获得构建体pCMV2Δ-L19-κ。
这些构建体的等摩尔量用于如上述共转染SP2/0鼠骨髓瘤细胞。将经Geneticin选择的克隆在ELISA中筛选分泌完整的重链和轻链嵌合免疫球蛋白的能力。
所有DNA构建体均使用Qiagen(Hilden，Germany)的Maxiprep系统纯化，构建体的两条链的DNA序列使用ABI PRISM dRhodamineTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(Perkin Elmer，FosterCity，CA)证实。除了BsiWI(New England Biolabs，Beverly，MA)之外，所有限制酶(RE)均得自Roche Diagnostics(Milan，Italy)。在RE消化后，插入体和载体使用Qiaquick方法(Qiagen)从琼脂糖凝胶中回收。
抗体的纯化和质量控制如Carnemolla et al.(24 1996)所述方法进行免疫亲和性层析以纯化不同的抗体。
将根据厂商指导(24 Carnemolla et al.，96)与Sepharose 4B(AmershamPharmacia Biotech.，Uppsala，Sweden)缀合的ED-B用于免疫纯化所有不同的L19抗体形式，与Sepharose 4B(Amersham Pharmacia)缀合的鸡卵清溶菌酶(Sigma，St.Louis，USA)层析柱用于纯化D1.3抗体。
免疫纯化的抗体形式L19-SIP和L19-IgG1不需要进一步纯化，在+4℃用PBS，pH 7.4透析。由于得自免疫亲和层析的scFv由单体和二聚体两种形式组成，因此需要如Demartis et al.(27 2001)所述另一个纯化步骤以分离后者。制备成批的不同抗体形式并在还原和非还原条件下使用SDS-PAGE、免疫组织化学、大小排阻层析(Superdex 200，AmershamPharmacia Biotech)和ELISA实验分析。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、大小排阻层析和免疫组织化学根据Camemolla et al.(24 1996)所述在条件培养基上进行筛选ELISA实验。为公开不同L19抗体形式的表达，将含有FN的ED-B结构域的重组片段7B89(24 Carnemolla et al.，1996)，包括L19识别的表位，固定在Maxisorp免疫平板(Nunc，Roskilde，Denmark)上。为了在ELISA实验中检测D1.3抗体，将鸡卵清鸡溶菌酶(Sigma)固定在EIA平板NH2表面(Costar，Cambridge，MA)。根据厂商指导稀释的过氧化物酶缀合的兔抗人IgE(Pierce，Rockford，IL)用作二级抗体以检测SIP。在IgG1情况中使用过氧化物酶缀合的兔抗人IgG(Pierce)。对于含有标记序列FLAG的scFv而言，小鼠抗人FLAG单克隆抗体(M2，Kodak)和过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠抗体(Pierce)分别用作二级和三级抗体。在所有情况中，固定的抗原的免疫反应性使用过氧化物酶的底物ABTS(Roche)检测并测定在405nm的吸光度。
Superdex 200(Amersham Pharmacia)层析柱用于分析纯化的抗体在天然条件下的凝胶过滤模式，使用快速蛋白质液相层析(FPLC；AmershamPharmacia)进行。
如Castellani et al.(22 1994)所述对不同组织恒冷箱切片进行免疫组织化学测定，并根据Carnemolla et al.(17 1989)所述在还原和非还原条件下进行4-18％梯度SDS-PAGE。
动物和细胞系无胸腺裸鼠(8周龄nude/nude CD1雌性)得自Harlan Italy(Correzzana，Milano，Italy)，129(SvHsd克隆)品系小鼠(8-10周龄，雌性)得自Harlan UK(Oxon，England)。小鼠胚胎畸胎癌细胞(F9)，人黑素瘤衍生的细胞(SK-MEL-28)和小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)购自American TypeCulture Collection(Rockville，MD)。为诱导肿瘤，将裸鼠皮下注射16×106SK-MEL-28细胞，129品系小鼠注射3×106F9细胞。肿瘤体积使用如下公式计算(d)2xDx0.52，其中d和D分别是用测径器测定的肿瘤的短径和长径(cm)。根据国家关于用于科学研究目的的动物保护法(意大利法律no.116，27 January，1992)饲养、处理和处死动物。重组抗体的放射性碘标记蛋白质的放射性碘标记根据Chizzonite间接方法(36 Riske et al.，1991)，使用IODO-GEN预包被的碘标记管(Pierce)根据厂商指导结合Na125I(NEN Life Science Products，Boston，MA)。在报道的实验中，0.5mg蛋白质使用1.0mCi的Na125I。放射性标记的分子使用0.25％BSA预处理及于PBS中平衡的PD10(Amersham Pharmacia)柱从游离125I中分离。样品的放射性使用Crystalγ-计数器(Packard Instruments，Milano，Italy)测定。放射性标记的蛋白质的免疫反应性在用含有0.25％BSA的PBS饱和的200μl ED-B Sepharose柱上进行。已知量的放射性碘标记的抗体(200μl含有0.25％BSA的PBS)用于顶部并使其进入柱中。然后将该柱用1.5ml含有0.25％BSA的PBS漂洗以除去非特异性结合的抗体。最后，免疫反应性结合物使用1.5ml的0.1M TEA，pH11洗脱。计数未结合物和结合物的放射性，计算免疫反应性抗体的百分比。免疫反应性总是高于90％。
为进一步分析放射性碘标记的抗体，将已知量的200μl放射性标记的蛋白质装入Superdex 200柱。不同蛋白质的保留体积在放射性碘标记后不改变。对于三种放射性碘标记的L19抗体形式及其阴性对照，从Superdex 200柱回收的放射性为100％(图3A，3B和3C)。
生物分布实验为阻止125I在胃中的非特异性积聚及在甲状腺中的浓缩，在注射放射性标记的抗体之前30分钟为小鼠口服溶于水中的20mg高氯酸钠(CarloErba，Italy)。在生物分布实验期间间隔24小时重复一次该程序。携带肿瘤的小鼠在尾静脉注射含有0.1nmole的不同放射性标记的抗体(对于scFv相应于6μg，对于SIP相应于8μg，对于IgG相应于18μg)的100μl盐水。在每个时间点处死三只动物，切离包括肿瘤的不同器官，称重，在γ计数器中计数，然后用PBS，pH 7.4中5％甲醛固定，根据Tarli et al.(23 1999)所述进行微量放射自显影。
取血样制备血浆以确定放射性标记的分子在血流中的稳定性，使用已经描述的免疫反应性测试和凝胶过滤分析进行。在这两种情况中均使用200μl血浆。不同器官的放射性含量以注射的剂量/克的百分比(％ID/g)表示。放射性碘标记的抗体的血液清除参数使用最小二乘法拟合，这一拟合使用的是MacIntosh Program Kaleidagraph(Synergy Software，ReadingPA，USA)和等式X(t)＝A exp(-(αt))+B exp(-(βt))，其中X(t)是在时间t放射性标记的抗体的％ID/g。这个等式描述了双指数血液清除模式，其中α期的幅度定义为A×100/(A+B)，β消除期的幅度定义为B×100/(A+B)。α和β是关于相应的血液清除期的半衰期的速度参数。T1/2(α期)＝ln2/α＝0.692.../α，T1/2(β期)＝ln2/α＝0.692.../α。X(0)假定等于40％，相应于每只小鼠中2.5ml血液体积。
结果抗体制备利用L19不同抗体形式(scFv、小免疫球蛋白和完整的人IgG1)的可变区(13 Pini et al.，1998)及其在体内靶向肿瘤血管的性质。
图1示出用于表达不同的L19抗体形式的构建体。使用特异于非相关抗原的scFv的可变区制备相似的构建体(D1.3；7 McCafferty；26 Neri etal.，1997)。
为获得SIP和IgG1，将SP2/0鼠骨髓瘤细胞用图1所示构建体转染，使用G418选择稳定的转染瘤。最佳生产者通过ELISA确定，扩展这些克隆以进行抗体纯化。所有这三种L19抗体形式的纯化基于免疫亲和层析，使用与Sepharose缀合的重组ED-B进行。产量对于scFv(L19)为大约8mg/l，对于L19-SIP为10mg/l，对于L19-IgG1为3mg/l。对于对照蛋白，使用特异于鸡卵溶菌酶的scFv(D1.3)，并且使用scFv D1.3的可变区构建D1.3-SIP。这两种抗体在与Sepharose缀合的鸡卵溶菌酶上纯化。产量分别为8和5mg/l。作为L19-IgG1的对照，使用可商购的人IgG1/κ(Sigma)。
在还原和非还原条件下对三种纯化的L19形式进行SDS-PAGE分析。对于scFv(L19)，表观分子量正如所期望的在还原和非还原条件下均为大约28kDa(未示出)。L19-SIP示出在非还原条件下分子量接近80kDa，在还原条件下分子量为大约40kDa。结果表明95％以上的天然分子以共价连接的二聚体形式存在。L19-IgG1示出正如所期望的在非还原条件下主带为大约180kDa，而在还原条件下示出相应于大约55kDa的重链和大约28kDa的轻链的两条条带。通过大小排阻层析(Superdex 200)分析获得三种L19抗体形式的洗脱模式。在所有三种情况中，均检测到具有正常分布的代表98％以上的单峰。使用标准校准曲线，表观分子量对于scFv(L19)2为60kDa，对于L19-SIP为80kDa，对于L19-IgG1为180kDa。另外，通常存在于重组蛋白制品中并可以使在体内研究中获得的结果无效的分子聚集物经证明不存在。对纯化的对照蛋白质进行SDS-PAGE和大小排阻层析(Superdex 200)提供相似的结果。
使用这三种不同的L19抗体形式，对在裸鼠中诱导的SK-MEL-28人黑素瘤及在129品系小鼠中诱导的F9鼠畸胎癌的恒冷箱切片进行免疫组织化学分析。在低如0.25-0.5nM的浓度获得最佳结果。所有三种纯化的L19抗体识别相同的结构。
放射性标记的L19抗体形式的体内稳定性为进行体内生物分布研究，使用SK-MEL-28人黑素瘤和F9鼠畸胎癌。SK-MEL-28肿瘤具有相对缓慢的生长速度，而F9肿瘤生长迅速(图2)。因此，使用SK-MEL-28肿瘤使得能够进行长期实验(直至144小时)，而诱导F9肿瘤用于短期生物分布研究(直至48小时)。当肿瘤为大约0.1-0.3cm3时，进行所有生物学分布实验。为对比各种抗体形式，注射于100μl无菌盐水中的等摩尔量(0.1nmol)抗体。在注射之前，将放射性碘标记的化合物经0.22μm过滤，检测免疫反应性和凝胶过滤模式(见“材料和方法”)。放射性标记的蛋白质的免疫反应性总是超过90％。
图3A-C报道了放射性碘标记的L19抗体形式的凝胶过滤分析(Superdex 200)图示。
注射后在不同时间点从处理的动物取血样，针对免疫反应性并通过凝胶过滤层析分析血浆中存在的放射性。凝胶过滤图示出所有三种L19抗体形式均具有注射的蛋白质的分子量的单一主峰。只有scFv的图示显示具有更高分子量的另一个峰，提示聚集物形成(图3D-F)。此外，对于scFv(L19)2观测到非洗脱自Superdex200柱的大分子量聚集物的形成。事实上，当L19-SIP和L19-IgG从Superdex 200柱中回收均为所用得放射性的90-100％时，scFv(L19)2的被上样的放射性产率为大约55％。滞留的放射性仅在用0.5M NaOH洗涤层析柱后回收，表明大聚集物封闭在层析滤柱上(表1)。
表1还报道了对血浆进行的免疫反应性测试结果(见“材料和方法”)。在实验期间，L19-SIP和L19-IgG1在血浆中保持与起始试剂相同的免疫反应性。相反，在注射后3小时，血浆中scFv(L19)2的免疫反应性降低至少于40％。
对比生物分布实验表2a、b、c和图4报道了在携带SK-MEL-28肿瘤的小鼠中使用放射性标记的L19抗体的生物分布实验中获得的结果。
表2a、b、c示出在静脉内注射放射性标记的抗体后不同时间，组织和器官包括肿瘤的％ID/g平均值(±SD)。
图4示出了在实验的不同时间肿瘤(A)和血液(B)中不同抗体形式的％ID/g变化，以及肿瘤和血液中％ID/g之间的比值(C)。所有三种L19抗体形式均选择性积聚在肿瘤中，肿瘤与其它器官的％ID/g的比值在表3中报道。
如显微放射自显影术所表明，抗体仅积聚在肿瘤血管中，而不特异性积聚在正常器官的血管上。相反，在肿瘤或正常组织中未发现放射性碘标记的对照分子特异性积聚(表2a、b、c)。
所有这三种L19抗体形式均示出主要由肾脏介导的清除，通过计数尿液样品确定。正如所期望的，scFv(L19)2清除速度较快，完整的L19-IgG1较慢。双指数函数曲线拟合产生如表4报道的半衰期数值。
图5示出使用F9畸胎癌肿瘤模型用放射性碘标记的scFv(L19)2和L19-SIP获得的肿瘤和血液的％ID/g(±SD)的变化。由于F9畸胎癌的高度血管生成活性，因此在静脉内注射后3小时和6小时放射性分子在这个肿瘤中的积聚与在SK-MEL-28肿瘤中积聚相比高出3-4倍，并且在实验持续的48小时内持续较高。对于SK-MEL-28肿瘤，在肿瘤血管中的特异性积聚通过显微放射自显影术证实，在注射对照分子后未观测到特异性肿瘤积聚。表5报道了在F9肿瘤和其它器官中在注射后不同时间L19(scFv)和L19SIP的％ID/g。
还原的L19-SIP的合成向含有375μg(5nmol)L19-SIP的422μl PBS溶液中加入50μl TCEP-溶液(14.34mg TCEPxHCl/5ml Na2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)。将反应混合物在37℃轻轻摇动1小时。还原的L19-SIP使用NAP-5柱(Amersham，EluantPBS)通过凝胶层析纯化。分离的产物的SDS-PAGE分析证实了L19-SIP定量转化为还原的L19-SIP。
产率100.3μg/200μl PBS(26.7％)。
Tc-99m-L19-SIP的合成将3.0mg L-酒石酸-二钠置于瓶中，随后加入含有100.3μg还原的L19-SIP的200μl PBS，将溶液用100μlNa2HPO4-缓冲水溶液(1M，pH＝10.5)稀释。加入85μl Tc-99m发生器(generator)洗脱液(24小时)和10μl SnCl2-溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将反应混合物在37℃摇动0.5小时。Tc-99m标记的L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5层析柱(Amersham，洗脱剂PBS)进行。
放射性化学制品产率35.6％。
放射性化学制品纯度90.2％(SDS-PAGE)。
比活性26.4MBq/nmol。
免疫反应性91.4％。
Tc-99m-MAG2-L19-SIP羧甲基-t-丁基二硫化物的合成将含有21.75ml(0.312mol)1-巯基乙酸、43.5ml(0.312mol)三乙胺和100g(0.312mol)N-(叔丁基巯基)-N，N′-二-BOC-肼的1L EtOH(abs.)溶液回流(N2-气)加热60小时。EtOH在减压下蒸发至终体积为大约200ml。将剩余物倒入1.8L H2O中并将所得悬浮液的pH使用5摩尔NaOH调节为7.14。滤除二-BOC-肼并将所得溶液的pH使用半浓缩的HCl调节为2.2。用600ml CH2Cl2从水中提取三次粗提物。组合的有机层经过MgSO4干燥，溶剂在减压下蒸发，产生41.1g(80％)黄色油状物。该原料对于进一步合成是足够纯的。
N-(苄氧基羰基-Gly)Gly t-丁酯(Z-(N-Gly)Gly t-丁酯将于含有35.02g(114mmol)Z-Gly-O琥珀酰亚胺和15g(114mmol)Gly-O-tBu的1.4L CH2Cl2溶液在N2-气下在室温搅动20小时。将有机层用250ml 1％柠檬酸水溶液洗涤3次，用200ml半饱和的NaHCO3水溶液洗涤2次，及用200ml水洗涤1次。将有机层经过无水MgSO4干燥。在减压下蒸发CH2Cl2产生36.5g(99％)Z-Gly-Gly-O-tBu黄色油状物。该粗提物对于进一步合成是足够纯的。
Gly-Gly t-丁酯将36.5g(113mmol)Z-Gly-Gly-OtBu溶解于1L THF中，随后加入3.65g活性炭上的钯(10％)。将该混合物在H2气(1atm)下在室温搅动3小时。将悬浮液用N2净化、过滤(PTFE滤膜0.45μm)并将滤液在减压下浓缩产生20.3g(95％)Gly-Gly-O-tBu黄色油状物。该粗提物对于进一步合成是足够纯的。
羧甲基t-丁基二硫化甘氨酰甘氨酸t-丁酯将含有23.85g(115.6mmol)DCC的430ml CH2Cl2溶液滴加至含有21.76g(115.6mmol)Gly-Gly-O-tBu、20.84g(115.6mmol)羧甲基-t-丁基二硫化物和13.3g(115.6mmol)NHS的1L CH2Cl2溶液中。所得悬浮液在N2气下在室温搅动过夜。在过滤后，将所得溶液用400ml半饱和的NaHCO3水溶液洗涤3次，用400ml水洗涤1次。将干燥的有机层(MgSO4)在减压下蒸发。粗提物通过在硅胶上层析纯化，使用的溶剂梯度范围是CH2Cl2/MeOH 99∶1至CH2Cl2/MeOH 98.5∶1.5。分离26.1g(64％)黄色油状物。
巯基乙酰基甘氨酰甘氨酸将26.32g(75.09mmol)羧甲基-t-丁基二硫化甘氨酰甘氨酸t-丁酯在N2气下溶解于233ml TFA中。所得溶液在室温下搅动20分钟。在减压下(5-10×10-2mbar)蒸发TFA，所得油状物另外搅动2小时干燥(5-10×10-2mbar)。加入250ml Et2O后沉淀出白色粉末，将该悬浮液搅动3小时。滤出该产物并再悬浮于100ml Et2O中。所得悬浮液搅动过夜，滤出产物并将该物质在室温下减压干燥，产生20.46g(92.5％)白色粉末物。
巯基乙酰基甘氨酰甘氨酸NHS酯将巯基乙酰基甘氨酰甘氨酸(1g，3.4mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(391mg，3.4mmol)混和在干燥的圆底瓶中，并溶解于无水DMF(4ml)中。加入含有DCC(700mg，3.4mmol)的无水二氧六环(2ml)中，同时搅动该混合物。在15分钟内开始形成沉淀物(DCU)。1小时后，通过真空过滤移除沉淀物。将该沉淀物用冷却的二氧六环洗涤。从滤物中除去二氧六环。通过加入二乙醚将产物从剩余的DMF溶液中沉淀。过滤分离产物，用冷却的二乙醚洗涤并在真空干燥器中干燥。产率1.33(99％)。
Tc-99m-MAG2-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成将含有200μg(2.66nmol)非还原的L19-SIP的111μl PBS用300μl硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释并用200ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析两次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。加入50μl巯基乙酰基甘氨酰甘氨酸NHS酯溶液(0.50mg溶解于500μl磷酸盐缓冲液中，0.1M，pH 8.5)，将反应混合物在37℃加热3小时。将反应混合物用200ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，及透析1次17小时(过夜)，应用Slide-A-Lyzer10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。向瓶中加入3.0mg L-酒石酸-二钠，随后加入90μl Tc-99m发生器洗脱液(每日洗脱的)和25μl SnCl2溶液(5mg SnCl2/1ml 0.1M HCl)。将反应混合物在37℃摇动0.5小时。Tc-99m-标记的L19-SIP使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液PBS)通过凝胶层析纯化。
放射性化学制品产率55.1％。
放射性化学制品纯度94.5％(SDS-PAGE)。
比活性15.2MBq/nmol。
免疫反应性81.1％。
Re-188-L19-SIP的合成将3.0mg L-酒石酸-二钠置于瓶中，随后加入含有150μg还原的L19-SIP-SH的310μl PBS，将溶液用100μl Na2HPO4缓冲水溶液(1M，pH＝10.5)稀释。加入100μl Re-188发生器洗脱液和50μl SnCl2溶液(5mgSnCl2/1ml 0.1M HCl)。将反应混合物在37℃摇动1.5小时。Re-188标记的L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率34.8％放射性化学制品纯度97.2％(SDS-PAGE)比活性13.5MBq/nmol免疫活性91.7％用于EDTA、CDTA、TETA、DTPA、TTHA、HBED、DOTA、NOTA、DO3A、及相似类型螯合剂与半胱氨酸SH基团特异性结合的还原的L19-SIP的合成将50μl TCEP溶液(14.34mg TCEPxHCl/5ml Na2HPO4水溶液，0.1M，pH＝7.4)加入到含有375μg(5nmol)L19-SIP的422μl PBS溶液中。将反应混合物在37℃轻轻摇动1小时。还原的L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液乙酸钠缓冲液，0.1M，pH 5.0)进行。分离的产物的SDS-PAGE分析证实了L19-SIP定量转化为还原的L19-SIP。
产率105.7μg/200μl(28.2％)。
In-111-MX-DTPA-马来酰亚胺-S(Cys)-L19-SIP-R的合成(R＝还原的)将含有105μg(2.8nmol)还原的L19-SIP的200μl乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 5)与50μl溶解的1，4，7-三氮-2-(N-马来酰亚胺乙烯基p-氨基)苯甲基-1，7-双(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷(0.25mg DTPA-马来酰亚胺于500μl0.1M pH 5乙酸钠缓冲液中)在37℃反应3小时。将反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH6)透析2次，每次1小时，应用SlideA-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)并将反应混合物在37℃加热30分钟。
In-111标记的DTPA-马来酰亚胺-S(Cys)-L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率51.6％放射性化学制品纯度97.2％(SDS-PAGE)比活性7.9MBq/nmol免疫反应性88.5％MX-DTPA-马来酰亚胺(1，4，7-三氮-2-(N-马来酰亚胺乙烯基p-氨基)苯甲基-1，7-二(羧甲基)-4-羧甲基6-甲基庚烷)的合成将512mg(1mmol)的{[3-(4-氨基-苯基)-2-(双-羧甲基-氨基)-丙基]-[2-(双-羧甲基-氨基)-丙基]-氨基}-乙酸(Macrocyclics Inc.Dallas，TX，U.S.A.)和707mg(7mmol)三乙胺溶解于3ml无水DMF中。滴加入含有400mg(1.5mmol)的3-(2，5-二氧-2，5-二氢-吡咯-1-基)-丙酸2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯(Aldrich)的1ml无水DMF。将溶液在50℃搅动5小时。缓慢加入30ml二乙醚。将反应混合物进一步搅动30分钟。通过过滤收集沉淀。粗提物通过RP-HPLC(乙腈-∶水-∶三氟乙酸/3∶96.9∶0.1至99.9∶0∶0.1)纯化。产率61％(405mg，0.61mmol)。MS-ESI664＝M++1。
In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成将含有200μg(2.66nmol)非还原的L19-SIP的111μl PBS用300μl硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释，并用200ml硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。加入50μl的1，4，7-三氮-2-(p-异硫氰酸)苯甲基-1，7-双(羧甲基)-4-羧甲基-6-甲基庚烷(MX-DTPA)溶液(0.33mgMX-DTPA溶解于500μl硼酸钠缓冲液0.1M，pH 8.5)，并将反应混合物在37℃加热3小时。将反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析2次1小时及1次17小时(过夜)，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，1N，40MBq，Amersham Inc.)并将反应混合物在37℃加热30分钟。In-111标记的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率72.4％放射性化学制品纯度80.3％(SDS-PAGE)比活性8.8MBq/nmol免疫反应性77.5％In-111-DOTA-C-苯甲基-p-NCS-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成将含有200μg(2.66nmol)非还原的L19-SIP的108μl PBS用300μl硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释，并用200ml硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。向溶液中加入50μl 1，4，7，10-四氮-2-(p-异硫氰酸)苯甲基环十二烷-1，4，7，10-四乙酸(苯甲基-p-SCN-DOTA，Macrocyclics Inc.，Dallas TX，U.S.A.)溶液(1.5mg苯甲基-p-SCN-DOTA溶解于5ml硼酸钠缓冲液，0.1M，pH 8.5中)，并将反应混合物在37℃加热3小时。将反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小时，及透析1次17小时(过夜)，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入80μl[In-111]InCl3溶液(HCl，IN，40MBq，Amersham Inc.)，将反应混合物在37℃加热30分钟。In-111标记的DOTA-C-苯甲基-p-NCS-ε-HN(Lys)-L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率70.8％放射性化学制品纯度92.1％(SDS-PAGE)比活性10.1MBq/nmol免疫反应性75.1％
Y-88-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L1 9-SIP的合成将含有200μg(2.66nmol)非还原的L19-SIP的110μl PBS用300μl硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)稀释，并用200ml硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。加入50μl的MX-DTPA溶液(0.33mgMX-DTPA溶解于500μl硼酸钠缓冲液，0.1M，pH 8.5)，将反应混合物在37℃加热3小时。将反应混合物用200ml乙酸钠(0.1M，pH 6.0)缓冲液透析2次，每次1小时，及透析1次17小时(过夜)，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入100μl[Y-88]YCl3溶液(HCl，1N，75MBq，Oak Ridge NationalLab.)并将反应混合物在37℃加热30分钟。Y-88标记的MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率68.1％放射性化学制品纯度91.5％(SDS-PAGE)比活性11.4MBq/nmol免疫反应性70.5％Lu-177-DOTA-C-苯甲基-p-NCS-ε-HN(Lys)-L19-SIP的合成将含有200μg(2.66nmol)非还原的L19-SIP的120μl PBS用300μl硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)溶解，并用200ml硼酸钠缓冲液(0.1M，pH 8.5)透析2次，每次1小时，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。加入50μl苯甲基-p-SCN-DOTA溶液(1.5mg溶解于5ml硼酸钠缓冲液0.1M，pH 8.5中)，将反应混合物在37℃加热3小时。将反应混合物用200ml乙酸钠缓冲液(0.1M，pH 6.0)透析2次，每次1小时，及透析1次17小时(过夜)，应用Slide-A-Lyzer 10,000MWCO(Pierce Inc.，Rockford，IL，U.S.A.)进行。
加入200μl[Lu-177]LuCl3溶液(HCl，1N，80MBq，NRH-Petten，Netherlands)，将反应混合物在37℃加热30分钟。Lu-177标记的DOTA-C-苯甲基-p-NCS-E-HN(Lys)L19-SIP通过凝胶层析纯化，使用NAP-5柱(Amersham，洗脱液PBS)进行。
放射性化学制品产率72.2％放射性化学制品纯度94.9％(SDS-PAGE)比活性18.3MBq/nmol免疫反应性73.4％In-111-MX-DTPA-L19-SIP在单次静脉内注射进携带肿瘤的裸鼠后的器官分布和排泄将本发明的标记的肽以大约37kBq剂量静脉内注射进携带F9(畸胎癌)的动物中(体重大约25g)。在给予所述物质后在各个时间各个器官中的放射性及在排泄物中的放射性使用γ计数器测定。
In-111-MX-DTPA-L19-SIP在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中的生物分布(平均值±SD，3只动物)示于表6。
Tc-99m-L19-SIP在单次注射进携带肿瘤的裸鼠后的器官分布和排泄将标记的肽以大约56kBq的剂量静脉内注射进携带F9(畸胎癌)的动物(体重为大约25g)。给予所述物质后在不同时间各个器官中的放射性浓度及排泄物中的放射性使用γ计数器测定。另外，基于肿瘤和血液中肽的浓度，在不同时间建立肿瘤血液比。
Tc-99m-L19-SIP在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中的生物分布(平均值±SD，3只动物)示于表7。
在携带F9(畸胎癌)的裸鼠中Tc-99m-L19-SIP的肿瘤血液比(平均值±SD，3只动物)示于表8。
放射性标记的肽在动物实验中被证实具有有利的性质。例如，Tc-99m-L19-SIP和In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP在注射(p.i.)后1小时显示17.2(Tc-99m)或12.9(In-111)％注射剂量/g(ID/g)的高肿瘤积聚力。在p.i.注射后24小时观测到9.4(Tc-99m)或13.0(In-111)％ID/g的显著肿瘤滞留。因此，肿瘤摄取显著高于其它已知In-111或Tc-99m标记的抗体片段(例如Kobayashi et al.，J.Nuc.Med.，Vol.41(4)，pp.755-762，2000；Verhaar et al.，J.Nuc.Med.，Vol.37(5)，pp.868-872，1996)。在注射后24小时，化合物的血液清除分别产生13∶1和6∶1的肿瘤/血液比。
最显著地，在p.i.注射后24小时，与例如Kobayashi等所述的其他高滞留的(120％ID/g)In-111标记的重组抗体片段相比，In-111-MX-DTPA-ε-HN(Lys)-L19-SIP显示明显较低的肾摄取和滞留(22.5％ID/g)。肾滞留是非常普遍的问题，通常妨碍镧系元素标记的化合物在放疗中的应用。
实验结果表明本发明描述的放射免疫缀合物用于诊断和治疗应用的极佳潜力，优选通过非肠道给予应用于患者。
讨论观测到胞毒性抗癌药物更有效地定位于正常组织而非肿瘤(37Bosslet et al.，1998)，这促使人们开始进行药物选择性送递至肿瘤的可能性研究。然而，肿瘤的有效靶向具有两个主要要求1)肿瘤内对来自血流的配体分子的特异性、丰富的、稳定的及易于获得的靶位，及2)具有合适的药代动力学性质的配体分子，其可易于从血流中扩散至肿瘤，并且具有与靶位的高度亲和性以保证其有效及选择性积聚在肿瘤中。
由于其与众不同的特点，肿瘤微环境是一个可能的泛肿瘤(pan-tumoral)靶位。事实上，肿瘤进展诱导(及随后需要)肿瘤微环境成分的显著更改，特别是胞外基质(ECM)的那些成分。构成实体瘤的ECM的分子在数量上和质量上均不同于正常ECM的那些分子。另外，许多这些肿瘤ECM成分是所有实体瘤共有的，是导致一般性质和功能如细胞侵润(正常细胞侵润进肿瘤组织及癌细胞侵润进正常组织)和血管发生的原因。在组成修饰的肿瘤ECM的众多分子中，本发明人注意力集中在含有ED-B结构域的FN同种型(B-FN上。
B-FN在迄今为止测试的所有实体瘤的ECM中广泛表达，并且与血管发生过程持续相关(22 Castellani et al.，1994)，但在正常成体组织中不可检测(17 Camemolla et al.，1989)。治疗剂定向送递至内皮下ECM克服了与实体瘤的间隙高压相关的问题(38 Jain et al.1988；39 Jain，1997；40Jain RK，1999)。
L19(13 Pini et al.1998；25 Viti，Canc.Res.，23 Tarli，et al.，1999)，一种与FN的ED-B结构域具有高亲和性(Kd＝5.4×10-11M)的scFv，其在体内选择性并有效地积聚在肿瘤新血管周围，并且能将与其缀合的任何治疗分子选择性转运至肿瘤并在其中聚集(28 Birchler et al.，1999；29Nilsson，et al.，2001；30 Halin et al.2002；31 Carnemolla et al.，2002)。L19选择性靶向肿瘤的能力使用闪烁扫描技术已经在患者中证实。
本说明书报道了用放射性同位素对小免疫蛋白(SIP)的标记、放射性标记的SIP的应用、及三种不同的L19人抗体形式的肿瘤血管靶向效力及药物动力学性质，所述三种不同L19人抗体形式是scFv、小免疫球蛋白/小免疫蛋白和完整的人IgG1。
SIP分子通过融合scFv(L19)与人IgE的分泌同种型S2的εCH4结构域而获得。所述εCH4是使得IgE分子二聚体化的结构域，所述S2同种型在COOH末端含有半胱氨酸，其通过链间二硫键共价地稳定所述二聚体(35 Batista et al.，1996)。FcεRI的IgE结合位点位于CH3结构域中(41Turner and Kinet，1999；42 Vangelista et al.，1999；43 Garman et al.，2000)，因此根据本发明的实施方案，与εCH4结构域融合的scFv不激活导致超敏反应的任何信号产生。
这三种形式在小鼠的两种不同肿瘤模型(鼠F9畸胎癌和人SK-MEL-28黑素瘤)中的表现已经进行了研究。F9畸胎癌是一种快速生长的肿瘤，一旦植入则在大约2周的时间内杀死动物。另一方面，SK-MEL-28肿瘤呈现双相生长曲线，早期快速生长相，随后是第二个较慢生长相。先前已经示出F9畸胎癌中ED-B的量在肿瘤生长期间保持稳定(23Tarli，et al.，1999)；相反，ED-B积聚在SK-MEL-28黑素瘤中，与肿瘤生长能力成正比(23 Tarli et al.，1999)，在第一相中发现丰富的ED-B，而在第二相中量较少。SK-MEL-28黑素瘤的应用使得可以长期研究生物分布情况，而没有可引起错误判断结果的肿瘤块明显改变(图2)。
三种L19抗体形式在体内的稳定性的对比研究示出L19-SIP和L19-IgG1在实验期间(144小时)在血浆中保持与注射前相同的免疫反应性和分子量。相反，scFv(L19)在血浆中迅速丧失其免疫反应性，并产生太大以至于不能进入凝胶过滤层析柱的聚集体。scFv的这种聚集很可能与肿瘤与肺的％ID/g比相关，因为聚集体可积聚在肺的微血管中(表3)。对于所有三种形式，血液清除主要通过肾脏介导，显示出表4报道的具有α和β相的双相曲线，其与分子大小成反比。
不同抗体形式在所研究的肿瘤中的积聚是分子的清除率和体内稳定性的结果。使用scFv，在注射放射性标记的抗体后3小时观测到注射剂量/g百分比(％ID/g)的最大值，然后迅速降低。使用SIP，肿瘤中％ID/g比scFv的％ID/g高2-5倍，在注射后4-6小时达到最大值。这种模式在F9和SK-MEL-28肿瘤中均观测到。相反，IgG1在肿瘤中的积聚在实验期间持续增加。然而，由于其缓慢清除，在144小时后％ID/g的肿瘤血液比仅为大约3，对比之下在相同时间后scFv的比值为10，SIP的比值为70(图4)。
本发明研究的三种抗体形式示出的体内稳定性、清除和肿瘤靶向性能的同样独特性质可用于不同的诊断和/或治疗目的，根据临床需要和疾病情况而定。例如，在注射后瞬即示出良好的肿瘤-器官和肿瘤-血液比的放射性标记的抗体是体内诊断性免疫闪烁扫描术所必需的，主要是因为这种分析中使用的同位素半衰期短。
使用抗体作为治疗剂的载体可以有不同的方法送递物质，在达到其靶位(例如仅在靶位上激活的光敏剂)后展示其治疗作用，为此与送递至肿瘤的绝对量相关；送递物质，在达到其靶位(例如β发射体Yttrium-90)之前发挥其治疗和毒性作用，为此必须特别注意作为时间的函数的肿瘤与血液积聚曲线下的面积比，以使得全身毒性最小化及抗肿瘤治疗作用最大化。
例如，L19-SIP似乎提供分子稳定性、清除率和肿瘤积聚的最佳协调。已经描述了由与一个二聚体化结构域结合的scFv抗体片段组成的相似的融合蛋白(44 Hu et al，1996；33 Li et al.，1997)，但在两种情况中均使用人γ1CH3作为二聚体化结构域。人εS2CH4结构域的使用提供了一种获得二聚体共价稳定的简易方式。另外，由C末端半胱氨酸残基形成的二硫键可易于在足够温和的条件下还原以保护分子的整体结构，因此提供了易于接触的进行放射性标记或化学缀合的反应基团。这个特征似乎特别具有临床应用潜力。
L19-IgG1在肿瘤中大量积聚，尽管这种积聚被缓慢的血液清除率抵消，但是所述除去循环抗体的三个步骤的程序不仅可用于治疗目的，也可以用于诊断性免疫闪烁扫描术(45 Magnani et al.2000)。
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表1.在静脉内注射后不同时间点放射性标记的抗体的免疫反应性(I*)和从superdex200的放射性回收率(R)
如“材料和方法”所述的测定了血浆中的免疫反应性(％)和从Superdex200的放射性回收率(％)。
*为标准化，免疫反应性测定结果指的是静脉内注射前的免疫反应性的百分比数值。
Nd未测定表2a.在携带SK-MEL-28肿瘤的小鼠中放射性标记的L19和D1.3抗体片段的生物分布实验L19(scFv)
D1.3(scFv)
结果表示为每克组织抗体注射剂量的百分比(％ID/g)±SDnd未测定表2b.在携带SK-MEL-28肿瘤的小鼠中放射性标记的L19-SIP和D1.3-SIP的生物分布试验L19 SIP
D1.3 SIP
结果表示为每克组织抗体注射剂量的百分比(％ID/g)±SDnd未测定表2c.在携带SK-MEL-28肿瘤的小鼠中放射性标记的L19-IgG1和hIgG1κ的生物分布试验L19 IgG1
hIgG1κ
结果表示为每克组织抗体注射剂量的百分比(％ID/g)±SDnd未测定表3.在携带SK-MEL-28肿瘤的小鼠中放射性标记的L19抗体形式的％ID/g的肿瘤-器官比
表4.三种L19抗体形式的血液清除的动力学参数
a)两个半衰期部分的相对数量表5.在携带F9肿瘤的小鼠中放射性标记的L19(scFv)和L19SIP的生物分布试验L19(scFv)
L19 SIP
结果表示为每克组织抗体注射剂量的百分比(％ID/g)±SDnd未测定表6
表7
表8
序列表<110>菲洛根股份公司舍林股份公司<120>使用放射性标记的抗纤连蛋白ED-B的抗体L19靶向肿瘤血管<130>SMWFP6177075<140>EP 03255633.4<141>2003-09-10<140>US 60/501,881<141>2003-09-10<150>
<151>
<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Ser Phe Ser Met Ser1 5<210>2<211>17<212>PRT
<213>Homo sapiens<400>2Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly<210>3<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr1 5<210>4<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala1 5 10<210>5<211>7<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5
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权利要求
1.一种结合人ED-B的特异性结合构件，其中所述特异性结合构件用选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的同位素标记，并且包含一种抗原结合位点，所述抗原结合位点包含抗体VH结构域和抗体VL结构域，其中所述抗体VH结构域选自由L19VH结构域和包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH结构域组成的一组，其中所述VH CDR3是SEQ ID NO3所示的L19VH CDR3，所述VH CDR1任选地是SEQ ID NO1所示的L19VH CDR1，所述VH CDR2任选地是SEQ ID NO2所示的L19VH CDR2；其中所述抗体VL结构域任选地选自由L19VL结构域及包含VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL结构域组成的一组，其中所述VL CDR3是SEQ ID NO6所示的L19VL CDR3，所述VL CDR1任选地是SEQ IDNO4所示的L19VL CDR1，所述VL CDR2任选地是SEQ ID NO5所示的L19VL CDR2；所述L19VH结构域和所述L19VL结构域序列在Pini et al.(1998)J.Biol.Chem.27321769-21776中公开；其中所述特异性结合构件包含一种小免疫球蛋白，所述小免疫球蛋白包含与εS2-CH4融合并二聚体化的所述抗体VH结构域和抗体VL结构域，或者所述特异性结合构件包含一种完整的IgG1抗体分子。
2.权利要求1的特异性结合构件，其包含一种抗体VH结构域，所述抗体VH结构域包含具有SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ IDNO3所示氨基酸序列的VH CDR，所述特异性结合构件与一种包含L19VH结构域和L19VL结构域的抗体的ED-B结合结构域竞争结合ED-B。
3.权利要求1或2的特异性结合构件，其包含L19VH结构域。
4.权利要求3的特异性结合构件，其包含L19VL结构域。
5.前述任一项权利要求的特异性结合构件，其是包含εS2-CH4的小免疫球蛋白。
6.权利要求5的特异性结合构件，其中所述抗体VH结构域和抗体VL结构域处于与εS2-CH4融合的scFv抗体分子内。
7.权利要求6的特异性结合构件，其中所述scFv抗体分子通过接头肽与εS2-CH4融合。
8.权利要求7的特异性结合构件，其中所述接头肽具有氨基酸序列GGSG(SEQ ID NO7)。
9.权利要求1-4任一项的特异性结合构件，其包含一种完整的IgG1抗体分子。
10.权利要求1-9任一项的特异性结合构件，其中所述同位素是131I。
11.一种产生权利要求1-10任一项的特异性结合构件的方法，所述方法包括用选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的同位素标记一种特异性结合构件。
12.权利要求11的方法，其中所述标记包括在所述特异性结合构件存在下氧化选自由76Br-、77Br-、123I-、124I-、131I-和211At-组成的一组的卤化物。
13.权利要求11的方法，其中所述标记包括将含有选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的一种放射性同位素的激活的双功能卤素载体与所述特异性结合构件的赖氨酸或半胱氨酸残基缀合或者与其N末端缀合。
14.权利要求11-13任一项的方法，其中所述方法包括在标记之前表达编码所述特异性结合构件的核酸。
15.权利要求14的方法，包括在产生所述特异性结合构件的条件下培养宿主细胞。
16.权利要求11-15任一项的方法，进一步包括分离和/或纯化所述特异性结合构件。
17.权利要求11-16任一项的方法，进一步包括将所述特异性结合构件配制为包括至少一种其它成分的组合物。
18.权利要求11-17任一项的方法，进一步包括将所述特异性结合构件与ED-B或ED-B的片段结合。
19.一种包括将权利要求1-10任一项的结合ED-B的特异性结合构件与ED-B或ED-B的片段结合的方法。
20.权利要求18或19的方法，其中所述结合在体外发生。
21.权利要求18-20任一项的方法，包括确定特异性结合构件与ED-B或ED-B的片段结合的量。
22.一种包含权利要求1-10任一项的特异性结合构件的组合物，其用于治疗人体或动物体的治疗方法中。
23.权利要求22的组合物，其用于治疗病理性血管发生的损害的方法中。
24.权利要求22的组合物，其用于治疗肿瘤的方法中。
25.权利要求1-10任一项的组合物，其用于诊断方法中。
26.权利要求1-10任一项的特异性结合构件在生产治疗病理性血管发生的损害的药物中的应用。
27.权利要求1-10任一项的特异性结合构件在生产治疗肿瘤的药物中的应用。
28.权利要求1-10任一项的特异性结合构件在生产诊断试剂中的应用。
全文摘要
一种结合人ED－B的特异性结合构件，其中所述特异性结合构件用选自由76Br、77Br、123I、124I、131I和211At组成的一组的同位素标记，并且包含一种抗原结合位点，所述抗原结合位点包含抗体VH结构域和抗体VL结构域，其中所述抗体VH结构域选自由L19 VH结构域和包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH结构域组成的一组，其中所述VH CDR3是SEQ ID NO3所示的L19 VH CDR3，所述VH CDR1任选地是SEQ ID NO1所示的L19 VH CDR1，所述VH CDR2任选地是SEQ ID NO2所示的L19 VH CDR2；其中所述抗体VL结构域任选地选自由L19 VL结构域及包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3的VL结构域组成的一组，其中所述VL CDR3是SEQ ID NO6所示的L19 VL CDR3，所述VL CDR1任选地是SEQ ID NO4所示的L19 VL CDR1，所述VL CDR2任选地是SEQ ID NO5所示的L19 VL CDR2；所述L19 VH结构域和所述L19 VL结构域序列在Pini et a1.(1998)J.Biol.Chem.27321769－21776中公开；其中所述特异性结合构件包含一种小免疫球蛋白(mini－immunoglobulin)，所述小免疫球蛋白包含与eS2－CH4融合并二聚体化的所述抗体VH结构域和抗体VL结构域，或者所述特异性结合构件包含一种完整的IgG1抗体分子；本发明还提供了应用这种特异性结合构件的方法和用途。
文档编号A61P35/00GK1849144SQ200480026048
公开日2006年10月18日 申请日期2004年9月1日 优先权日2003年9月10日
发明者劳拉·博尔西, 芭芭拉·卡尔内莫拉, 恩里卡·巴尔扎, 帕特里齐亚·卡斯泰拉尼, 卢恰诺·扎尔迪, 马蒂亚斯·弗里贝, 克里斯托夫-斯特凡·希尔格 申请人:菲洛根股份公司, 舍林股份公司