专利名称：藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及藁本内酯在制备药物中的新用途，特别是涉及藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的新用途。
背景技术：
脑缺血性疾病是由于脑部供血障碍引起脑组织相应区域缺血、低氧造成脑组织破坏所出现一系列生化代谢失常、生理功能丧失、病理形态软化改变等的疾病，是一种在脑组织上多层次、多方面损害的疾病。其中脑组织缺血引起的脑组织梗塞、血管性痴呆、缺血区血流再通导致的脑再灌注损伤是较为常见的脑缺血性疾病。
缺血性脑梗塞主要是由脑的供应动脉狭窄或闭塞引起，是危害人类生命与健康的常见病与多发病，是一组包括不同病因、不同严重程度、不同临床转归的疾病的总称，具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高的特点，决定病情轻重和预后效果的主要因素包括闭塞血管大小，梗死灶的范围、位置，侧支循环的代偿能力，以及继发再灌注损伤、脑水肿、颅内高压等脑损害的严重程度。由于中枢神经系统对缺血缺氧的敏感性很高，因此脑血管病变导致的局部或全脑缺血、缺氧后引起的脑部与认知、记忆等相关的特定神经组织损害，是引起血管性痴呆的主要病理机制之一。慢性进行性脑供血不足，使得脑组织对氧和葡萄糖及其它必需的代谢物质的利用下降，引起氧化损伤，线粒体功能和神经细胞的生物合成受损，突触传递功能受阻，导致神经病理学改变，即发生神经退性行变化，临床表现为记忆和空间知觉进行性衰退和认知功能缺损。
藁本内酯是一种不溶于水的油性物质，其结构如下通式(I)所示
因藁本内酯结构中有环外不对称双键，可分为顺反两种异构体，由于其自身结构的特殊性，顺式结构为空间优势构型，比反式更稳定，因而在自然界中(Z)-藁本内酯在药材中含量为(E)-藁本内酯的10倍左右。藁本内酯可以从常用中药如当归、川芎、茶芎等中提取得到，也可以通过化学合成得到，在中国专利03123994.3和92111278.5以及现有文献(胡长鹰，丁霄霖，无锡轻工大学学报，2003，969)中，都有不同程度的报道。此外本申请人于2005年7月8日提交的发明专利申请“一种快速制备高纯度藁本内酯的方法”也公开了一种利用减压柱层析的方法简单快速制备出高纯度藁本内酯的途径，使藁本内酯的得到变成了现实。
发明内容
本发明的目的是提供一种藁本内酯应用于制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物的新用途。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了如通式(I)所示的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用。
所述藁本内酯包括顺式藁本内酯、顺反式混合的藁本内酯以及反式藁本内酯。
所述藁本内酯包括从天然植物中提取的藁本内酯及化学合成的藁本内酯。
所述脑缺血性疾病包括脑缺血引起的脑梗塞和神经缺失、脑缺血治疗中血流再通引起的脑再灌注损伤、脑缺血引起的血管性痴呆。
所述藁本内酯的有效治疗剂量为0.1～500mg/kg/天。
本领域技术人员可根据公知技术，将本发明的藁本内酯与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或保健品使用的适当的施用形式和剂量形式。
根据本发明的藁本内酯可应用于制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物这一新用途而制备出的药物组合物，其给药剂量取决于多种因素，包括治疗对象的年龄、体重、个体差异、疾病的严重程度，临床治疗的个体化实施方案等。因此上述的治疗剂量可根据实际治疗情况进行较大范围的调整。每天的合适剂量范围选为0.1～500mg/kg体重。上述剂量可根据临床治疗的实施方案采用单一剂量形式或分成多次给药，可单独服用，或与其它治疗药物合并使用，并在合理的范围内调整剂量。上述给药剂量调整方案均为本领域技术人员公知的。
本发明所用的藁本内酯由本发明人经过天然植物提取或化学合成制备。
本发明通过建立SD大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)2h后再灌注24h造成缺血性脑梗塞模型，观察药物抗脑缺血作用。结果表明藁本内酯能够明显减小脑梗塞体积，明显改善神经功能，神经功能评分显著低于MCAO阴性对照组。
本发明通过建立小鼠前脑缺血30min再灌注24小时模型，显示出藁本内酯能够明显缩小脑组织梗塞体积。
本发明还通过建立永久性阻断大鼠双侧颈总动脉(2-VO)引起的持续低灌模型，用Morris水迷宫检测藁本内酯对动物近记忆和空间功能的影响，结果表明藁本内酯对低灌注大鼠记忆力和空间定向力、近记忆和空间位置功能缺损有明显的改善作用；同时，该模型的病理学结果还显示，持续低灌注大鼠皮层和海马CA1区神经元细胞缺失明显，有明显核固缩现象、浓染；海马神经元数目有所减少，缺失现象明显，而本发明的藁本内酯治疗后，明显改善大鼠皮层神经元的损伤，使神经元细胞形态基本正常；海马神经元细胞损伤情况明显改善，细胞形态基本正常，排列整齐，无明显核固缩现象，说明藁本内酯对于脑血液低灌流引起的神经元退行性病变具有防治作用。
本发明人通过大量研究证明，藁本内酯能够明显降低MCAO大鼠和前脑缺血小鼠脑梗塞体积，明显改善脑神经功能，从整体动物水平证实藁本内酯具有明显的防治缺血脑梗塞的作用。藁本内酯对永久性阻断大鼠双侧颈总动脉(2-VO)引起的持续低灌大鼠记忆力和空间定向力、近记忆和空间位置功能缺损有明显的改善作用。藁本内酯治疗后，明显改善大鼠皮层和海马神经元的损伤，使神经元细胞形态基本正常，说明藁本内酯对于脑血液低灌流引起的神经元退行性变具有治疗作用。由于藁本内酯具有上述作用，从而可将藁本内酯应用于制备预防与治疗脑缺血性疾病的药物。
图1为显示藁本内酯对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积的影响的结果图(n＝10)；*表示与模型组比较有显著性差异P＜0.01。
图2为显示藁本内酯对局灶性脑缺血大鼠行为学评分的影响的结果图(n＝10)；*表示与模型组比较有显著性差异P＜0.01。
图3为显示藁本内酯对前脑缺血再灌注小鼠脑梗塞体积的影响的结果图(n＝10)；*表示与模型组比较有显著性差异P＜0.01。
图4为显示藁本内酯对脑血液低灌流大鼠水迷宫学习记忆的影响的结果图A(n＝10)。
图5为显示藁本内酯对脑血液低灌流大鼠水迷宫学习记忆的影响的结果图B(n＝10)；*表示与模型组比较有显著性差异P＜0.05。
图6为显示藁本内酯对脑血液低灌流大鼠脑组织皮质区及海马CA1区的影响的结果图。
具体实施例方式
下面通过具体的实施例并结合附图对本发明作进一步详细的描述。
下述实施例中所用的藁本内酯由本发明人经过天然植物提取或化学合成制备，化学纯度＞98％。
实施例1藁本内酯对局灶性脑缺血大鼠脑梗塞体积及神经功能的影响动物雄性SD大鼠，体重280～320g，由广州中医药大学实验动物中心提供。
试剂和药品所用藁本内酯为本发明人从天然植物中提取得到的顺式藁本内酯，化学纯度＞98％，3％吐温-80配制；氯化三苯四氮唑(2、3、5tripheyltetrazolium，chloride，TTC)上海试剂三厂，生理盐水配置成1％备用。
方法和结果暂时性局部脑缺血模型的制备雄性SD大鼠，体重280～320g，饲养室室温保持在25℃，12/12h昼夜节律，自由进食。大鼠用水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉，75％酒精消毒颈部皮肤，正中颈部切口，分离颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(1CA)，结扎ECA并剪断，于ECA近分叉处插入直径为2.6mm的圆头尼龙线，使尼龙线插入ICA深度约20mm，以阻断大脑中动脉血液供应制成MCAO动物模型。待缺血2h后将尼龙线拉出实现再灌注24小时。术中室温保持在25℃，动物体温保持在37℃。麻醉清醒后大鼠出现右侧霍纳氏综合征、运动旋转追尾现象作为模型成功的标准。
分组与给药分为4组，每组10只，分别为1)假手术组，空白溶媒；2)MCAO模型对照组，空白溶媒；3)藁本内酯高剂组缺血2小时及再灌注4小时灌胃给予藁本内酯80mg/kg；4)藁本内酯低剂组缺血2小时及再灌注4小时灌胃给予藁本内酯20mg/kg。
神经行为评分测定时动物均处于清醒状态，分别在缺血2h和再灌24h时进行评定。
评分标准0分无神经功能缺损，肢体活动正常；1分神经功能轻度局灶性损伤，不能完全伸展左前肢；2分神经功能轻度局灶性损伤，轻抓尾巴时，左前肢肌力明显下降；3分神经功能轻度局灶性损伤，各个方向活动自如，抓尾巴时向左侧转圈；4分神经功能中度局灶性损伤，活动时向左侧转圈。
5分神经功能重度局灶性损伤，刺激后才能行走，向左侧倾倒或转圈；6分神经功能极重度局灶性损伤，无自主行走及意识障碍，对刺激无反应。
7分死亡分数越高，说明动物的行为障碍越严重。
脑梗塞体积的测定再灌24h后，大鼠用水合氯醛(300mg/kg)麻醉，用生理盐水及4％多聚甲醛心脏灌注固定，快速取出大脑并于-20℃保存，冻存5h后将大脑从前囟起作冠状切成6片(每片厚2mm)，迅速置于1％TTC-磷酸盐缓冲液中，避光、37℃孵育30分钟，将TTC染色后的脑组织切片置于4％的福尔马林中固定，染色后的正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，数码相机拍摄保存。每张脑片采用计算机图像分析系统处理(SPOT3.5软件)，梗塞面积叠加计算梗塞体积，梗塞体积的计算公式脑梗塞体积(％)＝(未手术侧半球体积-手术侧未梗塞部分的体积)/未手术侧半球的体积统计分析所有结果采用均数±标准差表达，行为学评分、脑梗塞体积实验采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间差异采用LSD检验，P＜0.01为显著性差异。结果见图1、图2。
图1结果显示缺血2h小时及再灌4h时，灌胃给予藁本内酯80mg/kg体重或20mg/kg体重，均能够剂量依赖性显著减小脑梗塞体积，与模型组比较有显著的差异。其中高剂量作用最为明显，缩小梗塞体积达到90％以上。
图2结果显示，模型组动物出现明显的神经功能障碍，活动时向左侧转圈，多数动物评分为4分。缺血2h小时及再灌4h时，灌胃给予藁本内酯80mg/kg体重或20mg/kg体重，均能明显改善神经症状，评分与模型组比较有显著的差异。其中高剂量改善神经功能的作用最为明显，多数动物只出现的轻微的神经功能局灶性损伤，表现为左侧肌力下降，不能完全伸展左前肢等。
实施例2藁本内酯对前脑缺血再灌注小鼠脑梗塞体积的影响动物雄性KM小鼠，体重28-32g，由广州中医药大学实验动物中心提供。
试剂与药品所用藁本内酯为本发明人经过化学合成得到的顺式藁本内酯，化学纯度＞98％，3％吐温-80配制；氯化三苯四氮唑(2、3、5tripheyltetrazolium，chloride，TTC)上海试剂三厂，生理盐水配置成1％备用。
方法与结果前脑缺血再灌注模型的制备小鼠水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，仰卧位固定于37℃恒温手术台上。颈正中切开皮肤，分离两侧颈总动脉，用微型动脉夹夹闭血管，造成大脑缺血状态。30min后松开动脉夹恢复血流，缝合切口，再灌注24小时。术中室温保持在25℃，动物体温保持在37℃，自由饮水进食。
分组与给药分为4组，每组10只，分别为1)正常对照组，空白溶媒；2)前脑缺血再灌注模型对照组，空白溶媒；3)藁本内酯高剂量组，缺血30分钟后，单次腹腔给予20mg/kg；4)藁本内酯低剂量组，缺血30分钟后，单次腹腔给予5mg/kg。
脑梗塞体积的测定再灌注24h后，小鼠水合氯醛(350mg/kg)腹腔麻醉，用生理盐水及4％多聚甲醛心脏灌注固定，快速取出大脑并于-20℃保存，冻存3h后，从前囟起作冠状切片共六片。0.05％TTC-磷酸盐缓冲液中，避光，37℃孵育30分钟，再置于4％的福尔马林中固定，经TTC染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗塞组织呈白色，排列整齐后，数码相机拍摄保存，每张脑片采用计算机图像分析系统处理(SPOT3.5软件)，梗塞面积叠加计算梗塞体积，梗塞体积的计算公式，结果见图3。
结果显示在小鼠脑缺血30min后单次腹腔给予5、20mg/kg体重藁本内酯均能够明显剂量依赖性减小脑梗塞体积，与模型组比较有显著的差异(P＜0.01)。
实施例3藁本内酯对脑血液低灌流大鼠水迷宫学习记忆的影响动物雄性SD大鼠，体重280～320g，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供。
试剂和药品所用藁本内酯为本发明人经天然植物提取得到的顺式藁本内酯，化学纯度＞98％，3％吐温-80配制；其余试剂均为市售分析纯。
仪器Morris水迷宫，记录仪等2-VO模型建立雄性SD大鼠，体重280～320g，饲养室室温保持在25℃，12/12h昼夜节律，自由进食。大鼠用水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉，75％酒精消毒颈部皮肤，分离颈总动脉，用5-0丝线结扎双侧颈总动脉。假手术组除不结扎双侧颈总动脉以外接受相同的手术。手术一个月后进行水迷宫实验。
分组与给药分为3组，每组10只，分别为1)假手术组，空白溶媒；2)低灌注模型对照组，空白溶媒；3)藁本内酯组，从术后第10天开始灌服药物，80mg/kg/天，连续给药4周。水迷宫实验在给药4周后进行。
水迷宫实验本发明用Morris水迷宫检测大鼠近记忆和空间位置的记忆力，用大鼠2-VO模型持续低灌模拟临床上供血不足引起的血管性痴呆。Morris水迷宫由圆柱性水池(直径120cm，池深50cm)，记录仪及安全岛组成。在水池内注入清水，水深30cm，水温23±1℃，然后加入1000g新鲜牛奶，使池水为不透明的乳白色。水池分为东南、西南、西北和东北四个象限，其中，西南象限的中央放置平台。平台无色透明，直径10cm，高28cm，平台没于水面下2cm，水池周围参照物保持不变，保证动物不能通过听、视、嗅觉达到平台，以便检测动物对空间位置的敏锐性。每只大鼠的游泳活动由操作者观察记录。水迷宫实验连续进行4天，每天大鼠接受2次训练寻找平台。操作者先将大鼠置于平台上10s，然后再将其面向池壁从西北象限中点放入水中，记录大鼠找到平台的时间(潜伏期)，如果60s内找不到平台，则由操作者帮助其上平台。大鼠站立于平台10s后，将大鼠从平台上拿下来休息10min，再由东北象限的中点入水进行试验，记录找到平台的时间(潜伏期)，将两次实验结果进行平均。最后一次训练后进行探索实验，撤除平台，大鼠自由游泳60s寻找平台，记录观察60s内大鼠在西南象限中的游泳时间，大鼠在西南象限停留时间长，提示大鼠已经对这个空间目标存在记忆。
统计分析所有结果采用mean±SD表达。水迷宫实验中各组的潜伏期差异采用重复测定的两因素方差分析。水迷宫平台探索实验采用单因素方差分析。组间差异采用LSD检验。P＜0.05为显著性差异。结果见图4及图5。
在水迷宫实验中，学习和保留实验经常被用于评价低灌大鼠的空间记忆能力。在第一天的训练中，各组间没有显著性的差异。经过4天的训练，假手术组的搜索策略从边缘式和随机式转向于趋向式和直线式，潜伏期(4.48±0.69秒)明显缩短。而溶剂对照组的搜索策略没有明显改变，仍为边缘式和随机式，潜伏期(43.2±7.85秒)未见明显缩短，与假手术组比较差异显著(P＜0.05)。藁本内酯(80mg/kg体重)治疗的大鼠组搜索策略亦表现为从边缘式和随机式转向于趋向式和直线式，潜伏期(17.5±4.10秒)明显缩短，与模型组比较差异显著(P＜0.05)。在4天的学习训练结束后，进行平台探索实验，将安全岛撤去以测试大鼠是否已经形成对安全岛的空间记忆。假手术组的停留时间(22.72±2.13秒)显著长于模型对照组(15.83±2.21秒)，藁本内酯(80mg/kg体重)治疗的大鼠平台所在象限的停留时间与模型组比较明显延长(19.25±2.05秒)。结果提示藁本内酯对于脑供血不足的大鼠记忆力和空间定向力、空间位置功能缺损有明显改善作用。
实施例4藁本内酯对脑血液低灌流大鼠神经元损伤的影响动物雄性SD大鼠，体重280～320g，由广州中医药大学实验动物中心提供。
试剂和药品所用藁本内酯为本发明人从天然植物中提取得到的顺式藁本内酯与反式藁本内酯的混合，化学纯度＞98％，3％吐温-80配制。
其余试剂均为市售分析纯试剂。
2-VO模型建立雄性SD大鼠，体重280～320g，饲养室室温保持在25℃，12/12h昼夜节律，自由进食。大鼠用水合氯醛(300mg/kg)腹腔麻醉，75％酒精消毒颈部皮肤，分离颈总动脉，用5-0丝线结扎双侧颈总动脉。假手术组除不结扎双侧颈总动脉以外接受相同的手术。从术后第10天开始灌服药物，80mg/kg/天，连续给药4周。大鼠用5％的水合氯醛腹腔注射麻醉，仰卧固定，剪开胸腔，暴露心脏，经左心室快速注入PBS液约50ml，然后缓慢注入4％多聚甲醛(PH7.4，4℃)约50ml。固定脑组织后将大鼠断头，快速分离脑组织，放入4％多聚甲醛中固定，切冠状切片，石蜡包埋，HE染色。
分组与给药分为3组，每组10只，分别为1)假手术组，空白溶媒；2)低灌注模型对照组，空白溶媒；3)藁本内酯组，从术后第10天开始灌服药物，80mg/kg/天，连续给药4周。
结果见图6HE染色后，光镜下观察可见假手术组大鼠皮层神经元细胞核呈圆形，大而清晰，核仁明显；海马神经元数目多，呈多层，排列整齐紧密，细胞核呈圆形，大而清晰，核仁明显。脑缺血再灌注模型组大鼠皮层神经元细胞脱失明显，有明显核固缩现象，浓染；海马神经元数目有所减少，脱失现象明显，层次少而不清，排列紊乱，核固缩为三角形或多角形，浓染。药物组明显改善大鼠皮层神经元的损伤，使神经元细胞形态基本正常，无明显核固缩现象；海马神经元细胞损伤情况明显改善，细胞形态基本正常，排列整齐，无明显核固缩现象。上述结果提示藁本内酯对于脑血液低灌流引起的神经元退行性变具有治疗作用。
本发明人进一步采用由化学合成得到的反式藁本内酯(化学纯度＞98％)进行上述实验，结果表明，反式藁本内酯也具有缩小前脑缺血局灶性缺血脑梗塞体积、改善脑缺血大鼠的近记忆和空间位置功能障碍、并改善脑血液低灌流引起的神经元退行性变的效果。
上述体外细胞水平、整体动物水平、生化水平、组织病理学的研究结果表明，本发明藁本内酯能够非常显著地缩小前脑缺血及局灶性缺血脑梗塞体积，可用于防治缺血性脑梗塞；此外本发明的藁本内酯可明显改善脑缺血大鼠的近记忆和空间位置功能障碍，明显改善脑血液低灌流引起的神经元退行性变，对脑缺血引起的血管性痴呆具有治疗作用。从而，可将藁本内酯应用于制备预防与治疗脑缺血性疾病的药物。
权利要求
1.如通式(I)所示的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于所述藁本内酯为顺式藁本内酯。
3.根据权利要求1所述的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于所述藁本内酯为顺反式混合的藁本内酯。
4.根据权利要求1所述的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于所述藁本内酯为反式藁本内酯。
5.根据权利要求1所述的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于所述藁本内酯包括从天然植物中提取的藁本内酯及化学合成的藁本内酯。
6.根据权利要求1所述的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于所述脑缺血性疾病为脑缺血引起的脑梗塞和神经缺失。
7.根据权利要求1所述的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于所述脑缺血性疾病为脑缺血引起的血管性痴呆。
8.根据权利要求1所述的藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用，其特征在于所述藁本内酯的有效治疗剂量为0.1～500mg/kg/天。
全文摘要
本发明公开了藁本内酯在制备预防和治疗脑缺血性疾病的药物中的应用。藁本内酯能显著缩小前脑缺血及局灶性缺血脑梗塞体积，用于防治缺血性脑梗塞；此外，藁本内酯还可明显改善脑缺血大鼠的近记忆和空间位置功能障碍，明显改善脑血液低灌流引起的神经元退行性变，对脑缺血引起的血管性痴呆具有治疗作用。因此，可将藁本内酯应用于制备预防与治疗脑缺血性疾病的药物。
文档编号A61P9/00GK1732921SQ20051002130
公开日2006年2月15日 申请日期2005年7月15日 优先权日2005年7月15日
发明者钱忠明, 杜俊蓉, 汪程远 申请人:钱忠明, 杜俊蓉, 汪程远