专利名称：抗微生物的光动力治疗化合物的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及光动力治疗领域，尤其是光动力治疗在选择性消灭人类和动物患者体内细菌中的应用。
2.现有技术的公开光动力治疗(PDT)是众所周知的，并且已被用于对抗大量通常与过度增生组织相关的疾病，诸如癌症和多种皮肤疾病。PDT也已经被用作抗微生物治疗。然而，目前存在两个与抗微生物PDT有关的主要问题。第一个问题源于难以发现可有效对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌二者的光活物质。革兰氏阴性细菌主要由于其双层外膜结构存在非常坚韧的屏障。
革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间的主要差异在于细胞壁，如图1和2所示。如图1所示，革兰氏阳性细胞具有较厚的肽聚糖细胞壁101，由许多单独的包围细胞膜105的肽聚糖层103(例如，20-40层)组成。相比之下，如图2所示，革兰氏阴性细胞只具有包围细胞膜203的薄层肽聚糖201，其还被附加的外膜205包围。这个附加层可以使革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌利用革兰氏染色法进行区分。由于革兰氏阴性细菌的外膜，结晶紫-碘染色剂不能到达细胞壁的肽聚糖层并且在革兰氏染菌法后不能象革兰氏阳性细菌一样被保留在革兰氏阴性细菌中。外膜主要负责抑制许多物质渗透进入革兰氏阴性细菌，并且是难以发现有效抗这两种类型细菌的光敏剂的原因所在。
第二问题源于难以发现在诸如血清，血液或者唾液的复合物介质存在下至少保留一些活性的合适的光敏化合物。大多数显示出抗诸如磷酸盐缓冲盐水的贫瘠介质中的细胞悬浮液的良好活性的光敏化合物(光敏剂)在血清，血液或者唾液存在下实际上无效果。这是因为这些复合物介质(例如，蛋白，血细胞)中的组分与细菌竞争PDT化合物的亲合性。
番红O是在450-600nm的蓝绿波长范围内有吸收的红色染料。在诸如显微摄影术的方法中用作生物染色剂。例如，番红O使核，染色体，木质化以及角化的细胞壁染成红色。其也与革兰氏染色用的碘连用以区分细菌，并用于电子显微术。番红产品也被用在用于显示灭菌技术中包括时间，压力，能量的条件，或者某些化学试剂存在与否的油墨组合物(ink compositions)(美国专利5,990,199)。
番红O，番红以及相关染料已被用于检测以及处理牙齿和齿龈上以及周围的微生物和孔洞的牙周治疗。美国专利6,337,357公开了一种包含水，水混溶的溶剂或者组合，能够对牙齿的龋齿感染部分染色的染料以及抗微生物剂的抗微生物的龋齿检测组合物。这既是孔洞检测也是孔洞杀菌系统。可以使用诸如番红O的染料，其是溶于溶剂并且能够目测显示孔洞的存在以及位置的合适染料。对于此发明，番红仅仅被用作着色剂并且不被考虑作为抗微生物剂。
番红也被用作抗微生物PDT敷剂中的光敏剂。美国专利6,558,653(以及美国专利申请2003/0059379)描述了一种PDT的方法以及用于消灭牙齿上的坏死组织以及细菌的光敏化合物。本方法包括施加诸如吸收450以及600nm之间波长的光能的番红的染料成分。该染料接触坏死组织，细菌以及周围组织对组织进行选择性染色。因此染色的感染组织很容易吸收施加的辐射并且热消灭染病的组织以及细菌。本发明限于利用光热效应处理牙周袋中的表面细菌。
番红O的光活特性已经被用于其它的敷剂中，诸如杀虫以及非人类抗微生物处理剂以及组合物。美国专利5,798,112描述了诸如番红O的光活染料在光毒性杀虫组合物中的应用。该组合物包含所选择的光活染料，引诱物以及佐剂。该化合物由所需的昆虫摄取，借此佐剂与光活染料以及昆虫膜相互作用以改变组合物的毒性，从而在曝光一段时间以后杀死昆虫。美国专利6,506,791公开了处理鱼中原生动物感染的方法。包括番红O的光活染料被引入包含感染的鱼的水相环境，使得光活染料的浓度足以杀死一些或者所有的细菌。
目前需要一种抗微生物PDT的方法以及在诸如血清，血液或者唾液的复合物介质存在下有效的化合物。这种方法应该被有效地用于抗革兰氏阳性以及革兰氏阴性细菌。本发明满足了这些需要。
发明目的以及概述本发明的一个目的是提供有效并且选择性消灭人类或者动物受试者体内有害微生物，尤其是细菌的方法。
本发明的另一目的是提供可由电磁辐射控制并且选择性活化的抗细菌的方法。
本发明的另一目的是提供有效消灭革兰氏阳性以及革兰氏阴性细菌的方法。
简而言之，本发明提供了利用番红精O连同电磁辐射消灭体内微生物尤其是细菌的方法以及组合物。在优选的方法中，包括番红O的组合物被引入处理区域。经过足够的时间后，将合适波长的辐射施加到该区域活化番红O并且通过光动力反应消灭细菌。优选的辐射具有大约530nm的波长。这种方法可有效消灭革兰氏阳性以及革兰氏阴性细菌，并且可尤其有效用于也存在诸如血清，血液或者唾液的复合物介质的区域。
本发明的上述及其他目的，特征以及优点将通过下列描述连同附图而显而易见。
图1-革兰氏阳性细菌细胞的细胞外膜的剖视图。
图2-革兰氏阴性细菌细胞的细胞外膜的剖视图。
图3-显示由番红O光动力灭活金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)DSM1104的图。
图4-显示由番红O光动力灭活铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)DSM1117的图。
图5-显示由番红O光动力灭活大肠杆菌DSM8698的图。
优选实施方案的详细描述因为现有技术方法以及化合物中存在的难点，尤其是提供消灭革兰氏阳性以及革兰氏阴性细菌以及避免诸如血清，血液或者唾液的复合物介质的有害效应的方法中的难点，需要发现克服这些缺点的化合物。令人惊讶地，人们发现番红O可连同电磁辐射被用于有效消灭革兰氏阳性以及革兰氏阴性微生物。另一个优点是复合组分的介质(例如血清，血液或者唾液)的存在并不中和靶细菌中番红O的效果，而通常中和其它光敏剂的效果。因此番红O是本发明有效抗细菌处理的一部分。包括番红精O的抗细菌PDT组合物也是本发明的一部分。
在优选实施方案中，抗菌处理包含3个常规步骤。第一步是向包含细菌的环境中引入番红O组合物。第二步是经过足够的时间段以使番红精O渗入处理区域中的细菌细胞或者至少结合在其细胞外膜的组分上。最后的步骤是施加合适波长的辐射通过活化引起导致细菌消灭的活性氧以及自由基产生的番红O启动光动力机制。
施加番红O组合物以及辐射之间的优选时间段是可变的，并且将取决于诸如待处理细菌的类型，待处理的身体区域以及引入番红O组合物的方法的因素而改变。通常，这个时间段为至少15分钟。对于处理体内细菌感染而言，该组合物可被注入血流中用于系统施用，或者如果感染限于特定区域进行局部注射。对于皮肤上或者接近皮肤的感染，该组合物可以为用于体表施用的溶液，乳油，凝胶或者洗剂的剂型。
预定的时间段后，将辐射施用于处理位点以活化番红O并消灭细菌。活化辐射的优选波长在500nm和580nm之间，并且更优选大约530nm。辐射可以是诸如来自灯的非相干辐射或者相干的激光辐射。对于表面或者皮下处理而言，灯可以有效辐射特定的感染区域，而对于体内较深的感染区域，包括一或者多条光纤，可能还包含漫射器或者其它辐射某一体内区域所需的装置的光纤设备优选将激光辐射递送到那些体内区域。优选的激光源是二极管泵激的532nm激光器。
本发明通过下列实施例进行进一步的描述，但并不限于此。
实施例1由番红O光动力灭活细菌细胞悬浮液几个研究已经显示革兰氏阳性细菌(例如，金黄色葡萄球菌)对光动力灭活尤其敏感，而革兰氏阴性细菌(例如，大肠杆菌，铜绿假单胞菌)对许多通常应用的光敏剂更具显著耐受性。而且，我们发现较复杂的介质(例如，血液，血浆，血清，唾液)中的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞更能免于光动力学作用。
用于本研究中的生物体是创口微生物群的3个成员金黄色葡萄球菌DSM1104(ATCC 25923)，革兰氏阳性；大肠杆菌DSM 8698，革兰氏阴性；铜绿假单胞菌DSM1117(ATCC 27853)，革兰氏阴性。所有的菌株在37℃需氧过夜培养在胰酶大豆肉汤(Merck KGaA Darmstadt，Germany)中。经离心收集细胞并分别再悬浮在无菌磷酸缓冲盐水(PBS)或者补充有10％无菌马血清(Oxoid)，10％人血浆或者10％人血液(均新鲜获自供体)的无菌PBS中。所有情况下，600nm，1cm的最终OD(光密度)均为0.03。
将等分试样(190μl)的细菌悬液置入具有透明底部的无菌黑色96孔板(Costar3603，Coming Inc.，USA)中。添加10μl的3种不同的番红O储液以分别获得10μM，100μM以及1mM的光敏剂终浓度。在黑暗室温下对板温育30分钟。
培养后，将样品暴露于来自532nm，设定到0.5W功率，经来自板底部的光纤辐射85s的激光器Ceralas G2(biolitec AG，Germany)的射线。这些设置的流量率为约1.2W/cm2(由来自德国Puchheim的Optometer P-9710，Gigahertz-Optik GmbH测定)。随着辐射时间的延长，产生的能量流量为约100J/cm2。
对照微孔不含番红O并且不暴露于激光。为了获得黑暗毒性的对照样品只暴露于番红O(终浓度1mM)，不伴随任何照明。
照明后，从微板孔除去样品，用胰酶大豆肉汤稀释并且通过利用螺旋涂板器Eddy Jet(iul Instruments，巴塞罗那，西班牙)在胰酶大豆琼脂板上涂板。通过利用菌落计数器Countermat Flash(iul Instruments，巴塞罗那，西班牙)在充分培养后对集落形成单位(CFU/ml)的数目进行计数。
实验的结果显示在图3，4和5中我们发现在革兰氏阳性金黄色葡萄球菌细胞的PBS和更复杂介质(PBS+10％马血清，PBS+10％人血浆；参见图4)的悬浮液的情况下通过利用番红O的PDT处理获得良好的杀伤效果。而且在存在血清或者血浆的处理悬液中也充分杀伤了革兰氏阴性铜绿假单胞菌和大肠杆菌细胞的细胞悬液(分别参见图4和5)。
已经参考附图描述了本发明的优选实施方案，应该理解本发明并不局限于确切的实施方案，本领域技术人员在不背离本发明的附属权利要求限定的范围或者精神的情况下可以对其进行多种改变和修改。
权利要求
1.一种消灭患者处理区域中细菌的方法，包括如下步骤a.向患者的处理区域引入包含番红O作为光敏剂的组合物；b.经过预置的时间段以使所述番红O与所述处理区域中的细菌结合；以及c.向所述处理区域施加预选定波长的辐射以活化所述番红O并由此刺激光动力反应从而消灭所述细菌。
2.根据权利要求1的消灭细菌的方法，其中所述预选定的波长在约500nm和约580nm之间。
3.根据权利要求2的消灭细菌的方法，其中所述预选定的波长为约530nm。
4.根据权利要求1的消灭细菌的方法，其中所述处理区域包含复合物介质，并且其中所述复合物介质选自血清，血液和唾液。
5.根据权利要求1的消灭细菌的方法，其中所述引入步骤选自系统施用，局部施用以及体表施用。
6.根据权利要求5的消灭细菌的方法，其中所述系统施用为静脉注射。
7.根据权利要求5的消灭细菌的方法，其中所述局部施用为局部注射入无血管组织。
8.根据权利要求5的消灭细菌的方法，其中用于体表施用的所述组合物为选自溶液，乳油，凝胶和洗剂的剂型。
9.根据权利要求1的消灭细菌的方法，其中所述预置时间为至少约15分钟。
10.根据权利要求1的消灭细菌的方法，其中所述辐射由选自非相干灯以及相干激光器的辐射源提供。
11.根据权利要求1的消灭细菌的方法，其中所述施加辐射的步骤由至少一条与辐射源耦合的光纤实现。
12.一种抗微生物的光动力治疗组合物，包括作为用于光动力治疗的活化光敏剂组分的番红O。
全文摘要
本发明公开了一种利用番红O连同电磁辐射用于消灭体内微生物，特别是细菌的方法和组合物。在优选的方法中，包括番红O的组合物被引入处理区域。经过充分的时间段后，将合适波长的辐射施加于该区域活化番红O并通过光动力反应消灭细菌。优选的辐射具备大约530nm的波长。这种方法可有效消灭革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，并且尤其对也存在复合物介质诸如血清，血液或者唾液的区域有效。
文档编号A61P31/00GK1863533SQ200480028934
公开日2006年11月15日 申请日期2004年8月30日 优先权日2003年9月2日
发明者福尔克尔·阿尔布雷希特, 布克哈德·吉特 申请人:塞拉莫普泰克工业公司