专利名称：一种含有丹参和三七药材的复方制剂的质量检测方法
技术领域：
本发明涉及中药质量检测领域，具体来说涉及一种含有丹参和三七药材的复方制剂的质量检测方法。
背景技术：
含有丹参和三七的制剂，通常亦被称为复方丹参制剂，在临床上广泛用于治疗心血管疾病。常见的有复方丹参片，复方丹参滴丸，丹七片，冠心丹参片等。
丹参和三七是复方丹参制剂的两个主要组成药物。现代研究表明丹参的活性成分主要为二萜醌类(如丹参酮IIA等)脂溶性及丹参酚酸类(如丹酚酸B等)水溶性有效成分，丹参酚酸类成分具抑制血小板聚集，抗血栓形成，抗氧化及保护心脏微血管内皮细胞等作用；丹参酮等脂溶性成分能扩张冠状动脉，提高冠脉血流，保护心肌及广谱抑菌作用。三七皂苷类(如三七皂苷R1，人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1)成分是三七的主要活性成分，具抗血栓形成，扩张血管及保护心肌等作用。
有关复方丹参制剂的质量标准不尽相同，丹七片及冠心丹参片没有含量测定指标，复方丹参片的含量测定指标为丹参酮IIA和丹酚酸B，复方丹参滴丸为丹参素。可见复方丹参制剂的质量标准差异大且不完善，复方丹参片质量标准较完善但也只是对丹参的脂溶性及水溶性成分分别进行质控。复方丹参制剂的质量标准中尚未有对其中三七活性成分的含量控制。相关的文献报道的检测方法有HPLC法测定复方丹参方中丹参3种脂溶性成分含量(北京中医药大学学报，2003年第26卷第4期)，HPLC法测定复方丹参中丹参的三种水溶性成分的含量(中草药，2002年第33卷第10期)，HPLC测定复方丹参方中三七皂苷类成分的含量(中药新药与临床药理，2003年第14卷第2期)。现有技术中都只能分开测定丹参或三七中某一类活性成分的含量，故建立一种能同时控制丹参和三七中多类有效成分含量的方法具有很大的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有含丹参和三七药材的复方制剂的质量控制缺陷，建立一种能够同时测定此类复方制剂中丹参和三七两味药的多类活性成分含量的质量检测方法。
本发明试验采用了HPLC-DAD法同时测定复方丹参制剂中原儿茶醛，丹酚酸B，隐丹参酮，丹参酮IIA，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1的含量，本方法相对简单，具良好的精密度，重现性和可靠性，可同时测定复方丹参制剂中丹参和三七的多类活性成分的含量，可用于复方丹参制剂的质量控制。
本发明的具体技术方案如下含有丹参和三七药材的复方制剂的质量检测方法，包括以下步骤分别制备供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱法测定，其特征是对照品为选自原儿茶醛，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，丹酚酸B，人参皂苷Rb1，隐丹参酮或丹参酮IIA中的几个；色谱条件为用十八烷基键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％的磷酸水为流动相，其中A为0.1％的磷酸水，B为乙腈，A+B＝100％，采用梯度洗脱0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B；柱温25-35℃；流速1ml/min(在22～28min时，流速为0.8ml/min)；DAD检测器，检测波长为203，270，281nm。在203nm处测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，在281nm处测定原儿茶醛，丹酚酸B，在270nm处测定隐丹参酮和丹参酮IIA。磷酸浓度为体积百分比。
优选的柱温是30℃。
上述质量检测方法，优选的对照品的制备方法为分别精密称取对照品a、原儿茶醛，b、三七皂苷R1，c、人参皂苷Rg1，d、丹酚酸B，e、人参皂苷Rb1，f、隐丹参酮和g、丹参酮IIA适量，置棕色容量瓶中，加70％甲醇(隐丹参酮和丹参酮IIA加甲醇)溶解并定容，作为对照品贮备液。分别精密吸取对照品贮备液，置棕色容量瓶中混合并加70％甲醇定容，形成混合对照品溶液，浓度范围分别为a、1.32-210.40μg/ml，b、15.34-368.16μg/ml，c、14.76-590.40μg/ml，d、12.70-762.00μg/ml，e、30.06-601.20μg/ml，f、0.33-66.00μg/ml，g、0.32-64.56μg/ml。
本发明的质量检测方法，其中优选的供试品溶液的制备方法为取含有丹参和三七药材的复方制剂，去糖衣或薄膜衣，研磨成粉末，精密称取0.25g～2.0g置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。超声提取30min，放冷，加入70％甲醇补足重量。摇匀，滤过，取续滤液，即得。
上述制备的供试品和对照品的进样量为10μl；记录时间80min。当只测定原儿茶醛，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，丹酚酸B，人参皂苷Rb1时，记录时间为60～65min即可。
上述的质量检测方法，其中检测波长可以仅为203,281nm。
本发明的质量检测方法，其中复方制剂选自含有丹参和三七的所有复方制剂，如丹七片、复方丹参片、复方丹参滴丸或冠心丹参片等。
本发明的含有丹参和三七药材的复方制剂质量检测方法，采用DAD检测器，在203nm处测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，在281nm处测定原儿茶醛，丹酚酸B，在270nm处测定隐丹参酮和丹参酮IIA。
本发明的含有丹参和三七药材的复方制剂质量检测方法，含量测定指标适当减少，如测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、丹酚酸B和丹参酮IIA的含量仍体现本发明的实质。
本发明的含有丹参和三七药材的复方制剂质量检测方法，检测波长为203nm和281nm，即在203nm处测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，在281nm处测定原儿茶醛，丹酚酸B，隐丹参酮和丹参酮IIA。仍能达到本发明的目的。
本发明的方法与现有的复方丹参制剂质量检测方法相比的进步性如下本方法克服了现有国家标准检测方法未有三七有效成分含量测定指标的缺陷，通过采用HPLC-DAD方法，实现了对丹参和三七中多类活性成分含量的同时测定。经试验表明，所测的多种成分分离度好，线性关系，重现性，精密度，稳定性，回收率均较好。本方法准确，先进，操作简便，能够更有效、更全面的控制产品的质量。
具体实施例方式
实施例11.仪器与试药Agilent 1100型系列高效液相色谱仪，包括G1312A四元梯度泵、G1313A自动进样器、G1316A柱温箱，G1315A DAD检测器；Chemstation 6.01色谱工作站。
复方丹参制剂丹七片(丹参∶三七＝1∶1)湖南安邦制药有限责任公司(批号040803)；复方丹参片(丹参∶三七＝450∶141)广东白云山制药厂(批号03121024)，南京同仁堂制药有限责任公司(批号040602)，浙江胡庆余堂制药有限责任公司(批号050308)；复方丹参滴丸天津天士力制药有限责任公司(批号20020921，20030604，20040303)。
对照品原儿茶醛，丹酚酸B，丹参酮IIA，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1购自中国药品生物制品检定所；隐丹参酮，购于成都思科华生物技术有限公司。纯度均＞98％。
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)、Milli-Q超纯水。其余试剂为分析纯。
2.色谱条件色谱柱C18色谱柱(ZORBAX ODS 4.6×250mm ID，5μm)和预柱(4.6×12.5mm ID，5μm)；流动相，A为0.1％的磷酸水；B为乙腈；A+B＝100％，采用梯度洗脱0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B。柱温30℃；流速1ml/min(22-28min，0.8ml/min)；检测波长203nm，270nm，281nm，在203nm处测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，在281nm处测定原儿茶醛，丹酚酸B，在270nm处测定隐丹参酮和丹参酮IIA。记录时间80min。
3.实验方法与结果3.1供试品溶液的制备取丹七片(去糖衣)和复方丹参片20片，称重，计算平均片重，并研磨成粉未，精密称取0.5g，置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容。取复方丹参滴丸75粒(约2g)，精密称定，研成粉未，去除薄膜衣，用70％甲醇溶解并转移到25ml棕色容量瓶中定容。超声提取30min，放冷，加入70％甲醇补足重量。
溶液滤过，取续滤液，即得。
3.2对照品溶液的制备分别精密称取对照品(1)原儿茶醛2.63mg，(2)三七皂苷R1 7.67mg，(3)人参皂苷Rg1 12.30mg，(4)丹酚酸B 2.54mg，(5)人参皂苷Rb1 12.53mg，置5ml棕色容量瓶中，加70％甲醇，(6)隐丹参酮2.75mg，(7)丹参酮IIA 2.69mg，置5ml棕色容量瓶中，加甲醇，溶解并定容，作为对照品贮备液。
分别精密吸取一定量的对照品贮备液，置棕色容量瓶混合并加70％甲醇定容，形成混合对照品溶液。各对照品浓度分别为(1)105.2μg/ml，(2)184.08μg/ml，(3)381.0μg/ml，(4)295.2μg/ml，(5)100.20μg/ml，(6)33.0μg/ml，(7)21.52μg/ml。
3.3含量测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表1。
表1三种复方丹参制剂含量测定结果(检测波长203nm，270nm，281nm)
ND未检测到实施例2检测波长为203nm和281nm，在203nm处测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1，在281nm处测定原儿茶醛，丹酚酸B，隐丹参酮和丹参酮IIA。记录时间80min。其它同实施例1。实验结果如表2表2三种复方丹参制剂含量测定结果(检测波长203nm，281nm)
ND未检测到实验例3方法学考察1.线性关系分别精密称取对照品(1)原儿茶醛2.63mg，(2)三七皂苷R17.67mg，(3)人参皂苷Rg112.30mg，(4)丹酚酸B 2.54mg，(5)人参皂苷Rb112.53mg，(6)隐丹参酮2.75mg和(7)丹参酮IIA 2.69mg，置5ml棕色容量瓶中，加70％甲醇(隐丹参酮和丹参酮IIA加甲醇)溶解并定容，作为对照品贮备液。分别精密吸取一定量的对照品贮备液，置棕色容量瓶混合并加70％甲醇定容，形成10个浓度的混合对照品溶液，浓度分别为(1)1.32，2.63，5.26，7.89，13.15，26.30，52.60，105.20，157.80，210.40μg/ml，(2)15.34，30.68，38.35，46.02，61.36，122.72，184.08，245.44，306.80，368.16μg/ml，(3)29.52，44.28，59.04，73.80，98.40，196.80，295.20，393.60，492.00，590.40μg/ml，(4)12.70，25.40，38.10，63.50，127.00，254.00，381.00，508.00，635.00，762.00μg/ml，(5)30.06，45.09，60.12，75.15，100.20，200.40，300.60，400.80，501.00，601.20μg/ml，(6)0.33，0.66，1.32，2.64，5.28，8.25，11.00，16.50，33.00，66.00μg/ml，(7)0.32，0.65，1.35，2.69，5.38，10.76，16.14，21.52，32.28，64.56μg/ml。
在“实施例1”色谱条件下，各浓度对照品溶液分别进样10μl。以峰面积(y)对浓度(x，mg·L-1)进行线性回归，得回归方程，见表3和表4。
表3线性关系实验结果(203，270，281nm)(n＝10)
y峰面积x浓度(mg·L-1)。
表4线性关系实验结果(203，281nm)(n＝10)
2.精密度实验取“线性关系”项下1/2浓度梯度点，连续进样6次，以峰面积计算，7个化合物日内精密度分别为1.25％，1.05％，0.71％，1.12％，0.61％，0.46％，0.61％。连续分析4天，7个化合物日间精密度分别为1.13％，1.78％，0.85％，1.76％，1.29％，0.91％，2.16％。
3.重复性实验取丹七片、复方丹参片(050308)及复方丹参滴丸(20040303)，每个样品6份，按照实施例1方法制备供试品溶液并分析，结果7个化合物色谱峰面积的RSD分别为(1)2.61％，2.17％，1.49％；(2)2.99％，4.32％，2.92％；(3)1.28％，2.32％，1.62％；(4)1.58％，2.31％，2.67％；(5)3.19％，2.70％，2.04％；(6)9.73％，1.59％，6.52％；(7)9.59％，1.84％，6.18％。
4.稳定性实验取“重复性试验”项下丹七片、复方丹参片及复方丹参滴丸供试品溶液各一份，分别于0，2，4，6，8，12小时进行测定，7个化合物色谱峰面积的RSD分别为(1)2.15％，1.72％，1.25％；(2)2.27％，4.16％，2.09％；(3)1.32％，2.03％，1.37％；(4)1.23％，2.72％，2.17％；(5)2.79％，2.21％，1.67％；(6)9.09％，1.45％，5.78％；(7)8.90％，1.55％，5.28％。
5.加样回收率试验精密称取已知含量的丹七片(0.25g)、复方丹参片(0.25g，批号050308)及复方丹参滴丸(40丸，批号20040303)，共5份，分别加入7个对照品(1)0.1000，0.0500，2.0000mg；(2)0.9375，0.9375，1.5625mg；(3)3.0180，2.8168，3.2192mg；(4)1.4157，5.2272，1.6335mg；(5)3.1578，2.1606，2.8254mg；(6)0.0372，0.3720，0.0372mg；(7)0.0385，0.3850，0.0385mg。按照实施例1方法制备供试品溶液并分析，得7个化合物的平均回收率分别为(1)98.5％，99.8％，96.7％；(2)102.1％，97.4％，95.2％；(3)102.6％，102.1％，100.4％；(4)96.9％，101.0％，97.2％；(5)99.0％，98.1％，99.3％；(6)103.3％，97.1％，97.2％；(7)104.9％，94.4％，95.8％。RSD分别为(1)3.89％，3.89％，1.50％；(2)4.60％，4.60％，3.57％；(3)3.52％，3.52％，4.07％；(4)4.07％，4.07％，2.05％；(5)4.43％，4.43％，2.22％；(6)2.97％，2.97％，4.59％；(7)4.45％，4.45％，4.19％。
综上，本发明所建立的HPLC-DAD法同时测定复方丹参制剂中原儿茶醛，丹酚酸B，隐丹参酮，丹参酮IIA，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1的含量，具良好的精密度，重现性，可靠性，方法先进简单，可同时测定复方丹参制剂中多类活性成分的含量，可更有效、更全面的控制含有丹参和三七的复方制剂的质量。
权利要求
1.一种含有丹参和三七药材的复方制剂的质量检测方法，包括以下步骤分别制备供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱法测定，其特征是对照品为选自原儿茶醛，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，丹酚酸B，人参皂苷Rb1，隐丹参酮或丹参酮IIA中的几个；色谱条件为用十八烷基键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％的磷酸水为流动相，其中A为0.1％的磷酸水，B为乙腈，A+B＝100％，采用梯度洗脱0-10min，7-17％B，10-12min，17-20％B，12-16min，20-21％B，16-32min，21％B，32-40min，21-29％B，40-55min，29-35％B，55-65min，35-65％B，65-80min，65-80％B；柱温25-35℃；流速1ml/min，当22～28min时，流速改为0.8ml/min；DAD检测器，检测波长为203，270，281nm。
2.权利要求1的质量检测方法，其中对照品为原儿茶醛，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，丹酚酸B，人参皂苷Rb1，隐丹参酮或丹参酮IIA。
3.权利要求1的质量检测方法，其中柱温是30℃。
4.权利要求1的质量检测方法，其中对照品的制备方法为分别精密称取对照品a、原儿茶醛，b、三七皂苷R1，c、人参皂苷Rg1，d、丹酚酸B，e、人参皂苷Rb1，加70％甲醇定容，f、隐丹参酮和g、丹参酮IIA加甲醇定容，作为对照品贮备液；分别精密吸取对照品贮备液，置容量瓶中混合并加70％甲醇定容，形成混合对照品溶液，浓度范围分别为a、1.32-210.40μg/ml，b、15.34-368.16μg/ml，c、14.76-590.40μg/ml，d、12.70-762.00μg/ml，e、30.06-601.20μg/ml，f、0.33-66.00μg/ml，g、0.32-64.56μg/ml。
5.权利要求1的质量检测方法，其中供试品溶液的制备方法为取含有丹参和三七药材的复方制剂，去糖衣或薄膜衣，研磨成粉末，精密称取0.25g～2.0g置25ml棕色容量瓶中，70％甲醇定容，超声提取30min，放冷，加入70％甲醇补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.权利要求1的质量检测方法，高效液相色谱的进样量为10μl；记录时间80min。
7.权利要求1的质量检测方法，其中检测波长为203，281nm。
8.权利要求1的质量检测方法，其中复方制剂选自丹七片、复方丹参片、复方丹参滴丸或冠心丹参片。
全文摘要
本发明涉及中药质量检测领域，具体来说涉及一种含有丹参和三七药材的复方制剂的质量检测方法。采用了HPLC－DAD法同时测定复方丹参制剂中原儿茶醛，丹酚酸B，隐丹参酮，丹参酮IIA，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb1的含量，本方法相对简单，具良好的精密度，重现性和可靠性，可同时测定复方丹参制剂中丹参和三七的多类活性成分的含量，可用于复方丹参制剂的质量控制。
文档编号A61P9/10GK1772041SQ200510095179
公开日2006年5月17日 申请日期2005年11月2日 优先权日2005年11月2日
发明者李萍, 韦英杰, 李松林 申请人:中国药科大学