专利名称：一种诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液及制备方法
技术领域：
本发明涉及鼠肺鳞癌模型的致癌领域，更具体涉及一种诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，主要应用于大鼠肺鳞癌模型的制作，适用于抗肺癌新药的筛选、疗效检测、药理及毒副作用等方面的研究，同时还涉及致癌质混悬液的制备方法。
背景技术：
肺癌是严重危害人类生命的常见恶性肿瘤之一，近年来其发病率及死亡率均呈上升趋势，尽管过去数十年里对肺癌的研究取得了很大进展，但诊断和治疗的手段仍十分有限。其主要原因之一是对人类肺癌的许多问题，不可能直接在病人身上进行研究，因此必须建立合适的动物模型作为研究对象，而成功建立动物肺癌模型的首要条件就是要找到能高效、特异诱发肺癌模型的合适致癌物质。
在制作肺癌模型的科学研究中，许多学者探索了多种不同的致癌物质，包括将致癌物与不同的促癌剂进行搭配、选择不同类别的致癌物、选择不同的溶剂等等。Konishi等在大白鼠饮水中加入亚硝胺类药物，虽能成功诱发肺肿瘤，包括肺癌和肺的良性肿瘤，但因为药物分布于全身，往往除肺癌外尚可诱发其它器官的肿瘤，如肝、甲状腺、肾、子宫、膀胱、胰腺等的肿瘤。Schreiber等将NMU(N-nitroso-N-Methylurea)溶于10％的乙醇中，配成1％的致癌质溶液，给金地鼠作支气管内冲洗，其诱癌率达100％，但冲洗的次数达30次，试验操作繁琐，且恶性肿瘤仅占75％。Saffiotti等用B(a)P和Fe2O3的水溶液灌注金地鼠气管，能诱发包括喉头、气管及肺的良性和恶性肿瘤，但灌注的次数仍达15次。申请人曾用甲基胆蒽(MCA)配制成水悬液，大白鼠支气管内灌注5次，成功建立大白鼠肺癌模型，诱癌率为93.75％，且均为肺的鳞状细胞癌。但MCA水悬液存在以下缺点①气管内灌注MCA水悬液，大白鼠容易将药物排出，其一易污染试验环境，其二由于药物易被排出，因而要求灌注次数多，而且药物易分布于全肺或数个肺叶，造成肺部的病变广泛，对动物正常呼吸影响较大；②MCA水悬液需将药物用乳钵研磨和经超声波发生器震荡，使其颗粒小于3μ以下，不仅制备药物麻烦，且不可能将全部药物粉碎至3μ以下，因而影响致癌质的作用；③水悬液易被微生物污染，加之灌注次数多，易导致肺内感染。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，配方合理，制作简便，无污染，成功诱发肺癌时间短，诱癌率高。
本发明的另一个目的在于提供一种制备诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液的方法，易于操作，既能保证致癌质充分溶解，又确保溶剂中所含的碘不会由于加温而析出，损伤模型动物的呼吸道粘膜。
为了实现上述任务，本发明采用以下技术措施将甲基胆蒽(MCA)浓度为60-100mg/ml和二乙基亚硝胺(DEN)浓度为80-100mg/ml溶于罂粟子之碘化脂酸乙脂(Lipiodol)10毫升，配成致癌质碘油混悬液，其步骤是A、称取甲基胆蒽及二乙基亚硝胺；B、将甲基胆蒽及二乙基亚硝胺混合均匀后加入罂粟子之碘化脂酸乙脂中，搅拌均匀；C、将步骤B的混合物置于70～75℃温箱中溶解11～13小时，取出备用。
按每只体重200克大鼠0.1毫升致癌质碘油混悬液的剂量，进行一次性大鼠支气管内灌注给药，即可成功诱发肺癌，最短成癌时间仅20天，诱癌率达80％。根据实验观察，该致癌质混悬液在支气管局部滞留时间长，且灌注药物不易排出，因而具有诱癌效率高的优点，同时配制方法简便，且易于X线拍片观察药物灌注部位以及肿瘤发生发展过程。而且该混合液中MCA和DEN的浓度适宜，既可高效诱发肺癌，而且成癌过程可被药物阻滞，非常适合于抗肺癌药物的筛选和鉴定。因此申请人认为该致癌质混合溶液可作为建立肺癌模型的一种理想的诱癌物质。
利用本发明的致癌质碘油混悬液所诱发的肺癌均为肺鳞癌，多数为高分化，用常规病理切片技术可观察到肺鳞癌形成的全过程，包括细支气管上皮增生、鳞状上皮化生、不典型增生等癌前病变，原位鳞癌，早期浸润鳞癌，晚期浸润鳞癌及癌的扩散(胸膜种植、肺门淋巴结转移、肾转移)等，可用于肺癌发生发展机制的基础性研究、治疗肺癌新药物的实验研究和肺癌新治疗方法的探索研究，能满足在肺癌基础和临床研究中对肺癌模型动物的大量需求，尤其是在抗癌药物的研制方面有重大意义。
动物模型是抗癌药物筛选及药效学试验的不可缺少的重要环节。由于生物试验的实验设计必须符合“随机、重复、对照”的原则，因而每组动物数及实验次数均有一定的要求，不能仅凭一次实验或少数几只动物的结果就断定某种药物有效、无效及疗效好坏，因此新药的药理学毒理学实验需要大量的患肺癌的大鼠。而且在药物实验中，除试验药物组外还要设立对照组，包括阳性对照组、阴性对照组；药物的浓度与剂量、给药途径、给药的次数不同，会得到不同的药效，因而在药物实验中，需要设立多组试验动物(十几组至几十组，甚至几百组)，而且各组例数应基本相同，数量不可过少(每组10只以上)，因此一次药物实验所需动物数量是极大的。例如依据抗癌药物剂量的不同分为高、中、低剂量组，每组中又根据每天给药次数分为一次给药组、两次给药组、三次给药组，每组中又根据疗程长短可分为短期疗程(1个月)、中期疗程(2个月)、长期疗程(3个月)，这样总共需要3×3×3，即27组共270只患肺癌的大鼠。这仅仅是一种药物的一次初步药效实验的粗略计算，国内外众多科研院所的研究人员开发新抗癌药物的热情不断高涨，正在进行或将要进行对各种各样新的、具有抗肺癌作用的中西药物的大量实验和探索，每一次的探索都需要用患肺癌的大鼠进行经过多次的、反复的实验验证，由此可见患肺癌大鼠的市场需求量之大。
只要按照申请人所设计的致癌质碘油混悬液配方来操作，就能在短时间内、高效率地制作出大量的大鼠肺鳞癌模型，来满足这种制药工业上的需求。目前有许多研究单位如武汉大学生命科学研究中心孙慧、齐义鹏教授，天津大学曹喜才教授等与申请人联系，希望能在新抗癌药的疗效检测方面给予技术支持，这也充分说明了申请人设计的致癌质碘油混悬液具有很好的科研效果和广泛的应用前景。
利用本发明的致癌质碘油混悬液，能特异性地诱发肺鳞癌，诱癌率高，且全部为肺内鳞癌，不引起肺外肿瘤，系首创的新配方。与现有致癌质混合液相比，具有以下优点(1)本发明中的致癌质碘油混悬液，是应用罂粟子之碘化脂酸乙脂作溶剂，溶解度高，致癌质溶解效果优于普通碘油，更优于水，溶解的致癌质停留在局部，易通过支气管粘膜上皮细胞膜进入细胞内促使癌变；(2)本发明中的致癌质碘油混悬液，在肺内不易排出，存留时间长，只用一次灌注即可成功诱癌，操作简便，同时也不污染环境；(3)本发明中的致癌质碘油混悬液以罂粟子之碘化脂酸乙脂作为溶剂，该物质本身具有脂溶剂及造影剂的双重作用，可供X线观察药物局部停留情况以及肿瘤发生发展过程；另外，罂粟子之碘化脂酸内微生物不易生长，可降低动物肺部感染。
(4)本发明中的致癌质碘油混悬液中MCA和DEN的浓度适宜，既可高效诱发肺癌，而且成癌过程可被药物阻滞，非常适合于抗肺癌药物的筛选和鉴定。
图1为灌注致癌质混悬液后拍摄X光片，箭头所示为灌注在肺内的致癌质混悬液图2为灌注本发明致癌质混悬液后成功建立的肺癌模型大鼠，图中箭头所示为诱发的肺癌组织，新生组织呈不规则结节状。
其中2A为肺癌模型大鼠大体观；2B为肺癌模型大鼠肺脏局部放大。
图3为肺癌模型大鼠肺脏HE染色镜下观，图中所示大小不一的癌细胞团为诱发的肺癌组织，可见红染角化珠，癌细胞核异型性明显。
图4为PCNA免疫组织化学染色图片(放大倍数为400倍)，图中原位癌基底部癌细胞核内PCNA表达强阳性，呈棕色。
图5为PCNA免疫组织化学染色图片(放大倍数为400倍)，图中肺癌癌巢周边部位癌细胞核内PCNA表达强阳性，呈棕色。
具体实施例方式
本发明药物实施例用量如下 一种诱发大鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其制造步骤是1.准确称取甲基胆蒽及二乙基亚硝胺；2.将甲基胆蒽及二乙基亚硝胺加入罂粟子之碘化脂酸乙脂中，并搅拌得到混合物；3.将混合物置于70或71或72或73或74或75℃温箱中溶解11～13小时，取出后备用。
试验结果分析应用本发明对915例大鼠进行诱癌试验，具体方法为选取体重200克、鼠龄3～6月的Wistar大鼠，雌雄各半；灌注前2天至灌注后5天，每只大鼠每天肌肉注射青霉素2万单位、链霉素50毫克，以预防感染；基础麻醉采用盐酸氯胺酮，用量为每公斤体重20毫克，当大鼠出现早期麻醉状态时，再用乙醚吸入麻醉；将麻醉状态的大鼠上颌门齿挂于操作台固定线上，操作台与水平面成45°角，用鸭嘴镊将大鼠的舌轻轻拉出，在额镜直视下，当大鼠吸气的瞬间，将特制的钝头注射针插入大鼠左肺下叶支气管内，注入0.1毫升的致癌质混悬液；注入致癌质混悬液的第2天摄片检查以确定灌注部位准确(见图1)。
本发明所诱发的癌均为肺鳞状细胞癌(见图2)。在注入致癌质碘油的第3天，大鼠支气管粘膜上皮出现过度增生，第5、6天出现鳞状化生，第7～9天出现不典型增生，第20天后可形成浸润性鳞癌。
HE染色后进行组织学分析，模型动物肺组织内出现大小不一癌细胞团，形态不～，其中可见角化珠或角化囊，癌细胞核大，部分呈空泡状，核内染色质粗糙，核分裂相多，核仁大、边移(见图3)。
依其病变进展程度不同，可分别诊断为原位癌、早期浸润癌、浸润癌。总诱癌率达80％。诱发肺癌情况总结如下表(表1、2)表1肺癌发生情况及诱癌率灌药后时间灌注剂量 灌注动物数 成癌动物总数诱癌率(％)(天) (毫升/只) (只) (只)200.1 150 78 52400.1 150 98 64500.1 160 135 84.4600.1 160 143 89.4700.1 160 145 90.6800.1 160 153 95.6总计940 752 80表2肺癌各阶段病变发生详细情况(单位只)诱癌后时间 灌注动物 病变类型(天) (只) 原位癌 早期浸润癌 浸润癌 成癌动物总数20 15032 41 5 7840 15036 53 9 9850 16019 94 22 13560 16015 81 47 14370 16011 68 66 14580 1606 62 85 153合计 940119399 234 752细胞增殖核抗原(PCNA)是DNA聚合酶δ的辅助蛋白，分子量为33-36KD，是细胞内DNA合成所不可缺少的。PCNA蛋白表达的变化在肺癌发生、发展中有重要作用，对于判断细胞增殖活跃和恶性程度具有重要参考价值。因此申请人对利用本发明诱发的肺癌进行了PCNA表达的免疫组织化学检测，以判断模型中肺癌细胞增殖活跃和恶性程度。根据我们的实验结果，在正常肺组织中仅发现少量PCNA阳性细胞；原位癌时阳性表达率上升到60.0％，且阳性细胞数逐渐增多到上皮的中层；早期浸润癌和浸润癌阶段PCNA阳性表达率进一步增高，达到76％和100％，并且显色呈强阳性的细胞增多，甚至整个癌巢都可呈阳性表达。提示细胞增殖活性的改变在癌变早期阶段就部分发生，且增殖活性的改变与癌变的进程相关。对照组的10例肺细支气管粘膜上皮细胞中有4例少部分细胞可见PCNA蛋白显色呈阳性，但阳性细胞数小于10％，结果判断为阴性。实验组肺组织中，阳性细胞数目增多，主要分布于上皮或癌巢基底细胞层，其他部位少见(图4、5)。PCNA蛋白阳性表达率在原位癌、早期浸润癌和浸润癌中呈明显递增趋势，分别为60.0％、76.0％和100.0％，与对照组(0/10例)比较，差异有高度显著性(p＜0.01)(表3)。此试验证明本发明诱发肺癌细胞增殖活跃，有明显恶性肿瘤特征。
表3正常组织及癌变组织中PCNA蛋白表达n PCNA 阳性率(％) P值- + ++ +++对照组正常粘膜上皮 10 100 0 0 0(0.0)实验组原位癌 52 1 2 0 3(60.0)早期浸润癌 25 6 4 6 9 19(76.0)浸润癌 20 0 4 5 1120(100.0)＜0.01*注*为实验组内癌变不同阶段PCNA阳性表达率比较结果总之，本发明中的致癌质碘油混悬液能在肺内高效、特异地诱发肺鳞癌，诱癌率高，成癌时间短，不污染环境，且配置方法简便，易于进行药物干预实验研究，是建立肺癌模型的理想致癌质溶液。
权利要求
1.一种诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，它由下述配比的原料制成的混悬液甲基胆蒽60-100毫克二乙基亚硝胺80-100毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
2.根据权利要求1所述的诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其特征是甲基胆蒽60-80毫克二乙基亚硝胺80-85毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
3.根据权利要求1所述的诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其特征是甲基胆蒽60毫克二乙基亚硝胺80毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
4.根据权利要求1所述的诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其特征是甲基胆蒽80毫克二乙基亚硝胺85毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
5.根据权利要求1所述的诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其特征是甲基胆蒽85毫克二乙基亚硝胺90毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
6.根据权利要求1所述的诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其特征是甲基胆蒽90毫克二乙基亚硝胺95毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
7.根据权利要求1所述的诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其特征是甲基胆蒽95毫克二乙基亚硝胺100毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
8.根据权利要求1所述的诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液，其特征是甲基胆蒽100毫克二乙基亚硝胺100毫克罂粟子之碘化脂酸乙脂10毫升。
9.一种用于实现权利要求1所述的一种诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液的制备方法，包括下列步骤A、称取甲基胆蒽和二乙基亚硝胺；B、将甲基胆蒽和二乙基亚硝胺加入罂粟子之碘化脂酸乙脂中，搅拌均匀；C、将步骤B的混合物置于70～75℃温箱中溶解11～13小时，取出备用。
全文摘要
本发明公开了一种诱发鼠肺鳞癌模型的致癌质混悬液及制备方法，将甲基胆蒽和二乙基亚硝胺及罂粟子之碘化脂酸乙酯按比例混合均匀，然后置于一定温度温箱中溶解一定时间，取出备用。本发明方法简便，配方合理，能高效、特异地诱发大鼠肺鳞癌，具有诱癌效率高、成癌时间短、不污染环境，是建立肺癌模型的理想致癌质溶液。
文档编号A61K49/00GK1724074SQ20051001906
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月8日 优先权日2005年7月8日
发明者刘铭球, 田鸿生, 杨飞, 江曼, 刁路明, 鲁植艳, 夏东, 张玉霞, 邹祖玉, 叶波, 陈洪雷, 李红钢, 刘绚, 胡雪峰, 刘骏方, 梅列军 申请人:武汉大学