专利名称：一种关节软骨原性微载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微载体，尤其涉及一种关节软骨原性微载体的制备方法及由该方法制备得到的产品，属于生物医学组织工程领域。
背景技术：
组织工程技术是一种应用生物技术在体外制备与人体相同的组织，用于修复人体病变或缺损组织，又称再生医学。
软骨缺损的修复主要依赖工程软骨组织。构建软骨组织工程的一个重要条件是软骨细胞在体外的大量扩增，采用生物反应器及微载体技术培养软骨细胞为高效扩增软骨细胞的一条途径。目前市售的微载体不但价格高昂，而且在使用时需要把软骨细胞从微载体上消化下来，势必存在部分软骨细胞的损伤或流失。另外，也存在细胞-微载体不能完全分离，微载体也被植入患者机体体内等可能，不但影响再生的工程化软骨的质量，同时也可能对患者机体产生危害。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种既能大量扩增软骨细胞同时又能作为细胞支架的关节软骨原性微载体。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种关节软骨原性微载体，由以下方法制备而成1)、将新鲜关节软骨冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为150-200μm的颗粒备用；2)、向颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃持续振荡24-48h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡48-72h，然后用蒸馏水冲洗48h；
3)、1000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，经25kGy钴60辐照灭菌再用10倍体积的0.25％胰蛋白酶消化15min，搅拌，再粉碎成颗粒状，蒸馏水洗3次，即得。
上述制备方法中，上述制备方法中，所用的关节软骨可为人、猪、羊或牛的关节软骨。步骤2)中优选为向颗粒中加入0.25％胰蛋白酶后37℃持续振荡48h；加入1％Triton X-100后在4℃温度下优选持续振荡72h。
本发明关节软骨原性微载体具有下述优点1、本发明关节软骨原性微载体在制备过程中用胰酶敲除了软骨蛋白聚糖，使关节软骨源性微载体呈绒球状或毛刷状(见图1)，极大增加了表面接触面积，软骨细胞能够更好的黏附其上，生长状态好。
2、本发明微载体由软骨基质构成，细胞在其上扩增后不须洗脱细胞，可直接植入体内，避免了因洗脱细胞而造成的损失。
3、在制备过程中用Triton X-100脱去了细胞成分，剔除了抗原性。如再植入体内，不被机体排斥。
4、制备成本低，方法简便易行，所用试剂价廉、易得。
本发明微载体使用方法将微载体根据需要与软骨细胞和培养基，按下述比例放入细胞培养液中250万骨髓基质干细胞∶50mg本发明微载体∶10ml培养基(DMEM见后)，再加入软骨细胞，置于旋转细胞培养器(生物反应器)中培养。
其中，软骨细胞培养基由高糖型DMEM、HEPES、L-脯氨酸、维生素C和NEAA配制而成，具体配制过程如下取1L装粉末状高糖型DMEM培养基1袋，倒入洁净三角烧瓶中，加入HEPES 2.97g、L-脯氨酸0.046g，维生素C 0.05g，NEAA 10ml，加三蒸水950ml溶解，用NaHCO3调整pH值到7.2，再加三蒸水到1000ml，用Zeiss不锈钢滤器过滤除菌(双层滤膜同上)，密闭分装到250ml瓶中，瓶口用火棉胶帽封口。4℃冰箱储存待用。
图1为本发明关节软骨源性微载体的外形图。
图2为用本发明微载体扩增软骨细胞8小时后的结果。
图3为用本发明微载体扩增软骨细胞30小时后的结果。
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
具体实施例方式1、取猪新鲜关节软骨1kg，冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为200μm的颗粒备用；2、将颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃持续荡48h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡72h，然后用蒸馏水冲洗48h；3、1000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，经25kGy钴60辐照灭菌再用10倍体积的0.25％胰蛋白酶消化15min，搅拌，再粉碎成颗粒状，蒸馏水洗3次，即得。
1、取牛新鲜关节软骨4kg，冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为150μm的颗粒备用；2、将颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶(购于Sigma公司)，37℃持续振荡48h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡72h，然后用蒸馏水冲洗48h；3、1000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，经25kGy钴60辐照灭菌再用10倍体积的0.25％胰蛋白酶(购于Sigma公司)消化15min，搅拌，再粉碎成颗粒状，蒸馏水洗3次，即得。
1、取人新鲜关节软骨0.5kg，冻干，用粉碎机将之粉碎，过筛，得直径为180μm的颗粒备用；2、将颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶(购于Sigma公司)，37℃持续振荡48h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡72h，然后用蒸馏水冲洗48h；3、1000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时，经25kGy钴60辐照灭菌再用0.25％胰蛋白酶消化15min，搅拌，再粉碎成颗粒状，蒸馏水洗3次，即得。本发明微载体扩增软骨细胞效果试验一、试验材料1、供试样品本发明实施例1所制备的微载体。
2、培养基1)DMEM配方(单位g/L)精氨酸(L-Arginine-HCl)0.084、胱氨酸(L-Cystine-2HCl)0.0626、谷氨酰胺(L-Glutamine)0.584、甘氨酸(Glycine)0.03、组氨酸(L-Histidine-HCl-H2O)0.042、异亮氨酸(L-Isolucine)0.105、亮氨酸(L-Lucine)0.105、赖氨酸(L-Lycine-HCl)0.146、蛋氨酸(L-Methionine)0.03、苯丙氨酸(L-Phenylalanine)0.066、丝氨酸(L-Serine)0.042、苏氨酸(L-Threonine)0.095、色氨酸(L-Tryptophan)0.016、酪氨酸二钠(L-Tyrosine-2Na-2H2O)0.10376、缬氨酸(L-Valine)0.094、氯化胆碱(Choline Chloride)0.004、叶酸0.004、肌醇0.0072、尼克酰胺0.004、D-泛酸0.004、吡哆醇(Pyridoxal-HCl)0.004、核黄素0.0004、硫胺素(Thiamine-HCl)0.004、氯化钙0.2、硝酸铁(Ferric Nitrate-9H2O)0.0001、硫酸镁0.09767、氯化钾0.4、氯化钠6.4、磷酸钠0.109、葡萄糖4.5、酚红(Phenol Red-Na)0.0159。
2)F-12配方(单位g/L)丙氨酸0.009、精氨酸0.211、天门冬氨酸0.013、天冬酰氨0.015、半胱氨酸0.035、谷氨酸0.0147、谷氨酰氨0.146、甘氨酸0.0751、组氨酸0.0209、异亮氨酸0.0039、亮氨酸0.013、赖氨酸0.0365、蛋氨酸0.0045、苯丙氨酸0.0049、脯氨酸0.0345、丝氨酸0.0105、苏氨酸0.0119、色氨酸0.002、酪氨酸二钠0.0077、缬氨酸0.0117、氯化钙0.0441、氯化钾0.224、磷酸二氢钠0.142、氯化钠7.1、生物素0.0000073、氯化胆碱0.0139、肌醇0.018、尼克酰胺0.000004、D-泛酸0.00048、吡哆醛0.000006、硫胺素0.00034、核黄素0.00004、维生素B-12 0.00136、叶酸0.000132、D-葡萄糖1.802、酚红0.0013、丙酮酸钠0.110、次黄嘌呤0.0041、胸苷0.00073、碳酸氢钠1.176。
二、试验方法及结果取人关节软骨，用胶元酶消化，体外培养至第6代，置入含有本发明微载体的培养液(DMEM/F-12，加10％牛血清白蛋白，其中，DMEM∶F-12＝1∶1)中继续培养，随着培养时间的延长，细胞黏附逐渐增多，培养30小时后，细胞布满于微载体上(见图2和图3)。
试验结果说明，本发明微载体具有良好的扩增软骨细胞的效果。
权利要求
1.一种制备关节软骨原性微载体的方法，包括以下步骤1)、将新鲜关节软骨冻干后粉碎，过筛，得直径为150-200μm的颗粒备用；2)、向颗粒中加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶，37℃持续振荡24-48h后用蒸馏水洗3次，用1％Triton X-100在4℃温度下持续振荡48-72h，然后用蒸馏水冲洗48h；3)、1000rpm，离心10min，取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，置入冷冻干燥机内冻干处理12小时经25kGy钴60辐照灭菌后加入10倍体积的0.25％胰蛋白酶消化15min，搅拌，再粉碎成颗粒状，蒸馏水洗3次，即得。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是所述的关节软骨为人、猪、牛或羊的关节软骨。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤2)中向颗粒中加入0.25％胰蛋白酶后37℃持续振荡48h。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征是步骤2)中向颗粒中加入1％Triton X-100后在4℃温度下持续振荡72h。
5.一种关节软骨原性微载体，其特征是由权利要求1～4任一所述方法制备得到的产品。
全文摘要
本发明公开了一种新的关节软骨原性微载体，该微载体通过以下方法制备而成1)将新鲜关节软骨冻干后粉碎，过筛，收集过筛后的颗粒备用；2)向颗粒中加入胰蛋白酶，37℃持续振荡24－48 h后用蒸馏水洗3次，接着用Triton X－100在4℃下持续振荡48－72h，然后用蒸馏水冲洗48h；3)离心取沉淀，将沉淀与蒸馏水按1∶3体积混合后，冻干处理12小时，经25kGy钴60辐照灭菌再用胰蛋白酶消化，搅拌，再粉碎成颗粒状，蒸馏水洗3次，即得。本发明微载体呈绒球状或毛刷状，具有较大的比表面积，软骨细胞能够更好的黏附其上，软骨细胞在其上迅速繁殖、扩增后可直接植入体内能有效促进软骨再生，避免了因洗脱细胞而造成软骨细胞的损失。
文档编号A61L27/36GK1868424SQ20051007300
公开日2006年11月29日 申请日期2005年5月27日 优先权日2005年5月27日
发明者卢世璧, 张建党, 袁玫, 黄靖香, 孙明学 申请人:中国人民解放军总医院