专利名称：丹参药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药材指纹图谱的建立方法，尤其是丹参药材高效液相色谱(HPLC) 指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的丹参药材标准指纹图谱。属于药物分析技术领域。
背景技术：
丹参又名赤参，紫丹参，红根等。主要功效为活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，清心除烦，养血安神。丹参根主含脂溶性的二萜类成分和水溶性的酚酸成分，还含黄酮类，三萜类，甾醇等其他成分。临床主要用于心脑血管疾病的治疗，还广泛地用于治疗慢性肝病、慢性肾功能不全、小儿病毒性心肌炎、脉管炎、硬皮病、流行性出血热、过敏性紫癜、精神分裂症、肺炎、血管性头痛、鼻炎等。由于受产地、气候和生态环境等的影响，不同丹参药材所含的成分也存在着一定差异。《中国药典》对丹参药材的质量控制仅限于丹参酮II A和丹酚酸B含量的测定，不能系统、完整地反映丹参的内在质量。要控制丹参及其成方制剂功效， 就不能只针对其中1、2个化学成分，必须对它的物质群整体予以控制。
中药指纹图谱特指中药材或中成药经光谱或色谱等现代分析技术得到的中药各组分群体共有特征的图谱或图象。目前指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段之一。
中药指纹图谱经过了数十年的研究，使用了包括紫外、红外、气相、高效液相、薄层、核磁共振、扫描电子显微镜、计算机图像分析、电泳技术、同功酶分析法、分子生物学技术、聚类分析技术等许多现代分析测试手段，为中药的物质鉴定和成分分析积累了大量的数据。但从中药全面质量控制的角度看，还远未达到有效地反映和控制中药的整体质量的目的。高效液相色谱(HPLC)指纹图谱在国际上容易获得认可，包括美国、英国、法国、加拿大、德国、日本和印度在内的许多国家更愿意接受HPLC指纹图谱。因此，为中药材建立相应的HPLC指纹图谱，是现阶段控制中药内在质量的有效手段。发明内容
本发明是要解决现有中药的物质鉴定和成分分析中不能有效地反映和控制中药的整体质量的问题，从而提供的丹参药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。
本发明的丹参药材指纹图谱的建立方法按以下步骤进行
一、供试品溶液的制备按质量体积比为Ig : 100 300mL将丹参药材粉末与水混合均匀，加热回流45 60min，冷却后取上清液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；
二、高效液相色谱分析将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以质量百分含量为I %冰醋酸水溶液为A相，乙腈为B相进行流动相梯度洗脱，分析供试品溶液，得到丹参药材的指纹图谱；其中，所述高效液相色谱条件为色谱分离柱填料为 YMC-PackC18，规格为150X4. 6_，5μπι，柱温为25 °C 35 °C，流动相为A相和B相，流速O.8 I. 2mL/min，供试品溶液进样量为10 μ I，高效液相色谱仪中检测波长290nm。
利用丹参药材指纹图谱的建立方法得到了丹参药材指纹图谱。
本发明具有如下显著的优点和用途
(I)将丹参药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异；
(2)供试品制作简便，色谱条件容易实现；
(3)方法的稳定性和重现性都比较好；
(4)适于对丹参药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。
图I为本发明提供的丹参药材的标准指纹图谱，其中I至18为丹参药材共有特征峰。
具体实施方式
具体实施方式
一本实施方式的丹参药材指纹图谱的建立方法按以下步骤实现
一、供试品溶液的制备按质量体积比为Ig : 100 300mL将丹参药材粉末与水混合均匀，加热回流45 60min，冷却后取上清液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；
二、高效液相色谱分析将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以质量百分含量为I %冰醋酸水溶液为A相，乙腈为B相进行流动相梯度洗脱，分析供试品溶液，得到丹参药材的指纹图谱；其中，所述高效液相色谱条件为色谱分离柱填料为 YMC-PackC18，规格为150X4. 6_，5μπι，柱温为25 °C 35 °C，流动相为A相和B相，流速O.8 I. 2mL/min，供试品溶液进样量为10 μ 1，高效液相色谱仪中检测波长290nm。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤一中所述的微孔滤膜过滤是采用O. 45 μ m微孔滤膜进行过滤的。其它步骤及参数与具体实施方式
一相同。
具体实施方式
三本实施方式与具体实施方式
一或二不同的是步骤二中所述的流动相梯度洗脱过程中，洗脱液A、B相变化为用梯度洗脱方式Omin 50min，乙腈0% 30%。其它步骤及参数与具体实施方式
一或二相同。
具体实施方式
四本实施方式利用丹参药材指纹图谱的建立方法得到了丹参药材指纹图谱。
具体实施方式
五本实施方式与具体实施方式
四不同的是图谱有18个共有特征峰，保留时间分别为7. lmin、9. Omin、10. lmin、10. 9min、14. 4min、19. 9min、22. 9min、 27. 2min>30. 6min>34. 4min>34. 8min>36. 4min>37. 3min>38. 3min>38. 9min、41. 7min、 44. 5min和45. 4min,这些共有特征峰构成了丹参药材的指纹特征,可作为丹参药材的标准指纹图谱。其它步骤及参数与具体实施方式
四相同。
本实施方式具有如下显著的优点和用途
(I)将丹参药材作为一个整体对待，通过比较其共有峰可以找出不同药材之间的细微差异；
(2)供试品制作简便，色谱条件容易实现；
(3)方法的稳定性和重现性都比较好；
(4)适于对丹参药材真伪、产地和品质的鉴别和控制。
通过以下试验验证本发明的有益效果
一、供试品溶液的制备精密称取丹参药材粉末O. 5g，置于容器中，加水IOOmL,加热回流60min，冷却后取上清液用O. 45 μ m微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；
二、高效液相色谱分析色谱分离柱填料5 μ m YMC-Pack C18 150X4. 6mm ;流动相 I %冰醋酸水溶液_乙腈；采用梯度洗脱方式Omin 50min,乙腈0% 30% ;流速I. OmL/ min ;检测波长290nm ;柱温30°C;进样量10 μ L ;在此条件下分析供试品溶液，得到丹参药材的指纹图谱。
三、按照本发明提供的方法，对10批丹参药材建立了 HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了 18个共有特征峰，保留时间分别为7. lmin、9. 0min、10. lmin、10. 9min、 14. 4min、19. 9min、22. 9min、27. 2min、30. 6min、34. 4min、34. 8min、36. 4min、37. 3min、 38. 3min、38. 9min、41. 7min、44. 5min、45. 4min,这些共有特征峰构成了丹参药材的指纹特征，可作为丹参药材的标准指纹图谱。
本试验使用的仪器和药品使用Agilent-1100型高效液相色谱仪，配有在线脱气机、四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器；丹参药材共10批，均购于中草药市场；其它试剂为色谱纯或分析纯。
本试验得到的丹参药材的标准指纹图谱如图I所示。由图I可以看出，通过本方法可以清晰地得到具有18个共有特征峰的丹参药材的标准指纹图谱，为整体评价丹参药材的质量提供了良好的依据。
四、方法学考察
I、精密度考察
取同一批样品，按本试验方法进行供试品溶液制备，连续进样测定5次，将数据输入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算，得到精密度匹配数据与精密度匹配的相似度数据如表I、表2所示
表I精密度匹配数据
权利要求
1.丹参药材指纹图谱的建立方法，其特征在于丹参药材指纹图谱的建立方法按以下步骤进行一、供试品溶液的制备按质量体积比为Ig 100 300mL将丹参药材粉末与水混合均匀，加热回流45 60min，冷却后取上清液用微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液；二、高效液相色谱分析将步骤一得到的供试品溶液注入高效液相色谱仪，以质量百分含量为1%冰醋酸水溶液为A相，乙腈为B相进行流动相梯度洗脱，分析供试品溶液，得到丹参药材的指纹图谱；其中，所述高效液相色谱条件为色谱分离柱填料为YMC-PackC18，规格为150X4. 6mm，5 μ m，柱温为25。。 35°C，流动相为A相和B相，流速O. 8 I. 2mL/min, 供试品溶液进样量为10 μ 1，高效液相色谱仪中检测波长290nm。
2.根据权利要求I所述的丹参药材指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤一中所述的微孔滤膜过滤是采用O. 45 μ m微孔滤膜进行过滤的。
3.根据权利要求I所述的丹参药材指纹图谱的建立方法，其特征在于步骤二中所述的流动相梯度洗脱过程中，洗脱液A、B相变化为用梯度洗脱方式Omin 50min，乙腈0% 30%。
4.如权利要求I所述的丹参药材指纹图谱的建立方法得到了丹参药材指纹图谱。
5.根据权利要求4所述的丹参药材指纹图谱，其特征在于所述的图谱有18个共有特征峰，保留时间分别为7. Imin、9. Omin、10. Imin、10. 9min、14. 4min、19. 9min、22. 9min、 27.2min>30.6min>34. 4min>34.8min>36.4min>37. 3min>38.3min>38.9min、41. 7min、 44. 5min和45. 4min,这些共有特征峰构成了丹参药材的指纹特征,可作为丹参药材的标准指纹图谱。
全文摘要
丹参药材指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，本发明涉及中药材指纹图谱的建立方法，尤其是丹参药材高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的丹参药材标准指纹图谱。本发明是要解决现有中药的物质鉴定和成分分析中不能有效地反映和控制中药的整体质量的问题。方法一、供试品溶液的制备；二、高效液相色谱分析。利用此方法得到了丹参药材的指纹图谱。本方法应用于药物分析技术领域。
文档编号G01N30/02GK102928538SQ20121048281
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月23日 优先权日2012年11月23日
发明者秦绪江, 单钰毓, 赛春梅, 刘文亮, 曲林, 凌雪宇, 李殿明 申请人:哈药集团中药二厂