专利名称：藁本内酯在制备防治老年痴呆病症组合物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种藁本内酯(Ligustilide)的新医药用途，具体讲是在用于制备防 治老年痴呆病症组合物包括药物和/或保健性食用组合物中的应用。
背景技术：
老年期痴呆是严重威胁老年人健康的一种常见病和多发病，患者在意识清醒状态 下出现持久全面的智能减退，表现为记忆、理解、计算、判断、定向、语言、抽象思维、自我控 制等能力障碍，导致患者独立生活和工作能力丧失。老年期痴呆系慢性进行性大脑结构器 质性损伤引起的高级大脑功能障碍的一组症候群，其病因目前尚未完全阐明。研究表明β 淀粉样肽(Αβ)在大脑记忆和认知有关区域形成的淀粉样物质沉积是构成老年痴呆患者 大脑神经性病变斑块并导致一系列神经功能受损的主要病理特征，而氧化损伤、炎症及凋 亡反应是该病发生发展的重要发病机制。目前治疗老年期痴呆的主要策略是改善认知功能 障碍以提高病人的生活能力。国内外用于老年期痴呆治疗的药物主要包括胆碱能制剂、兴 奋性氨基酸和肽类递质(如一叶秋碱、蛇床子等)、Αβ纤维形成和沉积的干扰物质(如丹 酚酸B、大黄素等)、抗氧化剂(如丹酚酸类化合物、茶多酚、银杏提取物等)、微循环改善物 质(如丹参酮和丹参素、川芎嗪和阿魏酸等)、钙拮抗剂(如芹菜甲素、小蘖碱等)等。但 大量研究发现现有药物大多存在长期治疗效果欠佳、不良反应较大、难以透过血脑屏障、 不易吸收或对老年期痴呆复杂的发病机制缺乏特异性和整合的干预作用等原因，严重影响 这些药物对老年痴呆的临床防治效果。随着社会人口进入老龄化的进程，痴呆患者逐年增 多，加之本病的患病率和致残率高、病程长、治疗和护理开支大等原因，给患者、家庭和社会 都带来巨大的负担和影响。因此，基于国际上老年期痴呆发病分子机制研究的最新进展，积 极研究多靶点干预老年期痴呆主要发病机制的新型药物具有重大意义。
发明内容
针对上述情况，本发明将提供一种经实验证实对老年痴呆病症的防治具有显著效 果的组合物。本发明所说的对老年痴呆病症具有防治作用的组合物，是以藁本内酯作为有效成 分，与药学和/或食品中可以接受的一种或多种固体或液体形式的其它成分或辅助成分共 同组成，是将已知药用成分藁本内酯在作为防治老年痴呆病症的治疗药物和/或辅助性治 疗组合物(包括功能性食品)中的一种应用。藁本内酯(Ligustilide)是一种不溶于水的油性物质，其结构如式(I)所示。 藁本内酯目前可以由含有该成分的常用中药，如当归、川芎、茶芎等植物中提取得 到，也可以由合成方式人工制备得到，如公开号CN 1552702AXN 1084851A和CN 1778799A 等中国专利文献，及其它相关文献(如胡长鹰，丁宵霖等当归中藁本内酯的提取、分离与 结构鉴定)在《无锡经工大学学报》2003，9 69中的报道，都有合成方式制备藁本内酯的相 关报道。由于藁本内酯在许多天然植物/药物中都存在，且多为顺式结构形式，因此在本发 明所说的组合物中，作为有效成分使用的藁本内酯，以采用来源更为丰富的天然存在形式 的藁本内酯更为有利目前对藁苯内酯的研究和应用，多是针对其在心脑血管方面的作用和功效，如公 开号CN 1732921A,CN 1748676A、CN1857534A等中国专利文献都涉及了以藁本内酯作为预 防和治疗缺血性脑梗塞等脑缺血性疾病的药物，CN1543859A中报道了将藁本内酯用于防治 动脉粥样硬化的用途等。本发明所说组合物的应用方式，可以作为老年痴呆病症治疗药物使用的适当的施 用形式和剂量形式的药物组合物。由于本发明涉及的只是将目前已经作为药物成分使用 的藁本内酯在防治老年痴呆病症这一新领域方面进行扩展的应用方式，因此在作为药物使 用时，目前作为药物成分使用的藁本内酯的各种制剂形式和/或应用方式，同样都适用于 本发明所说的组合物。例如，藁本内酯为油状液体且不稳定，根据上述的使用剂量需要， 制药领域的技术人员通过选择适当的辅料成分制成符合药品和保健品稳定性要求的各种 口服制剂。例如，可以按照公开号CN1732922A报道的方式制备成软胶囊制剂；或是按照 CN1732923A报道的方式通过环糊精或环糊精衍生物进行包合后，进一步制备成包括多种口 服型制剂和输液、水针、粉针等注射型制剂在内的多种可供使用的药物形式。除作为治疗药物外，本发明的上述组合物也可以是作为配合治疗、或是作为预防 老年痴呆病症使用的保健性食用组合物。作为治疗药物和/或保健性食用组合物的上述组合物，为进一步提高其对老年 痴呆病症的防治效果，在上述所说有效药物成分藁本内酯的基础上，还可以在目前已知对 老年痴呆病症有确切疗效作用的中药单体及其它有效成分，包括如乙酰胆碱酯酶抑制剂 (如石杉碱类化合物等)、兴奋性氨基酸和肽类递质成分(如一叶秋碱、蛇床子等)、Αβ 纤维形成和沉积的干扰成分(如丹酚酸B、大黄素等)、抗氧化剂成分(如丹酚酸类化合 物、茶多酚、银杏提取物等)、微循环改善成分(如丹参酮和丹参素、川芎嗪和阿魏酸等)、 钙拮抗剂(如芹菜甲素、小蘖碱等)等成分中，根据需要，以占有效成分总重量10% 40%的方式选择其中的一种或多种，作为辅助性有效成分，组成复方形式的有效成分使用。本发明上述组合物在用于预防和治疗老年痴呆病症时，对有效成分藁本内酯具体 用量(给药剂量)的确定，需取决于多种因素，包括使用对象的年龄、体重、个体差异、疾病
4的严重程度，以及相应临床治疗上的个体化实施方案等，因此可根据实际的治疗和需要进 行调整。试验显示，一般情况下每天的适宜用量(剂量)范围可在0. 1 500mg/kg体重范 围内，根据临床治疗的实施方案可以采用每天一次性或分为多次等不同方式使用。除可单 独服用上述的组合物外，也可与其他治疗药物合并使用，并在合理的范围内调整用量。体外实验证实，采用Αβ淀粉肽诱导人神经母细胞瘤株SH-SY5Y损伤，测定了氧 化、凋亡和炎症反应相关指标，藁本内酯对A β淀粉肽诱导的人神经母细胞瘤株SH-SY5Y损 伤有保护作用，并与藁本内酯的抗氧化、抗凋亡和抗炎作用相关。体内实验中，首先通过建立Wi star大鼠双侧侧脑室脑立体定位注射A β淀粉肽造 成记忆障碍模型，用Morris水迷宫检测藁本内酯对动物近记忆和空间功能的影响，结果表 明藁本内酯对痴呆大鼠记忆力和空间定向力、近记忆和空间位置功能缺损有明显的改善作 用；同时，该模型的病理学结果还显示，脑立体定位注射Aβ淀粉肽造成痴呆的大鼠前额叶 区层和海马CAl区神经元细胞缺失明显，有明显核固缩现象、浓染；海马神经元数目有所减 少，缺失现象明显。经藁本内酯治疗后，明显改善大鼠前额叶皮层神经元的损伤，使神经元 细胞形态基本正常；海马神经元细胞损伤情况明显改善，细胞形态基本正常，排列整齐，无 明显核固缩现象，说明藁本内酯对于Αβ淀粉肽引起的神经元退行性病变具有防治作用。由于老年痴呆疾病是一类以进行性记忆力减退为主要特点的大脑退行性疾病，并 且与年龄的增长关系最为密切，因而是老龄人群的常见疾病之一。此外，还由于老年痴呆疾 病的发病机制复杂，主要包括遗传因素(如APP、apoE、PsU Ps2等基因突变)、异常过度磷 酸化的tau蛋白引起的细胞骨架改变、脑内乙酰胆碱等神经递质代谢障碍、淀粉前体蛋白 代谢失调引起细胞外老年斑的形成、细胞内钙代谢紊乱、免疫炎症反应、自由基损伤学说和 神经细胞凋亡等发病机制，因此，仅就上述A β淀粉肽造成老年痴呆大鼠模型尚不足以完 全模拟和证明临床老年痴呆疾病的过程。在遗传性快速老化小鼠(SAM)由日本京都大学竹田教授培育成功，包括SAMP和抗 快速老化的R系(SAMR)的基础上，其中SAMP8亚系具有典型的痴呆特征和脑部病理变化， 该动物中枢学习记忆功能随年龄增长进行性快速衰退，是目前国内外公认的研究老年痴呆 的遗传性动物模型，而SAMRl则表现为正常衰老，可作为SAMP8的正常对照。因此在证明了 藁本内酯对Αβ淀粉肽造成的记忆障碍模型具有改善作用的基础上，本发明又进一步应用 快速老化痴呆SAMP8小鼠模型，采用Y型迷宫及跳台行为学实验检测藁本内酯对动物学习 记忆功能的影响。这些进一步的深入试验结果可充分表明，藁本内酯对痴呆小鼠学习记忆 功能障碍有明显的改善作用，进一步证实了藁本内酯对老年痴呆疾病具有的防治作用。以下通过由附图所示实施例的具体实施方式
，对本发明的上述内容再作进一步的 详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明 上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应 包括在本发明的范围内。
图1为显示藁本内酯保护Αβ淀粉肽诱导的SH-SY5Y细胞损伤的结果图。图2为显示藁本内酯抑制Αβ淀粉肽诱导SH-SY5Y细胞内ROS产生的结果图。图3为显示藁本内酯对Αβ淀粉肽诱导SH-SY5Y细胞线粒体途径凋亡蛋白表达的影响的结果图。图4为显示藁本内酯对Αβ淀粉肽诱导的SH-SY5Y细胞表达炎性相关蛋白 TNF-α，C0X-2的影响的结果图。图5为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宫学习记忆的影响的 结果图Α(η = 10)。图6为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宫学习记忆的影响的 结果图B(η = 10)。图7为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宫学习记忆的影响的 结果图C(n = 10)。图8为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠水迷宫学习记忆的影响的 结果图D(η = 10)。图9为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠脑前额叶皮层区及海马 CAl区的神经元细胞影响的结果图。图10为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠脑前额叶皮层区病变蛋 白ΑΡΡ、Αβ和Tau表达的影响的结果图。图11为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠海马CAl区病变蛋白 APP, A β和Tau表达的影响的结果图。图12为显示藁本内酯对脑立体定位注射Αβ淀粉肽大鼠脑前额叶皮层区和海马 CAl区炎性蛋白TNF-α和NF-κ B表达的影响的结果图。图13为显示藁本内酯对SAMP8快速老龄化小鼠学习记忆功能障碍的影响的结果 图 Α(η = 12)。图14为显示藁本内酯对SAMP8快速老龄化小鼠学习记忆功能障碍的影响的结果 图 C(n = 12)。其中，相关柱状图中标注有*或**的含义是*表示与模型组比较有显著性差异P < 0. 05 ；**表示与模型组比较有非常显著性差异P < 0. 01。
具体实施例方式实施例1藁本内酯(Ligustilide，LIG)保护A β淀粉肽诱导的SH-SY5Y细胞损伤细胞培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞株购自美国ATCC。SH-SY5Y细胞用 高糖 DMEM 完全培养基〔含 10% (V/V)FBS,1% (V/V)NEAA, 100U/ml 青霉素，100 μ g/ml 链霉 素〕，在37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养。每2-3天更换一次培养基，4-6天传
代一次。取对数生长期细胞接种于培养板，用于不同实验。 试剂和药品N_2supplement 美国Gibco公司 非必需氨基酸(NEAA) 美国Sigma公司 A β (25-35) 美国Sigma公司 TNF-α多克隆抗体 美国CST公司Cox2多克隆抗体 美国CST公司
其余试剂均为市售分析纯。仪器ESCO 二级生物安全柜Leica DMIL HC荧光倒置显微镜SHELLAB 2323-2C02 细胞培养箱
新加坡ESCO科技有限公司 德国莱卡仪器有限公司 美国Shellab公司ELGA PureLab Ultra/Classic 纯水系统 英国 ELGA LabWater 公司分组与给药①空白对照组只用含0. 1 % DMSO的DMEM完全培养基培养SH-SY5Y细胞，不加 A β (25-35)及 LIG 干预。②Αβ (25-35)损伤组以 Αβ (25-35)作用于 SH-SY5Y 细胞。 1^16干预组丄16孵育5^￥5￥细胞后，再给予六3 (25_35)，根据浓度梯度，LIG 干预组又分为5. 0,2. 5,1. 0,0. 1 μ g/ml四个浓度组。A β (25-35)溶液的配制用无菌蒸馏水配制ImM/l A β (25-35)溶液，经PBS稀释成不同浓度后，参照文献 方法于37°C老化14天后备用。细胞活力检测用MTT法检测细胞存活率。取对数生长期的SH-SY5Y细胞，用DMEM完全培养 基配成单细胞溶液，以1. 2X IO4个细胞/cm2细胞悬液的密度接种于96孔细胞培养板 中，每孔100μ 1，将接种后的细胞培养板放入37°C，5% C02，饱和湿度的细胞培养箱中培 养。①接种24h后，更换含有N-2的无血清培养基，同时每孔加入DMEM完全培养基其中含 有0.1%01^0，2处后，加入不同浓度的六3 (25-35)作用24h，观察不同浓度Aβ (25-35) 对细胞存活率的影响；②接种2处后，换液，加入5.0、2.5、1.0、0.1118/1111 LIG，空白对 照组和Αβ (25-35)损伤组加入DMEM完全培养基其中含有0. DMS0，孵育24h后，加 入Αβ (25-35) (50uM)作用24h后，加入MTT溶液10 μ 1/孔，37°C继续孵育4h后，吸去上 清液，每孔加入DMSO 150 μ 1溶解紫色结晶，在570nm波长下用酶标仪测定各孔吸光度值 (OD570nm)，按下式计算细胞存活率。细胞存活率=实验组(OD57tlnm) /空白对照组(OD57tlnm) X 100 %ROS 检测DCFH-DA是迄今为止最常用、最灵敏的细胞内ROS探针，本身没有荧光的DCFH-DA 可穿过细胞膜进入细胞，在细胞内转化生成DCHL在活性氧存在的条件下，DCFH被氧化生 成荧光物质DCF，绿色荧光强度与细胞内活性氧水平成正比。本实验参照Hong andjo印h方 法并有所改进，3^￥5￥细胞接种2411后，换液，加入5.0、2.5、1.0、0.1“8/1111 LIG，空白对 照组和A β (25-35)损伤组加入DMEM完全培养基(DMS0终浓度为0. 1 % )，孵育24h后，加入 Αβ (25-35) (5011] )作用311后，加入1(^]\1 DCFH-DA，37°C避光孵育30min。移出含有DCFH-DA 的溶液，PBS洗涤，每孔荧光强度用酶标仪检测(激发波长485nm，发射波长520nm)。免疫印迹分析取蛋白样品20-40 μ g，与5X上样缓冲液4 1体积混合，95°C加热5min使蛋白 变性。将处理后的蛋白样品慢慢加入加样孔中，并在其中一个泳道加5μ 1预染蛋白分子 量Marker。80V恒压电泳，当蛋白样品泳至浓缩胶与分离胶交界处时，改为100V恒压电泳。待溴酚蓝线泳至距胶边缘处时，停止电泳。参照分子量Marker，切下分离胶所需部分，浸入 转膜液备用。取下PVDF膜，标记承载蛋白的一面，浸于TBST中，洗膜3次，每次5min。将 PVDF膜浸于5%脱脂奶粉中，室温封闭2h。将PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次lOmin。 取出PVDF膜，浸入用TBST稀释的一抗(GAPDH抗体1 5000稀释；Bax，TNF- α，Cox-2抗 体1 1000稀释；Bc 1-2抗体1 1000稀释；细胞色素c抗体1 500)，室温孵育Ih。将 PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次lOmin。加入各抗体对应的辣根酶标记的二抗，Bax用 山羊抗兔IgG，β-actin，Bcl-2，细胞色素c用山羊抗小鼠IgG。二抗以1 2000的TBST 稀释。室温孵育2h。将PVDF膜浸于TBST中，洗膜3次，每次lOmin。化学发光，显影，定影。 条带分析，使用Image Pro-Plus软件分析目的条带灰度值，各样本以GAPDH内参校正，比较 各组蛋白表达差异。统计分析实验数据均以Mean士SD表示，实验结果采用SPSS11. 0软件进行统计分析，组间比 较采用单因素方差分析LSD法，以P < 0. 05为显著性差异。结果分析细胞存活率采用MTT法检测。SH-SY5Y细胞与不同浓度A β (25-35) (1 200uM) 孵育24h后，细胞存活率随着A β (25-35)浓度增加而减少。IuM A β (25-35)导致15. 93% 细胞损伤，随着Αβ (25-35)浓度增加，细胞损伤增加，当Αβ (25-35)浓度为50uM、100uM、 200uM时，SH-SY5Y细胞损伤百分率分别为53. 74%, 73. 49%和86. 74%。根据损伤百分率， 选择浓度为50uM Aβ (25-35)用于后续实验。LIG(0. 1、1· 0、2· 5、5· 0 μ g/ml)治疗后，能剂 量依赖性的减少SH-SY5Y细胞损伤，提高细胞存活率，见图1。活性氧在A β (25-35)介导的细胞死亡过程中有着重要作用。通过DCF荧光探针 测定胞内ROS水平可以评价LIG在Αβ (25-35)诱导细胞产生氧化应激中的作用，图2结果 表明，3^￥5丫细胞暴露在4 0 (25-35) (50uM)中3h后，胞内ROS水平明显增加，不同浓度 LIG(0. 1,1. 0,2. 5,5.0 μ g/ml)干预后，剂量依赖性地缓解胞内荧光强度的增加，其中2. 5 和5. 0yg/ml LIG作用显著。Aβ (25-35)通过激活线粒体Caspase途径诱导SH-SY5Y细胞凋亡。在凋亡通路 中，细胞色素c从线粒体释放至细胞浆，结合凋亡诱导因子Apaf-I后启动Caspase级联反 应。Bcl-2家族蛋白是以Bcl-2为代表的一组凋亡调节蛋白，作为线粒体的膜相关蛋白， Bcl-2通过抑制Bax的表达、细胞色素C释放、procaspase3激活而发挥抑制凋亡的作用。 凋亡级联反应早期，细胞存活很大程度上依赖于Bcl-2家族中促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的 平衡状态。本实验结果表明Αβ (25-35)明显上调Bax和胞浆细胞色素c的表达，同时下调 Bcl-2蛋白水平，促进细胞凋亡。但是浓度为0. 1,1.0,2. 5,5.0 μ g/ml的LIG能够显著抑制 Αβ (25-35)诱导的细胞凋亡过程，降低Bax和胞浆细胞色素c的表达，且上调Bcl-2蛋白水 平，见图3 (a为bax表达示意图；b为bcl-2表达示意图；c为细胞色素c表达示意图)。SH-SY5Y细胞能产生肿瘤坏死因子(TNF- α )并释放到细胞培养液。TNF- α是主要 的致炎细胞因子之一，是机体炎症应答的重要调节因子。TNF也能使C0X-2表达上调，使自 由基生成增多，加重炎症损伤。本实验结果表明，经Αβ (25-35)作用后，SH-SY5Y细胞表达 TNF-α明显增加，LIG能明显下调TNF-α蛋白表达。A β诱导SH-SY5Y细胞表达C0X-2，经 Aβ (25-35)作用后，SH-SY5Y细胞表达C0X-2明显增加，LIG能明显下调C0X-2蛋白表达，见图4(图a为TNF-α表达示意图；图b为C0X-2表达示意图)。实施例2藁本内酯对脑立体定位注射A β淀粉肽所致大鼠记忆功能障碍的影响动物雄性Wistar大鼠，体重300 350克，SPF级，由四川省医学院科学院实验 动物研究所购买。室温保持在25°C左后，自由进食和饮水。试剂和药品所用藁本内酯化学纯度> 98%，3%吐温-80配制；其余试剂均为市售分析纯。仪器Morris水迷宫，记录仪等A β (25-35)溶液的配制用无菌生理盐水配制A β (25-35)溶液(5mM/l)，参照文献方法于37°C老化7天后脑立体定位注射Αβ淀粉肽所致大鼠记忆功能障碍的模型建立实验大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，立体定位仪固定头部，颅顶区 备皮，常规消毒手术区皮肤。沿颅顶中线作约2mm切口，分离骨膜使头骨暴露，于前囟 向后0. 8mm,中线左右旁开各1. 5mm,用牙科钻钻开颅骨，垂直进微量进样器针3. 8mm,将 IOulA β (50nmol)溶液缓慢注入，注射时间为5分钟，留针5分钟，以保证溶液充分弥散，然 后缓慢撤针，之后用青霉素粉消毒，缝合切口皮肤。假手术组手术操作完全相同，注射相同 体积的生理盐水。分组与给药动物随机分为三组，假手术组、模型对照组和LIG(40mg/kg) 口服治疗组，每组10 只。手术前所有动物均进行水迷宫的训练实验(5天)，训练实验结束后即实行手术。手术 后七天开始进行水迷宫的测验(7天)，分为隐匿平台(3天)、探索平台(1天)和新平台(3 天)实验。从手术的当天即开始给药，直至水迷宫实验结束，共给药两周，模型对照组给予 相同剂量的溶剂(3%吐温80)。在行为学实验中，均在实验前1小时给药。水迷宫实验本发明用Morris水迷宫检测大鼠近记忆和空间位置的记忆力，用脑立体定位注 射Αβ淀粉肽所致大鼠记忆功能障碍的模型模拟临床上的老年痴呆。Morris水迷宫主要由 一金属柱形水池(池高60cm，直径120cm)及安全岛(高20cm，直径IOcm的平台)组成。预 先在水池中注入清水，然后加入新鲜奶粉水溶液(奶粉先用少量热水溶解成白色均勻溶液 后，加入水池内，边加边搅拌)，使池水成为不透明的乳白色，水面高出平台15cm，这样动物 不能通过听、视和嗅觉到达平台，以便检测动物对空间位置的敏锐性。水温保持在23士 1°C， 水池分为4个象限(东、南、西、北)，平台置与西南象限的中心。手术前的水迷宫训练实验 连续进行5天，均为隐匿平台实验(即水面高出平台，平台不可见)每只大鼠1天接受2次 训练寻找平台，两次分别从东北象限、西北象限的中点，头朝向池壁入水。两次训练间隔10 分钟。记录大鼠找到平台的时间(潜伏期)，并将两次实验结果进行平均。如果大鼠在60 秒内未找到平台，则潜伏期按60秒计算。无论大鼠在60秒内找到平台与否，大鼠都要在平 台上停留10秒。第一次实验开始前先将大鼠放在平台上适应10秒。手术后水迷宫实验连 续进行7天，1-3天为隐匿平台实验，方法与前所述相同，记录大鼠找到平台的时间(潜伏 期)；第4天为探索平台实验(即移去平台)，大鼠入水点位置不变，记录大鼠在原平台位置
9所在象限的停留时间及穿越次数；5-7天为新平台实验(即平台位置改变，放置在东北象限 的中心)，大鼠入水点位置不变，记录大鼠找到平台的时间(潜伏期)。统计分析所有实验结果采用Mean士SD表示。水迷宫实验中各组的潜伏期差异比较采用重 复测定的双因素方差分析(Two-way AV0NA)。水迷宫平台探索实验采用单因素方差分析。 组织病理学分析采用单因素的方差分析(One-way AVONA) (SPSS11. 0软件)。组间差异采用 post hoc LSD检验。P < 0. 05为有显著性差异。在水迷宫实验中，学习和保留实验经常被用于评价痴呆大鼠的空间记忆能力。在 手术前5天的训练实验中，各组间没有显著性差异。经过5天的训练，各组的游泳成绩均 提高，搜索策略也逐步从边缘式和随机式转向趋向式和直线式，潜伏期平均下降60%左右。 手术后的水迷宫实验从手术后七天开始，分为隐匿平台实验、探索平台实验和新平台实验。 隐匿平台实验中，模型组的潜伏期与手术前相比大大延长了，潜伏期从18. 2秒(手术前的 第五天)延长至27. 5秒(手术后的第三天)。搜索策略也转为随机式和边缘式，表现出记 忆能力的损伤。LIG组和假手术组搜索策略仍为趋向式后和直线式(第三天潜伏期分别为 6. 55秒和7. 4秒)与手术前(第五天潜伏期分别为16. 8秒和16. 2秒)相比，继续缩短。 而LIG和假手术组与模型组比较，潜伏期差异明显(P<0.01)，见图5。说明经LIG(40mg/ kg)治疗的大鼠已接近正常水平。在3天的隐匿平台实验结束后进行平台探索实验，将平台 撤去以测试大鼠是否已经形成对平台的空间记忆。假手术组和LIG给药组在目标象限的停 留时间和穿越次数都大于模型对照组，组间比较除假手术组在穿越次数上与模型组无显著 性差异外，其余比较均具有显著性差异(P<0.01)，见图6和图7。在新平台实验中，假手 术组和LIG治疗组与模型对照组比较，潜伏期缩短明显(P <0.01)，见图8。说明动物通过 学习掌握了一定的寻找平台的策略。证实LK^iAii淀粉肽片段损伤大鼠的近记忆和空间 位置功能缺损有明显改善作用。实施例3藁本内酯对脑立体定位注射A β淀粉肽所致大鼠神经元损伤的影响动物雄性Wistar大鼠，体重300 350克，SPF级，由四川省医学科学院实验动 物研究所购买。室温保持在25°C左后，自由进食和饮水。试剂和药品所用藁本内酯化学纯度> 98%，3%吐温-80配制；其余试剂均为市售分析纯。A β (25-35)溶液的配制用无菌生理盐水配制A β (25-35)溶液(5mM/l)，参照文献方法于37°C老化7天后脑立体定位注射A β淀粉肽所致大鼠记忆功能障碍的模型建立实验大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，立体定位仪固定头部，颅顶区 备皮，常规消毒手术区皮肤。沿颅顶中线作约2mm切口，分离骨膜使头骨暴露，于前囟 向后0. 8mm,中线左右旁开各1. 5mm，用牙科钻钻开颅骨，垂直进微量进样器针3. 8mm,将 IOulA β (50nmol)溶液缓慢注入，注射时间为5分钟，留针5分钟，以保证溶液充分弥散，然 后缓慢撤针，之后用青霉素粉消毒，缝合切口皮肤。假手术组手术操作完全相同，注射相同 体积的生理盐水。
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分组与给药动物随机分为三组，假手术组、模型对照组和LIG(40mg/kg) 口服治疗组，每组10 只。从手术的当天即开始给药，共给药两周，模型对照组给予相同剂量的溶剂(3%吐温 80)。结果见图9 :HE染色后，观察到假手术组和LIG治疗组在海马和皮层均没有出现异 常变化，皮质结构完整，神经细胞排列有序，层次清晰，细胞形态正常，结构完整、胞浆丰富、 核仁清晰。但模型对照组在注射A β (25-35)两周后，海马和皮层都出现了不同程度的神经 元退行性改变，可见神经元细胞明显减少，细胞排列散乱，组织水肿、着色变浅，细胞体积轻 度缩小，胞膜与周围分界明显，细胞核多固缩为三角形，结构及核仁消失，空泡现象严重。说 明LIG给药组(40mg/kg)治疗后能明显改善Αβ诱导的神经元细胞损伤。实施例4藁本内酯对脑立体定位注射Aβ淀粉肽所致大鼠前额叶皮层区和海马CAl区Αβ 淀粉肽相关病变蛋白ΑΡΡ、A β和Tau及炎性蛋白TNF- α和NF- κ B表达的影响动物雄性Wistar大鼠，体重300 350克，SPF级，由四川省医学科学院实验动 物研究所购买。室温保持在25°C左后，自由进食和饮水。试剂和药品所用藁本内酯化学纯度> 98%，3%吐温-80配制；A β 1-42、β-APP 兔抗体、Phospho-tau(pSer202)兔抗体、NF-κ Bp65 兔抗体、 TNF-α兔抗体由武汉博士德生物技术开发有限公司提供；其余试剂均为市售分析纯。A β (25-35)溶液的配制用无菌生理盐水配制A β (25-35)溶液(5mM/l)，参照文献方法于37°C老化7天后脑立体定位注射Αβ淀粉肽所致大鼠记忆功能障碍的模型建立实验大鼠用戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，立体定位仪固定头部，颅顶区 备皮，常规消毒手术区皮肤。沿颅顶中线作约2mm切口，分离骨膜使头骨暴露，于前囟 向后0. 8mm,中线左右旁开各1. 5mm，用牙科钻钻开颅骨，垂直进微量进样器针3. 8mm,将 IOulA β (50nmol)溶液缓慢注入，注射时间为5分钟，留针5分钟，以保证溶液充分弥散，然 后缓慢撤针，之后用青霉素粉消毒，缝合切口皮肤。假手术组手术操作完全相同，注射相同 体积的生理盐水。分组与给药动物随机分为三组，假手术组、模型对照组和LIG(40mg/kg) 口服治疗组，每组10 只。从手术的当天即开始给药，共给药两周，模型对照组给予相同剂量的溶剂(3%吐温 80)。结果见图10和图11 通过免疫组化的方法评价大鼠皮层和海马区的ΑΡΡ、Αβ和 磷酸化Tau蛋白的表达，结果显示在假手术组，这三种蛋白的表达都非常微弱，而模型对照 组的表达明显增强，阳性细胞数数量多，着色深，并且分布较密集。LIG(40mg/kg)能明显抑 制蛋白的表达，阳性细胞数量减少，着色较浅，结果见图12 通过免疫组化的方法评价大鼠 皮层和海马区的NFk β、TNF-α、蛋白的表达，结果显示在假手术组，这两种蛋白的表达都 非常微弱(而模型对照组的表达明显增强，阳性细胞数数量多，着色深，并且分布较密集。LIG(40mg/kg)能明显抑制蛋白的表达，阳性细胞数量减少，着色较浅。实施例5藁本内酯对快速老化痴呆SAMP8小鼠的神经保护作用动物SPF级10月龄雄性SAMP8快速老化小鼠48只，体重30g左右；10月龄SAMRl 抗老化小鼠12只，均由天津中医药大学第一附属医院提供。室温保持在25°C左后，自由进 食和饮水。试剂和药品所用藁本内酯化学纯度>99%，临用前3%吐温-80配制；其余试剂均为市售分析纯。仪器和试剂跳台仪，由中国科学院药物研究所提供。Y型迷宫刺激器，由江苏省张家港市青松生物医学仪器厂提供。分组与给药动物共分为五组，SAMP8小鼠随机分为模型组、LIG低剂量组(10mg/kg)、LIG中剂 量组(20mg/kg)、LIG高剂量组(40mg/kg)，SAMRl小鼠作为正常对照组，每组12只。灌胃给 药，1天1次，共给药8周，模型组与正常组灌胃给予等等体积空白溶剂(3%吐温80)。小鼠行为学测试跳台实验实验时将小鼠放入跳台实验箱内，接通电源，小鼠遭到电击后跳上平台，多数小鼠 可能再次跳回铜栅，受电击后又跳上平台，记录5min内小鼠双足同时接触铜栅即受电击的 次数，记为错误次数，作为训练成绩。24h后重复实验，为记忆保持测验。测验时记录5min 内小鼠的错误次数，作为跳台测试成绩。Y型迷宫实验实验装置为1个由不透明塑料板制成的Y型迷路箱，将其与可调变压器相连，电压 为36V。通过电击控制器，可使由3条支臂末端长18cm段相互围成的区域，交替作为起步区 或安全区。训练时将小鼠放入起步区，操纵电击控制器，小鼠遭到电击后，若直接逃至安全 区为正确反应，否则为错误反应。训练小鼠10次，于24h后进行相同测试，记录10次中正 确反应次数，作为迷宫测试成绩。统计分析所有实验结果采用Mean士SD表示。分析采用单因素的方差分析(One-way AV0NA) (SPSS11.0软件)。组间差异采用post hoc LSD检验。P < 0. 05为有显著性差异。小鼠跳台实验结果见图13，SAMRl组错误次数明显低于模型组(P < 0. 01)，LIG高 剂量组与模型组比较有显著性差异(P < 0. 05)而LIG中、低剂量组与模型组比较有减少的 趋势但无统计学差异。小鼠Y型迷宫实验结果见图14，与模型组比较，SAMRl组和LIG高、中剂量组正确 次数均有显著性差异(P < 0.01)，低剂量组小鼠成绩也有所提高，但无显著性差异。上述体外细胞实验、整体动物水平、组织病理学的研究结果表明，藁本内酯能够非 常明显的改善Αβ淀粉肽诱导的5^￥5￥细胞损伤；明显改善々0淀粉肽所致大鼠的近记 忆和空间位置功能障碍和立体定位注射Aβ淀粉肽引起的神经元退行性病变，对立体定位注射Αβ淀粉肽引起的痴呆具有治疗作用；明显的改善SAMP8快速老化小鼠的学习记忆功 能障碍，具有抗老年痴呆病症的治疗作用。从而，可制备成用于预防与治疗老年痴呆病症的 药物和/或保健性的食用组合。
权利要求
藁本内酯在制备防治老年痴呆病症组合物中的应用，其特征是以藁本内酯作为有效成分，与药学中可以接受的辅助成分共同组成。
2.如权利要求1所述的应用，其特征是所说的藁本内酯为顺式藁本内酯。
3.如权利要求1所述的应用，其特征是所说的有效成分中还可包括有占有效成分总重 量10% 40%的乙酰胆碱酯酶抑制剂、兴奋性氨基酸和肽类递质成分、Αβ纤维形成和沉 积干扰成分、抗氧化剂、微循环改善成分、钙拮抗剂中的至少一种。
4.如权利要求1至3之一所述的应用，其特征是所说的组合物为药物制剂。
5.如权利要求4所述的应用，其特征是所说的组合物为口服药物制剂。
6.如权利要求4所述的应用，其特征是所说的药物制剂组合物为适宜每天用量为 0. 1 500mg/kg体重的制剂形式。
7.如权利要求1至3之一所述的应用，其特征是所说的组合物为保健性食品组合物。
全文摘要
藁本内酯在制备防治老年痴呆病症组合物中的应用，以藁本内酯作为有效成分，与药学和/或食品中可以接受的其它成分或辅助成分共同组成，需要时有效成分中还可以包括有占总重量10％～40％的乙酰胆碱酯酶抑制剂、兴奋性氨基酸和肽类递质成分、Aβ纤维形成和沉积干扰成分、抗氧化剂、微循环改善成分、钙拮抗剂中的至少一种。实验结果表明，该组合物通过藁本内酯对Aβ淀粉肽片段诱导的氧化、凋亡和炎症反应所致损伤及老龄化神经元退行性病变的保护作用，可明显改善由Aβ淀粉肽片段及老龄化神经元退行性病变引起的学习记忆下降的效果，可以作为药物和/或保健性食用组合物形式使用。
文档编号A61P25/28GK101904838SQ20091005950
公开日2010年12月8日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者余彦, 张梦雪, 旷喜, 杜俊蓉, 汪程远, 王竞, 陈娅姝 申请人:四川大学