专利名称：人绒毛膜促性腺激素重组多表位嵌合肽cp22抗原的分子设计及其制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地说，本发明涉及人绒毛膜促性腺激素重组多表位嵌合肽CP22抗原及其制备方法。
背景技术：
人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)别称妊娠激素，是维持人类早期怀孕的一种糖蛋白激素，它由α和β两个亚单位构成。另外，它也早被鉴定为是一种癌胚抗原，其在许多恶性肿瘤中都有表达，例如在胰腺、肺、结直肠、子宫颈、卵巢、肝、胃等癌中都能检测到hCG及其亚单位或片段的存在(Triozzi P and StevensVC.Human chorionic gonadotropin as a target for cancer vaccines.Oncol Rep 67-17，1999)。因此，hCG一直被认为是研制避孕和/或肿瘤治疗性疫苗的重要靶抗原。作为疫苗，迄今用的最多的是从天然hCG中纯化拆分的其hCGβ亚单位和含β9和β8两个特异B-细胞表位的hCGβ羧基端(carboxyl-terminal peptide，CTP)合成37肽抗原。虽然与羊LHα亚单位偶联的hCGβ异源二聚体(HSD-hCG)疫苗已通过人临床II期功效试验(Talwar GP，et al.A vaccine that prevents pregnancy in women.Proc Natl Acad SciUSA，1994；918523-8536)，验证了免疫避孕的可行性而具有里程碑意义，但由于其一些难以克服的缺陷和实际问题被认定不适合推广应用(Stevens VC.Progress in thedevelopment of human chorionic gonadotropin antifertility vaccines.Am J ReprodImmunol，1996；35148-155.Talwar GP，Singh Om，Gupta SE，et al.The HSD-hCGvaccine prevents pregnancy in womenfeasibility study of a reversible safe contraceptivevaccine.Am J Reprod Immunol，1997；37153-160)。例如纯化拆分hCGβ抗原不易且成本高；疫苗原需要与羊LHα亚单位和破伤风类毒素(TT)或白喉类毒素(DT)偶联，以及因是自身抗原免疫原性弱而需要特别佐剂，除由此大大增加疫苗成本外，且难以按GMP标准大量生产疫苗；人临床II期的功效试验中有20％受试妇女对疫苗不应答或无效应答等。hCGβ-CTP合成肽疫苗也存在类似问题，相应的人临床II期功效试验一直未能顺利实施。不过，最近它作为hCG依赖性恶性肿瘤治疗性疫苗还是通过了人临床II期功效试验(Moulton HM，et al.Active specific immunotherapy with aβ-human chorionic gonadotropin peptide vaccine in patients with metastatic colorectalcancerantibody response is associated with improved survival.Clin Cancer Res，2002；8(7)2044-2051)，主动免疫抑制肿瘤生长或延长患者生存期的效果明显，从而展现了hCGβ-CTP合成肽疫苗在肿瘤免疫治疗上的应用前景。但是无需赘言，真正实际人临床应用也需要克服解决与DT偶联、需要特别佐剂(降低疫苗成本和便于制剂生产)、疫苗特异性强但所产生抗体对hCG中和性能差、以及如何提高和改善不同遗传背景肿瘤患者接种后的免疫应答率和治疗功效等问题。
另一方面，化学合成肽疫苗的研制一直被寄予厚望，希望它能为人类疾病的预防和治疗作出贡献，但近四十年来尚未开发出一个能实际应用的合成肽疫苗，尽管它有许多诸如可以获得恒定且相对价廉的稀有抗原等明显优点。造成这一局面的原因主要在于靶抗原单一B-细胞表位(B-cell epitope，BCE)肽不足以产生完全的免疫效果。尽管如此，那些研究还是为目前发展形成的多表位生物合成(也称重组)嵌合肽疫苗趋势(Xu WX.Trends in the development of chimeric peptide vaccines containing B-and T-cell epitopes.US Chin J Microbiol Immunol，2000；2(4)95-100)奠定了基础，其中一些研究启示在合成肽中共线性连接地掺入强和/或“广谱性”T-细胞表位(T-cell epitope，TCE；Sinigaglia F，et al.A malaria T cell epitope recognized in association with mostmouse and human class II molecules.Nature 336778-780，1998；Panina-Bordignon P，etal.Universally immunogenic T cell epitopespromiscuous binds to human class II andpromiscuous recognition by T cells.Eur J Immunol，1989；192237-2242)，能起到分子佐剂作用，并使目的嵌合肽疫苗具有跨越MHC免疫应答遗传限制的性能(Greenstein JL，et al.A universal T cell epitope-containing peptide from hepatitis B surface antigen canenhance antibody specific for HIV gp120.J Immunol，1992；1483970-3977.Lou YH，et al.A zona pellucida 3 peptide vaccine induces antibodies and reversible infertilitywithout ovarian pathology.J Immunol，1995；1552715-2720)，从而为同时攻克解决无需特别佐剂，在不同遗传背景人群中提高免疫应答率，即疫苗百家姓等难题提供了新思路新途径。受化学合成肽长度的限制，发展重组(也称基因工程或生物合成)多表位嵌合肽(chimeric peptide，CP)是一种必然选择，但由于相关知识和技术的限制，所设计嵌合肽分子能被一生物系统表达并完成动物免疫学研究的报道很少，不过仅有的几例还是展现了重组多表位合成肽疫苗的可行性和发展前景，如在大肠杆菌中表达的组合帽猴ZP三个糖蛋白3个B-细胞表位的CP改善了免疫学功能(Sivapurapu N，et al.Efficacy of antibodies against Escherichia coli expressed chimeric recombinant proteinencompassing multiple epitopes of zona pellucida glycoproteins to inhibit in vitro humansperm-egg binding.Mol Reprod Dev，2003；65309-317)，特别是在昆虫细胞中表达的组合12个B-细胞表位以及6个辅助T-细胞表位和1个广谱性T-细胞表位的疟原虫CP免疫原不仅无需特别佐剂就能产生较强的特异的抗体应答，而且还显示出具有跨越MHC限制的能力(Shi YP，Hasnain SE，Sacci JB，et al.Immunogenicity and in vitroprotective efficacy of a recombinant multistage Plasmodium falciparum candidate vaccine.Proc Natl Acad Sci USA，1999；961615-1620.Shi YP，Das P，Holloway B，et al.Development，expression，and murine testing of a multi-stage Plasmodium falciparummalaria vaccine candidate.Vaccine，2000，182902-2914)。
除了以上hCG疫苗，尤其是hCGβ-CTP合成肽疫苗的研制现状和化学合成肽领域新进展的启示，研制重组hCG多表位CP的必要性也基于如下报道，即复合并用hCGβ环肽38-57(内含β5线性B-细胞表位45-52)和hCGβ-CTP109-145(内含β9和β8特异的线性B-细胞表位113-116，137-144)两种合成肽疫苗实验的提示，因为hCGβ环肽和hCGβ-CTP合成肽(均与DT偶联)疫苗1∶1混合物的抗体应答水平显著高于两者单独免疫的效果，而且与单一合成肽疫苗的抗血清相比较，混合物免疫产生的抗血清中和以及结合靶hCG的能力也有明显的改善(Stevens VC.Am J Reprod Immunol，1996；35148-155)。
发明内容
本发明一方面提供了一种分离的多肽，该肽是人绒毛膜促性腺激素重组多表位嵌合肽CP22，它基本上由表位肽HBsAg19-33、表位肽HBcAg85-140和表位肽TT580-599，以及两组人绒毛膜促性腺激素β5表位肽、β8表位肽和β9表位肽组成。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。术语“分离的多肽”是指本发明的多肽基本上不含其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术来纯化该多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。术语“基本上由……组成”指该多肽中还可包含其它任何氨基酸，只要这些氨基酸的存在对于本发明的嵌合肽的生物效果没有实质性的不利影响。如下所示，本发明的嵌合肽中的各表位肽之间还可有增强嵌合肽亲水性的氨基酸片段或改善蛋白分子结构的柔性接头或转角肽。
本发明的嵌合肽中含有的各个表位肽的前后次序可任意互换。因此，尽管在本发明实施例中该嵌合肽中各表位肽是以HBsAg19-33-HBcAg85-140-表位肽TT580-599-β5表位肽-β9表位肽-β8表位肽-β5表位肽-β9表位肽-β8表位肽的次序依次连接的，但是本领域技术人员能够明了，将其中任意两个或多个表位肽的位置互换仍然能够获得有用的嵌合肽。
在较佳的方案中，各表位肽之间宜插入亲水性片段，以增强所述嵌合肽的亲水性，同时以达到适合一生物表达系统表达的合适长度。在一个更佳的实施方案中，两个或多个表位肽之间宜具有由6-15个(更佳为6-10个，最佳为6-8个)亲水性氨基酸构成的亲水性间隔臂。表位肽之间还可以插入屈曲的柔性接头，如β转角肽或Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(GGGGS)重复序列等，以改善嵌合肽的蛋白分子构象。这种接头的长度宜多达30个氨基酸，其作用是使嵌合肽中的各表位肽相互分开，以避免发生不正确的折叠使嵌合肽失去活性。
在另一较佳的实施方案中，所述肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
本发明第二个方面提供了一种分离的核酸序列，其特征在于，它编码上述分离的多肽。在一个较佳的实施方案中，所述核酸序列具有SEQ ID NO2所示的核酸序列。在本发明中，术语“核酸”指脱氧核糖核酸或核糖核酸及其单链或双链形式的聚合物。除非另有特别限定，该术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参比核酸相似的结合性能，并以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。术语“核酸”可与基因、cDNA和mRNA互换使用。另外，本发明的核酸序列可经过修饰以使用针对特别细胞类别而言较佳的密码子。例如，为了提高在大肠杆菌中的表达，可将部分氨基酸密码子变换为大肠杆菌偏好的密码子。本发明的核酸序列可用本领域技术人员熟知的方法来获得，例如，可根据本发明公开的序列人工合成、化学拼接、或用PCR法扩增得到。
本发明另一方面提供了一种表达载体，该表达载体含有上述序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。本发明还提供了经该表达载体转化或转导的宿主细胞。该表达载体可用本领域熟知的各种方法来获得，通过选择合适的酶切位点将上述这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们与表达载体中的表达调控序列操作性相连。“表达调控序列”通常指参与控制核酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。本发明中所用的表达载体可采用本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如pET11C细菌表达质粒。
然后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”可包括原核细胞和真核细胞。在本发明中，较佳的宿主细胞是原核宿主细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌等。本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括电穿孔；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。因此，本发明另一方面还提供了经上述表达载体转化的宿主细胞。
本发明另一方面提供了一种制备上述分离的多肽的方法，其特征在于，该方法包括a)用化学合成拼接的方法获得SEQ ID NO2所示的核酸序列；b)将步骤a)所得核酸序列插入表达载体中使其与表达调控序列操作性相连；c)用步骤b)所述的表达载体转化宿主细胞；d)在适合所述肽表达的条件下培养步骤c)所得的宿主细胞；和e)分离纯化获得所述肽。
本发明还有一个方面提供了一种疫苗组合物，它含有上述分离的多肽以及药学上可接受的载体。该疫苗组合物可用于治疗肿瘤和/或人类避孕。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的多肽相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知和容易选择的。本发明的疫苗组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。疫苗可以结合其它免疫调节剂或免疫佐剂一起给予。
本发明另外一个方面提供了一种分离的多肽序列，它由HBsAg19-33、HBcAg85-140和TT580-599组成(由SEQ ID NO1的氨基端92个氨基酸残基组成)。这一载体可用于设计构建其他靶抗原的重组多表位嵌合肽或它(们)的编码基因。在前者T-细胞表位肽的编码核苷酸序列中，TT580-599表位中间预留了1个Taq I(TCGA)限制性内切酶位点，所以其他靶抗原多个B-细胞表位串联基因编码片段只需要在其5′-端同时合成TT表位后半段11个氨基酸编码碱基片段，就能在此Taq I位点完成目的全基因片段拼接。
本发明提供了一个编码hCGβ加倍6个线性B-细胞表位(-β5表位肽-β9表位肽-β8表位肽-β5表位肽-β9表位肽-β8表位肽)和外源性6个Th-细胞表位(包括HBsAg19-33和TT580-599二个广谱性表位)的合成基因(CP22)及其重组表达质粒。构建的βET11c-CP22重组质粒能在大肠杆菌中以包涵体形式表达嵌合肽CP22蛋白。相比以前设计仅含单组3个β表位半分子肽的CP1和CP10以及CP7和CP11两类hCG CPs抗原(专利申请号03115893.5和03115894.3，这两份专利申请均纳入本文作为参考)，本发明通过基因工程实现了加倍6个靶抗原表位与T-细胞表位肽的共线性连接，表达的CP22嵌合肽由于删除了各表位肽两端疏水性氨基酸残基而增加了目的CP22蛋白的亲水性，分子量也更大一些(利于制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化)，尤其是动物免疫实验结果揭示其抗原性和免疫原性比之仅掺入3个靶表位的CP抗原更佳，即仅使用铝盐佐剂免疫兔和3个不同近交系小鼠品系中都能产生高水平抗体应答，并能在所产生抗血清中检测到3种抗各表位抗体，与对照标准hCGβ-CTP合成肽/DT相比，体内中和hCG的能力也有明显提高。从而为研制免疫原性更佳并能在遗传背景不同的被免疫人群中产生广泛免疫应答的hCG生物合成肽免疫原奠定了基础。所独特设计的hCG CP22抗原/编码基因能在大肠杆菌中表达，从而为研制新型优化且廉价恒定地获得hCG重组多表位CP疫苗重组重组有望成为可能。
图1为hCG重组多表位嵌合肽CP22表达和纯化蛋白的SDS-PAGE分析，其中黑箭头指示CP22表达蛋白带。
图2为hCG重组多表位嵌合肽CP22表达和纯化蛋白的蛋白印迹鉴定，其中M为蛋白质分子量标准，1为8Mol尿素溶解诱导CP22工程菌包涵体蛋白样品，2为8Mol尿素溶解未诱导CP22工程菌包涵体蛋白样品，3为纯化的CP22蛋白样品，4为诱导CP22工程菌蛋白样品，5为未诱导CP22工程菌蛋白样品。
图3为CP22主动免疫兔后的抗体应答水平检测。用铝盐佐剂(Alum)吸附的纯化CP22蛋白(每次0.5毫克)主动免疫兔(N＝6)四次后第7天采集抗血清测定的平均抗体滴度。ELESA法中使用hCGβ亚单位作为抗原，抗体滴度以最高稀释度表示。抗原对照分别为标准的hCGβ-CTP/DT和仅组合3个B-细胞表位的CP12蛋白，佐剂对照为幅氏佐剂(CFA)。
图4为CP22主动免疫小鼠后的抗体应答水平检测。用幅氏佐剂的纯化CP22蛋白(每次0.1毫克)主动免疫三种不同近交系品系小鼠(N＝4)四次后第7天采集抗血清测定的平均抗体滴度。ELESA法中使用hCGβ亚单位作为抗原，抗体滴度以最高稀释度表示。
图5为CP22主动免疫兔后采集抗血清中各表位抗体生成的鉴定，其中1为未表达链亲和素(Stv)-单一表位(β5 BCE)融合蛋白的工程菌总蛋白样品，2为含表达Stv-β5BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，3为含表达Stv-β9 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，4为含表达Stv-β8 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，5为蛋白质分子量标准。
图6为CP22主动免疫Balb/C小鼠后采集抗血清中各表位抗体生成的鉴定，其中1为蛋白质分子量标准，2为含表达Stv-β8 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，3为含表达Stv-β9 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，4为含表达Stv-β5 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，5为未表达Stv-β5 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品。
图7为CP22主动免疫C3H小鼠后采集抗血清中各表位抗体生成的鉴定，其中1为蛋白质分子量标准，2为含表达Stv-β8 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，3为含表达Stv-β9 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，4为含表达Stv-β5 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，5为未表达Stv-β5 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品。
图8为CP22主动免疫C57小鼠后采集抗血清中各表位抗体生成的鉴定，其中1为蛋白质分子量标准，2为未表达Stv-β BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，3为含表达Stv-β5 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，4为含表达Stv-β9 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品，4为含表达Stv-β8 BCE融合蛋白的工程菌总蛋白样品。
图9为子宫称重实验中兔抗CP22抗血清中和hCG性能的测定。连续3天每天注射一次hCG加不同稀释度兔抗hCG CP22抗血清后称重未成熟小鼠子宫重量，与hCG加兔抗标准hCGβ-CTP/DT疫苗抗血清和hCG加兔抗hCG CP12(仅掺入3个B-细胞表位)抗血清对照组相比，兔抗hCG CP22抗血清中和hCG能力明显提高(▲P＜0.001，▲▲P＜0.005)。
图10A-E显示了各hCG嵌合肽的细胞表位排列顺序及其氨基酸序列，其中图10A是hCG嵌合肽CP1中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列；图10B显示了hCG嵌合肽CP10中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列；图10C显示了hCG嵌合肽CP7中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列；图10D显示了hCG嵌合肽CP11中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列(以上4个hCGCP嵌合肽序列中hCGβ38-57肽段含β5表位，hCGβ111-145肽段含β9和β8表位)；图10E显示了本发明的hCG嵌合肽CP22中的T-和B-细胞表位排列顺序及其氨基酸序列。
具体实施例方式
本发明的目的在于提供一个编码hCGβ3个线性B-细胞表位(加倍)和外源性6个Th-细胞表位(包括HBsAg19-33和TT580-599二个广谱性表位)的拼接合成基因(CP22)和它们的重组表达质粒。构建的pET11c-CP22重组质粒均能在大肠杆菌中以包涵体形式表达嵌合肽CP22蛋白。本发明通过基因工程实现了免疫原性更佳的hCGβ环肽和hCGβ-CTP的线性连接，表达的hCG嵌合肽CP22由于在其N端掺入了足够多的外源广谱性或单倍型强T细胞表位而不必与其他大分子蛋白载体偶联，因而为研制免疫原性强并能在遗传背景不同的被免疫人群中产生广泛免疫应答的hCG生物合成肽疫苗奠定了基础。所独特设计的hCG嵌合肽CP22(氨基酸序列见SEQ.NO1)及其编码基因(DNA碱基序列见SEQ.NO2)能在大肠杆菌中表达，动物免疫实验结果证明CP22多表位嵌合肽抗原不与外源大分子蛋白载体偶联且仅用铝盐佐剂也能在受试兔和小鼠中产生强免疫应答；该抗原能在3种不同近交系品系小鼠中产生同样的抗体应答；兔和小鼠抗CP22抗血清中都能分别检测到抗所设计分子中三种hCGβ线性表位抗体；与标准的hCGβ-CTP/DT化学合成肽疫苗相比，抗hCG CP22抗血清中和天然hCG的性能明显增强(有显著统计学意义)。因此，hCG CP22重组多表位嵌合肽有可能成为研制人类避孕和肿瘤治疗的新抗原。
根据免疫学原理和hCG疫苗研究现状，特别针对其推广应用所面临的主要障碍，例如，如何能廉价恒定地获得hCG疫苗抗原？怎样在具特异性的基础上增加hCGβ-CTP合成肽抗血清中和hCG的性能？能否避免使用提供体内免疫应答所需Th细胞表位的大分子蛋白载体和特殊佐剂，以方便疫苗制剂生产并降低生产成本？另外，还有″疫苗百家姓″的问题，即如何避开MHC遗传限制，在欲避孕妇女的被免疫人群包括hCG激素依赖性恶性肿瘤患者的有效免疫应答率？我们设计了旨在解决以上问题的新型优化的hCG嵌合肽免疫原CP22，它由hCGβ中3个线性比细胞表位(加倍)和包括2个广谱性表位在内的6个外源Th细胞表位组成。
本发明提供了独特设计的CP22多表位嵌合肽拼接组合序列，即HBsAg19-33-HBcAg85-140-TT580-599-β转角肽-hCGβ42-54-hCGβ中亲水性片段-hCGβ109-122-hCGβ132-145-hCGβ中亲水性片段-hCGβ42-54-hCGβ111-121-hCGβ133-140。SEQ.NO1中CP22的各表位片段，除β转角肽(L0u-Ser-Pro-Gly)外，均选自己上市在临床应用或已经过人临床试验无安全问题的疫苗组份。hCGβ的表位肽和亲水性片段编码基因序列依据已克隆的hCGβcDNA序列(Fiddes JC and Goodman HM.The cDNAfor the β-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene byreadthrough into the 3′untranslated region.Nature 286684-687，1980)，其中部分氨基酸密码子改用了大肠杆菌偏爱的密码子。
HCG CP22嵌合肽中的β545-52抗体中和表位以及β9113-116和β8137-144两个特异表位的选择依据如下公开发表的文献Stevens VC，et al.The identification of peptidesequences of human chorionic gonadotropin containing a conformational epitope.ImmunolLitters 1211-18，1986；Dirnhofer S，et al.The molecular basis tor epitopes on the freeβ-subunit of human chorionic gonadotrophin(hCG)，its carboxyl-terminal peptide andthe hCG β-core fragment.J Endocrinol 141153-162，1994。考虑到生物合成的肽需要一定的长度，以及方便表达产物便于SDS-PAGE电泳检测，以及适当增加合成肽长度也有利于免疫原性增强这几点，在目的CP分子设计中使用了带两端相对亲水性氨基酸残基。另外，为了增强目的分子的亲水性和/或改善蛋白分子构象，在CP22分子中分别掺入了hCG β中的亲水性片段(8或6个残基，个别残基作了调整)和β转角肽。
本发明的hCG CP22嵌合肽通过上述各表位或肽片段编码基因片段拼接，并在其5′端加上Ecor I-Nde I酶切位点和ATG起始密码子，以及在其3′端末接上TAA终止密码子和BamH I酶切位点后，以完整的目的嵌合肽阅读框重组插入可经IPTG诱导的pET11c这一细菌表达质粒，最终在低成本且便于操作的大肠杆菌中实现了CP22的表达。表达产物经用可识别hCGβ133-139序列的单克隆抗体OT3A的免疫印迹(Western blotting test)鉴定，证实了所设计构建的hCG CP22嵌合肽占细胞总蛋白约1％的特异表达。
在本发明构建的重组多表位hCG CP22中，其N端的六个细胞表位的选择依据以下公开信息1.广为所知，HBsAg是一能诱发自身抗体生成的强力免疫原，表明它本身具有强Th-细胞表位。所鉴定的HBsAg19-33则是可被不同HLA-DR和-DQ单倍型识别的″广谱性″T细胞表位。Greenstein JL等报道此肽与HIV-1被膜gp120第三可变区结构域(V3环，能引导有效中和抗体区)共线性化学合成的嵌合肽，仅用铝盐佐剂吸附就在全部6种不同近交系小鼠品系中都诱发产生了抗V3环肽抗体(A universal T cellepitope-containing peptide from hepatitis B surface antigen can enhance antibody specificfor HIV gp120.J Immunol 1483970-3977，1992)；2.在已上市应用的疫苗中，HBcAg也是一种强力免疫原。其85-140肽中存在的各T细胞表位也早已被鉴定(Tiollais P，et al.Biology of hepatitis B virus.Science，1981；213406-411；Milich DR，et al.Hepatitis B synthetic immunogen comprised ofnucleocapsid T-cell sites and an envelope B-cell epitope.Proc Natl Acad Sci USA，1988；851610-1614)。现已清楚HBcAg85-100为H-2d、HBcAg100-120为H-2f和H-2q、HBcAg120-131为B10.S(H-2s)、HBcAg129-140为B10(H-2b)，以及HBcAg120-140为H-2s，b的MHC II类限制性T辅助性细胞表位。很清楚，HBcAg85-140肽中至少含有四个Th-细胞表位。选用由57个氨基酸残基组成的HbcAg此段肽，既是为完善所构建嵌合肽的T细胞刺激广谱性，从而达到增强此T细胞表位肽段的分子佐剂作用，也同样是出于生物合成肽需要一定长度的考虑；3.众所周知，广谱的定义是相对而言的。因此，为了在遗传背景趋异的免疫人群中尽可能地产生接近100％的免疫应答率，我们所在设计的目的嵌合肽中又并用了另一个也广为熟知和应用的广谱性Th-细胞表位---TT580-599(Ho PC，et al.Identification of two promiscuous T cell epitopes from tetanus toxin.Eur J Immunol，1990；20477-483.Kaumaya PTP，et al.Peptide vaccines incorporating a‘promiscuous’T-cell epitope bypass certain haplotype restricted immune responses and provide broadspectrum immunogenicity.J Mol Recog，1993；681-94)。
本发明利用重组DNA技术表达hCG多表位嵌合肽并进行动物免疫学检测，其具体步骤如下(1)hCG CP22嵌合肽全长编码cDNA的设计，将各编码基因片段按顺序串连在一起，5’-端加上起始密码子ATG以及之前的EcoR I-Nde I粘性酶切位点碱基，3’-端接上双终止密码子TAATGA以及其后的BamH I粘性酶切位点碱基，形成完整的CP22编码基因(SEQ.NO2)；(2)将CP22编码基因正负链各分解成12个片段进行化学合成，之后通过DNA重组技术将它们拼接；(3)hCG CP22嵌合肽全长编码cDNA的克隆和测序鉴定；(4)pET11c-hCG重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达，表达载体选用pET11c质粒，用Nde I和BamH I两种限制性内切酶从经过DNA测序鉴定的pBS/CP22质粒中酶切出CP22基因，然后重组插入pET11c质粒。此重组表达质粒再次经DNA测序鉴定，然后分别转化BL21(DE3)plysS宿主菌；(5)目的表达产物CP22的分离纯化；(6)主动免疫兔和不同近交系品系小鼠，检验CP22的抗原性和免疫原性以及其跨越MHC遗传限制和其抗血清中和hCG的性能。
本发明提供的重组hCG多表位嵌合肽CP22组合了靶抗原hCGβ亚单位中全部3个线性B-细胞表位(双份共6个，其中第二个β8表位以OT3A单抗识别顺序133-139替代)以及外源性蛋白包括两个广谱性表位的6个Th-细胞表位。由于重组表达的hCGCP22免疫原既保有了hCGβ-CTP化学合成肽的β9和β8两个特异性的B-细胞表位，同时也掺入了β5这一抗体中和表位，因此动物抗血清中在能检测到反映其特异性的抗β9和β8抗体的同时，也因β5抗体的存在而明显改善了它中和hCG的能力。这些相关实验证据表明本发明可形成新的hCG肿瘤免疫治疗和/或人类免疫避孕合成肽疫苗制备方法和生物制品。CP22中的6个T辅助性(Th-)细胞表位串连肽半分子，选用了乙肝表面抗原中1个T-细胞表位HBsAg19-33、乙肝核心抗原中包含4个T-细胞表位的肽段HBcAg85-140和破伤风类毒素中1个T-细胞表位TT580-599。串连组合的T-细胞表位肽可起调动体内免疫系统中T细胞应答分泌Th2型细胞因子的分子佐剂作用，因而这样的CP免疫原不再需要与提供Th-细胞表位的外源大分子蛋白偶联和使用特别免疫佐剂，同时方便疫苗制剂生产(经人可用铝盐佐剂吸附即可)。其中的HBsAg19-33和TT580-599两个表位特征在于它们都是强且广谱性的T-细胞表位。两者在1个重组多表位嵌合肽中的组合并用，有助于克服疫苗研制中普遍存在的“疫苗百家姓”这一难题，既有可能通过它们在主要组织相容性复合物(major histocompatibilitycomplex，MHC)遗传背景不同被免疫人群中产生最大限度接近100％的有效免疫应答率。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件如Sambrook等人的《分子克隆实验室手册》(第三版)(Cold Spring HarborLaboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。
实施例材料和方法1.限制性内切酶EcoR I、Sal I、Nde I、BamH I为美国Boehringer Mannheim公司产品，T4DNA连接酶为英国Biolabs产品，T4多核苷酸激酶为美国New EnglandBiolabs产品，Taq I DNA聚合酶为复旦大学遗传工程国家重点实验室产品，IPTG为美国Promega产品，蛋白质低分子量标准和碱性磷酸酶联羊抗鼠二抗(IgG/HRP)为华美生物工程公司产品，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-gal)和异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)为美国Sigma公司产品，识别hCGβ133-139序列的单克隆抗体OT3A由荷兰Organon Technika惠赠。
2.克隆和测序载体pBluescript KS(PBS)购自Stratagene公司，表达载体pET11c为Novagen公司产品。大肠杆菌TG1和BL21(DE3)为复旦大学遗传工程国家重点实验室保藏菌株。
3.QIAprep SPIN质粒抽提试剂盒、QIAquick PCR纯化试剂盒和QIAquick胶回收试剂盒为德国QIA公司产品。
4.所设计CP22编码基因的正负链24个(十二对)核苷酸碱基片段由上海生工公司合成。
5.实验动物新西兰雄性白兔(体重2.0±0.5kg)由SIPPR-BK Lab Animal LtdCo.(Shanghai)提供。6-9周的Balb/C(H-2b)、C3H/hej(H-2k)和DBA/1(H-2q)雌性小鼠(18-20g)分别购自SIPPR-BK Lab Animal Ltd Co.(Shanghai)和中国科学院上海实验动物中心。hCG、hCGβ亚单位和幅氏佐剂购自美国Sigma公司，铝盐佐剂购自上海生物制品研究所。标准WHO hCGβ-CTP/DT合成肽疫苗由美国俄亥俄州立大学Stevens教授惠赠。
制备的具体步骤如下1、hCG CP22完整编码基因的设计hCG嵌合肽CP22中的外源蛋白T-和靶抗原双份B-细胞表位及其他片段排列氨基酸顺序序列见SEQ ID NO1。
hCG CP22全长cDNA的设计在计算机辅助下完成，阅读框内基本选用大肠杆菌偏爱的密码子，按各T-细胞表位肽段和B-细胞表位肽段已公开发表的编码基因片段进行拼接设计。经PC-GENE软件检索，对个别密码子的组成碱基加以调整，以消除可能的正反重复序列，包括片段与片段之间重叠区碱基互补情况出现以及不合适的酶切位点。在hCG CP1基因阅读框的5′-端增加了起始密码子ATG以及之前的EcoR I-Nde I粘性酶切位点，在它的3′-端添加了双终止密码子TGATAA以及其后的BamHI粘性酶切位点。
2、hCG CP22完整基因的拼接全长562个碱基对(正负链两端预留了EcoR I和BamH I粘性末端)的CP22基因，分成24个从31聚到57聚长度不等的寡聚核苷酸片段进行合成。合成后加ddH2O稀释成20pmol/μl的各片段先经16％聚丙烯酰胺变性胶电泳鉴定纯度，然后各取16μl(不包括正负链5′-端两个片段)在0.5μl 10U/μld T4多核苷酸激酶(外加2μl10mmol/L ATP)催化下进行18个片段的5′-端磷酰化。继之使正负链对应片段分别两两退火复性，再通过酶促反应让相邻的DNA片段分级两两相连。最后一次完整基因连接反应液经5％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，溴乙锭(EB)染色，然后在长波长紫外光下对照分子量标准切割下全长目的基因片段，用″压碎浸泡法″回收DNA。
3、hCG CP22基因的克隆和测序预留基因两端的EcoR I和BamH I粘性末端的CP22基因片段直接通过DNA重组插入也经EcoR I和BamH I双酶切的pBS克隆测序载体，再用酶连接反应液转化大肠杆菌TG1宿主菌，最后在涂布20％的X-gal和100mmol/L的IPTG的LB培养基平板上筛选可能是重组克隆的白色菌落。若干抽提的重组质粒经初步的酶切鉴定后，在ABI373A型DNA自动测序仪的PAGE胶上作基因碱基序列分析。最终确定所要的插入基因序列与设计一致的阳性克隆。
4、pET11c/hCG CP22重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达表达载体选用了带有强T7启动子的可通过IPTG诱导的pET11c质粒。先用NdeI和BamH两种限制性内切酶从经DNA测序鉴定的pBS/CP1质粒中酶切出CP22基因片段，然后用T4DNA连接酶将它重组插入pET11c质粒的Nde I和BamH I位点。此重组质粒经再次DNA测序鉴定后分别转化蛋白酶缺陷型宿主菌BL21(DE3)plysS。工程菌BL21(DE3)/pET11c-CP22的诱导表达条件如下在加入含50μg/ml ampicillin和34μg/ml chloramphenicol的50ml LB培养基(250ml摇瓶)中接种目的工程菌。37℃震摇培养3-4小时使培养物的OD600值达到0.5，取3ml起始培养物接种于含500μg ampicillin和340μg chloramphenicol的500ml LB培养基(2000ml摇瓶)中，37℃震摇发酵3-4小时使培养物的OD600值达到0.8-1.0，然后加入IPTG(终浓度1.0mM)进行诱导，继续发酵4-5小时。菌液在4℃下5000转/分钟离心15分钟，收集细菌沉淀。
5、目的表达产物的SDS-PAGE分析和蛋白印迹(Western blot)鉴定。
经诱导表达的细菌沉淀物以每克湿菌体加入5ml溶液的比例重悬于细菌裂解液中，超声破碎细菌0.5-1小时，于4℃离心收集菌体沉淀，再加50ml含0.5％Triton的裂解液进行超声打匀，之后4℃离心取沉淀，加50ml 1mol/L尿素进行洗涤，离心沉淀物加25ml 8mol/L尿素超声悬浮后，离心取上清进行SDS-PAGE分析。重复上样的另一半凝胶进行电转印，硝酸纤维膜上的目的表达蛋白通过与特异的单克隆抗体OT3A(一抗)和辣根过氧化碱性磷酸酶标记的羊抗鼠二抗的反应后，用DAB液显色。
6、目的表达产物CP22的分离纯化用制备性SDS-PAGE方法[邹永水，徐万祥等重组人绒毛膜促性腺激素嵌合肽12的聚丙烯酰胺凝胶电泳制备.生物化学与生物物理学报，2002；34(5)671-674]一步纯化CP22表达蛋白，每升大肠杆菌培养液可获得电泳条带均一性高于95％以上的0.1-0.5毫克的目的蛋白。蛋白质纯度通过SDS-PAGE方法检测。
7、用hCG CP22纯化蛋白主动免疫动物的免疫学检测(1)新西兰白兔(N＝6)主动免疫主动免疫采用背部多点注射方法。经0.5ml生理盐水溶解的0.5mg CP22蛋白加0.5ml幅氏完全佐剂(CFA)后充分乳化或用1ml铝盐佐剂研磨吸附，每次每只注射1ml。10天后注射用0.5ml不完全幅氏佐剂(IFA)乳化的0.5mg CP免疫原。隔周再分别在兔前足掌肌肉内加强免疫二次。对照标准hCGβ-CTP/DT疫苗仅用CFA佐剂。另外对照组仅注射CFA或铝盐佐剂。
(2)三种具不同-2单倍型近交系品系小鼠的主动免疫第1周在小鼠臀部皮下和颈部多点注射用0.1ml CFA佐剂研磨吸附的0.1mg CP22蛋白抗原，10天后用0.1ml IFA乳化经0.5ml生理盐水溶解的CP22免疫原再次进行免疫。隔周再分别在小鼠前足掌肌肉内加强免疫二次。
(3)ELESA抗体效价测定抗体效价的测定采用ELESA方法。在第4次加强免疫后，每隔1周抽取兔耳缘静脉血，检测其血清抗体效价。从第一次免疫后的第3周开始对小鼠尾静脉采血，并在以后每周/每二周采血一次，测定其血清抗体效价。在ELESA方法中用美国Sigma公司的hCGβ亚单位为抗原包被酶标板，加入系列稀释的抗血清为一抗，羊抗兔/鼠IgG-HRP为二抗，H2O2-OPD系统显色，最后在ELX 800Universal Microplate Reader(Bio-TEK Instruments，Inc.)进行测定。
(4)免疫血清中各BCE抗体生成检测先前我们已分别构建了可在大肠杆菌中高表达的β5、β9和β8单一表位的链亲和素融合蛋白[徐万祥等人绒毛膜促性腺激素β亚基单一B-细胞表位(β5、β9或β8)融合蛋白的表达和纯化.生物工程学报，2004；20(1)49-53]。以它们被诱导的工程菌总蛋白为样品(抗原)走SDS-PAGE，然后将表达蛋白电转移到尼龙膜上，用丽春红短暂染色后在目的表达融合蛋白两端打孔，再水洗脱色，最后用最高滴度的兔/小鼠抗血清为一抗进行蛋白印迹分析。
(5)小鼠子宫称重实验选用18-25天的Balb/C雌性小鼠，用200ng的hCG标准品(购自美国Sigma公司)，使之分别与以CP12、CP22和对照β-hCG CTPDT的兔抗血清原液、1∶10和1∶50的稀释抗血清连续3天进行腹腔内注射，末次注射后24小时处死，称重小鼠子宫重量。阴性和阳性对照组分别注射生理盐水和hCG。
研究结果表明，本发明已经成功地拼接合成和构建了hCG嵌合肽CP22人工基因以及pET11c/CP22重组表达质粒，用它们转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)plysS后能以包涵体形式表达出CP22目的蛋白，并通过蛋白印迹实验获得验证(图1和图2)。
SDS-PAGE分析结果显示，hCG嵌合肽CP22在大肠杆菌中的表达水平约为1％，通过制备性SDS-PAGE方法每升工程菌培养液可收获0.5mg电泳均一性高于90％的目的蛋白(图1和图2)。
动物免疫学实验也获得了预期结果1，由于所设计CP22嵌合肽掺入了6个外源T-细胞表位，仅用人可用铝盐佐剂主动免疫兔和小鼠，CP22能产生与使用幅氏完全佐剂结果非常接近的抗体应答水平(图3和图4)；2，在兔和小鼠抗CP22抗血清中都能检测到所掺入的β5、β9和β8三种抗体存在(图5～图8)，表明CP22合成肽中各表位在体内免疫系统抗原加工处理中未受破坏地被提呈；3，由于T-细胞表位肽中选用了两个广谱性T-细胞表位，在被免疫的三种不同近交系品系小鼠中都产生了水平非常接近的抗体应答，包括存在各表位抗体(图4，图6～图8)，提示CP22抗原初步具有跨越MHC遗传限制的性能；4，由于在CP22重组多表位嵌合肽中掺入了β5抗体中和表位，与仅含β9和β8两个特异B-细胞表位的标准β-hCG CTPDT化学合成肽疫苗相比，其体内中和hCG的能力获得有统计学意义的提高(表1和图9)。
表1子宫称重实验中兔抗CP22抗血清中和hCG性能的测定
很显然，hCG嵌合肽CP22嵌合基因的构建及其表达蛋白的获得，特别是出示的良好动物免疫学检测结果，为研制用于hCG激素依赖性恶性肿瘤治疗和人类生育调控目标的新型优化hCG合成肽疫苗奠定了基础，在发展其他抗病毒和/或寄生物合成肽疫苗领域也具有重要意义。
尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
序列表<110>上海市计划生育科学研究所复旦大学<120>人绒毛膜促性腺激素重组多表位嵌合肽CP22抗原的分子设计及其制备方法<130>052542<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>183<212>PRT<213>1<400>1Met Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp1 5 10 15Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu20 25 30Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu35 40 45Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr50 55 60Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile65 70 75 80Asn Ser Thr Lys Ile Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Gly Pro Ser Leu85 90 95Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Gly Thr Thr100 105 110Thr Asp Tyr Gly Gly Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser115 120 125
Ser Ser Lys Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro130 135 140Gln Thr Thr Asp Tyr Gly Ser Thr Arg Val Leu Gln Gly Val Leu Pro145 150 155 160Ala Leu Pro Gln Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Arg165 170 175Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr180<210>2<211>549<212>DNA<213>1<400>2atgtttttcc tgctgacacg catcctgaca atcccgcagt ctctggacgt agtatcttat 60gttaatacca acatgggtct gaagttccgt caactgcttt ggtttcatat ctcttgcctt120acatttggcc gtgagacagt acttgaatat ctggtatctt tcggtgtatg gattcgcacc180ccgcctgcgt atcgtcctcc gaatgctcct atccttaatt ctgttgatga cgcactgatc240aattcgacca aaatttattc atattttccg tctgtaggtc cgtctctgac ccgcgttctg300cagggtgttc tgccggccct gcctcagggt acgacaaccg actacggtgg tacctgtgat360gatccgcgct tgcaagattc ctcaagttca aagtcacgtc tgccgggtcc ctcagacacc420ccgatcctgc ctcaaaccac tgactacgga tccacccgcg ttcttcaggg tgttctgccg480gccctgcctc aggatgatcc gcgcttccag gactcttcct cctcccgtct gccgggtccg540tcagacacc549
权利要求
1.一种分离的多肽，其特征在于，它是人绒毛膜促性腺激素重组多表位嵌合肽CP22，它基本上由表位肽HBsAg19-33、表位肽HBcAg85-140和表位肽TT580-599，以及两组人绒毛膜促性腺激素β5表位肽、β8表位肽和β9表位肽组成。
2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述表位肽之间还具有6-15个亲水性氨基酸构成的亲水性间隔臂和/或β转角肽。
3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
4.一种分离的核酸序列，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。
5.根据权利要求4所述的核酸序列，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的核酸序列。
6.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的核酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列。
7.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求6所述的表达载体转化。
8.一种制备权利要求1所述的分离的多肽的方法，其特征在于，该方法包括a)用化学合成拼接的方法获得SEQ ID NO2所示的核酸序列；b)将步骤a)所得核酸序列插入表达载体中使其与表达调控序列操作性相连；c)用步骤b)所述的表达载体转化宿主细胞；d)在适合所述肽表达的条件下培养步骤c)所得的宿主细胞；和e)分离纯化获得所述肽。
9.一种疫苗组合物，它含有权利要求1所述的分离的多肽以及药学上可接受的载体。
10.一种分离的多肽序列，它由HBsAg19-33、HBcAg85-140和TT580-599组成。
全文摘要
本发明提供了人绒毛膜促性腺激素重组多表位嵌合肽CP22，它基本上由表位肽HBsAg
文档编号A61K38/24GK1810833SQ20051002606
公开日2006年8月2日 申请日期2005年5月23日 优先权日2005年5月23日
发明者徐万祥, 谢毅, 廖矛川, 季朝能, 何亚萍, 顾少华, 洪爱真, 应康, 王键, 孙志达 申请人:上海市计划生育科学研究所, 复旦大学