专利名称：肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及肽。特别是，本发明涉及从初乳素中分离出的某些肽。本发明还涉及肽的治疗用途以及从其得到的抗体。
背景技术：
初乳是一种浓稠、浅黄色的液体，在胎儿出生后头几天由哺乳动物母体乳房产生。它是分娩后最初的乳汁性分泌物，含有高浓度免疫球蛋白(IgG、IgM和IgA)和其它蛋白质。它在产后约四到五天被成熟乳汁取代。与成熟乳汁相比，初乳含糖和铁较低，但富含脂肪、蛋白质、矿物盐、维生素和免疫球蛋白。初乳还含有各种游走细胞，如颗粒细胞和基质细胞、嗜中性粒细胞、单核/巨噬细胞和淋巴细胞，并且包含生长因子、激素、细胞因子和多肽复合物。
从哺乳动物初乳中已分离出多种因子，并对它们进行了表征。1974年，Janusz等(FEBS Lett.，49，276-279)从羊的初乳中分离出一种富含脯氨酸多肽(PRP)。此后发现除羊之外的哺乳动物初乳成份中也有PRP类似物。后来PRP就被称为初乳素(colostrinin)(有时称为colostrinine)。
M.Janusz & J.Lisowski在“富含脯氨酸多肽(PRP)-一种来源于羊初乳中的免疫调节肽”(Archivum Immunologiae etTherapiae Experimentalis，1993，41，275-279)一文中提到羊初乳中的PRP在小鼠中具有免疫活性。
A.Dubowska-Inglot等在“初乳素来源于羊初乳的富含脯氨酸多肽在人白细胞中是最普通的细胞因子诱导剂”(ArchivumImmunologiae et Therapiae Experimentalis，1996，44，215-224)一文中讨论了初乳素在阿尔茨海默病治疗中的用途。初乳素在阿尔茨海默病和其它症状治疗中的用途在WO-A-98/14473和“初乳素从羊初乳中分离出的富含脯氨酸多肽(PRP)复合物用于治疗阿尔茨海默病。一项双盲，安慰剂对照研究”(Leszek，J.etal，Archivum Immunologiae et TherapiaeExperimentalis，1999，47，377-385)一文中也有讨论。
天然形式的初乳素从哺乳动物的初乳中获取。如WO-A-98/14473中所述，电泳和色谱分析显示，初乳素具有以下特点(i)其分子量介于16000到26000道耳顿之间(这由在SDS存在下的电泳显示)；(ii)其是一种亚单位的二聚体或三聚体，每一亚单位的分子量介于5000到10000道耳顿之间(这由在SDS存在下的丙烯酰胺凝胶电泳显示)；(iii)它含有脯氨酸，脯氨酸的量远高于其它任何单一氨基酸的量(这由常规氨基酸分析显示)。
通过这些技术显示，羊初乳素分子量约为18000道耳顿，由三个非共价结合的亚单位组成，每一个的分子量约6000道耳顿，其包括约22％(重量)的脯氨酸。羊初乳素的氨基酸组成如下，后面的数字表示每一亚单位所含的残基数赖氨酸-2，组氨酸-1，精氨酸-0，天冬氨酸-2，苏氨酸-4，丝氨酸-3，谷氨酸-6，脯氨酸-11，甘氨酸-2，丙氨酸-0，缬氨酸-5，甲硫氨酸-2，异亮氨酸-2，亮氨酸-6，酪氨酸-1，苯丙氨酸-3，半胱氨酸-0。
为了尽量明确其成份，我们对初乳素的组成作了进一步分析，以便能制备合成形式的初乳素。
我们已得出结论，初乳素包含的肽片段来源于至少两种不同蛋白膜联蛋白和β-酪蛋白。此外，初乳素包含大量其它未知前体蛋白的肽片段；这些氨基酸序列可能来自未知前体蛋白，或者它们可能没有前体蛋白。据信某些肽序列来自β-酪蛋白的同源物。
发明内容
根据本发明的一方面，提供含有以下氨基酸序列A-1到D-1之一的肽A组未知前体的肽A-1LQTPQPLLQVMMEPQGDA-2MPQNFYKLPQMA-3VLEMKFPPPPQETVTA-4LKPFPKLKVEVFPFPA-5SEQPA-6DKEA-7DPPPPQSA-8LNFB组(可能)具有β-酪蛋白同源物前体的肽B-1VLPPNVGB-2KYKLQPEB-3SEEMPB-4DSQPPVB-5FPPPKB-6VVMEVB-7DLEMPVLPVEPFPFVB-8LFFFLPVVNVLPB-9MQPPPLPB-10 DQPPDVEKPDLQPFQVQS
C组具有β-酪蛋白前体的肽C-1 VYPFTGPIPN (酪蛋白位置74-83)C-2 SLPQNILPL(酪蛋白位置84-92)C-3 TQTPVVVPPF (酪蛋白位置93-102)C-4 LQPEIMGVPKVKETMVPK (酪蛋白位置103-120)C-5 HKEMPFPKYPVEPFTESQ (酪蛋白位置121-138)C-6 SLTLTDVEKLHLPLPLVQ (酪蛋白位置139-156)C-7 SWMHQPP (酪蛋白位置157-163)C-8 QPLPPTVMFP (酪蛋白位置164-173)C-9 MHQPPQPLPPTVMFP (酪蛋白位置159-173)C-10 PQSVLS (酪蛋白位置174-179)C-11 LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ (酪蛋白位置180-201)C-12 AFLLYQE (酪蛋白位置202-208)C-13 FLLYQEPVLGPVR(酪蛋白位置203-214)C-14 RGPFPILV (酪蛋白位置214-222)D组具有膜联蛋白前体的肽D-1 ATFNRYQDDHGEEILKSL(膜联蛋白位置203-220)A组的肽可能也来源于β-酪蛋白同源物，但目前尚无证据支持此结论。
这些肽可以以基本上分离的形式提供。此外，也可提供含有上述两种或两种以上的肽组合的组合物。
就A-1到B-1的肽而言，本发明进一步包括任何包含特定氨基酸序列的肽。就A-1到D-1的肽而言，本发明进一步包括任何含有与特定序列相应的氨基端氨基酸序列的肽。因此，参考肽A-1，例如，本发明包括任何具有N-端氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD的肽；同样适用于A-2到D-1。为避免疑问，在此说明氨基端是指序列的左手端，这与通常惯例相符。还将说明的是任何特定的氨基酸序列可以具有氨基端和/或其羧基端的惰性氨基酸序列。本发明进一步包括这些肽的生理学可接受的活性衍生物。
可以通过许多技术获得肽。在一个实施方案中，可以天然地从初乳素或初乳中分离而制备它们。在优选的实施方案中，通过常规肽合成技术，如固相或液相肽合成制备它们。或者，可以通过已知的技术构建编码这些肽的基因序列，如表达载体或质粒并转染入合适的微生物，该微生物将表达DNA序列，借此以后可以从微生物生长的培养基中提取肽。这样，本发明还包括编码上述肽的DNA序列以及通过将DNA插入载体而制备的重组载体。
这些肽，无论是单独还是与另一种组合，都有许多治疗用途。
在一个有利的实施方案中，A-1到D-1中的一种或多种肽可用于治疗中枢神经系统疾病，特别是慢性中枢神经系统疾病。可治疗的中枢神经系统疾病包括神经性疾病和精神性疾病。治疗有效的神经性疾病的实例包括痴呆和引起痴呆的疾病，如神经变性疾病。神经变性疾病包括，例如，老年性痴呆和运动神经原疾病；帕金森病是能够治疗的运动神经原疾病的实例。阿尔茨海默病是能治疗的神经变性疾病的实例。能被一种或多种肽治疗的精神性疾病包括精神病和神经症。例如肽可用于治疗情绪障碍，尤其是处于抑郁状态的精神病患者的情绪障碍。这些肽也可以在脱瘾疗法一段时间后作为纠正药物成瘾的辅助性治疗，以及用于兴奋剂依赖的人。
在本发明另一个有利的实施方案中，A-1到D-1中的一种或多种肽可用于治疗免疫系统疾病，特别是在高龄人中可自发的慢性免疫系统疾病。这些肽还能用于治疗需要免疫调节的疾病。这些肽在各种以免疫性和感染性为基础的疾病治疗中有用。例如，它们能用于治疗具有细菌和病毒病原学的慢性疾病，以及治疗例如肿瘤化疗或放疗后造成的获得性免疫缺陷。这些肽可用于治疗需要非特异性免疫刺激和免疫矫正的慢性细菌和病毒感染。
慢性疾病是长期存在或预计长期存在的疾病，即至少为3个月，通常至少为6个月。
一种或多种这些肽可用于提高新生儿免疫系统的发育。本发明进一步的特点在于用肽纠正小儿免疫缺陷。肽的此类用途特别适用于未经初乳喂养的婴幼儿。比如婴幼儿自出生后就未母乳喂养的情况。
这些肽，无论是单独还是与另一种组合，还有诊断和研究应用。例如，合成肽以及下面提到的相应抗体，可用于识别发生于宿主中的病理过程。这些过程可被肽或抗体过度产生或抑制所诱导。一旦知道病理过程与特定水平的肽或抗体相关，测定肽和抗体在体液的生成就可用于确定发生在宿主中的病理过程。
根据本发明的另一方面，我们提供A-1到D-1任一肽用于饮食补充的用途。这种饮食补充对于婴儿，尤其是早产儿和足月婴儿，以及幼儿，在纠正他们的免疫系统发育缺陷方面特别有用。饮食补充还可用于接受化疗或因慢性疾病而有恶病质或体重减轻的成人，包括老年人。
在本发明的一方面，我们提供饮食补充，其包含一种或多种A-1到D-1的肽与生理学可接受的载体的可口服摄入的组合。这种饮食补充可为液体或固体形式；该饮食补充可适当地为片剂形式。这种饮食补充可为婴儿食物配方的形式。作为添加剂，饮食补充可包含乳铁蛋白和/或硒和/或包含干扰素族成员的细胞因子组。
按照本发明，可预防性地给予一种或多种A-1到D-1的肽，以帮助预防产生中枢神经系统和免疫系统疾病。
根据本发明的肽可用于促进β-淀粉样斑的分解，因此这些肽可用于治疗任何以产生β-淀粉样斑为特征的疾病。
根据本发明的肽的给药剂量范围可以为1纳克至10毫克。通常的剂量单位约为3微克。然而，最佳的剂量当然取决于所治疗的症状。
根据本发明的肽可以以任何适合的形式配方以给药。因此本发明进一步提供组合物，特别是药物组合物，它包括一种或多种肽和生理学可接受的载体。例如，这些肽可以配方以口服、局部、直肠或非胃肠给药。更具体地说，这些肽可以配方以注射给药，或者优选地，以适于经口腔/鼻咽腔粘膜、消化道或其它粘膜表面吸收的形式配方。这些肽可以配方以静脉内、皮下或肌肉内给药。口服配方可以为用于吞咽的形式，或者优选地，为溶于唾液的形式，借此该配方能在口腔/鼻咽腔粘膜中被吸收。口服配方可为口服给药的片剂形式、锭剂(即甜味片剂，其形式为适于含在口中或吸吮的形式)或涂于牙龈的粘胶。这些肽可以配方成橡皮膏或贴剂，它们可用于牙龈。这些肽还可以配方成泌尿生殖器官粘膜使用的制剂。局部配方可以为例如乳膏或凝胶的形式。
一种或多种这些肽可以混入牛奶或软干酪的制品。
根据本发明的另一方面，提供药物组合物，其包括含氨基酸链LQTPQPLLQVMMEPQGD；DPPPPQS；和/或LFFFLPVVNVLP的肽，或作为免疫抑制剂的用途，用于治疗自身免疫病和/或用于抑制移植器官的排异反应。本发明还包括一种或多种这些肽在用作免疫抑制的药物的生产中的用途，所述药物用于治疗自身免疫病和/或用于抑制移植器官的排异反应。
我们已发现初乳中肽的比例随时间而改变。由于激素的变化，许多分泌到初乳中的蛋白随之降解。分娩后时间越长，降解的范围越广。这一知识将有助于新生儿食物配方和许多用于免疫受损患者药物的设计。
另一方面，本发明提供A-1到D-1的每一种肽的抗体，以及含有所述抗体的组合物。特别是本发明提供了基本上分离形式的抗体。抗体可通过用相应的肽(配以合适的佐剂)注射合适的哺乳动物如兔而产生，然后，等待至抗体产生的时间后，从个体回收抗体。这一技术在实施例3中有详述。用合成的肽作为抗原就可能通过ELISA(酶联免疫吸附测定)测试产生正确的抗体。还能用初乳素中的天然肽进一步测试抗体，以确认合成肽的确与初乳素中发现的天然肽相对应。这些抗体在治疗、作为诊断工具和研究工具方面具有潜在用途。
本发明还包括在选定的时间，将一种或多种A-1到D-1的肽选择性给予患者，以及在选定的时间，为起动或终止肽的活性而选择性给予一种或多种肽的抗体。
选择的一种或几种肽和/或抗体可以为单一组合物的形式，特别设计该组合物以产生特定效果。例如，某人有免疫性疾病，组合物可以为那种疾病特别地设计。可以为一种以上的疾病特定地选择组合物。可以特定地选择组合物以在个体中维持或产生特定的平衡。
在某些应用中，提供药物组合物可能是可取的，所述组合物含有一种或多种肽和一种或多种抗体，以及生理学可接受的载体。
本发明进一步包括一种或多种肽和/或抗体在用于任何上述治疗应用中的药物的生产中的用途。
图1-18是本发明的某些肽的基质辅助激光解吸飞行时间质谱(LDMS)的谱图。
具体实施例方式
本发明将参考以下实施例被进一步描述。
实施例1初乳素的制备初乳素能通过已有技术已经公开的技术制备，包括例如WO-A-98/14473。分娩后12小时内从母羊收集初乳，通过离心去除细胞和脂质成份、调节pH去除营养成份、硫酸铵沉淀、离子交换色谱和分子筛而将其纯化。
实施例2初乳素成份的鉴定通过实施例1制得的初乳素最先经SDSPAGE分析，由此我们发现以下两种肽VLEMKFPPPPQETVT(A-3)和LKPFKLKVEVFPEP(A-4)。但用此技术我们不能鉴定其它任何肽，所以我们改用hplc。
使用C-18反相柱通过hplc将实施例1制得的初乳素分级分离。该技术用于分离初乳素中不同疏水性的肽。hplc柱由Separation Methods Technologies(Newark，Delaware，U.S.A)得到。此柱类型被命名为C-18，长150毫米，直径10毫米。柱中填有粒度为3微米的颗粒，孔径大小为30纳米。泵组件和二极管阵列由Beckman(Fullerton，California，U.S.A)提供使用Beckman SystemGold 126泵组件和Beckman SystemGold168二极管阵列检测器组件。
将初乳素加载于于hplc级水中的0.1％的三氟乙酸(TFA)。将500微升样品，其含有约900皮摩尔初乳素，加载于柱上，柱在加载前已经平衡。集中冲洗约10分钟后，用溶液A和B形成的梯度洗脱物质，其方式列于表1。在此期间，通过柱的流速为0.06毫升/分钟。
表1
溶剂A于hplc级水中的0.1％TFA(三氟乙酸)。
溶剂B于hplc级水中的70％氟化乙腈和0.09％TFA。
hplc各峰中所得的肽然后用Edman降解进行单独分析；这通过Beckman LF3000测序仪完成。将各浓缩的部分加载至预先用盐处理的Beckman肽支持板中。使用标准Edman降解步骤对样品进行测序。通常，各分析中用10到100皮摩尔产生10-25个循环。
接下来，用列式hplc系统分析各部分。在此使用惠普PTH-AA柱，长250毫米，直径2.1毫米。使用BeckmanSystemGold126泵组件和Beckman System Gold 168二极管阵列检测器组件。柱中流速为0.275毫升/分钟，溶剂组成的变化列于表2。
表2
溶剂A于hplc级水中的3.5％THF(四氢呋喃)，1.5％氟化乙腈预混合液，1％乙酸和0.02％TEA(三乙醇胺)。
溶剂B于乙腈中的12％异丙醇。
然后将肽A-1到D-1的结构用于与在两个已知计算机程序中登记的序列作比较研究National Center for BiotechnologyInformation NR Protein Data Base(国家生物技术信息中心NR蛋白数据库)的Wu-Blast 2和Human Genome Center(人类基因组中心)，Baylor医学院，Houston，Texas，USA提供的Beauty-Post Processing。这使确定P1-P32肽序列中任何序列是否为已知序列成为可能。
Edman降解的结果总结于表3中。随后用计算机程序进行的分析表明在初乳素中的肽至少有两种不同的前体蛋白β-酪蛋白和膜联蛋白。而且，通过使用Tremble程序，可能发现某些肽可能有酪蛋白同源物前体的证据。最后，某些肽有独特的序列，与任何已知蛋白无同源性。
表3
ND表示这些部分未作分析。
DKE(A-6)、LQPEIMGVPKVKETMVPK(C-4)、FLLYQEPVLGPVR(C-11)和RGPFPILV(C-13)也通过hplc检测到，但它们的存在在上表中没有列出。
实施例3抗体的制备实施例2中鉴定的肽通过已知的固相方法合成技术制备。这一方法包括以下步骤1.用DMF(二甲基甲酰胺)洗涤预先加载的树脂，然后彻底排液。
2.在树脂中加入10毫升20％哌啶/DMF，振摇5分钟，然后排液。
3.另外加入10毫升20％哌啶/DMF，振摇30分钟。
4.将反应容器排液，用DMF洗涤树脂4次。然后用DCM(二氯甲醇)洗涤一次。用茚三酮试验检查珠粒一珠粒应为蓝色。
5.偶联步骤实施如下准备以下溶液1毫摩尔Fmoc(即芴基甲氧碳酰)氨基酸，2.1毫升0.45M HBTU/HOBT(1毫摩尔)(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸/N-羟基苯并三唑-H2O)348微升D工EA(2毫摩尔)(二异丙基乙基胺)将溶液加入树脂并振摇至少30分钟。
6.将反应容器排液，再次用DMF洗涤树脂4次，用DCM洗涤一次。
7.进行茚三酮试验如果为阳性(无色)-进行步骤2，继续合成。
如果为阴性(蓝色)-返回步骤5，再偶联同样的Fmoc氨基酸。
8.合成结束后，用5％水、5％苯酚、3％thionisole、3％EDT(乙二硫醇)、3％三异丙基甲硅烷和81％TFA将肽从树脂上裂解下来，共2小时。
9. 2小时后，滤入冷MTBE(甲基叔丁基醚)。然后将沉淀的肽用冷MTBE洗两次，并在氮气下干燥。
10.合成肽的分子量用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(LDMS)检测，而纯度用hplc检测，使用C-18，300埃，5微米的柱。所得某些肽的谱图在图1-18中显示。
在合成肽的每一N-末端，连有L-半胱氨酸，肽形成一环使半胱氨酸基团位于合成肽的N-末端与C-末端之间。这使肽易于与匙孔血淋巴(Keyhole Hemolymph，KHL)缀合。在连接L-半胱氨酸之前，用生物惰性的氨基酸人工将短肽(即含有9个或9个以下氨基酸的肽)延长。此举是为了易于退火并增加短肽的抗原性。
表4列举了许多形成的肽并标明了激光解吸质谱的图号。
表4
本发明进一步提供了表4中的每一特定肽，以及每一种肽的环化形式，尤其是分离形式的和通过合成方法制备的。术语“Ac”是指酰基。
为了免疫接种，使用两只幼年成兔(5-6月龄，重5-6lb[2.3-2.7千克])。将各抗原(即各合成肽)在10个不同部位进行皮下和肌肉内注射，每处0.1毫升。所用方案按以下顺序进行
日过程0预先放血，用200微克肽，以0.5毫升与等体积弗氏完全佐剂(矿物油/乳化剂/灭活的分支杆菌)混和的缀合物溶液首次接种兔。
14 用200微克肽，以0.5毫升与等体积弗氏不完全佐剂(矿物油/乳化剂)混和的缀合物溶液加强接种。
28 加强接种(同第14天)制备取血(约20毫升血清)42 加强接种(同第14天)制备取血(约20毫升血清)56 加强接种(同第14天)制备取血(约20毫升血清)70 加强接种(同第14天)制备取血(约20毫升血清)此方案可以有所变化。例如制备取血的频率特别地取决于宿主品种的大小及其健康状况。
按此方案制备的血清用于在蛋白A基质(来自Sigma，St.Louis，MO，USA)上的IgG纯化。此方案如下1.用10毫升1×PBS(磷酸缓冲盐水)洗柱。有两根1米柱串联排列，各自含有蛋白A基质。
2.在3毫升PBS中加入3毫升血清，在2根柱间分离此混合物。
3.血清从柱中流出来后将其收集入试管。
4.当血清流完后，将洗出的血清再注入柱中，开始重新收集流出液。重复此步骤5-6次。
5.用10毫升1×PBS洗柱。
6.准备几个1毫升的试管，内有50微升1M的TRIS(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)(pH＝9.5)。
7.在每一试管中加入1毫升洗脱缓冲液(100mM甘氨酸，pH＝2.8)并收集1毫升流出液。
8.转到下一个制备试管并重复步骤7。
9.准备含有10微升Bradford测定液的ELISA板，向其中加入各1毫升流出液50微升，测定各1毫升样品。保留使Bradford测定液由红变蓝的样品。
10.将1毫升阳性样品与4升1×PBS，pH＝7.2一起透析至少24小时。
11.用分光光度计在280纳米处测定溶液中IgG(消光系数＝1.4)的浓度。
12.保存IgG溶液，保持于-4℃至20℃冷冻。
表5列出了某些抗体的结果。
表5
血清中的抗体水平用相应的合成肽作为抗原以ELISA(酶联免疫吸附测定)测定。这一技术包括以下步骤
1.将抗原用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH9.0)稀释，得到含抗原10微克/毫升的溶液。在96孔板的每一微孔中加入50微升此溶液。
2.盖上板，并在37℃保温3小时。
3.用偶联缓冲液洗涤孔并用200微升BSA(牛血清白蛋白)Pierce标准溶液封闭。
4.将50微升稀释的BSA(0.75％溶液)滴入各孔。将50微升用稀释的BSA稀释为1∶100的抗体血清样品放在每一行的A排。
5.沿着板往下进行1∶2系列稀释。
6.盖上板，并在室温下保温60分钟。
7.将滴定板用PBS洗涤液洗涤4次。
8.将50微升于BSA中稀释为1∶1000的山羊抗兔IgG(H&L)HRP缀合物滴入各孔中，并在室温下保温60分钟(H&L＝重链与轻链；HRP＝辣根过氧化物酶)。
9.将滴定板用PBS洗涤液洗涤4次。
10.往各孔中滴入50微升底物溶液2，2′-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二铵盐(ABTS，来自Pierce，其用于帮助显示抗体抗原反应程度)并在室温下保温约2分钟。
11.通过加入50微升1％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应。
12.然后用滤光器(Dynoplate reader)在405读板。
表6中的数据显示了血清抗体与经10周免疫反应后特定抗体的滴度。
表6
表6中显示了两只兔R1和R2的结果。总而言之，这些结果说明制得的肽的抗体的效价非常高，所以每一种抗体是其合成肽抗原的正确抗体。用此技术制备的抗体是单特异性的。但是对肽A-1、A-7和B-8的抗原反应明显低于预期，使我们预见这些肽，尤其是B-8作为免疫抑制剂将会有用，因此在自身免疫性疾病的治疗和预防器官移植中的器官排异方面将会有用。
实施例4为了确定与合成肽抗原相应的肽存在于初乳素中，我们作了试验来确认是否某些抗体自身在初乳素中产生反应。
我们研究了肽A-4、B-7、B-8和B-9在羊初乳中消失的速度。在产后24小时、48小时和72小时从母乳中收集初乳，测定肽的水平。通过抗原-抗体反应测定肽的水平，使用实施例3中方法制得的抗体。结果列于表7。
表7
这些结果证明抗体识别氨基酸序列A-4、B-7、B-8和B-9，由于抗体与肽相结合，肽的浓度随时间而降低。
可以理解，上述发明可被改进。
序列表<110>雷根医疗公开有限公司<120>肽<130>GBAAT0061<140>
<141>
<150>9912852.2<151>1999-06-02<160>50<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>17<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>15Asp Leu Glu Met Pro Val Leu Pro Val Glu Pro Phe Pro Phe Val1 5 10 15<210>16<211>12<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>16Leu Phe Phe Phe Leu Pro Val Val Asn Val Leu Pro1 5 10<210>17<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>17Met Gln Pro Pro Pro Leu Pro1 5<210>18<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>18Asp Gln Pro Pro Asp Val Glu Lys Pro Asp Leu Gln Pro Phe Gln Val1 5 10 15Gln Ser<210>19<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>19Val Tyr Pro Phe Thr Gly Pro Ile Pro Asn1 5 10<210>20<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>20Ser Leu Pro Gln Asn Ile Leu Pro Leu1 5<210>21<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>21Thr Gln Thr Pro Val Val Val Pro Pro Phe1 5 10<210>22<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>22Leu Gln Pro Glu Ile Met Gly Val Pro Lys Val Lys Glu Thr Met Val1 5 10 15
Pro Lys<210>23<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>23His Lys Glu Met Pro Phe Pro Lys Tyr Pro Val Glu Pro Phe Thr Glu1 5 10 15Ser Gln<210>24<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>24Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Lys Leu His Leu Pro Leu Pro Leu1 5 10 15Val Gln<210>25<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽
<400>25Ser Trp Met His Gln Pro Pro1 5<210>26<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>26Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro1 5 10<210>27<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>27Met His Gln Pro Pro Gln Pro Leu Pro Pro Thr Val Met Phe Pro1 5 10 15<210>28<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>28Pro Gln Ser Val Leu Ser1 5
<210>29<211>22<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>29Leu Ser Gln Pro Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Gln1 5 10 15Arg Asp Met Pro Ile Gln20<210>30<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>30Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Glu1 5<210>31<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>31Phe Leu Leu Tyr Gln Glu Pro Val Leu Gly Pro Val Arg1 5 10<210>32
<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>32Arg Gly Pro Phe Pro Ile Leu Val1 5<210>33<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>33Ala Thr Phe Asn Arg Tyr Gln Asp Asp His Gly Glu Glu Ile Leu Lys1 5 10 15Ser Leu<210>34<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>34Cys Leu Gln Thr Pro Gln Pro Leu Leu Gln Val Met Met Glu Pro Gln1 5 10 15Gly Asp
<210>35<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>35Cys Met Pro Gln Asn Phe Tyr Lys Leu Pro Gln Met1 5 10<210>36<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>36Cys Val Leu Glu Met Lys Phe Pro Pro Pro Pro Gln Glu Thr Val Thr1 5 10 15<210>37<211>16<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>37Cys Leu Lys Pro Phe Pro Lys Leu Lys Val Glu Val Phe Pro Phe Pro1 5 10 15<210>38<211>8<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>38Ser Glu Gln Pro Gly Gly Gly Cys1 5<210>39<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>39Cys Gly Val Leu Pro Pro Asn Val Gly1 5<210>40<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>40Cys Gly Gly Gly Lys Tyr Lys Leu Gln Glu1 5 10<210>41<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>41Cys Gly Gly Gly Ser Glu Glu Met Pro
15<210>42<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>42Cys Gly Gly Gly Asp Ser Gln Pro Pro Val1 5 10<210>43<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>43Cys Phe Pro Pro Pro Lys Gly Gly Gly Cys1 5 10<210>44<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>44Cys Gly Gly Gly Val Val Met Glu Val1 5<210>45<211>16
<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>45Cys Asp Leu Glu Met Pro Val Leu Pro Val Glu Pro Phe Pro Phe Val1 5 10 15<210>46<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>46Cys Leu Phe Phe Phe Leu Pro Val Val Asn Val Leu Pro Ile1 5 10<210>47<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>47Cys Met Gln Pro Pro Pro Leu Pro1 5<210>48<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽
<400>48Cys Asp Gln Pro Pro Asp Val Glu Lys Pro Asp Leu Gln Pro Phe Gln1 5 10 15Val Gln Ser<210>49<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>49Cys Gly Ala Phe Leu Leu Tyr Gln Glu1 5<210>50<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述从初乳素分离的肽<400>50Cys Ala Thr Phe Asn Arg Tyr Gln Asp Asp His Gly Glu Glu Ile Leu1 5 10 15Lys Ser Leu
权利要求
1.基本上分离形式的肽，其基本上包括以下氨基端氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD-OH(SEQ ID 1)；MPQNFYKLPQM(SEQID 2)；VLEMKFPPPPQETVT(SEQ ID 3)；LKPFPKLKVEVFPFP(SEQID 4)；SEQP(SEQ ID 5)；DKE(SEQ ID 6)；DPPPPQS(SEQID 7)；LNF(SEQ ID 8)；VLPPNVG(SEQ ID 9)；KYKLQPE(SEQID 10)；SEEMP(SEQ ID 11)；DSQPPV(SEQ ID 12)；FPPPK(SEQ ID 13)；VVMEV(SEQ ID 14)；DLEMPVLPVEPFPFV(SEQID 15)；LFFFLPVVNVLP(SEQ ID 16)；MQPPPLP(SEQ ID 17)；DQPPDVEKPDLQPFQVQS(SEQ ID 18)；VYPFTGPIPN(SEQ ID19)；SLPQNILPL(SEQ ID 20)；TQTPVVVPPF(SEQ ID 21)；LQPEIMGVPKVKETMVPK(SEQ ID 22)；HKEMPFPKYPVEPFTESQ(SEQ ID 23)；SLTLTDVEKLHLPLPLVQ(SEQ ID 24)；SWMHQPP(SEQ ID 25)；QPLPPTVMFP(SEQ ID 26)；MHQPPQPLPPTVMFP(SEQ ID 27)；PQSVLS(SEQ ID 28)；LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ(SEQ ID 29)；AFLLYQE(SEQ ID 30)；FLLYQEPVLGPVR(SEQID 31)；RGPFPILV(SEQ ID 32)；ATFNRYQDDHGEEILKSL(SEQID 33)。
2.基本上分离形式的肽，其基本上包括以下氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD(SEQ ID 1)；MPQNFYKLPQM(SEQ ID 2)；VLEMKFPPPPQETVT(SEQ ID 3)；LKPFPKLKVEVFPFP(SEQ ID4)；DPPPPQS(SEQ ID 7)；VLPPNVG(SEQ ID 9)；KYKLQPE(SEQ ID 10)；DSQPPV(SEQ ID 12)；DLEMPVLPVEPFPFV(SEQID 15)；LFFFLPVVNVLP(SEQ ID 16)；MQPPPLP(SEQ ID 17)；DQPPDVEKPDLQPFQVQS(SEQ ID 18)。
3.基本上分离形式的肽，其基本上完全由以下氨基酸序列组成LQTPQPLLQVMMEPQGD(SEQ ID 1)；MPQNFYKLPQM(SEQ ID2)；VLEMKFPPPPQETVT(SEQ ID 3)；LKPFPKLKVEVFPFP(SEQID 4)；SEQP(SEQ ID 5)；DKE(SEQ ID 6)；DPPPPQS(SEQID 7)；LNF(SEQ ID 8)；VLPPNVG(SEQ ID 9)；KYKLQPE(SEQID 10)；SEEMP(SEQ ID 11)；DSQPPV(SEQ ID 12)；FPPPK(SEQ ID 13)；VVMEV(SEQ ID 14)；DLEMPVLPVEPFPFV(SEQID 15)；LFFFLPVVNVLP(SEQ ID 16)；MQPPPLP(SEQ ID 17)；DQPPDVEKPDLQPFQVQS(SEQ ID 18)；VYPFTGPIPN(SEQ ID19)；SLPQNILPL(SEQ ID 20)；TQTPVVVPPF(SEQ ID 21)；LQPEIMGVPKVKETMVPK(SEQ ID 22)；HKEMPFPKYPVEPFTESQ(SEQ ID 23)；SLTLTDVEKLHLPLPLVQ(SEQ ID 24)；SWMHQPP(SEQ ID 25)；QPLPPTVMFP(SEQ ID 26)；MHQPPQPLPPTVMFP(SEQ ID 27)；PQSVLS(SEQ ID 28)；LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ(SEQ ID 29)；AFLLYQE(SEQ ID 30)；FLLYQEPVLGPVR(SEQID 31)；RGPFPILV(SEQ ID 32)；ATFNRYQDDHGEEILKSL(SEQID 33)。
4.根据权利要求1、2或3的肽，其通过合成方法而得到。
5.通过合成方法而得到的肽，其基本上包括以下氨基端氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD(SEQ ID 1)；MPQNFYKLPQM(SEQID 2)；VLEMKFPPPPQETVT(SEQ ID 3)；LKPFPKLKVEVFPFP(SEQID 4)；SEQP(SEQ ID 5)；DKE(SEQ ID 6)；DPPPPQS(SEQID 7)；LNF(SEQ ID 8)；VLPPNVG(SEQ ID 9)；KYKLQPE(SEQID 10)；SEEMP(SEQ ID 11)；DSQPPV(SEQ ID 12)；FPPPK(SEQ ID 13)；VVMEV(SEQ ID 14)；DLEMPVLPVEPFPFV(SEQID 15)；LFFFLPVVNVLP(SEQ ID 16)；MQPPPLP(SEQ ID 17)；DQPPDVEKPDLQPFQVQS(SEQ ID 18)；VYPFTGPIPN(SEQ ID19)；SLPQNILPL(SEQ ID 20)；TQTPVVVPPF(SEQ ID 21)；LQPEIMGVPKVKETMVPK(SEQ ID 22)；HKEMPFPKYPVEPFTESQ(SEQ ID 23)；SLTLTDVEKLHLPLPLVQ(SEQ ID 24)；SWMHQPP(SEQ ID 25)；QPLPPTVMFP(SEQ ID 26)；MHQPPQPLPPTVMFP(SEQ ID 27)；PQSVLS(SEQ ID 28)；LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ(SEQ ID 29)；AFLLYQE(SEQ ID 30)；FLLYQEPVLGPVR(SEQID 31)；RGPFPILV(SEQ ID 32)；ATFNRYQDDHGEEILKSL(SEQID 33)。
6.通过合成方法而得到的肽，其基本上包括以下氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD(SEQ ID 1)；MPQNFYKLPQM(SEQ ID 2)；VLEMKFPPPPQETVT(SEQ ID 3)；LKPFPKLKVEVFPFP(SEQ ID4)；DPPPPQS(SEQ ID 7)；VLPPNVG(SEQ ID 9)；KYKLQPE(SEQ ID 10)；DSQPPV(SEQ ID 12)；DLEMPVLPVEPFPFV(SEQID 15)；LFFFLPVVNVLP(SEQ ID 16)；MQPPPLP(SEQ ID 17)；DQPPDVEKPDLQPFQVQS(SEQ ID 18)。
7.通过合成方法而得到的肽，其基本上完全由以下氨基酸序列组成LQTPQPLLQVMMEPQGD(SEQ ID 1)；MPQNFYKLPQM(SEQID 2)；VLEMKFPPPPQETVT(SEQ ID 3)；LKPFPKLKVEVFPFP(SEQID 4)；SEQP(SEQ ID 5)；DKE(SEQ ID 6)；DPPPPQS(SEQID 7)；LNF(SEQ ID 8)；VLPPNVG(SEQ ID 9)；KYKLQPE(SEQID 10)；SEEMP(SEQ ID 11)；DSQPPV(SEQ ID 12)；FPPPK(SEQ ID 13)；VVMEV(SEQ ID 14)；DLEMPVLPVEPFPFV(SEQID 15)；LFFFLPVVNVLP(SEQ ID 16)；MQPPPLP(SEQ ID 17)；DQPPDVEKPDLQPFQVQS(SEQ ID 18)；VYPFTGPIPN(SEQ ID19)；SLPQNILPL(SEQ ID 20)；TQTPVVVPPF(SEQ ID 21)；LQPEIMGVPKVKETMVPK(SEQ ID 22)；HKEMPFPKYPVEPFTESQ(SEQ ID 23)；SLTLTDVEKLHLPLPLVQ(SEQ ID 24)；SWMHQPP(SEQ ID 25)；QPLPPTVMFP(SEQ ID 26)；MHQPPQPLPPTVMFP(SEQ ID 27)；PQSVLS(SEQ ID 28)；LSQPKVLPVPQKAVPQRDMPIQ(SEQ ID 29)；AFLLYQE(SEQ ID 30)；FLLYQEPVLGPVR(SEQID 31)；RGPFPILV(SEQ ID 32)；ATFNRYQDDHGEEILKSL(SEQID 33)。
8.肽，包括以下NH2-(AC)CLQTPQPLLQVMMEPQGD-OH(SEQ ID 34)；NH2-(AC)CMPQNFYKLPQM-OH(SEQ ID 35)；NH2-(AC)CVLEMKFPPPPQETVT-OH(SEQ ID 36)；NH2-(AC)CLKPFPKLKVEVFPFP-OH(SEQ ID 37)；NH2-SEQPGGGC-OH(SEQ ID 38)；NH2-(AC)CGVLPPNVG-OH(SEQID 39)；NH2-(AC)CGGGKYKLQE-OH(SEQ ID 40)；NH2-(AC)CGGGSEEMP(酰胺)-OH(SEQ ID 41)；NH2-(AC)CGGGDSQPPV-OH(SEQ ID 42)；NH2-CFPPPKGGGC-OH(SEQ ID 43)；NH2-(AC)CGGGVVMEV-OH(SEQ ID 44)；NH2-(AC)CDLEMPVLPVEPFPFV-OH(SEQ ID 45)；NH2-(AC)CLFFFLPVVNVLPI-OH(SEQ ID 46)；NH2-(AC)CMQPPPLP-OH(SEQ ID 47)；NH2-(AC)CDQPPDVEKPDLQPFQVQS-OH(SEQ ID 48)；NH2-(AC)CGAFLLYQE-OH(SEQ ID 49)；NH2-(AC)CATFNRYQDDHGEEILKSL-OH(SEQ ID 50)。
9.根据前述任一权利要求的肽，其用作药物。
10.根据权利要求9的肽，其用于治疗慢性中枢神经系统疾病。
11.根据权利要求10的肽，其用于治疗神经性疾病和/或精神性疾病。
12.根据权利要求9的肽，其用于治疗痴呆和/或神经变性疾病。
13.根据权利要求9的肽，其用于治疗阿尔茨海默病和/或运动神经原疾病。
14.根据权利要求9的肽，其用于治疗精神病和/或神经症。
15.根据权利要求9的肽，其用于治疗慢性免疫系统疾病。
16.根据权利要求9的肽，其用于治疗具有细菌和病毒病原学的疾病，和/或用于治疗获得性免疫缺陷。
17.根据权利要求9的肽，其用于治疗慢性细菌和/或病毒感染。
18.根据权利要求9的肽，其用于治疗以存在β-淀粉样斑为特征的疾病。
19.权利要求1-8中的任一权利要求的肽在用于治疗慢性中枢神经系统疾病的药物的生产中的用途。
20.权利要求1-8中的任一权利要求的肽在用于治疗慢性免疫系统疾病的药物的生产中的用途。
21.治疗中枢神经系统和/或免疫系统疾病的方法，所述方法包括给予患者治疗有效量的权利要求1-8中的任一权利要求的肽。
22.包含权利要求1-8中的任一权利要求的肽和生理学可接受的载体的组合物。
23.包含两种或更多种权利要求1-8中的任一权利要求的肽和生理学可接受的载体的组合物。
24.根据权利要求22或23的组合物，其为适合于注射的形式。
25.根据权利要求22或23的组合物，其为适合于经口腔/鼻咽腔粘膜吸收的形式，和/或适合于消化道吸收的形式。
26.根据权利要求22或23的组合物，其为片剂、锭剂、凝胶、贴剂或硬膏剂的形式。
27.根据权利要求22或23的组合物，其为适合于局部施用的形式。
28.权利要求1-8中的任一权利要求的肽作为饮食补充的用途。
29.权利要求1-8中的任一权利要求的肽作为婴儿、小儿、接受化疗的成人和/或因慢性疾病而有恶病质或体重减轻的成人的饮食补充的用途。
30.一种饮食补充，其包含权利要求1-8中的任一权利要求的肽与生理学可接受的载体的可口服摄入的组合。
31.与权利要求1或8中的任一权利要求的肽结合的抗体。
32.可通过将权利要求1-8中的任一权利要求的肽用作抗原而得到的抗体。
33.用作免疫抑制剂的肽，其包括氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD；DPPPPQS；和/或LFFFLPVVNVLP。
34.用于治疗自身免疫疾病的肽，其包括氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD；DPPPPQS；和/或LFFFLPVVNVLP。
35.用于抑制移植器官的排异反应的肽，其包括氨基酸序列LQTPQPLLQVMMEPQGD；DPPPPQS；和/或LFFFLPVVNVLP。
全文摘要
本发明公开了初乳素(colostrinin)中存在的几种肽的氨基酸序列。这些肽在免疫系统和中枢神经系统疾病的治疗中特别有用。
文档编号A61P37/02GK1800213SQ20051010879
公开日2006年7月12日 申请日期2000年6月2日 优先权日1999年6月2日
发明者耶日·A·杰奥尔贾德 申请人:雷根医疗公开有限公司