专利名称：制备内酯的方法
技术领域：
本发明涉及一种借助于微生物制备内酯的方法，所述内酯可用于香料和香精物质、药物中间体等等。
背景技术：
芳香族物质大致分为两类即，化学合成的(所谓的“合成芳香族化合物”)；和非化学合成的(所谓的“天然芳香族化合物”)，根据其初始材料或其制备方法。近来，相对于“合成产物”，消费者更趋向于选择“天然产物”。但是，例如，天然物质中仅仅含有非常少量的光学活性γ-癸内酯(R-γ-癸内酯或S-γ-癸内酯)和δ-癸内酯，它们是天然食品香料的重要组分。因此，这些方法，例如高光学纯度的这种光学活性物质的提纯或者通过其它方法将其分离，从技术和经济的角度来考虑是不利的。结果，目前，通常以低价供应大量合成产物。相反，天然产物的生产规模很小，这些天然产物通常很昂贵。
希望开发一种制备大量前述天然芳香族化合物的方法，所述方法的成本低至目前在合成芳香族化合物中使用的成本。在这些已经提出的提供大量天然产物的方法当中，一种基于微生物发酵技术的方法引起人们的注意。在这种技术中，天然R-γ-癸内酯由天然材料或其降解产物通过生物或物理技术进行制备，没有使用任何化学技术。
例如，日本专利公开(Kokai)No.59-82090A(1984)公开了一种基于微生物的方法，用于从蓖麻油或其水解产物中制备γ-癸内酯。在这种方法中，微生物例如米曲霉、皱褶假丝酵母、Geotrichum klebannii和Yarrowia lipolytica用于制备γ-羟基癸酸，加入盐酸等等将所得产物进行酸化，接着加热进行内酯化，由此制得γ-癸内酯。日本专利公开(Kokai)No.63-56295A(1988)和K.A.Maume等人的报道(Biocatalysis，vol.5，79-97，1991)公开了一种制备γ-癸内酯的方法，其中γ-羟基癸酸从蓖麻油酸源中使用Sporobolomyces odorus或粘红酵母制备，将所得产物同样进行内酯化。日本专利公开No.2-174685A(1990)公开了一种从蓖麻油或蓖麻油酸中制备γ-癸内酯的方法，通过使用微生物例如黑曲霉制备γ-羟基癸酸。日本专利公开No.3-117494 A(1991)公开了同样的技术，使用微生物例如酿酒酵母。在这些技术公开之前，S.Okui等人报道了在使用念珠菌属的若干细胞株氧化和降解蓖麻油酸的方法中，γ-羟基癸酸和γ-癸内酯作为中间体(J.Biochem.，vol.54，No.6，536-540，1963)。同样，EP 997533公开了一种使用Yarrowia lipolytica从蓖麻油中制备γ-癸内酯的方法，每升蓖麻油获得12g产物。然而，由于在培养期间需要使用乳化剂或pH调节剂，并且少量的初始材料，即蓖麻油需要加入到培养体系中，其低至0.0247kg/L，因此从生产效率的角度考虑，这种生产方法是极其不利的。此外，在这些出版物等等中公开的微生物，其不同于在本发明中所使用的那些微生物物种，由于很难从培养产物中分离出细胞株并且从经济的角度来说生产是不足量的，因此并不总适于实际使用。
作为选择，已经报道了一种从糖底物中借助于Sporobolomycesodorus(S.Taquara等人，Agric.Biol.Chem.，vol.36，No.13，2585-2587，1972；N.Jourdain等人，“Top.Flavour Res.，Proc.Int.Conf，”H.Eichhorn，427-441，1985)或梨孢镰刀菌(J.Sarris等人，Agric.Biol.Chem.，vol.49，No.11，3227-3230，1985)制备γ-癸内酯的方法，其是方法的例子，其中一种组分而不是蓖麻油或其水解产物用作碳源。但是，这些技术不适合工业规模生产，因为仅仅制得非常少量的γ-癸内酯。
因此，希望开发一种有效地制备γ-羟基癸酸和γ-癸内酯的方法，所述方法不需要使用乳化剂或pH调节剂，并且可以加入高浓缩的初始材料，即蓖麻油和/或其水解产物。
还报道了在天然存在的γ-癸内酯中，R-γ-癸内酯对映体的丰度是过量的(A.Bernreuther等人，J.Chromatography，481，363，1989)。通过化学合成制备这种纯光学活性形式的R-γ-癸内酯的方法公开在日本专利公开No.4-108782A(1992)。
R-γ-癸内酯还可以通过从外消旋混合物中选择性地分离R-γ-癸内酯进行制备，其中外消旋混合物从天然物质中通过本领域熟练技术人员已知的技术提取得到。由于在天然物质中非常少量的R-γ-癸内酯以及从其它挥发性化合物中分离R-γ-癸内酯存在物理困难，因此从天然物质中提取并不是成本有效的。为了解决不断增加的对上述天然物质的需求，需要开发一种有效制备天然R-γ-癸内酯的方法，其使用不同于化学合成或从外消旋混合物中分离的技术。
现已提出了一种使用微生物制备δ-癸内酯的方法，其使用真菌特别是酵母的还原能力。例如，日本专利公开No.3-155792 A(1992)公开了一种从天然存在的2-癸烯-1，5-内酯中通过利用酿酒酵母来生产5-癸内酯的方法。日本专利公开No.6-225781 A(1994)报道了一种从含相应的不饱和内酯(即δ-癸烯-2-内酯、δ-十二烯-2-内酯或其混合物)的底物中，通过使用酵母例如Saccharomyces delbrueckii进行生物氢化，以制备δ-癸内酯、δ-十二内酯或其混合物的方法。但是，例如由于在高浓度底物上作用存在困难，需要较长时间才能获得所需物质，因此使用酵母的还原能力来进行化学转化的技术仍然是存问题的。
发明内容
本申请要求日本专利申请No.2002-190616的优先权，其内容在此被引入。
为了克服上述问题，完成了本发明。本发明的一个目的是提供一种使用微生物有效制备天然内酯的方法，所述的天然内酯包括光学活性内酯例如光学活性γ-癸内酯和光学活性δ-癸内酯。
为了达到上述目的，本发明人已经从现有细胞株和自然界中广泛寻找微生物，其可以在蓖麻油和/或其水解产物作为碳源的培养基中累积高浓度的γ-羟基癸酸。结果，他们发现，在一种培养基中，使用candidasorbophila以及加入至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的高浓度初始原料，能够高效地产生和累积γ-羟基癸酸和/或光学活性γ-癸内酯，同时不需要使用乳化剂或pH调节剂。此外，他们还发现通过在酸性条件下加热获得的γ-羟基癸酸，可以很容易地制得光学活性的γ-癸内酯。由此制得的光学活性γ-癸内酯可以以非常高的生产率进行回收。此外，他们还发现通过使用各种羟基脂肪酸作为碳源，上述candida sorbophila能够制得各种光学活性内酯。
本发明是在基于这些发现下完成的，本发明将在下面进行描述。
(1)一种制备内酯的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila，然后从培养基中回收生成的内酯。
(2)一种制备内酯的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila，然后对从培养基中生成的内酯前体羟基脂肪酸进行内酯化。
(3)根据(1)或(2)的方法，其中candida sorbophila是至少一种选自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candida sorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candidasorbophila菌株FC 58的微生物，它们以登记号FERM BP-8388保藏。
(4)根据(1)或(2)的方法，其中内酯用下面的通式表示 其中环A表示一个内酯环；R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；以及R2表示氢原子、烃基或取代烃基；其中环A和R2可以连接在一起形成一个环。
(5)根据(1)或(2)的方法，其中内酯是光学活性内酯。
(6)根据(1)或(2)的方法，其中羟基脂肪酸用下面的通式(2)表示 其中R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；R2表示氢原子、烃基或取代烃基；以及R3表示任选取代的二价烃基，具有一条4个或更多个碳的链；其中R2和R3可以连接在一起形成一个环。
(7)根据(1)或(2)的方法，其中羟基脂肪酸衍生物是羟基脂肪酸烷基酯或羟基脂肪酸甘油酯。
(8)根据(7)的方法，其中羟基脂肪酸烷基酯用下面通式(3)表示
其中R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；R2表示氢原子、烃基或取代烃基；以及R3表示任选取代的二价烃基，具有一条4个或更多个碳的链；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以连接在一起形成一个环。
(9)根据(7)的方法，其中羟基脂肪酸甘油酯用下面通式(4)表示 其中R6-R8每个独立地表示氢原子或下面通式(6)表示的基团 其中R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；R2表示氢原子、烃基或取代烃基；R3表示任选取代的二价烃基，具有一条4个或更多个碳的链；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以连接在一起形成一个环，条件是R6-R8中至少一个是上述通式(6)表示的基团。
(10)根据(1)或(2)的方法，其中candida sorbophila在在含至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸、11-羟基棕榈酸、lesquerolicacid、10-羟基硬脂酸、10-羟基棕榈酸和11-羟基棕榈酸乙酯的培养基中进行培养。
(11)根据(2)的方法，其中内酯前体羟基脂肪酸是具有4个或更多个碳原子的羟基脂肪酸，其在4或5位具有一个羟基。
(12)根据(1)或(2)的方法，其中内酯是选自γ-癸内酯、γ-戊内酯、γ-己内酯、γ-庚内酯、γ-辛内酯、γ-壬内酯、γ-十一内酯、γ-十二内酯、γ-十三内酯、γ-十四内酯、δ-癸内酯、δ-己内酯、δ-庚内酯、δ-辛内酯、δ-壬内酯、δ-十一内酯、δ-十二内酯、δ-十三内酯和δ-十四内酯的任何一种。
(13)一种制备内酯前体羟基脂肪酸的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila。
(14)一种制备γ-癸内酯的方法，包括在含至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介质中培养candidasorbophila，然后从介质中回收生成的γ-癸内酯。
(15)一种制备γ-癸内酯的方法，包括在含至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介质中培养candidasorbophila，然后对从介质中生成的γ-羟基癸酸进行内酯化。
(16)根据(14)或(15)的方法，其中γ-癸内酯是光学活性的γ-癸内酯。
(17)根据(14)或(15)的方法，其中至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid是蓖麻油和/或蓖麻油水解产物。
(18)一种制备δ-癸内酯的方法，包括在一种含11-羟基棕榈酸和/或11-羟基棕榈酸乙酯的介质中培养candida sorbophila，然后从介质中回收生成的δ-癸内酯。
(19)一种制备δ-癸内酯的方法，包括在一种含11-羟基棕榈酸和/或11-羟基棕榈酸乙酯的介质中培养candida sorbophila，然后对从介质中生成的δ-羟基癸酸进行内酯化。
(20)根据(18)或(19)的方法，其中δ-癸内酯是光学活性的δ-癸内酯。
(21)根据(14)、(15)、(18)或(19)的方法，其中candida sorbophila是至少一种选自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candidasorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candida sorbophila菌株FC 58，以登记号FERM BP-8388保藏。
(22)candida sorbophila的用途，用于制备内酯。
(23)candida sorbophila菌株FERM BP-8388。
本发明的内酯制备方法可以如下进行通过在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的介质中培养candida sorbophila，以制备内酯，然后将从介质中回收内酯。
本发明的内酯制备方法还可以如下进行通过在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的介质中培养candida sorbophila，以制备内酯前体羟基脂肪酸，然后对内酯前体羟基脂肪酸进行内酯化。
在下文中，将详细描述本发明的内酯制备方法。
(1)candida sorbophila在本发明中使用的candida sorbophila的具体例子包括，但是不限于，candida sorbophila菌株FC 58、candida sorbophila菌株ATCC 74362、candida sorbophila菌株ATCC 60130和candidasorbophila菌株IFO 1583。candida sorbophila菌株FC 58于2002年6月10日保藏在International Patent Organism Depositary of theNational Institute of Advanced Industrial Science andTechnology(Tsukuba Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki，Japan)，登录号为FERM BP-8388(原始保藏)。根据布达佩斯条约，于2003年5月28日将原始保藏转移到国际保藏。
使用常规技术，从Kanagawa prefecture，Japan的普通土壤中分离得到上述candida sorbophila菌株FC 58。鉴别其真菌学性质，和根据分类学教科书研究确定的性质(Kurtzman，C.P.et al.，″The Yeasts，A Taxonomic Study″4th edition，1998，Elsevier Science B.V.；andBarnett，J.A.et al.，″YeastsCharacteristics and identification″3rded).结果，Candida sorbophila菌株FC 58被确定是Candidasorbophila属的一种微生物。因此，将这种从自然界分离的微生物命名为Candida sorbophila菌株FC 58(在下文中被缩写为″FC 58菌株″)。
可以优选在本发明中使用的FC 58菌株的真菌学性质如下。
(1)在YM液体培养基中生长在24℃-27℃下培养24小时后，形状主要从球形变为椭圆形。
(2)在YM琼脂培养基中生长在24℃-27℃下培养2-3天后，菌株的颜色介于白色和奶油色之间，并且菌株被润湿。
(3)形状球形到椭圆形，由多极芽殖繁殖，当它在Adams、Gorodokowa、麦芽、YM、V-8或马铃薯葡萄糖的培养基中培养时，没有观察到假菌丝体的形成和子囊孢子的形成。
(4)最佳生长条件在24℃-27℃，pH5.5-6.0。
(5)生长的最高温度在35℃-37℃。
(6)维生素需求它不能生长在维生素缺乏的培养基。需要生物素、吡哆醇或维生素B1。
(7)发酵葡萄糖(-)、半乳糖(-)、蔗糖(-)、麦芽糖(-)、乳糖(-)、棉子糖(-)、海藻糖(-)。
(8)可同化性半乳糖(+)、山梨糖(+)、蔗糖(-)、麦芽糖(-)、海藻糖(-)、乳糖(-)、棉子糖(-)、纤维二糖(-)、蜜二糖(-)、松三糖(-)、淀粉(-)、D-木糖(-)、L-阿拉伯糖(-)、D-核糖(-)、D-鼠李糖(-)、D-葡糖胺(-)、N-乙酰基-D-葡糖胺(-)、丙三醇(弱)、赤藓糖醇(-)、核糖醇(-)、D-甘露糖醇(+)、乳酸(弱)、柠檬酸(-)、肌醇(-)。
上述″ATCC″和″IFO″分别是″美国模式培养物保藏所″(AmericanType Culture Collection)和″Institution for Fermentation，大阪，日本″的缩写。″ATCC″或″IFO″表示每种菌株的编目号。根据那些编目号，由″ATCC″或″IFO″后的数值表示的上述Candida sorbophila可以从各个组织处获得。
当本发明所使用的Candida sorbophila在含羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物和/或羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中进行培养时，通过β-氧化，它可以产生一种内酯前体羟基脂肪酸，然后通过内酯化生成的内酯前体羟基脂肪酸，可以制备内酯，导致它们在培养基中累积。当本发明所用的Candida sorbophila在一种含羟基脂肪酸衍生物的培养基中在合适的培养条件下进行培养时，这种菌株水解羟基脂肪酸衍生物，然后β-氧化所述的水解产物，生成一种内酯前体羟基脂肪酸。然后，产物在培养基中累积。在这种情况下，在培养基中产生和累积的内酯前体羟基脂肪酸的内酯化可以导致所需内酯的生成。
当本发明所使用的Candida sorbophila在一种例如含蓖麻油的培养基中进行培养时，它可以水解蓖麻油。此外，在期间培养，通过β-氧化这种蓖麻油的水解产物，可以在培养基中产生和累积γ-羟基癸酸和/或γ-癸内酯。
(2)用于制备内酯的培养基在本发明的方法中，使用一种培养基，其含有至少一种作为碳源的选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物和羟基脂肪酸衍生物的水解产物的物质，并且Candida sorbophila可以生长在这种培养基中，用于制备内酯。
本发明所使用的羟基脂肪酸或羟基脂肪酸衍生物的水解产物没有特别限制，只要它可以被Candida sorbophila β-氧化，由此产生内酯前体羟基脂肪酸。本发明所使用的羟基脂肪酸衍生物没有特别限制，只要它被Candida sorbophila水解，并且内酯前体羟基脂肪酸可以由所得的水解产物通过β-氧化制得。
羟基脂肪酸，其具有6个或更多个，优选6-25个，更优选6-20个碳原子，并且至少在6-位上具有一个羟基，从羧基的碳原子上数起优选在6-到20-位上，优选在本发明中使用。
例如，羟基脂肪酸的一个具体例子用下面通式(2)表示 其中R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；R2表示氢原子、烃基或取代的烃基；R3表示任选取代的二价烃基，其具有一个4个或更多个碳的链；其中R1和R2或R2和R3可以连接在一起形成一个环。
通式(2)中的这些基团描述如下。
烃基的例子，例如，包括烷基、具有不饱和键的烷基、芳基、芳烷基等等。
烷基可以是线性的、分枝的或环状的。例如，烷基具有至少一个，优选1-20个，更优选1-15个，更进一步优选1-10个碳原子。其具体例子包括甲基、乙基、正丙基、2-丙基、正丁基、2-丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、叔戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲丙基、正己基、2-己基、3-己基、叔己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基戊-3-基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
具有不饱和键的烷基包括在它的链中具有至少一个不饱和键例如双键等等的烷基。其具体例子包括链烯基、烷二烯基、烷三烯基等等。
链烯基在上述烷基的链中具有一个双键。例如，它可以是线性的、分枝的或环状的，并且它可以具有至少2个，优选2-20个，更优选2-15个，更进一步优选2-10个碳原子。其具体例子包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、辛烯基、壬烯基(nonanyl)、癸烯基等等。
烷二烯基在上述烷基的链中具有两个双键。例如，它可以是线性的、分枝的或环状的，并且它可以具有至少4个，优选4-20个，更优选4-15个，更进一步优选4-10个碳原子。其具体例子包括1，3-丁二烯基、2，4-丁二烯基、2，3-二甲基-1，3-丁二烯基等等。
芳基包括具有6-14个碳原子的那种。其具体例子包括苯基、萘基、蒽基、联苯基等等。
芳烷基包括来源于上述烷基的基团，其中烷基的至少一个氢原子被上述芳基取代。例如，芳烷基优选具有7-12个碳原子。其具体例子包括苄基、2-苯乙基、1-苯丙基、3-萘丙基等等。
杂环基的例子脂肪族杂环基和芳香族杂环基。
脂肪族杂环基包括，例如，5-到8-元，优选5-或6-元的单环、多环或稠环的脂肪族杂环基，其具有2-14个碳原子并且含有至少一个，优选1-3个杂原子，例如氮、氧和硫原子。脂肪族杂环基的具体例子包括，例如，吡咯烷基-2-酮、哌啶子基、哌嗪基、吗啉代、四氢呋喃基、四氢吡喃基等等。
芳香族杂环基例如包括5-到8-元，优选5-或6-元的单环、多环或稠环的杂芳基，其具有2-15个碳原子，并且含有至少一个，优选1-3个杂原子，例如氮、氧和硫原子。其具体例子包括呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基(pyrazyl)、哒嗪基(pyridazyl)、吡唑基、咪唑基、噁唑基、噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、phthalazyl、喹唑啉基、naphthylidyl、噌啉基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并噻唑基等等。
取代烃基包括取代烷基、具有不饱和键的取代烷基、取代芳基和取代芳烷基，其中在上述烃基中，至少一个氢原子被取代基所取代。
上述取代基包括烃基、取代烃、杂环基、杂环基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、烷氧羰基、芳氧羰基、芳烷氧羰基、酰基、酰氧基、烷硫基、芳烷硫基、芳硫基、卤素、亚烷基二氧基、氨基、取代氨基、肼基、氰基、硝基、羟基、被保护基取代的羟基、羧基、磺酰氨基、磺基、酰胺磷酸酯、取代的甲硅烷基等等。
在它们当中，这些由R1表示的基团优选是烷基或具有不饱和键的烷基。
二价烃基，其可以有一个取代基并且含有一条4个或更多个碳的链，包括具有一条4个或更多个碳的链的二价烃基和具有一条4个或更多个碳的链的二价取代烃基。具有一条4个或更多个碳的链的二价烃基包括亚烷基、具有一个不饱和键的亚烷基、和二价芳香族基团，其具有一条至少4个碳的链。
具有一条4个或更多个碳的链的亚烷基包括线性的、分枝的或环状的亚烷基，具有一条至少4个，优选4到20个，更优选4到15个碳的链。其具体例子包括1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基、1，7-亚庚基、1，8-亚辛基、1，9-亚壬基、1，10-亚癸基和-(CH2)m-o-C6H10-(CH2)n-等等，其中m和n每个独立地是0或自然数，并且m+n≥2。
具有一条4个或更多个碳的链和一个不饱和键等等的亚烷基包括在所述4个或更多个碳的链中含有至少一个不饱和键例如双键等等的亚烷基。具有一条4个或更多个碳的链和一个不饱和键的亚烷基可以具有一条至少4个，优选4到20个，更优选4到15个碳的链，并且它可以是线性的、分枝的或环状的。其具体例子包括亚烯基例如亚丁烯基、亚戊烯基和亚己烯基。
具有一条4个或更多个碳的链的二价芳香族基团含有一条至少4个，优选4到20个，更优选4到15个碳的链的二价芳香族基团。其具体例子包括-(CH2)p-o-C6H4-(CH2)q-，其中p和q每个独立地是0或自然数，以及p+q≥2等等。
含有一条4个或更多个碳的链的二价取代烃基包括，来源于含有一条4个或更多个碳的链的二价烃基的二价取代烃基，其中用上述取代基而不是羟基取代它的至少1个氢原子。
当R1和R2或R2和R3连接在一起形成一个环时，所形成的环包括脂肪族环、芳香族环等等。脂肪族环包括环丁烷环、环戊烷环、环己烷环、环己烯环等等。芳香族环包括苯环。
羟基脂肪酸的优选例子包括蓖麻油酸、11-羟基棕榈酸、lesquerolicacid、10羟基硬脂酸和10-羟基棕榈酸，以及由下式表示的内酯前体羟基脂肪酸。
上述羟基脂肪酸优选是蓖麻油酸、11-羟基棕榈酸、lesquerolicacid、10-羟基硬脂酸、10-羟基棕榈酸等等。
在本发明中所使用的羟基脂肪酸衍生物优选来源于上述羟基脂肪酸。这种羟基脂肪酸衍生物的优选例子包括羟基脂肪酸的烷基酯、羟基脂肪酸的甘油酯等等。
例如，羟基脂肪酸烷基酯的一个具体例子用通式(3)表示 其中R4表示烷基，R1-R3如上所定义。
由R4表示的烷基可以是线性的或分枝的。所述烷基包括具有至少一个，优选1-10个，更优选1-6个，更进一步优选1-3个碳原子的烷基。其具体例子包括甲基、乙基、正丙基、2-丙基等等。
在本发明中，优选的羟基脂肪酸烷基酯是在它的烷基酯部分中具有1-3个碳原子的那种(例如，甲酯、乙酯和丙酯等等)。其具体例子包括11-羟基棕榈酸乙酯、蓖麻酸乙酯、ethyl lesquerolate、10-羟基硬脂酸乙酯、10-羟基棕榈酸乙酯等等。
羟基脂肪酸甘油酯包括羟基脂肪酸单酸甘油酯、羟基脂肪酸二酸甘油酯和羟基脂肪酸三酸甘油酯。例如，其具体例子由通式(4)表示 其中R6-R8每个独立地表示氢原子或一个由通式(6)表示的基团 其中R1-R3如上所定义，条件是R6-R8中的至少一个独立地是由上述通式(6)表示的基团。
由上述通式(4)表示的羟基脂肪酸甘油酯包括甘油和由上述通式(2)表示的羟基脂肪酸缩合反应得到的那种。
在本发明中，羟基脂肪酸甘油酯的优选例子包括蓖麻油等等。
本发明所使用的羟基脂肪酸衍生物的水解产物可以由上述羟基脂肪酸衍生物水解制得。例如，这样的水解产物可以通过化学或酶水解制得，例如用水解酶如脂肪酶等等、碱处理或高压蒸气对羟基脂肪酸的甘油酯或烷基酯进行处理。羟基脂肪酸衍生物的水解产物包括，但不局限于，蓖麻油水解产物和11-羟基棕榈酸乙酯的水解产物。
本发明所使用的羟基脂肪酸和羟基脂肪酸衍生物可以是光学活性的(R)或(S)形式，或者是一种外消旋体。在本发明中，例如，当光学活性的羟基脂肪酸由通式(2-1)表示时 其中*表示手性碳原子，R1-R3如上所定义，用作由通式(2)表示的羟基脂肪酸，所得内酯是光学活性内酯。当R1与R2相同时，与R1和R2相连的碳原子不是手性碳原子。
当光学活性羟基脂肪酸衍生物用作羟基脂肪酸衍生物时，所得内酯同样是一种光学活性内酯。
例如，光学活性内酯可以通过使用由通式(3-1)表示的光学活性羟基脂肪酸烷基酯获得 其中R1-R4以及*如上所定义，当由上述通式(3)表示的羟基脂肪酸烷基酯或由通式(4-1)表示的光学活性的羟基脂肪酸甘油酯
其中R9-R11每个独立地表示氢原子或一个由通式(6-1)表示的基团 其中R1-R3以及*如上所定义，条件是R9-R11中的至少一个是由通式(6-1)表示的基团，当羟基脂肪酸甘油酯由上述通式(4)表示。
光学活性的羟基脂肪酸甘油酯包括光学活性的羟基脂肪酸单酸甘油酯、光学活性的羟基脂肪酸二酸甘油酯、光学活性的羟基脂肪酸三酸甘油酯等等。
此外，当羟基脂肪酸衍生物的水解产物在本发明中使用时，使用光学活性的羟基脂肪酸衍生物作为羟基脂肪酸衍生物进行水解也是同样正确的。
更具体地说，如果羟基连接的碳具有R-构型，那么所得光学活性内酯是R-内酯。如果羟基连接的碳具有S-构型，那么所得光学活性内酯是S-内酯。
由通式(2-1)表示的光学活性羟基脂肪酸的优选例子是羟基脂肪酸的旋光体，其以上述羟基脂肪酸的优选例子的形式存在。在它们当中，光学活性的蓖麻油酸、光学活性的11-羟基棕榈酸、光学活性的lesquerolic acid、光学活性的10-羟基硬脂酸、光学活性的10-羟基棕榈酸等等是优选的。
由通式(3-1)表示的光学活性的羟基脂肪酸烷基酯的优选例子包括光学活性的11-羟基棕榈酸乙酯、光学活性的蓖麻酸乙酯、光学活性的ethyl lesquerolate、光学活性的10-羟基硬脂酸乙酯和光学活性的10-羟基棕榈酸乙酯等等。
由通式(4-1)表示的光学活性的羟基脂肪酸甘油酯的优选例子例如包括光学活性的蓖麻油。
为了通过本发明的方法制备作为内酯的γ-癸内酯，至少一种选自，但不限于，蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物质优选用作羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物或羟基脂肪酸衍生物的水解产物。当通过本发明的方法制备δ-癸内酯时，优选使用，但不局限于，11-羟基棕榈酸和/或11-羟基棕榈酸乙酯作为羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物或羟基脂肪酸衍生物的水解产物。
本发明所使用的羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物或羟基脂肪酸衍生物的水解产物可以是一种商业产品，或者可以从天然物质中提取获得。或者，它可以视情况而定进行制备。为了通过本发明的制备方法获得天然内酯，优选使用不是化学合成的方法来获得羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物或羟基脂肪酸衍生物的水解产物。例如，优选可以从球根牵牛(jalap)或甘薯中提取11-羟基棕榈酸，以便在制备天然δ-癸内酯中使用。为了通过如上所述的本发明的方法获得一种光学活性的内酯，优选使用光学活性形式的羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物或羟基脂肪酸衍生物的水解产物。
在本发明中用于制备内酯的培养基含有至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物和羟基脂肪酸衍生物的水解产物的物质，其中在每升培养基中，这些物质的量为10％(w/v)-50％(w/v)，优选15％(w/v)-25％(w/v)。
在本发明中用于制备内酯的培养基可以如下进行制备如果需要，将其它用于细胞培养的常规组分(例如氮源等等)加入到上述至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物和羟基脂肪酸衍生物的水解产物的物质中。加入到培养基中的其它组分包括，但不局限于，氮源例如酵母抽提物、脲、玉米浆、硫酸铵和磷酸氢二胺；补充碳源例如麦芽提取物、多种蛋白胨以及糖例如葡萄糖；无机盐例如硫酸锰、氯化钙、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁、氯化钴、钼酸钠、硼酸和碘化钾；辅酶例如黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和辅酶A(COA)；核苷酸例如三磷酸腺苷(ATP)；维生素例如L-肉碱；以及无菌水。辅助因素例如无机盐、辅酶和维生素可以进一步增加内酯前体羟基脂肪酸和/或制得的内酯的数量，其加入的数量通常可以是非常小的。本领域熟练技术人员可以容易地确定这些用于制备培养基的其它组分，其中Candida sorbophila可以生长在这种培养基中。
(3)使用Candida sorbophila生产光学活性内酯在本发明中，将如上面(1)中所述的Candida sorbophila在培养基中进行培养，用于制备如上面(2)中所述的内酯，使得Candidasorbophila能够在培养基中制得一种内酯前体羟基脂肪酸和/或内酯。
可以将由Candida sorbophila制得的内酯前体羟基脂肪酸通过内酯化作用转变为内酯。内酯前体羟基脂肪酸可以通过本领域熟练技术人员已知的任何方法进行内酯化。例如，内酯化可以在酸性条件下通过加热处理进行。更具体地说，这种方法可以通过在pH3-5和100℃的条件下，加热含内酯前体羟基脂肪酸的培养物20分钟，由此在培养产物中对内酯前体羟基脂肪酸进行内酯化。来源于内酯前体羟基脂肪酸的内酯化化合物是所述的内酯。在本发明中，内酯化可以在没有使用pH调节剂的情况下进行。
通过内酯化由上述方法制得的内酯前体羟基脂肪酸获得的内酯，或由Candida sorbophila制得的内酯，可以用本领域熟练技术人员已知的方法进行回收和/或分离和提纯。
在此使用的术语″内酯前体羟基脂肪酸″是指可以被内酯化的羟基脂肪酸。根据本发明的″内酯前体羟基脂肪酸″优选是一种羟基脂肪酸，其自羧基的碳原子起，在4-或5-位上具有羟基，并且具有至少4个、优选5-22个、更优选5-17个、进一步优选5-12个碳原子。
所述的内酯前体羟基脂肪酸的一个具体例子包括由通式(5)表示的羟基脂肪酸 其中R5表示任选取代的二价烃基，具有一条2个或3个碳的链；R1和R2如上所定义；以及做为选择，R2和R5可以连接在一起形成一个环。
R5，任选取代的二价烃基，包括二价烃基其具有一条2个或3个碳的链，和二价取代烃基其具有一条2个或3个碳的链。
所述的二价烃基其具有一条2个或3个碳的链，包括亚烷基其具有一条2个或3个碳的亚乙基或1，3-亚丙基链，和亚烯基其具有一条2个或3个碳的亚乙烯基或亚丙烯基链。
所述的二价取代烃基，其具有一条2个或3个碳的链，来源于上述二价烃基，其具有一条2个或3个碳的链，其中用上述取代基而不是羟基取代至少1个氢原子。二价取代烃基(具有一条2个或3个碳的链)的一个具体例子包括2-亚丙基等等。当R2和R5连接在一起形成一个环时，生成的环包括脂肪族环和芳香族环。脂肪族环包括环丁烷环、环戊环、环己环、环己烯环等等。芳香族环包括苯环等等。
本发明所使用的内酯前体羟基脂肪酸由通式(5)表示，其中R5表示烃(具有一条2个碳的链)，的具体例子包括γ-羟基癸酸、由下式表示的羟基脂肪酸等等。
由通式(5)表示的内酯前体羟基脂肪酸，其中R5表示烃(具有一条3个碳的链)，的具体例子包括δ-羟基癸酸和由下式表示的羟基脂肪酸。
当羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物或羟基脂肪酸衍生物的水解产物的光学活性物质在本发明的方法中使用时，所得的内酯前体羟基脂肪酸是一种由通式(5-1)表示的光学活性物质 其中R1、R2、R5和*如上所定义。在本发明中，内酯前体羟基脂肪酸优选使用光学活性的内酯前体羟基脂肪酸。
通过本发明的制备方法获得的内酯例如用通式(1)表示 其中环A表示内酯环；R1和R2如上所定义，其中环A和R2可以连接在一起形成一个环。
在通式(1)中由环A表示的内酯环包括由下式(7)表示的γ-内酯环和由下式(8)表示的δ-内酯环。环A也可以具有一个取代基。
环A和R2一起形成的环的具体例子包括由下式表示的环。
通过本发明的制备方法获得的内酯的例子包括，但不局限于，具有4个或更多个碳原子的内酯。其具体例子包括γ-癸内酯、γ-戊内酯、γ-己内酯、γ-庚内酯、γ-辛内酯、γ-壬内酯、γ-十一内酯、γ-十二内酯、γ-十三内酯、γ-十四内酯、δ-癸内酯、δ-己内酯、δ-庚内酯、δ-辛内酯、δ-壬内酯、δ-十一内酯、δ-十二内酯、δ-十三内酯、δ-十四内酯、当归内酯、whisky内酯、γ-jiasmolactone、茉莉内酯、顺-茉莉酮内酯、甲基γ-癸内酯、jasmolactone、薄荷内酯(menthalactone)、正丁基-2-苯并[c]呋喃酮、丙叉-2-苯并[c]呋喃酮、丁叉-2-苯并[c]呋喃酮、4，6，6，(4，4，6)-三甲基四氢吡喃-2-酮、δ-2-癸烯内酯、香豆素、二氢香豆素、环己基内酯、σ-甲基香豆素和由下式表示的内酯。
在上式中，R表示保护基。
在上述当中，具有5-12个碳的内酯，例如γ-癸内酯、γ-戊内酯、γ-己内酯、γ-庚内酯、γ-辛内酯、γ-壬内酯、γ-十一内酯、γ-十二内酯、γ-十三内酯、γ-十四内酯、δ-癸内酯、δ-己内酯、δ-庚内酯、δ-辛内酯、δ-壬内酯、δ-十一内酯、δ-十二内酯、δ-十三内酯和δ-十四内酯是特别优选的。
当羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物或羟基脂肪酸衍生物的水解产物的光学活性形式在本发明的制备方法中使用时，所得内酯是光学活性内酯。
例如，光学活性内酯的一个例子由通式(1-1)表示 其中环A、R1、R2和*如上所定义。
在此使用的术语″光学活性内酯″是指一种内酯，其是光学活性物质(例如R或S形式)。通过本发明方法制得的光学活性内酯由以下制得使用Candida sorbophila由羟基脂肪酸制得内酯前体羟基脂肪酸，然后将这种内酯前体羟基脂肪酸内酯化。或者，光学活性内酯由羟基脂肪酸通过使用Candida sorbophila制备。
通过本发明的制备方法获得的光学活性内酯包括，但不局限于，具有至少5个，优选5-12个碳原子的光学活性内酯。例如，可以获得上面作为具体例子给出的光学活性形式的内酯。其优选例子包括光学活性的γ-癸内酯、光学活性的γ-戊内酯、光学活性的γ-己内酯、光学活性的γ-庚内酯、光学活性的γ-辛内酯、光学活性的γ-壬内酯、光学活性的γ-十一内酯、光学活性的γ-十二内酯、光学活性的γ-十三内酯、光学活性的γ-十四内酯、光学活性的δ-癸内酯、光学活性的δ-己内酯、光学活性的δ-庚内酯、光学活性的δ-辛内酯、光学活性的δ-壬内酯、光学活性的δ-十一内酯、光学活性的δ-十二内酯、光学活性的δ-十三内酯和光学活性的δ-十四内酯。
(4)通过本发明的方法制备光学活性的γ-癸内酯通过使用制备光学活性的γ-癸内酯作为例子，本发明的光学活性内酯的制备方法将在下文中进行更详细地描述。本发明的光学活性内酯的制备方法基本上可以与光学活性γ-癸内酯的制备方法相同。
a)培养基，被用来培养用于制备光学活性的γ-羟基癸酸和/或光学活性的γ-癸内酯(主培养物的培养基)根据本发明，至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物质用作培养基的碳源，当进行培养，以便制备光学活性的γ-羟基癸酸和/或光学活性的γ-癸内酯时(在实施例中称为主培养物)。在本发明中，蓖麻油水解产物是指通过化学或酶水解蓖麻油获得的混合物。蓖麻油水解产物包括使用脂肪酶水解蓖麻油获得的水解产物(下文它称为″脂肪酶处理的水解产物″)。使用通过水解蓖麻油获得的水解产物的主要成分是蓖麻油酸。因此，蓖麻油水解产物主要由蓖麻油酸组成，蓖麻油酸是构成蓖麻油的一种主要脂肪酸。
任何脂肪酶可以用于水解蓖麻油，没有特别的限制，只要它可以从蓖麻油中制得蓖麻油酸。这种脂肪酶的例子，例如，包括脂肪酶OF和脂肪酶MY(Meito Sangyo Co.，Ltd.)；以及Newlase F3G、脂肪酶A″Amano″6、脂肪酶AY″Amano″30G、脂肪酶F-AP 15、脂肪酶G″Amano″50、脂肪酶M″Amano″10和脂肪酶R″Amano″G(Amano Enzyme Inc.)。脂肪酶处理的水解产物可以在下面的条件下获得其中主要由蓖麻油酸组成的水解产物从蓖麻油，例如，通过每100g蓖麻油中加入0.5g脂肪酶，在30℃下培养24小时获得。这种脂肪酶处理的水解产物可以以混合物的形式直接使用。
当蓖麻油水解产物含在本发明的主要培养基中时，优选将脂肪酶处理的水解产物加入到所述的培养基中。但是，在本发明的生产方法，由于以下原因，含蓖麻油的培养基在培养后在培养基中产生含脂肪酶处理的水解产物。也就是说，根据本发明的方法，在本发明所使用的Candida sorbophila的帮助下，在培养基中由蓖麻油生成水解产物。因此，加入脂肪酶处理的水解产物是一个任选步骤，如果培养基中含蓖麻油的话。
在本发明中，可以使用至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物质。这些物质可以单独使用，或者可以视情况任何两种或多种混合使用。在它们当中，蓖麻油和/或蓖麻油水解产物是特别优选的。
在每升培养基中，加入到培养基中的至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物质的浓度通常约10％-50％(w/v)，优选约15％-25％(w/v)。
如果需要，本发明所使用的培养基可以进一步含有其它组分例如酵母提取物、麦芽提取物、聚胨和葡萄糖。含其它组分的这种培养基可以作为一种营养培养基用于生产本发明的γ-羟基癸酸和/或光学活性的γ-癸内酯。
酵母抽提物、脲、玉米浆、硫酸铵、磷酸氢二胺等等可以作为氮源加入到上述培养基中。此外，麦芽提取物、聚胨和糖例如葡萄糖等等可以作为补充碳源加入到培养基中。
或者，还可以使用含至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid作为单一碳源的人工培养基。这种人工培养基可以进一步含有其它组分例如上述其它氮源或碳源。
通过向上述培养基中任选加入各种辅助因素，可以进一步增加所制备的光学活性γ-羟基癸酸和/或光学活性γ-癸内酯的收率。
辅助因素包括无机盐例如硫酸锰、氯化钙、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锌、硫酸铜、硫酸镁、氯化钴、钼酸钠、硼酸和碘化钾；辅酶例如黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和辅酶A(COA)；核苷酸例如三磷酸腺苷(ATP)；维生素例如L-肉碱。辅助因素的加入量可以非常少。
本发明所使用的主培养基包括通过向YM培养基、马铃薯葡萄糖培养基或马铃薯蔗糖培养基中加入至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid制得的培养基，以及通过向上述培养基中加入任何上述其它组分制得的培养基。
b)通过主要培养制备光学活性的γ-羟基癸酸和/或光学活性的γ-癸内酯在本发明中，通过将本发明的Candida sorbophila在上面a)中所述的培养基中进行培养，可以在培养基中产生和累积γ-羟基癸酸和/或光学活性γ-癸内酯。
本发明的Candida sorbophila可以直接接种和培养在a)的培养基上。但是，优选，将这种Candida sorbophila预先在一种常规培养基中进行种子培养，然后将所得物接种或涂布到培养基a)中进行培养。种子培养的条件可以与用于生产γ-羟基癸酸和/或光学活性γ-癸内酯的培养(主培养)相同。但是，所述的条件没有特别地限制，只要Candidasorbophila菌株可以增殖就行。用于种子培养的常规培养基可以是固体或液体。它可以含有或不含有至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物质。种子培养培养基包括YM斜面琼脂培养基和马铃薯葡萄糖斜面琼脂培养基。加入到进行主培养的培养基中的种子培养产物的数量并没有特别地限制。但是，当种子培养产物例如是液体时，相对于主培养基的数量，优选加入1％-3％数量的在610nm(OD 610)具有约30吸光度的培养产物。或者，在预培养之前，进行种子培养，然后在培养基中a)中进行主培养。这种双阶段培养适合于大量生产，特别是可用于工业生产。预培养的条件可以与主培养相同。但是，所述条件没有特别地限制，只要Candida sorbophila菌株可以增殖就行。种子培养培养基可以含有或不含有至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的物质。
在本发明的生产方法中，培养条件是需氧的。培养温度视情况进行选择，通常在20℃-35℃的范围内，优选在24℃-30℃的范围内。培养基的pH水平视情况进行选择，通常在5至7之间，优选在5.5至6.5之间。例如以振荡培养的方式在摇瓶或发酵罐(例如装有搅拌器和曝气机的发酵罐)中进行培养。
主培养的时间没有特别地限制，只要它足够长，以便产生光学活性γ-羟基癸酸和/或光学活性γ-癸内酯。优选地，以这样一种方式选择时间，以便使产生的光学活性γ-羟基癸酸和/或光学活性γ-癸内酯的数量达到最大水平。这样的时间随下面的因素而变例如培养基的组成、至少一种作为底物加入的选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic酸的数量、以及所使用的培养装置的通风和搅拌效率。例如，在使用摇瓶作为培养装置进行培养的情况下，培养时间可以视情况进行选择，通常在1小时-30天的范围内，优选在12小时-25天的范围内。在使用发酵罐进行培养的情况下，培养时间可以视情况进行选择，通常在1天-20天的范围内，优选在3天-10天的范围内。使用发酵罐可以在相对短的时间内完成培养，因此从生产效率的角度来考虑，它是优选的。
进行足够长时间的培养，以产生足够数量的光学活性γ-癸内酯，培养时间可以按照下面的方式进行测定。在时间过程中，对在培养基中产生的光学活性γ-癸内酯进行取样。或者，在时间过程中，对在培养基中产生的γ-羟基癸酸进行取样，然后进行内酯化。然后，所得光学活性Y-癸内酯的数量通过气相色谱(GC)、薄层层析(TLC)、或气相色谱/质谱(GC-MS)进行确定，如果需要，进一步与标准进行比较。
c)从光学活性γ-羟基癸酸制备光学活性γ-癸内酯以上述方式在一种培养基中制得的光学活性γ-羟基癸酸可以用作药物中间体等等。但是，在本发明中，通过内酯化作用，上述γ-羟基癸酸还可以转化为光学活性γ-癸内酯。
可以通过其任何常规技术进行内酯化。通过常规技术回收在上述培养基中制得的γ-羟基癸酸后，可以进行本发明的光学活性γ-羟基癸酸的内酯化。或者，当培养基含有光学活性的γ-羟基癸酸时，培养完成后，可以对培养基进行直接内酯化。
上述内酯化可以通过常规技术进行，例如在培养液中进行内酯化。这种方法的一个具体例子是培养完成后，将酸例如稀盐酸或稀硫酸加入到培养液中，以酸化所述的培养液。
在本发明中，内酯化优选在没有对培养液进行酸化的情况下进行，以便获得光学活性γ-癸内酯，这种内酯具有与自然态中的那些尽可能接近的性质。在本发明中，由于培养完成后培养液的pH水平已经在3.0至4.5的酸性范围内，不需要进一步酸化培养液就可以得到酸性培养液。通常，在没有酸化培养液的情况下，通过将这种酸性培养液加热约10分钟-1小时，优选加热约10分钟-30分钟，可以实现含在培养液中的光学活性γ-羟基癸酸的内酯化。加热温度设定在约70℃-130℃之间，优选在约90℃-120℃之间。在本发明中，当进行内酯化时，培养基的pH水平在酸性条件内是足够的，优选pH在2至5之间。
在本发明中，这种内酯化可以将光学活性的γ-羟基癸酸转化为光学活性的γ-癸内酯。
通过离心或其它方法从培养液中分离和除去细胞后，通过常规技术例如溶剂萃取和蒸馏，可以将获得的光学活性γ-癸内酯从培养液中进行回收和提纯。
根据本发明的制备光学活性的γ-癸内酯的方法，可以获得高光学纯度的R-γ-癸内酯。
由本发明的生产方法获得的内酯可以用于调味剂和香精物质、药物中间体等等。例如，R-γ-癸内酯可以用于增加、增强或改善饮料、口香糖、果汁、烟制品、药物制剂、调味剂和/或香精制剂、香味产物等等的风味作为它的特征，R-γ-癸内酯具有一种比S-γ-癸内酯更强的香味，并且有利地具有一种更像天然果实的香味(A.Mosandle et al.，J.Agric.Food Chem.，37，413，1989)。
(5)结论本发明生产方法的特点在于使用Candida sorbophila。根据本发明的方法，可以获得高光学纯度的光学活性内酯例如R-γ-癸内酯或R-δ-癸内酯。此外，在制备R-γ-癸内酯方面，本发明的制备光学活性的γ-癸内酯的方法具有高的效率。由于Candida sorbophila较少地引起在本发明生产系统中生成的R-γ-癸内酯的破坏，因此由本发明方法提供的这种高生产率是可能的。特别地，据信Candida sorbophila不会分解R-γ-癸内酯，导致高的生成效率。但是，应该指出的是，本发明的技术范围不应该限于这种假设的理论。
本发明的方法有助于有效制备高纯度的光学活性内酯并且在工业生产中可以改善工作效率。
本发明的优选实施方案参考下面的实施例，本发明将在下文中进行更详细地说明，不过本发明的技术范围并不受这些实施例的限制。
在下面的实施例中，气相色谱(GC)分析在下列条件下进行。
仪器型号5890，Hewlett Packard色谱柱BC-WAX(0.25mm(直径)×30m(长度)，GL Sciences)内标试样癸酸乙酯(1.0v/v％)在实施例中制得的内酯的光学纯度通过GC分析进行测定(仪器G3000，色谱柱Chirasil-DEX-CB，0.25mm(直径)×25m(长度)，Hitachi)。
实施例1将FC 58菌株接种在YM斜面琼脂培养基上，在27℃下培养3天以进行活化。预培养的培养基以下面的方式进行制备。首先，将0.09g酵母抽提物、0.09g麦芽提取物、0.15g聚胨和0.3g葡萄糖放在一个体积为300mL的锥形瓶中，向其中加入蒸馏水，使总体积达到30mL，pH6。生成物在高压釜中在121℃下灭菌15分钟。将由此制得的培养基冷却，以上述方式活化的FC 58菌株接种在其上，在旋转振荡培养装置中，在27℃和150rpm下振荡培养24小时，制得一种预培养液。此外，制备用于随后主培养的培养基。具体地说，将0.3g酵母抽提物、0.3g麦芽提取物和0.5g聚胨放在一个体积为500mL的坂口瓶中，向其中加入蒸馏水，使总体积达到100mL，pH6，再向其中加入20g蓖麻油。生成物在高压釜中在121℃下灭菌15分钟。随后，将用于主培养的培养基冷却，将2ml上述预培养液接种在其上，通过振荡培养在27℃和150rpm下进行主培养。在培养期间，没有调节pH水平。培养后，培养液的pH水平是4.06。开始培养3天后，对培养液进行无菌取样，每次5ml，取样在时间过程内进行，将取得的培养液(样品)独立地加热到100℃，加热20分钟，以对γ-羟基癸酸进行内酯化。这种内酯化后，样品用乙酸乙酯萃取，分离的有机层通过气相色谱(GC)分析进行定量，使用内标法(用癸酸乙酯作为内标试样)。结果，在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养14天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是8.41g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例2除使用20g蓖麻油酸(80％的纯度或更高，Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)而不是20g蓖麻油外，以与实施例1相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养20天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是21.89g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例3除向主培养基中加入1.7mg硫酸锰(MnSO4·H2O)、0.55mg氯化钙(CaCl2·H2O)、0.375mg氯化铁(FeCl3·H2O)、2.2mg硫酸锌(ZnSO4·H2O)、0.4mg硫酸铜(CuSO4·H2O)、5.9mg硫酸镁(MgSO4·H2O)、0.28mg氯化钴(CoCl2·H2O)、0.26mg钼酸钠(Na2MoO4·H2O)、0.4mg硼酸(H3BO3)和0.06mg碘化钾(KI)外，以与实施例2中相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养20天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是27.37g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例4将FC 58菌株接种在YM斜面琼脂培养基上，在27℃下培养3天以进行活化。用于预培养的培养基以下面的方式进行制备。首先，将0.3g酵母抽提物、0.3g麦芽提取物、0.5g聚胨和1.0g葡萄糖放在一个体积为500mL的坂口瓶中，向其中加入蒸馏水，使总体积达到100mL，pH6。生成物在高压釜中在121℃下灭菌15分钟。将由此制得的培养基冷却，以上述方式活化的FC 58菌株接种在其上，在旋转振荡培养装置中，在27℃和150rpm下振荡培养24小时，制得一种预培养液。此外，制备一种用于随后主培养的培养基。具体地说，6.0g酵母抽提物、6.0g麦芽提取物、10.0g聚胨、34mg硫酸锰(MnSO4·H2O)、11mg氯化钙(CaCl2·H2O)、7.5mg氯化铁(FeCl3·H2O)、44mg硫酸锌(ZnSO4H2O)、8.0mg硫酸铜(CuSO4·H2O)、118mg硫酸镁(MgSO4·H2O)、5.6mg氯化钴(CoCl2·H2O)、5.2mg钼酸钠(Na2MoO4·H2O)、8.0mg硼酸(H3BO3)和1.2mg碘化钾(KI)放入一个体积为5L的小型发酵罐中，向其中加入蒸馏水，使总体积达到2,000ml，pH6，向其中再加入400g蓖麻油酸(80％的纯度或更高，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)。生成物在高压釜中在121℃下灭菌15分钟。随后，将用于主培养的培养基冷却，40ml上述预培养液接种在其上，在600rpm的搅拌速率下，1,000ml/mm的曝气速率和27℃下，进行主培养。在培养期间，没有调节pH水平。培养后，培养液的pH水平是4.75。开始培养3天后，对培养液进行无菌取样，每次5ml，取样在时间过程内进行，将取得的培养液(样品)独立地加热到100℃，加热20分钟，以对γ-羟基癸酸进行内酯化。这样进行内酯化后，样品用乙酸乙酯萃取，分离的有机层通过气相色谱(GC)分析进行定量，使用内标法(用癸酸乙酯作为内标试样)。结果，在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养10天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是49.94g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例5除使用用脂肪酶(脂肪酶OF，Meito Sangyo Co.，Ltd.)处理600g蓖麻油获得的水解产物而不是400g蓖麻油酸(80％的纯度或更高，WakoPure Chemical Industries，Ltd.)外，以与实施例4相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养5天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是40.50g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例6除使用Candida sorbophila菌株ATCC 74362、Candidasorbophila菌株ATCC 60130或Candida sorbophila菌株IFO 1583而不是Candida sorbophila菌株FC 58外，以与实施例2相同的方式制备光学活性的γ-癸内酯。结果，对于每一种上述细胞株，在培养液中制得的γ-癸内酯的数量分别在开始培养19天、11天和11天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量分别是13.75g、12.97g和12.97。
实施例7除取样得到的培养液(取样)不通过加热进行内酯化以外，以与实施例1相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养14天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是8.41g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例8除取样得到的培养液(样品)不通过加热进行内酯化以外，以与实施例2相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，发现在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养20天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是21.89g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例9除取样得到的培养液(样品)不通过加热进行内酯化以外，以与实施例3相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，发现在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养20天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是27.37g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例10除取样得到的培养液(样品)不通过加热进行内酯化以外，以与实施例4相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，发现在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养10天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是49.94g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例11除取样得到的培养液(样品)不通过加热进行内酯化以外，以与实施例5相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，发现在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量在开始培养5天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量是40.50g。其光学纯度是99％ee或更高。
实施例12除取样得到的培养液(样品)不通过加热进行内酯化以外，以与实施例6相同的方式制备R-γ-癸内酯。结果，对于每一种上述细胞株，发现在培养液中制得的R-γ-癸内酯的数量分别在开始培养19天、11天和11天后达到最大。这样，每升主培养基中，R-γ-癸内酯的量分别是13.75g、12.97g和12.97g。
实施例13将FC 58菌株接种在YM斜面琼脂培养基上，在27℃下培养3天以进行活化。用于预培养的培养基以下面的方式进行制备。首先，将0.09g酵母抽提物、0.09g麦芽提取物、0.15g聚胨和0.3g葡萄糖放在一个体积为300ml的锥形瓶中，向其中加入蒸馏水，使总体积达到30ml，pH6。生成物在高压釜中在121℃下灭菌15分钟。将由此制得的培养基冷却，以上述方式活化的FC 58菌株接种在其上，在旋转振荡培养装置中，在27℃和150rpm下振荡培养24小时，制得一种预培养液。
此外，制备一种用于随后主培养的培养基。具体地说，0.09g酵母抽提物、0.09g麦芽提取物、0.1g聚胨、0.51mg硫酸锰(MnSO4·H2O)、0.17mg氯化钙(CaCl2·H2O)、0.11mg氯化铁(FeCl3·H2O)、0.66mg硫酸锌(ZnSO4·H2O)、0.12mg硫酸铜(CuSO4·H2O)、1.77mg硫酸镁(MgSO4·H2O)、0.08mg氯化钴(CoCl2·H2O)、0.08mg钼酸钠(Na2MoO4·H2O)、0.12mg硼酸(H3BO3)和0.02mg碘化钾(KI)放入一个体积为300mL的坂口瓶中，向其中加入蒸馏水，使总体积达到30ml，pH6，向其中再加入0.13g 11-羟基棕榈酸乙酯。生成物在高压釜中在121℃下灭菌15分钟。随后，将用于主培养的培养基冷却，将2ml上述预培养液接种在其上，在中振荡培养在27℃和150rpm下进行主培养。在培养期间，没有调节pH水平。开始培养3天后，对培养液进行无菌取样，每次5ml，取样在时间过程内进行，将取得的培养液(样品)独立地加热到100℃，加热20分钟，以对δ-羟基癸酸进行内酯化。这样进行内酯化后，样品用乙酸乙酯萃取，分离的有机层通过GC分析进行定量，使用内标法(用癸酸乙酯作为内标试样)。
结果，发现在培养液中制得的S-δ-癸内酯的数量在开始培养11天后达到最大。这样，每30mL主培养基中，S-δ-癸内酯的量是0.019g。其光学纯度是96％ee或更高。
实施例14除取样得到的培养液(样品)不通过加热进行内酯化以外，以与实施例13相同的方式制备S-δ-癸内酯。结果，发现在培养液中制得的S-δ-癸内酯的数量在开始培养11天后达到最大。这样，每30mL主培养基中，S-δ-癸内酯的量是0.019g。其光学纯度是96％ee或更高。
参考实施例1除使用Yarrowia lipolytica菌株IFO 0717(其已知具有强的制备γ-癸内酯能力)代替FC 58菌株外，以与实施例2的相同方式制备γ-癸内酯。结果，发现在培养液中制得的γ-癸内酯的数量在开始培养6天后达到最大。这样，每升主培养基中，γ-癸内酯的量是4.90g。其后，所制得的γ-癸内酯的数量在时间过程内进行监测。这显示开始培养6天后，每升主培养基所制得的γ-癸内酯的数量开始下降。开始培养23天后，每升主培养基所制得的γ-癸内酯的数量是3.17g。
在此引用的所有出版物、专利和专利申请在此整个引入作为参考。
工业实用性根据本发明，可以容易地生产率高的获得一种内酯，例如一种光学活性内酯包括光学活性的γ-癸内酯(例如，R-γ-癸内酯)和光学活性的δ-癸内酯。此外，当进行本发明生产方法的时候，在中间步骤中，可以有效地制备内酯前体羟基脂肪酸，例如γ-羟基癸酸或δ-羟基癸酸。在本发明的制备方法中，不需要向培养基中加入乳化剂或pH调节剂，以及碳源，例如，羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物和/或羟基脂肪酸衍生物的水解产物可以以大规模生产所需的足够高的浓度加入到培养基中。因此，本发明的方法在工业生产中非常有用。
权利要求
1.一种制备内酯的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila，然后从培养基中回收生成的内酯。
2.一种制备内酯的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila，然后对从培养基中生成的内酯前体羟基脂肪酸进行内酯化。
3.权利要求1或2的方法，其中candida sorbophila是至少一种选自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candida sorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candidasorbophila菌株FC 58的微生物，它们以登记号FERM BP-8388保藏。
4.权利要求1或2的方法，其中内酯用下面的通式(1)表示 其中环A表示一个内酯环；R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；以及R2表示氢原子、烃基或取代烃基；其中环A和R2可以连接在一起形成一个环。
5.权利要求1或2的方法，其中内酯是光学活性内酯。
6.权利要求1或2的方法，其中羟基脂肪酸用下面的通式(2)表示 其中R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；R2表示氢原子、烃基或取代烃基；以及R3表示任选取代的二价烃基，具有一条4个或更多个碳的链；其中R2和R3可以连接在一起形成一个环。
7.权利要求1或2的方法，其中羟基脂肪酸衍生物是羟基脂肪酸烷基酯或羟基脂肪酸甘油酯。
8.权利要求7的方法，其中羟基脂肪酸烷基酯用下面通式(3)表示 其中R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；R2表示氢原子、烃基或取代烃基；以及R3表示任选取代的二价烃基，具有一条4个或更多个碳的链；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以连接在一起形成一个环。
9.权利要求7的方法，其中羟基脂肪酸甘油酯用下面通式(4)表示 其中R6-R8每个独立地表示氢原子或下面通式(6)表示的基团 其中R1表示氢原子、烃基、取代烃基、杂环基或取代的杂环基；R2表示氢原子、烃基或取代烃基；R3表示任选取代的二价烃基，具有一条4个或更多个碳的链；以及R4表示烷基；其中R2和R3可以连接在一起形成一个环，条件是R6-R8中至少一个是上述通式(6)表示的基团。
10.权利要求1或2的方法，其中candida sorbophila在含至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸、11-羟基棕榈酸、lesquerolicacid、10-羟基硬脂酸、10-羟基棕榈酸和11-羟基棕榈酸乙酯的培养基中进行培养。
11.权利要求2的方法，其中内酯前体羟基脂肪酸是具有4个或更多个碳原子的羟基脂肪酸，其在4或5位具有一个羟基。
12.权利要求1或2的方法，其中内酯是选自γ-癸内酯、γ-戊内酯、γ-己内酯、γ-庚内酯、γ-辛内酯、γ-壬内酯、γ-十一内酯、γ-十二内酯、γ-十三内酯、γ-十四内酯、δ-癸内酯、δ-己内酯、δ-庚内酯、δ-辛内酯、δ-壬内酯、δ-十一内酯、δ-十二内酯、δ-十三内酯和δ-十四内酯的任何一种。
13.一种制备内酯前体羟基脂肪酸的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila。
14.一种制备γ-癸内酯的方法，包括在含至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介质中培养candidasorbophila，然后从介质中回收生成的γ-癸内酯。
15.一种制备γ-癸内酯的方法，包括在含至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid的介质中培养candidasorbophila，然后对从介质中生成的γ-羟基癸酸进行内酯化。
16.权利要求14或15的方法，其中γ-癸内酯是光学活性γ-癸内酯。
17.权利要求14或15的方法，其中至少一种选自蓖麻油、蓖麻油水解产物、蓖麻油酸和lesquerolic acid是蓖麻油和/或蓖麻油水解产物。
18.一种制备δ-癸内酯的方法，包括在一种含11-羟基棕榈酸和/或11-羟基棕榈酸乙酯的介质中培养candida sorbophila，然后从介质中回收生成的δ-癸内酯。
19.一种制备δ-癸内酯的方法，包括在一种含11-羟基棕榈酸和/或11-羟基棕榈酸乙酯的介质中培养candida sorbophila，然后对从介质中生成的δ-羟基癸酸进行内酯化。
20.权利要求18或19的方法，其中δ-癸内酯是光学活性δ-癸内酯。
21.权利要求14、15、18或19的方法，其中candida sorbophila是至少一种选自candida sorbophila菌株ATCC 74362、candidasorbophila菌株ATCC 60130、candida sorbophila菌株IFO 1583和candida sorbophila菌株FC 58，以登记号FERM BP-8388保藏。
22.candida sorbophila的用途，用于制备内酯。
23.candida sorbophila菌株FERM BP-8388。
全文摘要
一种制备内酯的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila，然后从培养基中回收生成的内酯。本发明还提供一种制备内酯的方法，包括在含至少一种选自羟基脂肪酸、羟基脂肪酸衍生物、羟基脂肪酸衍生物的水解产物的培养基中培养candida sorbophila，然后对从培养基中生成的内酯前体羟基脂肪酸进行内酯化。
文档编号C12P17/02GK1675370SQ0381964
公开日2005年9月28日 申请日期2003年6月27日 优先权日2002年6月28日
发明者三桥胜久, 饭森真人 申请人:高砂香料工业株式会社