Fc区变体的制作方法

专利名称：Fc区变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及多肽Fc区变体和编码Fc区变体的寡核苷酸。具体而言，本发明提供包含新Fc区变体的组合物、鉴定有用Fc区变体的方法和利用Fc区变体的方法(例如用于治疗疾病)。
背景技术：
人存在五种类型免疫球蛋白。已知这些种类是IgG、IgM、IgD、IgA和IgE，并且是基于重链基因同种型(分别为γ、μ、δ、α和ε)区分的。最常见的同种型是IgG，由两条完全相同的重链多肽和两条完全相同的轻链多肽组成(见图1)。两条重链通过二硫键彼此共价连接，每条轻链通过一个二硫键与一条重链连接(见图1)。每条重链含大约445个氨基酸残基，每条轻链含大约215个氨基酸残基。
每条重链含有四个明显的结构域，通常称作可变结构域(VH)、重链恒定结构域1(CH1)、重链恒定结构域2(CH2)和重链恒定结构域3(CH3)(见图1)。CH1和CH2结构域由赋予Ig柔性的铰链区(结构域间部分)连接。每条轻链含有两个明显的结构域，通常称作可变轻链(VL)和恒定轻链(CL)。
重链和轻链的可变区直接结合抗原并决定Ig多样性和特异性。每个VL和VH具有三个互补决定区(CDR，也称高变区)。当VL和VH通过重链和轻链的相互作用相遇对，则CDR形成接触抗原的结合表面。
所述的可变区参与抗原结合，而重链恒定结构域(主要是CH2和CH3)参与非抗原结合性功能。该区域通常称作Fc区，具有许多重要功能。例如Fc区结合补体，这可启动吞噬作用或补体依赖性细胞毒作用(CDC)。Fc区还结合Fc受体，这可启动吞噬作用或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。Fc区还具有辅助维持循环中免疫球蛋白的作用以及与常用于纯化免疫球蛋白的A蛋白相互作用。
近来人们已经致力于提高抗体的免疫原性品质和抗原结合特征。例如，已开发了用于免疫治疗的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。已批准用于人免疫治疗的抗体实例及对应的疾病包括RITUXAN(淋巴瘤)、SYNAGIS(传染病)、ZENEPAX(肾移植)、REMICADE(克隆病和类风湿性关节炎)、HERCEPTIN(乳腺癌)和EDRECOLOMAB(结肠癌)。然而，许多抗体已进入临床试验但因缺乏功效或者其他相关问题而未获批准。
为改善功效和加速批准另外的治疗性抗体，所需要的是组合物及用于改变Fc区以产生具有改善特性的变体多肽的方法。
发明简述本发明提供多肽Fc区变体和编码Fc区变体的寡核苷酸及其部分。特别地，本发明提供包含新Fc区变体的组合物、鉴定有用Fc区变体的方法和利用Fc区变体的方法。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含247位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是P247L。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含的251位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是L251F。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含256位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是T256M。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含268位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是H268E。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含280位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是D280A。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含330位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是A330K。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含332位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是I332E。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含339位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是A339T。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在全血测定法中变体比母体多肽更有效地介导靶细胞(如B细胞)减少，并且该变体在Fc区内至少包含378位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是A378D。
在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含440位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，变体包含抗体(例如抗CD20抗体)。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是S440Y。
在一些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO15中所示序列的肽(含有P247L氨基酸修饰)。在其他实施方案中，本发明提供编码带P247L修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO40)。在一些实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO15的带P247L修饰的CH2区的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明提供具有在SEQ ID NO16中所示序列的肽(含有L251F氨基酸修饰)。在另外的实施方案中，本发明提供编码带L251F修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO41)。在另外的实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO16的带L251F修饰的CH2区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO17中所示序列的肽(含有T256M氨基酸修饰)。在其他实施方案中，本发明提供编码带T256M修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO42)。在一些实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO17的带T256M修饰的CH2区的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO20中所示序列的肽(含有H268E氨基酸修饰)。在另外的实施方案中，本发明提供编码带H268E修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO45)。在另外的实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO20的带H268E修饰的CH2区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO21中所示序列的肽(含有D280A氨基酸修饰)。在其他实施方案中，本发明提供编码带D280A修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO46)。在一些实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO21的带D280A修饰的CH2区的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO23中所示序列的肽(含有A330K氨基酸修饰)。在另外的实施方案中，本发明提供编码带A330K修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO48)。在另外的实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO23的带A330K修饰的CH2区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO26中所示序列的肽(含有I332E氨基酸修饰)。在其他实施方案中，本发明提供编码带I332E修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO51)。在一些实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO26的带I332E修饰的CH2区的氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO29中所示序列的肽(含有A339T氨基酸修饰)。在另外的实施方案中，本发明提供编码带A339T修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO54)。在另外的实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO29的带A339T修饰的CH2区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO30中所示序列的肽(含有A378D氨基酸修饰)。在其他实施方案中，本发明提供编码带A378D修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO55)。在一些实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO30的带S440Y修饰的CH2区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含在SEQ ID NO31中所示序列的肽(含有S440Y氨基酸修饰)。在其他实施方案中，本发明提供编码带S440Y修饰的CH2区的核酸序列(例SEQ ID NO56)。在一些实施方案中，本发明提供编码包含SEQ ID NO31的带S440Y修饰的CH2区的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含247位置处的选自P247H、P247I和P247L的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区至少包含251位置处的L251F氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含256位置处的选自T256M和T256P的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含268位置处的选自H268D和H268E的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含280位置处的选自D280A和D280K的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含330位置处的选自A330K和A330R的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含332位置处的选自I332D和I332E的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含339位置处的A339T氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含378位置处的A378D氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体(或编码该变体的核酸序列)，其中该变体在Fc区内至少包含440位置处的S440Y氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含247位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含247位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO13的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含含有SEQ IDNO14的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含含有SEQ ID NO15的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中核酸序列包含SEQ ID NO38和/或SEQ ID NO39和/或SEQ ID NO40或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO38、39或40的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)和包含SEQ ID NO38和/或SEQ ID NO39和/或SEQ ID NO40的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO13、14、15、38、39或40的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是P247H、P247I或P247L。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含251位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体比母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含251位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，该多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQ ID NO16的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含含有SEQ IDNO41或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO41的序列的核酸序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)和包含SEQ ID NO41的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO16或41的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是L251F。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含256位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含256位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO17的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含含有SEQ IDNO18的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO42和/或SEQ ID NO43或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO42或43的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO42和/或SEQ IDNO43的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO17、18、42或43的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是T256M或T256P。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含268位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含268位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO19的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含含有SEQ IDNO20的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO44和/或SEQ ID NO45或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO44或45的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO44和/或SEQ IDNO45的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO19、20、44或45的表现形式。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区内至少包含322位置处的一处氨基酸修饰。在特定实施方案中，至少一处氨基酸修饰是I322K或I322R。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是H268D或H268E。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含280位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含280位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO21的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含含有SEQ IDNO22的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO46和/或SEQ ID NO47或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO46和47的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO46和/或SEQ IDNO47的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO21、22、46和47的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是D280A或D280K。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含330位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含330位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO23的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含含有SEQ IDNO24的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO48和/或SEQ ID NO49或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO48或49的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO48和/或SEQ IDNO49的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO23、24、48和49的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是A330K或A330R。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含332位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含332位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO25的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含含有SEQ IDNO26的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO50和/或SEQ ID NO51或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO50或51的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO50和/或SEQ IDNO51的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO25、26、50和51的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是I332D或I332E。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含339位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含339位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO29的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO54或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO54的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO54的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO29或54的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是A339T。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在全血测定法中变体较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗，并且变体在Fc区至少包含378位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在全血测定法中变体较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗，并且变体在Fc区至少包含378位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO30的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO55或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO55的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO55的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO30或55的表现形式。
在某些实施方案中，多肽在全血测定法中变体较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是A378D。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在一些实施方案中，本发明提供组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含440位置处的一处氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含440位置处的一处氨基酸修饰，和ii)具有一种或多种疾病症状的受试者；以及b)在使得至少一种症状缓解的条件下向受试者施用该组合物。在特定实施方案中，变体包含抗体或免疫粘附素，并且受试者具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状。
在某些实施方案中，变体包含至少一部分Fc区(例如含有氨基酸修饰的Fc区的40％、50％、60％、80％或90％或更高)。在一些实施方案中，多肽变体包含CH2或CH3区。在又一些实施方案中，组合物包含含有SEQID NO31的氨基酸序列。在某些实施方案中，组合物包含核酸序列，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO56或其互补物或者在高严格条件下结合SEQ ID NO56的序列。在又一些实施方案中，本发明提供宿主细胞(例如CHO细胞)以及包含SEQ ID NO56的载体。在特定实施方案中，本发明提供计算机可读介质，其中计算机可读介质载有SEQ ID NO31或56的表现形式。
在某些实施方案中，多肽变体于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。在一些实施方案中，多肽变体包含抗体或抗体片段(例如多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或Fc片段)。在一些实施方案中，母体多肽包含人IgG Fc区。在另外的实施方案中，母体多肽包含人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在其他实施方案中，母体多肽包含选自SEQ ID NO1-12的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，氨基酸修饰是S440Y。在某些实施方案中，多肽变体在Fc区内包含第2个、第3个、第4个等的氨基酸修饰(见例如表1)。在一些实施方案中，变体是CHO所表达的多肽。
在又一些实施方案中，组合物包含核酸序列，其编码具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中在效应细胞存在时，变体较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)，并且变体在Fc区至少包含247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其组合位置处的一处氨基酸修饰。在一些实施方案中，组合物包含这样的核酸序列，其编码于效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)的变体Fc多肽，其中变体Fc多肽包含氨基酸247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其组合位置处的氨基酸修饰。
在又一些实施方案中，组合物包含编码具有至少一部分Fc区的母体多肽变体的核酸序列，其中在全血测定法中变体较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗，并且变体在Fc区至少包含247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其组合的位置处的一处氨基酸修饰。在一些实施方案中，组合物包含这样的核酸序列，其编码在全血测定法中较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗的变体Fc多肽，其中变体Fc多肽包含氨基酸247、251、256、268、280、330、332、339、378或440或其组合位置处的氨基酸修饰。
在某些实施方案中，本发明的变体以及编码变体的核酸序列与至少一种其他成分一起提供于试剂盒中。例如试剂盒可包含至少一种类型变体以及使用变体的书面说明书。试剂盒还可包含缓冲液以及其他有用试剂。
在一些实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)表达靶抗原(例如CD20)的细胞，ii)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体，其中该变体在Fc区内至少包含一处氨基酸修饰，iii)效应细胞(例如来自人类供体的已富集PBMC)，以及b)在使得变体与靶细胞结合(例如通过表达在该细胞表面的配体)的条件下，将靶细胞与组合物和效应细胞接触，以及c)测量靶细胞的杀伤(例如释放LDH或铬51)。
在其他实施方案中，本发明提供方法，其包括a)提供i)含有表达靶抗原的细胞(例如表达CD20的B细胞)的全血样品和ii)包含具有至少一部分Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在Fc区内至少包含一处氨基酸修饰，以及b)在使得变体与靶细胞结合(例如通过表达在细胞表面的CD20配体)的条件下，将靶细胞与组合物接触，以及c)测量靶细胞的消失(例如用Facs分析其他B细胞标志物，如CD19)。
在一些实施方案中，本发明提供鉴定双物种改良变体的方法，其包括a)提供i)靶细胞，ii)组合物，其包含具有Fc区的母体多肽的候选变体，其中候选变体在Fc区内至少包含一处氨基酸修饰，并且其中在第一个物种的效应细胞存在时，候选变体较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性，和iii)第二个物种的效应细胞，以及b)在使得候选变体结合靶细胞由此产生结合候选变体的靶细胞的条件下，将组合物与靶细胞温育，c)将第二个物种的效应细胞与已结合候选变体的靶细胞混合，d)测量靶细胞细胞毒性(例如由该候选变体所介导的细胞毒性)，e)确定候选变体是否在第二个物种的效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性。在一些实施方案中，该方法还包括用第二个物种的效应细胞以相同方式筛选母体多肽。在又一些实施方案中，同时实施步骤b)和c)。在特定实施方案中，方法还包括步骤f)鉴定作为双物种改良变体的候选变体，其中在第二个物种的效应细胞存在时，双物种改良变体较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性。在其他实施方案中，此方法还包括步骤f)鉴定作为双物种改良变体的候选变体，其中在第二个物种的效应细胞存在时，双物种改良变体较母体多肽以大约1.2倍(或大约1.5倍、5倍或大约10倍)的更有效地介导靶细胞细胞毒性(例如观察到超过大约1.2倍的靶细胞裂解)。
在其他实施方案中，本发明提供鉴定双物种改良变体的方法，其包括a)提供i)靶细胞，ii)组合物，其包含具有Fc区的母体多肽的候选变体，其中候选变体在Fc区内至少包含一处氨基酸修饰，iii)第一个物种的效应细胞和iv)第二个物种的效应细胞，以及b)在使得候选变体结合靶细胞由此产生结合候选变体的靶细胞的条件下，将组合物与靶细胞温育，c)将第一个物种的效应细胞与已结合候选变体的靶细胞混合，d)测量靶细胞细胞毒性(例如由候选变体所介导的细胞毒性)，e)确定候选变体是否在第一个物种的效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性，f)将第二个物种的效应细胞与已结合候选变体的靶细胞(例如在步骤b中产生的靶细胞)混合，g)测量靶细胞细胞毒性(例如由候选变体所介导的细胞毒性)，h)确定候选变体是否在第二个物种的效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性。
在特定实施方案中，方法还包括确定在第一个物种和/或第二个物种效应细胞存在时母体多肽介导靶细胞细胞毒性能力的步骤。例如，方法还可包括将第一个或第二个物种的效应细胞与已结合母体多肽的靶细胞混合，然后测量靶细胞细胞毒性(例如测定数值以便将变体的数值与其比较)。
在某些实施方案中，方法还包括步骤g)向测试动物施用双物种改良变体，其中测试动物是第二个物种的一个成员。在其他实施方案中，方法还在步骤a)之前包括一个步骤，即在Fc受体(FcR)结合测定法中筛选候选变体的步骤。在某些实施方案中，FcR结合测定法是Fc新生儿受体(FcRn)结合测定法。
在一些实施方案中，方法还在步骤a)之前包括一个步骤，即在CDC测定法中筛选候选变体的步骤(见例如以下第IV部分)。在一些实施方案中，第一个物种的效应细胞是人外周血单核细胞(PBMC)。在其他实施方案中，第一个物种的效应细胞是小鼠PBMC或大鼠PBMC。在某些实施方案中，第二个物种的效应细胞是小鼠PBMC或大鼠PBMC。在特定实施方案中，第二个物种的效应细胞是人PBMC。
在一些实施方案中，本发明提供鉴定双物种改良变体的方法，其包括a)提供i)组合物，其包含具有Fc区的母体多肽的候选变体，其中候选变体在Fc区内包含至少一处氨基酸修饰，并且其中候选变体较母体多肽更有效地介导CDC，和iii)第二个物种来源的补体，以及b)将组合物与第二个物种来源的补体温育，c)确定候选变体是否较母体多肽更有效地介导CDC。在特定实施方案中，该方法还包括步骤d)鉴定作为双物种改良变体的候选变体。
在一些实施方案中，靶细胞是人细胞(例如，过表达如下一种或多种肿瘤相关抗原CD20、CD22、CD33、CD40、CD63、EGF受体、her-2受体、前列腺特异性膜抗原、Lewis Y糖类、GD2和GD3神经节苷脂、lamp-1、CO-029、L6和ephA2)。在某些实施方案中，变体包括靶细胞特异性的抗体或其部分。在其他实施方案中，在第一个物种的效应细胞存在时，候选变体较母体多肽以大约1.2倍地更有效介导靶细胞细胞毒性。在一些实施方案中，步骤e)包括周母体多肽开展对照反应。在另外的实施方案中，测量包括靶细胞死亡或靶细胞裂解的定量。在其他实施方案中，靶细胞被感染病毒(例如HIV、CMV、乙型肝炎病毒或RSV)或微生物(例如葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)等)。在某些实施方案中，靶细胞是微生物(例如葡萄球菌、链球菌、假单胞菌等)。在一些实施方案中，靶细胞由病毒替代(例如HIV、CMV、乙型肝炎病毒或RSV)。
在一些实施方案中，本发明提供包含CD20结合分子或编码CD20结合分子的核酸序列的组合物，其中CD20结合分子包含轻链可变区，并且其中轻链可变区包含在SEQ ID NO57中所示氨基酸序列。在其他实施方案中，本发明提供包含CD20结合分子或编码CD20结合分子的核酸序列的组合物，其中CD20结合分子包含重链可变区，并且其中重链可变区包含在SEQ ID NO58中所示氨基酸序列。在某些实施方案中，本发明提供包含CD20结合分子或编码CD20结合分子的核酸序列的组合物(见例如图16)，其中CD20结合分子包含轻链可变区和重链可变区，其中轻链可变区包含在SEQ ID NO57中所示的氨基酸序列(见图15)并且其中重链可变区包含在SEQ ID NO58中所示的氨基酸序列(见图15)。
在一些实施方案中，本发明提供包含多肽的组合物，其中多肽包含i)未修饰的人骨架区(例如未改变天然存在的人骨架区)，以及ii)变体Fc区。在某些实施方案中，未修饰的人骨架区是人类种系的骨架区。在其他实施方案中，本发明提供包含多肽的组合物，其中多肽包含i)至少一种已随机化的CDR序列和ii)变体Fc区。在又一些实施方案中，本发明提供包含多肽的组合物，其中多肽包含i)未修饰的人骨架区(例如人类种系的骨架区)，ii)至少一种已随机化的CDR序列和iii)变体Fc区。


图1显示了带有标注的多种区域和部分的IgG分子图示。
图2显示多种母体Fc氨基酸序列的比对，包括人IgG1(显示非a同种异型(SEQ ID NO1)和a同种异型)、人IgG2(SEQ ID NO2)、人IgG3(SEQ ID NO3)、人IgG4(SEQ ID NO4)、鼠IgG1(SEQ ID NO5)、鼠IgG2A(SEQ ID NO6)、鼠IgG2B(SEQ ID NO7)和鼠IgG3(SEQID NO8)。
图3显示多种氨基酸序列，包括人IgG1的CH2区(SEQ ID NO9)和CH3区(SEQ ID NO10)，以及包括CH1区、铰链区、CH2区和CH3区的人IgG1的f同种异型(SEQ ID NO11)和a、z同种异型(SEQ IDNO12)序列。
图4显示在局部周围序列环境中的变体中已改变的氨基酸序列。
图5显示编码母体多肽的核苷酸序列。
图6显示在局部周围核酸序列环境中的变体中已改变的核酸序列。
图7A显示野生型Fc区与在330和332位置上的A330K、A330R、I332E及组合突变的ADCC测定结果比较。
图7B显示Fc区氨基酸变体I332D和I332E与Fc区聚糖修饰变体33(GnTIII)的ADCC测定结果比较以及氨基酸修饰外加聚糖修饰33(I332E+GnTIII)对ADCC活性的影响。
图8显示使用纯化的变体IgG所获得的代表性ADCC数据。
图9显示了对CD20抗原为低亲和性的可变区变体(6F1)和对CD20抗原为相对高亲和性的可变区变体(33和5)针对Wil-2(A)或SKW6.4(B)靶细胞系的ADCC活性。
图10显示FcγRI结合Fc区变体IgG的滴定曲线。
图11A、B和C显示从使用人补体和Ramos靶细胞滴定Fc区变体所获得的代表性CDC数据。
图12显示使用含W(高亲和性)基因型FcγRIIIa受体的全血样品通过AME-133(带有I332E Fc变体序列的可变区33)、Rituxan和非特异性IgG造成的代表性B细胞损耗。
图13显示使用含FF(低亲和性)基因型FcγRIIIa受体的全血样品通过AME-133(带有I332E Fc变体序列的可变区33)、Rituxan和非特异性IgG造成的代表性B细胞损耗。
图14显示使用全血样品通过Rituxan、非特异性IgG和变体A378D和T256P、I332E造成的代表性B细胞损耗。
图15显示AME-133(具有I332E的Fc变体序列的可变区33)的轻链氨基酸序列(SEQ ID NO57)和重链氨基酸序列(SEQ ID NO58)。
图16显示AME-133(具有I332E的Fc变体序列的可变区33)的轻链核苷酸序列(SEQ ID NO59)和重链核苷酸序列(SEQ ID NO60)。
定义为便于理解本发明，众多术语如下定义。
如此处所使用，术语“受试者”和“患者”指任何动物，如狗、猫类的哺乳动物、鸟、家畜，并且优选地是人(例如患有疾病的人)。
如此处所使用，术语“编码……的核酸分子”、“编码……的DNA序列”和“编码……的DNA”指脱氧核糖核苷酸沿脱氧核糖核酸链的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定沿多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。因此DNA序列编码氨基酸序列。
将DNA分子称作具有“5’末端”和“3’末端”，这是因为可将单核苷酸以如此方式反应以产生寡核苷酸或多核苷酸，即一个单核苷酸戊糖环中的5’磷酸通过磷酸二酯键以一个方向与其临近单核苷酸戊糖环中的3’氧连接。因而，如果寡核苷酸或多核苷酸的一个末端的5’磷酸未与单核苷酸戊糖环的3’氧连接则将该末端称为“5’末端”，并且如果一个末端的3’氧未与下一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸连接则将该末端称为“3’末端”。如此处所使用，即便一个核酸序列位于一个更大的寡核苷酸或多核苷酸内部，仍可称其具有5’和3’末端。在线性或环状DNA分子中，将间断的元件称为“下游”或3’端元件的“上游”或5’端。该术语学反映了这样一种事实，即转录沿着DNA链以5’至3’方式前进。指导所连接基因转录的启动子和增强子元件通常位于编码区的5’端或上游。然而，增强子元件即便位于启动子元件和编码区3’端仍能发挥其作用。转录终止和多腺苷酸化信号位于编码区3’端或下游。
如此处所使用，术语“密码子”或“三联体”指三个毗邻核苷酸单体的联合体，该联合体在多肽生物合成中指定二十种天然存在的氨基酸之一。该术语还包括不指定任何氨基酸的无义密码子。
如此处所使用，术语“具有编码多肽的核苷酸序列的寡核苷酸”、“具有编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸”和“编码多肽的核酸序列”意为包含特定多肽编码区的核酸序列。该编码区可以cDNA、基因组DNA或RNA的形式存在。当以DNA形式存在时，寡核苷酸或多核苷酸可为单链(即有义链)或双链。可根据需要在紧临基因编码区处放置适宜控制元件如增强子/启动子、剪接信号、多腺苷酸化信号等，以便促使正确的转录起始和/或初级RNA转录物的正确加工。备选地，本发明表达载体中所用的编码区可含有内源性增强子/启动子、剪接信号、间插序列、多腺苷酸化信号等等或者内源性和外源性控制元件的组合。
如此处所使用，术语“互补的”或“互补性”用来指按碱基配对规则关联的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，对于序列“A-G-T”，其与序列“T-C-A”互补。“互补”可以是“部分”互补，即仅仅核酸的某些碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可“完全”互补或“全部”互补。核酸链之间的互补程度显著影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应以及依赖核酸之间结合的方法中尤其重要。
如此处所使用，术语特定序列的“互补物”用来指与一个序列在全部长度上完全互补的序列。例如序列A-G-T-A是序列T-C-A-T的“互补物”。
术语“同源性”(当指核酸序列时)指互补程度。可为部分同源性或完全同源性(即同一性)。部分互补的序列是至少部分抑制完全互补的序列与靶核酸杂交的序列并且用功能性术语“基本同源的”描述。当用来指核酸结合时，术语“对结合的抑制”指通过同源序列对靶序列结合的竞争所导致的对结合的抑制。可使用低严格条件下的杂交测定法(Southern或Northern印迹、溶液杂交等等)检测对完全互补序列与靶序列杂交的抑制。基本同源的序列或探针将在低严格条件下竞争和抑制完全同源序列与靶标的结合(即杂交)。这并不是说低严格条件是允许非特异性结合的条件；低严格条件要求两种序列的相互结合应当是特异性(即选择性)相互作用。可通过使用甚至缺乏部分互补性(例如小于大约30％的同一性)的第二个靶标测试非特异性结合的缺乏；在没有非特异性结合时，探针将不与第二个非互补靶标杂交。
本领域众所周知，众多等效条件包含低严格条件；要考虑因素例如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶标的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或已固定等)和盐及其他成分的浓度(例如存在或不存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇)并且可改变杂交溶液以产生不同于、但等效于上述所列的低严格杂交条件。此外，本领域知晓促进高严格条件下杂交的条件(例如提高杂交和/或洗涤步骤温度、在杂交溶液中使用甲酰胺等)。
核酸序列(例如编码变体Fc区或其部分)可通过初级RNA转录物的不同剪接产生多种RNA。同一基因的剪接变体将包含序列同一性或完全同源性的区域(代表在两种cDNA中存在相同的外显子或相同的外显子部分)和完全非同一性的区域(例如，代表在cDNA1中存在外显子“A”而cDNA2含有外显子“B”)。因为两种cDNA含有序列同一性的区域，它们都与来自含有两种cDNA中均存在序列的完整基因或其部分的探针杂交；因此这两种剪接变体与此探针基本同源和彼此基本同源。
当用来指单链核酸序列时，术语“基本同源”指可在低严格条件与单链核酸序列杂交的任何探针(即其是该单链核酸序列的互补物)。
如此处所使用，术语“杂交”用来指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即核酸之间结合的强度)受诸如核酸间互补性、所涉及条件的严格性、所形成杂交体的Tm、核酸的G∶C比的因素影响。
如此处所使用，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是当双链核酸分子群体中的一半解离为单链时的温度。计算核酸Tm的方程为本领域众所周知。如标准参考文献所指出，当核酸处于1M NaCl水溶液中时，可通过方程Tm＝81.5+0.41(％G+C)计算来简单估计Tm值(见例如Anderson和Young，Quantitative Filter Hyberization，in Neucleic AcidHyberization )。其他参考文献包括更复杂的计算，其将结构和序列特征加以考虑计算Tm，并且在某些情况下，可通过以所计算的Tm开始测试温度小量提高或降低并检查其对核酸分子群体的影响来根据经验确定Tm。
如此处所使用，术语“严格”用来指开展核酸杂交的温度、离子强度和其他化合物如有机溶剂存在的条件。本领域技术人员将意识到，可通过单独或一致性地变换上面刚刚描述的参数来改变“严格”条件。在“高严格”条件下，核酸碱基配对将只在具有高频率互补碱基序列的核酸片段之间发生(例如“高严格”条件下的杂交可在具有大约85-100％同一性、优选大约70-100％同一性的同系物之间发生)。在中等严格条件下，核酸碱基配对将在具有中等程度互补碱基序列的核酸之间发生(例如“中等严格”条件下的杂交可在具有大约50-70％同一性的同系物间发生。因此，从遗传多样的生物来源的核酸由于互补序列频率通常较低常需要“弱”或“低”严格条件。
当用来指核酸杂交时，“高严格条件”包含等效于以下的条件当使用长约500个核苷酸的探针时，于42℃在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调至pH 7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后于42℃在含有0.1×SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤。
当用来指核酸杂交时，“中严格条件”包含等效于以下的条件当使用长约500个核苷酸的探针时，于42℃在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调至pH 7.4)、0.5％SDS、5×Denhardt试剂和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后于42℃在含有1.0×SSPE、1.0％SDS的溶液中洗涤。
“低严格条件”包含等效于以下的条件当使用长约500个核苷酸的探针时，于42℃在由5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4H2O和1.85g/l EDTA，用NaOH调至pH 7.4)、0.1％SDS、5×Denhardt试剂[每500ml的50×Denhardt含有5g Ficoll(Type 400，Pharmacia)、5g BSA(第V组分；Sigma)]和100μg/ml变性鲑精DNA组成的溶液中结合或杂交，随后于42℃在包含5.0×SSPE、0.1％SDS的溶液中洗涤。
用如下术语描述两种或多种多核苷酸之间的序列关系“参考序列”、“序列同一性”和“序列同一性百分数”。“参考序列”是用作序列比较基础的已定义的序列；参考序列可以是较大序列的子序列(例如作为在序列列表中所给出的全长cDNA序列的片段)或包含完整的基因序列。通常，参考序列长度为至少20个核苷酸，常常至少25个核苷酸，并且经常至少50个核苷酸(例SEQ ID NO32-37的任一序列可用作参考序列)。因为两种多核苷酸的每一种可(1)包含在这两种多核苷酸间相似的序列(即完整多核苷酸序列的部分)，和(2)还包含在两种多核苷酸间不相同的序列，所以两种(或多种)多核苷酸间的序列比较一般通过比较“比较窗口”中的两种多核苷酸的序列进行以鉴定和比较序列相似的局部区域。如此处所使用，“比较窗口”指至少20个连续核苷酸位置的概念上的片段，其中多核苷酸序列与至少20个连续核苷酸的参考序列比较，并且其中为了优化两种序列的比对在比较窗口内的多核苷酸序列部分与参考序列(其不含插入和缺失)相比可包含20％或更低的插入或缺失(即缺口)。用于比较窗口比对的优化的序列比对可通过Smith和Waterman的局部同源性算法[Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2482(1981)]、通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法[Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48443(1970)]、通过Pearson和Lipman的相似性搜索方法[Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)852444(1988)]、通过这些算法的计算机化执行(在Wisconsin Genetics软件包7.0版中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，Wis.)或通过检查进行，并且选择了通过多种方法产生的最佳比对(即在比较窗口中产生最高同源性百分数)。术语“序列同一性”意思是指比较窗口中的两种多核苷酸序列是相同的(即在一个个核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分数”通过如下步骤计算比较在比较窗口内经优化比对的两种序列，确定两种序列中出现的相同核酸碱基(例如A、T、C、G、U或I)的位置数目以得到配对位置数，将配对位置数除以比较窗口(即窗口大小)中的位置总数并且将该结果乘以100以产生序列同一性百分数。如本申请中所用，比较窗口是所引用参考序列的全长(即如果将SEQ ID NO33引用作为参考序列，序列同一性百分数在SEQ IDNO33的全长范围内比较)。
如此处所使用，术语“探针”指能与另一目的寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即核苷酸序列)，而无论其是天然存在的(作为纯化的限制性消化物)还是合成产生的、重组产生的或通过PCR扩增产生的。探针可为单链或双链。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离。可以预计，本发明中所用的任何探针可用任何“报道分子”标记，以便在任何检测系统中可检测到，其中检测系统包括但不限于酶系统(例如ELISA、以及基于酶的组织化学测定法)、荧光系统、放射性系统和发光系统。本发明将不限于任何特定的探测系统或标记。
如此处所使用，术语“聚合酶链式反应”(“PCR”)指美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188(在此处引用作为参考)中描述的方法，其描述了用于无需克隆或纯化而提高基因组DNA混合物中靶序列片段浓度的方法。这种扩增靶序列的方法为向含有目的靶序列的DNA混合物中加入两种大大过量的寡核苷酸引物，随后在DNA聚合酶存在下按精确顺序进行热循环。两种引物与双链靶序列中各个链互补。为实施扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶延伸引物以至形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸步骤可重复多次(即变性、退火和延伸构成一个“循环”，可进行许多“循环”)以便获得高浓度的目的靶序列的扩增片段。目的靶序列扩增片段的长度由引物彼此间的相对位置决定，因此其长度是一个可控参数。由于本方法具有可重复的特点，所以将此方法称作“聚合酶链式反应”(以下称作“PCR”)。因为靶序列的目的扩增片段成为了混合物中的主要序列(就浓度而言)，故他们被称为是“PCR扩增的”。
利用PCR，可将基因组DNA中单拷贝的特定靶序列扩增至可通过几种不同方法学(例如使用标记探针的杂交；在生物素化引物掺入后用抗生物素蛋白-酶缀合物检测；所扩增的片段中32P-标记脱氧核苷酸三磷酸如dCTP或dATP的掺入)可检测的水平。使用适宜的引物分子对除了可以扩增基因组DNA以外，还可扩增任何寡核苷酸或多核苷酸序列。具体而言，通过PCR方法自身所产生的扩增片段本身就是后续PCR扩增的高效模板。
术语“分离的”当涉及核酸使用时，如在“分离的寡核苷酸”或“分离的多核苷酸”中使用时，是指已鉴定的并且从至少一种在天然来源中通常结合的污染物核酸分离的核酸序列。所分离的核酸以一种不同于天然存在时的方式或环境存在。因此所分离的核酸分子与在天然细胞中存在的核酸分子可以区分。然而，所分离的核酸分子包括通常表达多肽的细胞中所含有的核酸分子，例如核酸分子位于与其在天然细胞的染色体位置不同的染色体位置内。所分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸可以单链或双联形式存在。当所分离的核酸、寡核苷酸或多核苷酸用于表达蛋白质时，该寡核苷酸或多核苷酸将最低限度地包含有义链或编码链(即寡核苷酸或多核苷酸可为单链)，但是可包含有义链和反义链(即寡核苷酸或多核苷酸可为双链)。
如此处所使用，术语“部分”当用来指核苷酸序列(如在“特定核苷酸序列的部分”)时指的是该序列的片段。片段大小范围为从10个核苷酸至比全部核苷酸序列少一个核苷酸的核苷酸(例如10个核苷酸、20个、30个、40个、50个、100个、200个等)。
如此处所使用，术语“部分”当用来指氨基酸序列(如在“特定氨基酸序列的部分”)时指的是该序列的片段。片段大小范围为从6个氨基酸至比全部氨基酸序列少一个氨基酸的氨基酸(例如6个氨基酸、10个、20个、30个、40个、75个、200个等)。
如此处所使用，术语“纯化的”或“纯化”指将污染物从样品中去除。例如，通过去除污染性非免疫球蛋白的蛋白质可纯化抗原特异性抗体；还可通过去除不结合同一抗原的免疫球蛋白来纯化这些抗体。去除非免疫球蛋白和/或去除不结合特定抗原的免疫球蛋白导致样品中抗原特异性免疫球蛋白百分数增加。在另一个例子中，重组的抗原特异性多肽在细菌宿主细胞内表达，并且通过去除宿主细胞蛋白来纯化多肽；由此样品中重组抗原特异性多肽百分数增加。
如此处所使用，术语“重组DNA分子”指由通过分子生物学技术连接在一起的DNA片段组成的DNA分子。
如此处所使用，术语“重组蛋白”和“重组多肽”指由重组DNA分子所表达的蛋白质分子。
如此处所使用，术语“天然蛋白”指不含由载体序列所编码的氨基酸残基的蛋白质；即该天然蛋白仅含有通常在天然蛋白质内存在的那些氨基酸残基。天然蛋白可通过重组方式产生或从天然存在来源中分离。
术语“Southern印迹”指对琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中的DNA进行分析，在凝胶中根据大小分离DNA，随后将该DNA从凝胶转移至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜。然后用标记的探针探测已固定的DNA以便检测与所用探针互补的DNA种类。DNA可在电泳前用限制性酶切割。电泳后，DNA可在转移至固体支持物之前或转移期间部分地脱嘌呤以及变性。Southern印迹是分子生物学家的标准工具(J.Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，NY，第9.31-9.58页 )。
如此处所使用，术语“Northern印迹”指对RNA的分析，通过在琼脂糖凝胶中将RNA电泳以便根据大小分离RNA，随后将RNA从凝胶转移至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后用标记的探针探测已固定的RNA以便检测与所用探针互补的RNA种类。Northern印迹是分子生物学家的标准工具(J.Sambrook，等，同上，第7.39-7.52页 )。
术语“Western印迹”指对固定于支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上的蛋白质(或多肽)进行分析。将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离蛋白质，随后将蛋白质从凝胶中转移至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜。随后已固定的蛋白质与具有目的抗原反应性的抗体接触。可通过多种方法包括使用放射性标记抗体检测抗体的结合。
如此处所使用，术语“抗原决定簇”指抗原中与特定抗体接触的部分(即表位)。当蛋白质或蛋白质片段用于免疫宿主动物时，该蛋白质的多个区域可诱导产生特异性地结合该蛋白质特定区域或三维结构的抗体，将这些区域或结构称做抗原决定簇。抗原决定簇可与完整抗原(即用于引起免疫应答的“免疫原”)竞争对抗体的结合。
如此处所使用，术语“转基因”指通过向新近受精的卵或早期胚胎导入基因而置于生物中的外来基因、异源基因或自体基因。术语“外来基因”指通过实验操作导入动物基因组的任何核酸(例如基因序列)，并且可包括该动物内存在的基因序列，只要所导入基因不处于天然存在基因的同一位置即可。术语“自体基因”旨在包括天然存在基因的变体(例如多态性或突变体)。因此，术语转基因包括用基因的变体形式对天然存在基因形式的替换。
如此处所使用，术语“载体”用来指将DNA片段从一种细胞转移至另一种细胞的核酸分子。术语“运载体”有时与“载体”互换使用。
如此处所使用，术语“表达载体”指重组DNA分子，其含有目的编码序列和对于有效连接的编码序列在特定宿主生物中表达所必需的适宜核酸序列。在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括经常和其他序列在一起的启动子、操纵基因(任选)和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子以及终止和多腺苷酸化信号。
如此处所使用，术语“宿主细胞”指任何真核或原核细胞(例如细菌细胞如大肠杆菌(E.coli.)、CHO细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖类细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，无论其位于体外(in vitro)或体内(in vivo)。例如，宿主细胞可位于转基因动物内。
如此处所使用，术语“转染”和“转化”指外来DNA向细胞(例如真核以及原核细胞)中的导入。转染可通过本领域已知的众多方法实现，包括磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖介导转染法、Polybrene介导转染法、电穿孔法、微注射法、脂质体融合法、脂质转染法、原生质体融合法、逆转录病毒法和生物射弹法。
术语“稳定转染”或“稳定地转染”指外来DNA向所转染细胞基因组内内的导入和整合。术语“稳定转染体”指具有已稳定整合至基因组DNA内的外来DNA的细胞。
术语“瞬时转染”或“瞬时地转染”指将外来DNA向细胞内的导入，其中外来DNA未整合至所转染细胞的基因组内。外来DNA在已转染细胞的细胞核内持续存留数日。在此期间，外来DNA受到决定染色体中内源性基因表达的调节控制。术语“瞬时转染体”指已接受外来DNA但是可能并未整合该DNA的细胞。
术语“磷酸钙共沉淀法”指用于将核酸导入细胞的技术。当核酸作为磷酸钙-核酸共沉淀物存在时，增强了细胞对该核酸的摄取。Graham和vander Eb的原创技术(Graham and van der Eb，Virol.，52456 )已经由几个研究组修改以优化用于特定类型细胞的条件。本领域熟知这类为数众多的修改。
如此处所使用，“包含特定多核苷酸序列的组合物”广泛地指任何含有特定多核苷酸序列的组合物。该组合物可包含水溶液。包含编码例如变体Fc区或其片段的多核苷酸序列的组合物可用作杂交探针。在此情况下，编码变体Fc区的多核苷酸序列一般在含有盐(例如NaCl)、去污剂(例如SDS)和其他成分(例如Denhardt溶液、干奶粉、鲑精DNA等)的水溶液中应用。
术语“测试化合物”或“候选化合物”指可用于治疗或预防疾病、不适、病症或身体功能紊乱或者改变样品生理学或细胞状态的任何化学实体、药物、药等。测试化合物包括已知的和潜在的治疗化合物。可通过使用本发明筛选方法进行筛选来确定测试化合物的治疗性。“已知的治疗化合物”指已证实在治疗或预防中有效的(例如通过动物试验或施与人的先前经验)治疗化合物。
如此处所使用，关于测定法的术语“反应”指可检测信号的产生(例如报道蛋白质的积累、离子浓度的增加、可检测化学产物的积累)。
如此处所使用，术语“报道基因”指编码可分析蛋白质的基因。报道基因的实例包括(但不限于)萤光素酶(见例如deWet等，Mol.cell.Biol.7725 和美国专利号6,074,859，此处引用作为参考)，绿色荧光蛋白(例如GenBank登录号U43284；众多GFP变体可商业性地从CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA获得)、氯霉素乙酰基转移酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。
如此处所使用，术语“计算机存储器”和“计算机存储设备”指可由计算机处理器读取的任何存储介质。计算机存储器的实例包括(但不限于)RAM、ROM、计算机芯片、数字视频光盘(DVD)、压缩光盘(CD)、硬盘驱动器(HDD)和磁带。
如此处所使用，术语“计算机可读介质”指用于存储和向计算机处理器提供信息(例如数据和指令)的任何设备或系统。计算机可读介质的实例包括(但不限于)DVD、CD、硬盘驱动器、磁带和网络上的流媒体服务器。
如此处所使用，短语“计算机可读介质载有核酸或氨基酸序列的表现形式”指这样的计算机可读介质，其在已经存储信息后，当向处理器传递时，允许该核酸序列或氨基酸序列向用户显示(例如打印输出或显示于显示屏)。
如此处所使用，术语“处理器”和“中央处理单元”或“CPU”可互换使用，并且指能够从计算机存储器(例如ROM或其他计算机存储器)中读取程序并根据该程序执行一系列步骤的装置。
如此处所使用，氨基酸残基在免疫球蛋白重链中的编号使用EU索引形式，如在Kaba等，Sequence of Proeins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda、MD(1991)，此处特别引用作为参考。“如Kabat中的EU索引形式”指人IgG1 EU抗体的残基编号。
如此处所使用，“母体多肽”是包含这样一种氨基酸序列的多肽，其中氨基酸序列可以变化或改变(例如进行氨基酸替代、添加或缺失)以产生变体。在优选的实施方案中，母体多肽包含天然存在的Fc区或含有氨基酸序列修饰(例如添加、缺失和/或替代)的Fc区的至少一部分。在一些实施方案中，特别考虑了比母体多肽更短或更长的变体。在特别优选的实施方案中，母体多肽在功能(例如效应子功能、结合等)上与变体不同。
如此处所使用，术语“母体多肽变体”指包含通过至少一种氨基酸修饰而与母体多肽不同的氨基酸序列的肽。在某些实施方案中，变体包含至少一部分(例如至少40％、50％、75％或90％)Fc区。在优选的实施方案中，变体包含具有至少一处氨基酸修饰的母体多肽的Fc区。
如此处所使用，术语“Fc区”指免疫球蛋白重链的C末端区域(例如，如图1所示)。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。虽然通常所认可的免疫球蛋白重链Fc区的边界可变动，但是通常将人IgG重链Fc区定义为从Cys226或从Pro230位置的氨基酸残基至其羧基末端的延伸。在一些实施方案中，变体仅包含部分Fc区并且可包括或不包括羧基末端。例如在图1中所示，免疫球蛋白Fc区通常包含两个恒定结构域，CH2和CH3。在一些实施方案中，考虑了具有一个或多个恒定结构域的变体。在其他实施方案中，考虑了无此类恒定结构域(或仅具有一部分的这类恒定结构域)的变体。
如此处所使用，“CH2结构域”(也称作“Cγ2”结构域)通常包含Fc区(例如在人IgG Fc区)中从大约231位氨基酸至大约340位氨基酸的残基延伸。CH2结构域的独特性在于它不与另一个结构域紧密配对。此外，两个N-连接的分支糖链插入到完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。
如此处所使用，“CH3结构域”(也称作“Cγ3”结构域)通常包含Fc区中CH2结构域的C末端残基延伸(例如人IgG Fc区中从大约第341位氨基酸残基至大约447位氨基酸残基)。
如此处所使用，Fc区可具有负责(例如在受试者中)激活或减弱生物学活性的“效应子功能”。效应子功能的实例包括(但不限于)C1q结合；补体依赖性细胞毒作用(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。此类效应子功能需要Fc区与结合结构域(例如抗体可变结构域)结合并且可用多种测定法估(例如Fc结合测定法、ADCC测定法、CDC测定法、靶细胞从全血或分部分离的血液样品中损耗等)。
如此处所使用，术语“天然序列Fc区”或“野生型Fc区”指与通常在自然中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。示例性天然序列的人Fc区示于图2，并且包括天然序列的人IgG1 Fc区(f和a、z同种异型)；天然序列的人IgG2 Fc区；天然序列的人IgG3 Fc区和天然序列的人IgG4 Fc区及其天然存在的变体。天然序列的鼠Fc区也示于图2。其他序列是可以预计的并且可容易地从多个网址(例如NCBI的网址)中获得。
如此处所使用，术语“变体Fc区”指由于至少一处氨基酸修饰(例如替代、插入或缺失)而与天然序列Fc区(或其部分)的氨基酸序列不同的氨基酸序列，包括重链亚单位序列彼此不同的异二聚体变体。在优选的实施方案中，与天然序列Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸替代(例如在天然序列Fc区中的大约1个至大约10个氨基酸替代，并且优选地从大约1个至大约5个氨基酸替代)。在优选的实施方案中，变体Fc区与天然序列Fc区具有至少大约80％的同源性，优选至少大约90％的同源性并且更加优选至少大约95％的同源性。
如此处所使用，关于氨基酸序列的术语“同源性”指在比对序列并根据需要导入旨在获得同源性百分数最大值的缺口之后，在氨基酸序列变体中与天然氨基酸序列相同的残基百分数。
术语“包含Fc区的多肽”指多肽，如包含Fc区的抗体或免疫粘附素(见以下定义)。
术语“Fc受体”和FcR”用于描述结合Fc区(例如抗体或抗体片段的Fc区)的受体。该术语包括负责将母体IgG转移至胎儿的新生儿受体FcRn。
如此处所使用，短语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”和“ADCC”是指表达FcR的细胞毒性细胞(例如非特异性的细胞毒性细胞)(例如天然杀伤细胞(NK)、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合于靶细胞的抗体并且随后引起该靶细胞裂解的细胞介导性反应。介导ADCC的主要细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。
如此处所使用，短语“效应细胞”指表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。优选地，细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的白细胞实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤细胞(NK)、单核细胞、细胞毒T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可从天然来源(例如血液)分离。
如此处所使用，短语“全血”指未分部分离的血液样品。
如此处所使用，具有“改变的”FcR结合亲和性或ADCC活性的多肽变体是这样一种变体，即与母体多肽或含有天然序列Fc区的多肽相经其具有增强的(即提高的)或减弱的(即降低的)FcR结合活性和/或ADCC活性。对FcR“表现出增加结合”的多肽变体以比母体多肽更佳的亲和性结合至少一种FcR。对FcR“表现出降低结合”的多肽变体以比母体多肽更差的亲和性结合至少一种FcR。对FcR表现出降低结合的此类变体对FcR结合较少或其结合不可测量，例如对FcR的结合与母体多肽相比为0-20％。以比母体多肽“更佳亲和性”结合FcR的多肽变体是这样的多肽变体，即当在结合测定法中多肽变体与母体多肽的量基本相同并且所有其他条件均相同时，该多肽变体以比母体抗体更高的结合亲和性结合任何一种或多种如上所鉴定的FcR。例如，具有改善FcR结合亲和性的多肽变体与母体多肽相比在FcR结合亲和性上表现出大约1.10倍至大约100倍(更一般地从大约1.2倍至大约50倍)的改善(即提高)，其中FcR结合亲和性在例如ELISA测定法中进行测定。
如此处所使用，“氨基酸修饰”指特定氨基酸序列中的氨基酸序列变化。示例性修饰包括(但不限于)氨基酸替代、插入和/或缺失。在优选的实施方案中，氨基酸修饰是替代(例如在母体多肽的Fc区)。
如此处所使用，在特定位置处(例如在Fc区内)的“氨基酸修饰”指所指定残基的替代或缺失或在邻近所指定残基处的至少一个氨基酸残基的插入。在“邻近”指定残基处插入意味着在该残基的一至两个残基范围内插入。插入可位于指定残基的N末端或C末端。
如此处所使用，“氨基酸替代”指以另一个不同的“替代”氨基酸残基替代特定氨基酸序列中的至少一个现存氨基酸残基。替代残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码的氨基酸残基)并且选自丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。以一种或多种非天然存在的氨基酸残基进行替代也处于此处氨基酸替代的定义范围内。“非天然存在的氨基酸残基”指除了以上所列那些天然存在的氨基酸残基以外的残基，其可在多肽链中与邻近氨基酸残基共价结合。非天然存在的氨基酸残基的实例包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，例如Ellman等Meth.Enzym.202301-336(1991)(此处引用作为参考)中所描述的那些。
如此处所使用，术语“氨基酸插入”指至少一个氨基酸向特定氨基酸序列中的掺入。在优选的实施方案中，插入通常是一个或两个氨基酸残基的插入。在其他实施方案中，插入包括较大肽的插入(例如大约3个至大约5个或甚至多达大约10个氨基酸残基的插入。
如此处所使用，术语“氨基酸缺失”指至少一个氨基酸残基从特定氨基酸序列中去除。
术语“测定信号”指来自检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法中的输出结果，包括但是不限于比色测定法的吸收率测量、荧光强度、每分钟衰变次数。测定法形式可包括ELISA、facs或其他方法。“测定信号”的改变可反映细胞活力的改变或动力学解离率、动力学结合率或两者的改变。“较高的测定信号”指所测量的输出数大于另一个数(例如在ELISA测定法中变体较母体多肽具有较高(较大)的测定数)。“较低的测定信号”指所测量的输出数小于另一个数(例如在ELISA测定法中变体较母体多肽具有较低(较小)的测定数)。
术语“结合亲和性”指与每一Fc受体-Fc结合相互作用相关的平衡解离常数(以浓度单位表示)。结合亲和性与动力学解离率(通常以反比时间单位表示，例如秒-1)除以动力学结合率(通常以每单位时间的浓度单位表示，例如摩尔/秒)的比值直接相关。通常不可能确定无疑地将平衡解离常数的改变归因于结合率、解离率或两者的差异，除非实验测定了这些参数中的每一个(例如通过BIACORE或SAPIDYNE测量法)。
如此处所使用，术语“铰链区”指人IgG1中从Glu216至Pro230的氨基酸延伸。可以通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同的位置，将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列比对。
如此处所使用，术语Fc区的“低铰链区”指紧邻铰链区C末端的氨基酸残基延伸(例如IgG1 Fc区中第233至第239位的残基)。
“C1q”是包含对免疫球蛋白Fc区的结合位点的多肽。C1q与两种丝氨酸蛋白酶C1r和C1s一起形成复合物C1，即补体依赖性细胞毒作用(CDC)途径中的第一个成分。
如此处所使用，术语“抗体”作最广义使用并且尤其包括单抗克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所期望生物学活性即可。
如此处所使用，术语“抗体片段”指完整抗体的部分。抗体片段的实例包括(但不限于)线性抗体；单链抗体分子；由抗体片段形成的Fc或Fc’肽，Fab和Fab片段以及多特异性抗体。抗体片段优选地保留至少一部分IgG重链铰链区并且任选地保留IgG重链的CH1区。在其他优选的实施方案中，抗体片段包含至少一部分CH2区或整个CH2区。
如此出所用，当用来指单克隆抗体时，术语“功能性片段”旨在指仍保留功能性活性的单克隆抗体部分。功能性活性可以是例如抗原结合活性或特异性。单克隆抗体的功能性片段包括例如单独的重链或轻链以及其片段，如VL、VH和Fd；单价片段如Fv、Fab和Fab’；双价片段如F(ab’)2；单链Fv(scFv)和Fc片段。此类术语描述于例如Harlowe和Lane，AntibodyA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork(1989)；Molec.Biology and BiotechnologyA Comprehensive DeskReference(Myers，R.A.(编)，New YorkVCH Publisher，Inc.)；Huston等，Cell Biophysics，22189-224(1993)；Pluckthun和Skerra，Meth.Enzymol.，178497-515(1989)以及Day，E.D.，Advanced Immunochemistry.第二版、Wiley-Liss，Inc.，New York，NY(1990)，所有文献此处引用作为参考。术语“功能性片段”旨在包括例如通过对单克隆抗体进行蛋白酶消化或还原和通过本领域技术人员已知的重组DNA方法所产生的片段。
如此处所使用，非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有来自非人免疫球蛋白的最少序列或不含此类序列的抗体。大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者高变区内的残基由具有所预期特异性、亲和性和能力的来自非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基由相应的非人类残基代替。而且，人源化抗体可包含在受者抗体或供者抗体中不存在的残基。通常进行这些修饰以进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体基本包含至少一个、一般两个可变区，在此可变区中，全部或基本上全部的高变区环对应于非人免疫球蛋白的全部或基本上全部的高变区环，并且全部或基本上全部的FR残基对应于人免疫球蛋白序列的全部或基本上全部的FR残基。人源化抗体还可以包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白恒定区。用于产生人源化抗体的方法实例描述于Winter等的美国专利5,225,539中(此处引用作为参考)。
如此处所使用，术语“高变区”指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR的氨基酸残基(即轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，Sequenceof proteins of Immunological Interest，第五版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或那些来自“高变区环”的残基(即轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。“骨架”或“FR”残基是除了如此处所定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。
如此处所使用，术语“免疫粘附素”指与具有免疫球蛋白恒定结构域的异源“粘附”蛋白质(例如受体、配体或酶)的结合结构域结合的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包含具有期望结合特异性的粘附素氨基酸序列(其不同于抗体的抗原识别和结合位点(抗原结合位点))(即为异源性)与免疫球蛋白恒定结构域序列的融合。
如此处所使用，术语“配体结合结构域”指任何天然受体或至少保留相应天然受体的定性配体结合能力的其任何区域或衍生物。在某些实施方案中，受体来自与免疫球蛋白超家族成员同源的具有细胞外结构域的细胞表面多肽。非免疫球蛋白超家族成员但本定义明确涵盖的其他受体是细胞因子受体，并且尤其是具有酪氨酸激酶活性的受体(受体酪氨酸激酶)、促红细胞生成素和神经生长因子受体超家族成员以及细胞粘附分子(例如E-选凝素、L-选凝素和P-选凝素)。
如此处所使用，术语“受体结合结构域”指受体的任何天然配体，包括细胞粘附分子或至少保留相应天然配体的定性受体结合能力的此天然配体的任何区域或衍生物。
如此处所使用，术语“抗体-免疫粘附素嵌合体”包括这样的分子，其将至少一个抗体结合结构域与至少一种免疫粘附素结合。此类分子的实例包括(但不限于)在Berg等，PNAS(USA)884723-4727(1991)和Charnow等，J.Immunol.，1534268(1994)中描述的双特异性CD4-IgG嵌合体，该两篇文献此处引用作为参考。
如此处所使用，“分离的”多肽是已鉴定并从其天然环境成分中分离和/或回收的多肽。多肽的天然环境污染性成分是将会干扰该多肽的诊断性或治疗性用途的物质，其包括酶、激素和其他蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将分离的多肽纯化至(1)如通过Lowry方法所测定，大于95％(以多肽重量计)，并且优选地大于99％(以重量计)，(2)足以通过使用旋杯测序仪(spinning cup sequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度或(3)通过还原或非还原条件的SDS-PAGE使用考马斯蓝或银染显示出均质性。因为多肽天然环境中的至少一种组分将不存在，故分离的多肽包括在重组细胞内原位存在的多肽。然而，通常通过至少一个纯化步骤来制备分离的多肽。
如此处所使用，术语“治疗”指治疗性治疗以及预防性或防止性措施。需要治疗者包括已经患有病症的那些患者以及有待防止病症的那些患者。
如此处所使用，术语“病症( )”指从使用多肽变体治疗中获益的状况，包括慢性和急性病症或疾病(例如使患者易患特定病症的病理性状况)。在某些实施方案中，病症是癌。
如此处所使用，术语“癌”和“癌的”指或描述哺乳动物中一般表征为无节制的细胞生长的生理状况。癌的实例包括(但不限于)癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌的更特别实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝脏癌症和多种类型的头颈癌。
如此处所使用，短语“表达HER2的癌”是包含这样一种细胞的癌，其中细胞在其表面具有HER2受体蛋白(例如Genebank登录号X03363)，以至于抗HER2抗体能够与这种癌结合。
如此处所使用，术语“标记”指直接或间接与多肽缀合的可检测化合物或组合物。标记本身是可探测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记情况下，标记可以催化可检测的底物化合物或组合物发生化学改变。
如此处所使用，术语“控制元件”、“控制序列”和“调节元件”指控制核酸序列表达的一些方面的遗传元件。例如，启动子是促进已有效连接的编码区转录起始的调节元件。其他调节元件包括剪接信号、多腺苷酸化信号、终止信号等。适于原核生物的控制元件包括例如启动子，任选地包括操纵基因序列以及核糖体结合位点。已知真核细胞可利用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。
如此处所使用，当核酸与另一核酸序列处于功能性联系时，该核酸被“有效连接”。例如，若前序列或分泌前导序列DNA作为参与多肽分泌的前蛋白表达，则其与多肽DNA是有效连接的；若启动子或增强子影响序列的转录，则其与编码序列是有效连接的；或者如果核糖体结合位点位于促进翻译的位置，则其与编码序列是有效连接的。在优选的实施方案中，“有效地连接”意指所连接的DNA序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下其是连续的且符合读码框的。然而，例如增强子不必为连续的。连接可通过例如常规限制性位点处的连接实现。如果此类位点不存在，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头或连结体。
如此处所使用，措辞“细胞”、“细胞系”和“细胞培养”可互换使用并且所有此类名称包括其后代。因此词汇“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和其衍生培养物，而无论传代次数多少。还应当理解，由于有意的或无意的突变所有子代在DNA含量上并非完全相同。可包括如在最初转化的细胞中所筛选的具有相同功能或生物学活性的突变的后代。旨在明确指定时，将从上下文中予以明确。
如此处所使用，“分析物”指待分析的物质。优选的分析物是待分析其结合Fc受体能力的包含Fc区的多肽。
如此处所使用，术语“受体”指能够结合至少一种配体的多肽。优选的受体是具有细胞外配体结合结构域且任选地具有其他结构域(例如跨膜结构域、细胞内结构域和/或膜锚定区)的细胞表面受体或可溶性受体。在此处所述测定法中进行评价的受体可以是完整受体或者其片段或衍生物(例如包含与一种或多种异源多肽融合的受体结合结构域的融合蛋白)。而且，待进行结合特性评价的受体可存在于细胞中或者被分离且任选地被包被于测定平板或其他固相上或者被直接标记并用作探针。
如此处所使用，短语“CHO表达的多肽”指已经在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内重组表达的多肽。
如此处所使用，术语“抗体应答性疾病”指已证实用抗体疗法可治疗的、至少可部分治疗的任何疾病或医学状况。此类疾病和医学状况的实例包括(但不限于)淋巴瘤(证实可用RITUXAN治疗)、传染病(证实可用SYNAGIS治疗)、肾移植(已证实ZENAPAX有益)、克隆病和类风湿性关节炎(证实可用REMICADE治疗)、乳腺癌(证实可用HERCEPTIN治疗)和结肠癌(证实可用EDRECOLOMAB治疗)。如此处所使用，术语“免疫粘附素应答性疾病”指已证实用免疫粘附素疗法可治疗的、至少可部分治疗的任何疾病或医学状况。
如此处所使用，较母体抗体“在人效应细胞存在时更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)”的多肽变体是这样一种多肽变体，即在测定法中所用的多肽变体与母体抗体的量基本相同时，其在体外或体内基本上更有效地介导ADCC。例如，该变体在特定ADCC测定法中引起的靶细胞裂解较母体多肽在同一ADCC测定法中引起的靶细胞裂解的数量更大。可用一种ADCC测定法鉴定此类变体，但也可应用其他测定ADCC活性的测定法或方法(例如动物模型)。在优选的实施方案中，该多肽变体较母体多肽以大约1.2倍、1.5倍、50倍、100倍、大约500倍或大约1000倍地更有效介导ADCC。
如此处所使用，较母体抗体“更有效地介导全血中的抗体依赖性B细胞损耗”的多肽变体是这样一种多肽变体，即在测定法中所用的多肽变体与母体抗体的量基本相同时，其在体外或体内基本上更有效地介导B细胞损耗。例如，在特定的测定法中此变体引起的B细胞损耗程度高于在同一测定法中母体多肽所引起的B细胞损耗程度。同样，此变体可损耗B细胞至与母体多肽在同一测定法中引起的B细胞损耗相同的程度，但其浓度要低于母体多肽所需浓度。例如可用一种ADCC测定法鉴定该变体，但是也可应用另一些测定ADCC活性的测定法或方法(例如动物模型)。在优选的实施方案中，相对于母体多肽的损耗增强不依赖于FcRIIIa位置158处的基因型(V或F)和FcRIIa位置131处的基因型(H或R)，并且多肽变体较母体多肽以大约1.2倍、1.5倍、50倍、100倍、大约500倍或大约1000倍地更有效介导B细胞损耗。
术语“抗体或免疫粘附素应答性疾病症状”指通常与特定疾病相关的那些症状。例如，通常与克隆病相关的症状包括腹痛、腹泻、直肠出血、体重减轻、发热、厌食、脱水、贫血、膨胀、纤维变性、肠道发炎和营养不良。
短语“在使得症状缓解的条件下”指任何抗体或免疫粘附素应答性疾病的可检测症状的任何程度的定性或定量减少，包括但不限于对疾病恢复速率的可检测影响(例如体重增加率)或至少一种通常与特定疾病相关症状的减轻(例如若抗体或免疫粘附素应答性疾病是克隆病，至少如下症状之一减轻腹痛、腹泻、直肠出血、体重减轻、发热、厌食、脱水、贫血、膨胀、纤维变性、肠道发炎和营养不良)。
发明详述本发明提供多肽Fc区变体和编码Fc区变体的寡核苷酸。具体而言，本发明提供包含新Fc区变体的组合物、用于鉴定有用Fc区变体的方法以及用于应用Fc区变体治疗疾病的方法。在以下部分中描述本发明I.)抗体Fc区；II.)变体Fc区；III.)组合变体；IV.)变体多肽测定法；V.)示例性的含变体Fc区的分子；VI.)编码Fc区变体的核酸序列；VII.)治疗性用途和制剂；VIII.)额外的变体Fc区的用途。
I.抗体Fc区如上所述，抗体具有参与非抗原结合功能的区域，主要是CH2和CH3区。通常将这些区共同称作Fc区，并且这些区具有数种由效应分子结合所介导的效应子功能。
抗体Fc区介导的效应子功能可分为两类(1)在抗体结合抗原后产生的效应子功能(这些功能涉及例如补体级联或携带Fc受体(FcR)细胞的参与)；和(2)不依赖于抗原结合而产生的效应子功能(这些功能赋予例如循环中的持久性和通过转胞吞作用跨细胞屏障的转运能力)。例如，补体CI成分与抗体的结合活化了补体系统。在调理作用后，补体的活化对细胞病原体的裂解是重要的。补体的活化还刺激炎症反应并且还参与自身免疫超敏。此外，抗体通过Fc区结合细胞，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合细胞上的Fc受体(FcR)。存在对不同类的抗体特异的多种Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。尽管本发明不受任何特定机制限制，抗体与细胞表面Fc受体的结合启动了众多重要而不同的生物学反应，包括内吞和破坏由抗体包被的颗粒、清除免疫复合物、通过杀伤细胞裂解由抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用或ADCC)、释放炎性介质、胎盘转移和控制免疫球蛋白产生。
数种抗体效应子功能通过与抗体Fc区结合的Fc受体(FcR)介导。通过其对免疫球蛋白同种型的特异性定义了FcR；将IgG抗体的Fc受体称作FcγR，IgE抗体的Fc受体称作FcεR，IgA抗体的Fc受体称作FcαR等。已鉴定出三亚类FcγRFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。
因为每一FcγR亚类均由两个或三个基因编码，并且可变RNA剪接导致产生多种转录物，因此FcγR同种型存在广泛的多样性。编码FcγRI亚类(FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC)的三个基因聚集在1号染色体长臂的1q21.1区内；编码FcγRII同工型(FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC)的基因和编码FcγRIII(FcγRIIIA和FcγRIIIB)的两个基因均聚集在1q22区内。这些不同的FcR亚型在不同细胞类型中表达(见例如Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-492(1991))。例如对于人，仅在嗜中性粒细胞上发现FcγRIIIB，而在巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤细胞(NK)和T-细胞的一个亚群中发现了FcγRIIIA。值得注意的是，FcγRIIIA存在于NK细胞上，该细胞是一种在ADCC中发挥作用的细胞类型。
人FcγRIIIA(CD16)受体在其细胞外结构域中的第158位置处具有一个常见多态性，在此位置编码苯丙氨酸或缬氨酸。FcγRIIIA的V等位基因对人IgG1的亲和性高于F等位基因。V158等位基因还更有效地介导ADCC。临床数据表明，在经历Rituxan治疗的患者中FcγRIIIA受体基因型与治疗反应之间存在关联。证实在FcγRIIIA-158V基因型纯合的患者中(大约占群体的20％)临床和分子的应答和进展时间较好。相反，在低亲和性FcγRIIIA-158F基因型杂合或纯合的患者中(大约占群体的80％)应答较差。这些数据表明增强158F携带者ADCC活性的Fc突变可增强基于抗体的癌症治疗法的临床功效。在人FcγRIIA(CD32)受体的细胞外结构域第131位置内也存在一个遗传多态性，在此位置编码组氨酸(H)或精氨酸(R)。已经发现第131位置内的多态性影响人FcγRIIA(CD32)受体结合人IgG的能力。最新数据还表明，在FcγRIIA位置131的多态性与对Rituxan的临床应答之间的存在关联。H131等位基因纯合的患者较其他两组具有显著高的应答率。
FcγRI、FcγRII和FcγRIII是免疫球蛋白超家族(IgSF)受体；FcγRI在其细胞外结构域有三个IgSF结构域，而FcγRII和FcγRIII在其细胞外结构域仅有两个IgSF结构域。
Fc受体的另一种类型是新生儿Fc受体(FcRn)。FcRn在结构上类似于主要组织相容性复合体(MHC)，并且由与β2微球蛋白非共价结合的一条α链组成。
II.变体Fc区本发明提供多肽变体、编码此多肽变体的核酸序列和用于产生多肽变体的方法。优选地，本发明的多肽因至少一处氨基酸修饰而与母体多肽不同。“母体”多肽、“野生型”多肽、“起始”多肽或“非变体”多肽优选地包含至少一部分抗体Fc区，并且可使用本领域可获得的用于产生包含Fc区或其部分的多肽的技术来制备。在优选的实施方案中，母体多肽是抗体。然而母体多肽可为包含至少一部分Fc区的任何其他多肽(例如免疫粘附素)。在某些实施方案中，可产生变体Fc区(例如根据此处公开的方法)并且变体Fc区可与所选择的异源多肽如抗体的可变结构域或者受体或配体的结合结构域融合。
在优选的实施方案中，母体多肽包含Fc区或其功能性部分。通常，母体多肽的Fc区将包含天然序列Fc区，并且优选地包含人的天然序列Fc区。然而，母体多肽的Fc区可具有一个或多个来自天然序列Fc区内的先前存在的氨基酸序列改变或修饰。例如，Fc区的C1q结合活性可能先前已经改变或者Fc区的FcγR结合亲和性可能已经改变。在另外的实施方案中，母体多肽Fc区为概念性的(例如智力思考或在计算机或纸张上的可视形式)，然而即便其并非物质存在，但抗体工程师可确定所预期的变体Fc区的氨基酸序列并产生包含该序列的多肽或编码所预期变体Fc区氨基酸序列的DNA。然而，在优选的实施方案中，编码母体多肽Fc区的核酸可以获得并且将该核酸序列进行改变以产生编码Fc区变体的变体核酸序列。
可通过本领域所知方法使用本说明书对于特定序列的指导来制备编码母体多肽变体的核酸。这些方法包括(但不限于)通过对早期制备的编码多肽的核酸进行位点定向(或寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和盒式诱变而制备。位点定向诱变是用于制备变体的优选方法。该技术为本领域众所周知(见例如Carter等，Nucleic Acids Res.134431-4443(1985)和Kunkel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488(1987)，两篇文献在此处引用作为参考)。简而言之，在实施DNA位点定向诱变时，首先通过编码预期突变的一种或多种寡核苷酸与该起始DNA的单链同时杂交而改变该起始DNA。杂交后，利用已杂交的寡核苷酸为引物并以起始DNA的单链为模板，使用DNA聚合酶合成完整的第二链，并且使用DNA连接酶连接第二链以形成环状双链DNA。因此将编码所预期突变的寡核苷酸掺入所得到的双链DNA中。
PCR诱变也适用于产生起始多肽的氨基酸序列变体(见例如Vallette等，Nuc.Acids Res.17723-733(1989)，此处引用作为参考)。简而言之，当小量模板DNA用作PCR中的起始材料时，可用与来自模板DNA对应区域内的序列略微不同的引物产生相对大量的特定DNA片段，该DNA片段仅在引物不同于模板的位置处与模板序列不同。
另一种用于制备变体的方法，即盒式变体基于Wells等，Gene 34315-323(1985)(此处引用作为参考)描述的技术。起始材料是包含待突变的起始多肽DNA的质粒(或另其他载体)。鉴定了待突变的起始DNA中的密码子。在已鉴定的突变位点的两侧必须存在一个唯一的限制性内切酶位点。如果没有这类限制性位点，可使用上述寡核苷酸介导诱变方法在起始多肽DNA内的适宜位置处导入这些限制性位点。在这些位点处切割质粒DNA以使之线性化。使用标准方法合成编码限制性位点之间的DNA序列且含有预期突变的双链寡核苷酸，其中分别合成寡核苷酸的两条链，随后使用标准技术使之杂交。将此种双链寡核苷酸称作盒。将该盒设计为具有与已线性化的质粒末端相容的5’和3’末端，以便将此盒与质粒直接连接。质粒现已包含已突变的DNA序列。
备选地或额外地，可对编码多肽变体的预期氨基酸序列测序，并且可合成性产生编码此氨基酸序列变体的核酸序列。
可以修饰母体多肽的氨基酸序列以产生具有改变的体外和/或体内Fc受体结合亲和性或活性和/或改变的体外和/或体内抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)活性的变体Fc区。还可修饰母体多肽的氨基酸序列以产生具有改变的补体结合特性和/或循环半衰期的变体Fc区。
对Fc区生物学特性的显著修饰可通过选择替代实现，其中选择替代对改变(a)替代范围内的多肽主链结构，例如片层或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积，(d)与糖类相互作用，或(e)结构域运动灵活性的影响显著不同。基于共同的侧链特性将天然存在的残基分为如下几类(1)疏水性正亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸；(2)中性亲水半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；(3)酸性天冬氨酸、谷氨酸；(4)碱性天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸；(5)影响链方向的残基甘氨酸，脯氨酸；和(6)芳香族色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸。
非保守性替代必须是这些类中的一个类别的成员与另一类别的成员的交换。保守性替代必须是这些类中的一个类别中的一个成员与同一类别的另一成员的交换。
如以下实施例中所示，Fc区变体可设计为具有改变的活性(效应子功能和药物动力学)。例如可修饰Fc区的一个或多个氨基酸残基以便改变(例如提高或降低)ADCC活性。在优选的实施方案中，修饰包括这里所鉴定的一个或多个Fc区残基(见例如实施例2和WO0042072，此处引用作为参考用于所有目的)。通常，对此处已鉴定的影响ADCC活性的一个或多个Fc区残基进行氨基酸替代，以便产生此种Fc区变体。在优选的实施方案中，将不超过1个至大约10个Fc区残基进行缺失或替代。此处包含一个或多个氨基酸修饰(例如替代)的Fc区将优选地保留至少80％、并且优选至少大约90％以及最优选至少大约95％的母体Fc区序列或天然序列的人Fc区。
还可产生氨基酸插入的Fc区变体，这种变体具有改变的效应子功能。例如，可在此处已鉴定的影响FcR结合的一个或多个Fc区位置附近导入至少一个氨基酸(例如导入1-2个氨基酸残基并且通常不超过10个残基)。在“附近”意指在此处所鉴定的Fc区残基的1-2个氨基酸残基范围内。此Fc区变体可表现出相对母体分子增强或减弱的FcR结合和/或ADCC活性。为了产生此类插入变体，可评估包含FcR结合区域(例如目的FcR的细胞外结构域)和待插入氨基酸残基的Fc区的多肽的共结晶结构(见例如Sondermann等，Nature 406267(2000)；Deisenhofer、Biochemistry 20(9)2361-2370(1981)和Burmeister等，Nature 342379-383，(1994)；所有文献此处引用作为参考)，以便合理地设计具有例如改善FcR结合能力的Fc区变体。在优选的实施方案中，可在Fc区环内而不是在Fc区的二级结构(β-链)内进行此类插入。
通过在母体Fc区中导入适宜的氨基酸序列修饰，可产生成变体Fc区，该变体Fc区较母体多肽(a)在人效应细胞存在下更高效或更低效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)和/或(b)在人补体存在下更高效或更低效地介导补体依赖性细胞毒作用(CDC)和/或(c)在不同pH以所期望的亲和性结合Fcγ受体(FcγR)或Fc新生儿受体(FcRn)。此类Fc区变体通常在其Fc区内包含至少一处氨基酸修饰。
在优选的实施方案中，母体多肽Fc区是人Fc区，例如人IgG1(f和a、z同种异型)、IgG2、IgG3、IgG4天然人Fc区和从任何物种中所发现和所知的全部同种异型。此类区域具有如图2(SEQ ID NO1-8)、图3(SEQ ID NO9-12)和图5(SEQ ID NO32-37)中所示的序列。
在某些实施方案中，为了产生具有改善ADCC活性的Fc区，母体多肽优选具备先前存在的ADCC活性(例如包含人IgG1或人IgG3 Fc区的母体多肽)。在一些实施方案中，具有改善ADCC的变体较具有天然序列IgG1或IgG3 Fc区的抗体基本上更有效地介导ADCC(例如P247L和I332E变体)。
在优选的实施方案中，将氨基酸修饰导入Fc区的CH2和/或CH3结构域。对于为产生具有改变ADCC活性的变体IgG Fc区而进行的突变，有用的氨基酸位置包括如下任何一个或多个氨基酸位置Fc区中的247、251、256、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300 301、303、305、307、309、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、360、373、376、416、419、430、434、435、437、438、439或440。在优选的实施方案中，用作模板以产生此类变体的母体Fc区包括人IgG Fc区。
在某些实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含247位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是P247L。在另外的实施方案中，氨基酸修饰是P247I或P247H。
在一些实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含251位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是L251F。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含256位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是T256M或T256P。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含268位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是H268D或H268E。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含280位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是D280A或D280K。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含330位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是A330K或A330R。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含332位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是I332D、I332E、I332K或I332R。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含339位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是A339T。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含378位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是A378D。
在特定实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体在效应细胞存在时介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)并且在Fc区内至少包含440位置处的一处氨基酸修饰。在某些实施方案中，氨基酸修饰是S440Y。
可对上述多肽变体进一步修饰，这取决于对该多肽所期望或所计划的用途。此类修饰可包括例如氨基酸序列的进一步改变(氨基酸残基的替代、插入和/或缺失)、糖修饰、与异源多肽融合和/或共价修饰。此类另外的修饰可在如上所公开的氨基酸修饰之前、同时或随后进行，导致Fc受体结合和/或ADCC活性的改变。
备选地或额外地，将氨基酸修饰与改变Fc区的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒作用功能的一种或多种另外的氨基酸修饰结合是有用的。此处特别感兴趣的起始多肽是一种结合C1q并表现出补体依赖性细胞毒作用(CDC)的多肽。此处所述的氨基酸替代可改变该起始多肽结合C1q的能力和/或修饰其补体依赖性细胞毒作用功能(例如降低并且优选地消除这些效应子功能)。然而这里构想了在所述的一个或多个位置处包含替代的具有改善C1q结合和/或补体依赖性细胞毒作用(CDC)功能的多肽。例如，起始多肽不能够结合C1q和/或介导CDC并且可根据此处的教导得以修饰以至于获得这些另外的效应子功能。此外，可对具有先前存在的C1q结合活性、任选地还具有介导CDC的能力的多肽进行修饰，以至于这类活性中的一种或两种活性得到增强。在例如WO0042072(此处引用作为参考)中描述了改变C1q和/或修饰其补体依赖性细胞毒作用功能的氨基酸修饰。
如上所公开，可通过例如修饰CDC活性和/或ADCC活性对具有改变的效应子功能的Fc区或其部分进行设计。例如，可生成具有改善CDC活性和改善ADCC活性的变体Fc区(例如既具有改善的ADCC活性又具有改善的CDC活性)。备选地，在需要降低或消除效应子功能时，可设计具有降低CDC活性和/或降低ADCC活性的变体Fc区。在其他实施方案中，可仅仅提高这些活性中的一种活性，并且任选地还可降低其他活性，以产生例如具有改善的ADCC活性但降低的CDC活性的Fc区变体或具有改善的CDC活性但降低的ADCC活性的Fc区变体。此外，还可设计对FcRn、A蛋白和/或另一些Fc结合蛋白质具有修饰的结合亲和性的变体Fc区。
氨基酸替代的另一类型起改变多肽糖基化方式的作用。这可通过例如缺失多肽内存在的一个或多个糖类部分和/或添加一个或多个多肽中不存在的糖基化位点而实现。备选地，这可以通过改变糖基化位点以外的氨基酸或通过将细胞工程化而间接实现。多肽的糖基化一般是N-连接或O-连接。N-连接指糖类部分与天冬酰胺残基侧链连接。天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸的肽序列是糖部分与天冬酰胺侧链进行酶性连接的识别序列，其中X为除脯氨酸以外的任意氨基酸。因此，在多肽中出现这两种肽序列之一则产生潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟氨基酸的连接，尽管也可以利用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸，但在多数情况下该羟氨基酸是丝氨酸或苏氨酸。
可通过改变氨基酸序列以至于该多肽含有一个或多个上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)方便地实现向多肽中添加糖基化位点。这种改变还可以通过向原始多肽序列中添加或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)实现。示例性糖基化变体含有重链Asn297残基的氨基酸替代。
在一些实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体包含至少一处表面残基氨基酸修饰(见例如Deisenhofer，Biochemistry，28；20(9)2361-70，1981年4月以及WO0042072，此处引用作为参考)。在其他实施方案中，本发明提供包含具有Fc区的母体多肽变体的组合物，其中变体包含至少一处非表面残基氨基酸修饰。在另外一些实施方案中，本发明包含具有Fc区的母体多肽变体，其中变体包含至少一处表面残基氨基酸修饰和至少一处非表面残基氨基酸修饰。
III.组合变体在一些实施方案中，本发明的变体包含两处或多处氨基酸修饰(例如替代)。可通过选择两处或多处上面所详述的氨基酸修饰产生此类组合变体。下表1提供了两处或多处氨基酸替代的示例性组合。例如，表1的第一行显示了P247H与位置251、256、268、280、330、332、339、378和440上的其他氨基酸替代的可能组合(例如这一行显示了2处、3处、4处、5处、6处、7处、8处、9处和10处氨基酸修饰的组合)。
表1.示例性组合变体


**注意本表使用了如在Kabat中的EU编号。
示于表1中的组合变体和其他组合变体(如在WO0042072中公开的那些组合变体)可在多种测定法(见以下IV部分)中测试特定的活性(例如FcR结合活性、ADCC活性和CDC活性)。就此而言，可鉴定出有用的组合变体。
在某些优选的实施方案中，本发明的组合变体具有一处提高ADCC活性的氨基酸修饰和一处提高新生儿Fc受体(FcRn)结合亲和性(例如在pH 6.0，而不是在pH 7.0或7.4)的氨基酸修饰。在其他实施方案中，本发明的组合变体具有一处表面氨基酸修饰和一处非表面氨基酸修饰。可通过将两处或多处此处所述氨基酸修饰进行组合或者将至少一处此处所述氨基酸修饰与WO004207中所述的那些氨基酸修饰进行组合产生另一些组合变体。
IV.变体多肽测定法本发明提供用于筛选Fc区变体的多种测定法。筛选测定法可用于发现或证实有用的变体。例如可筛选组合变体(见表1)以发现具有改变的FcR结合和/或改变的ADCC和/或改变的CDC活性(例如提高的或降低的ADCC或CDC活性)和/或修饰的从全血损耗靶细胞(例如B细胞)能力的变体。如下所述，本发明的测定法还可用于发现或证实在受试者(例如具有抗体或免疫粘附素应答性疾病症状的人)中表现有益治疗性活性的变体。可使用多种类型的测定法，以便评价与母体多肽相比变体的任何变化(见WO0042072中所提供的筛选测定法，此处引用作为参考)。另一些示例性测定法如下描述。
在优选的实施方案中，本发明的变体是与非变体(母体)多肽相比基本保留结合抗原的能力(通过未修饰的抗原结合区域或经修饰的抗原结合区域)(例如结合能力优选地不低于非变体多肽结合能力大约20倍或不低于大约5倍)的抗体。此多肽变体结合抗原的能力可使用技术例如ELISA、荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)测定。
Fc受体(FcR)结合测定法可用于评估本发明的变体。例如，可使用特异性结合多肽变体的抗体，以ELISA方式滴定多肽变体和测量所结合多肽变体(见以下实施例)来测量对Fc受体例如FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII、FcRn等的结合。例如，可在标准ELISA测定法中筛选包含抗体的变体以便确定在pH 6.0和pH 7.0或7.4时与FcRn的结合。可用已包被链霉亲和素或中性链亲和素(Neutravidin)的固体表面捕获生物素标记的任何物种(如小鼠或人)FcRn。封闭后，将已捕获的受体与在pH 6.0或pH 7.0的缓冲液中稀释的变体多肽(抗体)温育。在后续步骤中加入对人抗体特异的分子(如缀合一种酶的山羊(Fab’)2抗人Fab)。随后加入底物，以测定与在pH 6.0或pH 7.0或7.4时固定化FcRn结合的变体多肽的量。将该测定结果与母体(非变体)多肽与同一FcR结合的能力进行比较。在其他优选的实施方案中，将用于实施筛选变体的ELISA(例如用FcRn)的成分包装于试剂盒中(例如与使用说明书一起)。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)测定法还可用于筛选本发明的变体。ADCC测定法可在体外或体内进行。为评估多肽变体的ADCC活性，可开展效应物靶比例可变的体外ADCC测定法。示例性ADCC测定法可使用表达如下任一靶抗原的靶细胞系CD20、CD22、CD33、CD40、CD63、EGF受体、her-2受体、前列腺特异性膜抗原、Lewis Y糖类、GD2和GD3神经节苷脂、lamp-1、CO-029、L6和ephA2。效应细胞可从健康供者中获得(例如在试验当日)并且可使用Histopaque(Sigma)纯化PBMC。在与效应细胞按照例如40∶1、20∶1和10∶1的效应物∶靶比例混合之前，靶细胞与例如0.1-1,000ng/ml的IgG变体预先温育大约30分钟。随后使用细胞毒性检测试剂盒(Roche Molecular Biochemicals)比色测量ADCC活性，其中试剂盒基于测量从所破坏细胞的胞质中释放到上清液中的乳酸脱氨酶(LDH)活性来定量细胞的死亡和裂解。对于已经加入铬51的靶细胞测定法，还可通过测量所释放得到的铬51来测量ADCC活性。抗体非依赖性细胞的细胞毒作用可通过测量无抗体时来自靶细胞和效应细胞的LDH活性确定。在1％Triton X-100加至靶细胞和效应细胞的混合物中后测量总释放量。在优化的时间段(0.54-18小时)内于37℃在5.0％CO2中进行靶细胞和效应细胞的温育，然后离心测定培养板。将上清液转移至96孔培养板并且与LDH检测试剂于25℃温育30分钟。然后使用微量培养板读数器在490nm测量样品吸收。随后使用如下方程式计算细胞毒性百分数细胞毒性％＝试验值-低对照/高对照-低对照×100％。抗CD20和变体的细胞毒性百分数可与等量RITUXAN直接比较以测量相对有效性。示例性ADCC测定法可使用过表达CD20抗原的SKW6.4细胞(例如购自美国典型培养物保藏中心)作为靶细胞源。此测定法的多种变化为本领域所知(见例如Zuckerman等，CRC Crit Rev Microbiol 1978；7(1)1-26，此处引用作为参考)。
用于这类测定法的效应细胞包括(但不限于)天然杀伤细胞(NK)、巨噬细胞和其他外周血单核细胞(PBMC)。备选地或额外地，本发明多肽变体的ADCC活性可在如Clynes等(PNAS(USA)95652-656(1998)，此处引用作为参考)所公开的动物模型中进行体内确定。还可筛选本发明变体的补体活化作用。为评估补体活化作用，可实施补体依赖性细胞毒作用(CDC)测定法(见例如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods，202163(1996)，此处引用作为参考)。例如，可用缓冲液将多肽变体和人补体稀释为多个浓度。将表达多肽变体所结合抗原的细胞稀释至～1×106细胞/ml的密度。多肽变体、已稀释的人补体和表达所述抗原的细胞的混合物可加至96孔平底组织培养平板并且于37℃在5％CO2中温育2小时以促进补体介导的细胞裂解。然后可向每孔加入50μl alama蓝(AccumedInternational)并且于37℃温育过夜。使用96孔荧光计在530nm激发光和590nm发射光下测量吸收度。将结果表示为相对荧光单位(RFU)。样品浓度可从标准曲线计算并且与非变体多肽相比的活性百分数表示为目的多肽变体的活性百分数。
在某些实施方案中，本发明的变体不活化补体。例如，与具有未突变IgGl Fc区的对照抗体相比，多肽变体在该测定法中表现出大约0-10％的CDC活性。优选地，在以上CDC测定法中，该变体不具有任何CDC活性(例如高于背景)。在其他实施方案中，与母体多肽相比，本发明的变体具有增强的CDC活性(例如当比较IC50值时，表现出体内或体外CDC活性改善大约2倍至大约100倍(或更高))。
还可在全血测定法中筛选本发明变体对靶细胞的损耗。例如，使用facs(Vugmeyster等，2003 Cytometry 52A，101-109)对多种浓度的具有CD20靶特异性的多肽变体在全血测定法中对B细胞的损耗进行筛选。新鲜抽取的血液与不同浓度的多肽变体于37℃在5％CO2中温育4小时(时间可变动)。温育后，根据制造商说明书用氯化铵试剂(Beckton-Dickinson，目录号#555899)裂解红细胞并且使用B细胞特异性荧光标记抗体(例如抗CD19)通过facs检测B细胞。结果表示为相对于未处理样品或用无关(非损耗作用的)抗体温育后样品的B细胞损耗的百分数。
在优选的实施方案中，变体较母体多肽更有效地损耗B细胞。变体以大约2倍或更大程度、并且优选大约5倍或更大程度地损耗B细胞。同样，变体在损耗B细胞方面表现出更大的潜力。例如，可使用少大约5倍且优选少大约10倍的变体抗体而得到与母体多肽所损耗B细胞的百分数相同。与母体多肽相比，变体所介导的靶细胞损耗提高大约5倍至大约100倍，并且优选地从大约5倍至大约1000倍。
还可体内筛选本发明的变体。可采用任何类型的体内测定法。如下提供一种类型测定法的特定实例。该示例性测定法可以用于Fc变体的体内临床前评估。可在已知具有某些活性的特定抗体的Fc区中加入待测试变体。例如，可通过诱变将变体加入到抗CD20 IgG的Fc区。而这可将母体IgG和Fc变体IgG与RITUXAN(已知促进肿瘤消退)直接比较。可在两期(药物代谢动力学期和药物效应动力学期)中进行临床前评估。I期药物代谢动力学研究的目标是确定Fc变体IgG和具有已知体内活性的抗体(例如RITUXAN)之间的清除率是否存在差异。清除率的差异可引起血清中IgG稳态水平的差异。因此，若检测到稳态浓度的差异，应当进行归一化以便进行精确比较。II期药物效应动力学研究的目标是确定Fc突变对肿瘤生长(本例中)的效应。先前用RITUXAN进行的研究使用了完全抑制肿瘤生长的单个剂量。因为这种剂量不能测量定量性差异，因此应当使用一个剂量范围。
可按照如下方式实施Fc变体、野生型母体Fc和RITUXAN的I期药物代谢动力学比较。首先，向每只动物静脉内注射40μg，并且在第0、0.25、0.5、1、24、48、72、96、120、168和336小时定量血浆IgG水平。例如，可使用药物代谢动力学程序(WinNonLin)利用零延迟二室药物代谢动力学模型过滤数据以获得清除率。清除率可在如下等式中用于描述稳态血浆水平C＝剂量/(清除率×τ)，其中τ是剂量之间的间隔期并且C是稳态时的血浆水平。药物代谢动力学试验可在不带肿瘤的小鼠中实施，每个时间点用最少5只小鼠。
可按如下方式在下一期中使用动物模型。可向CB17-SCID小鼠右腹部皮下移植106个Raji细胞。移植后可立即静脉注射Fc变体、野生型Fc和RITUXAN并且持续至肿瘤直径大于2cm。在每周一、周三、周五使用测径器测量肿瘤的长、宽和高来确定肿瘤体积(肿瘤体积＝W×L×D)。肿瘤体积对时间的曲线将给出用于药物代谢动力学计算的肿瘤生长率。每组应当最少使用大约10只动物。
可按如下方式实施Fc变体、野生型Fc和RITUXAN的II期药物效应动力学比较。基于已公开的数据，每周10μg/g的RITUXAN完全抑制体内肿瘤生长(Clynes等，Nat.Med.2000年4月；6(4)443-6，2000，此处引用作为参考)。因此可测试如下的每周剂量范围10μg/g、5μg/g、1μg/g、0.5μg/g和0μg/g。通过稳态血浆水平和效力间的相互关系图表确定抑制肿瘤生长50％的稳态血浆水平。稳态血浆水平可如上所述计算。根据需要，对于每个Fc变体和Fc野生型可根据它们的药物代谢动力学特性相应调整τ以取得与RITUXAN可比的稳态血浆水平。与母体多肽(例如Fc野生型)和RITUXAN相比，Fc变体的在统计学上改善的药物效应动力学数值通常说明Fc变体提供了改善的体内活性。
如前所述(Reff等，Blood 83，435-445、1994)，可在食蟹猴中进行Fc变体、野生型Fc和RITUXAN的另外的药物效应动力学比较。损耗外周B细胞和淋巴结B细胞的剂量反应可用于比较静脉内和/或皮下所施用Fc变体与野生型Fc和Rituxan的相对潜能。与母体多肽(例如Fc野生型)和RITUXAN相比，Fc变体的在统计学上改善的药物效应动力学数值通常说明Fc变体赋予了改善的体内活性。
在另外一些实施方案中，对本发明的变体进行筛选以至于鉴定出在至少两个物种中具有治疗用途的变体。此类变体在此处称作“双物种改良变体”，并且该类变体尤其用于鉴定在人中有疗效、并且在动物模型中也表现(或有可能表现)功效的变体。就此而言，本发明提供鉴定变体的方法，其中变体很有可能被批准用于人临床测试，因为动物模型数据将有可能支持向政府管理机构(如美国食品药品管理局)提出的任何人类测试申请。
在某些实施方案中，如下鉴定双物种改良变体，即首先实施使用人效应细胞的ADCC测定法以发现改良的变体，然后使用小鼠、大鼠或非人灵长类效应细胞进行ADCC测定法以便鉴定作为双物种改良变体的改良变体的亚类。在一些实施方案中，本发明提供鉴定双物种改良变体的方法，其包括a)提供i)靶细胞，ii)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽的候选变体，其中候选变体在Fc区内包含至少一处氨基酸修饰，并且其中该候选变体在第一个物种(例如人)效应细胞存在时较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性，和iii)第二个物种(例如小鼠、大鼠或非人灵长类)效应细胞，以及b)将组合物与靶细胞在使得候选变体结合靶细胞的条件下温育，以至于产生结合该候选变体的靶细胞，c)将第二个物种的效应细胞与已结合候选变体的靶细胞混合，以及d)测量由该候选变体介导的靶细胞细胞毒性。在某些实施方案中，方法还包括步骤e)确定在第二个物种细胞应细胞存在时候选变体是否较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性。在一些实施方案中，方法还包括步骤f)鉴定作为双物种改良变体的候选变体，其中在第二个物种的效应细胞存在时双物种改良变体较母体多肽更有效地介导靶细胞细胞毒性。在优选的实施方案中，随后在一种或多种动物测定法中体内筛选所鉴定的双物种变体。
在某些实施方案中，如下鉴定双物种改良变体，即首先使用人的血液进行全血测定以发现改良的变体，然后使用小鼠、大鼠或非人灵长类的血液进行全血测定以便鉴定作为双物种改良变体的改良变体的亚类。在一些实施方案中，本发明提供用于鉴定双物种改良变体的方法，其包括a)提供i)靶细胞，ii)组合物，其包含具有至少一部分Fc区的母体多肽的候选变体，其中候选变体在Fc区内包含至少一处氨基酸修饰，并且其中该候选变体在第一个物种(例如人)血液存在时较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗，和iii)第二个物种(例如小鼠、大鼠或非人的灵长类)血液，以及b)将组合物与靶细胞在使得候选变体结合靶细胞的条件下一起温育，以至于产生结合该候选变体的靶细胞，c)将第二个物种血液与已结合候选变体的靶细胞混合，以及d)测量由候选变体介导的靶细胞损耗。在某些实施方案中，方法还包括步骤e)确定在第二个物种血液存在时候选变体是否较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗。在一些实施方案中，方法还包括步骤f)鉴定作为双物种改良变体的候选变体，其中在第二个物种血液存在时双物种改良变体较母体多肽更有效地介导靶细胞损耗。在优选的实施方案中，随后在一种或多种动物测定法中体内筛选所鉴定的双物种变体。
在某些实施方案中，通过使用人成分(例如人细胞、人Fc受体等)开展以上任意测定法以鉴定改良的变体，随后以使用非人的动物成分(例如小鼠细胞、小鼠Fc受体等)的相同测定法鉴定双物种改良变体。就此而言，可鉴定出在基于人的测定法和基于第二个物种的测定法中根据特定标准表现均为良好的变体亚类。
用于鉴定双物种改良变体的示例性方法如下。首先，将编码至少一部分IgG Fc区的核酸序列突变，以便所表达的氨基酸序列具有至少一处氨基酸改变，由此产生变体。随后，该种表达的IgG变体在使用人PBMC或亚类(例如NK细胞或巨噬细胞)的ADCC测定法中进行表征。如果发现ADCC活性增强，随后在使用小鼠或大鼠PBMC的第二个ADCC测定法中筛选该变体。备选地或额外地，测定变体对克隆的啮齿类受体或细胞系的结合。最后，如果在第二个测定法中发现该变体得到改善，则认定其为双改良变体，然后在小鼠或大鼠中体内筛选该变体。
V.含变体Fc区的示例性分子本发明的变体Fc区可以是较大分子的一部分。较大分子可以是例如单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体、免疫粘附素等。因此，显而易见本发明的变体Fc区应用范围广泛。
A.含有变体Fc区的抗体在优选的实施方案中，含有变体Fc区的分子(例如多肽)是抗体。产生抗体的技术如下所述。
(i)抗原选择和制备通常，当含有变体Fc区的分子是抗体时，该抗体针对目的抗原。优选地，抗原是多肽并且抗体向患有疾病或病症的哺乳动物的施用可以在该哺乳动物中产生治疗性益处。然而还可使用针对非多肽抗原(如肿瘤相关糖脂抗原；见美国专利5,091,178，此处引用作为参考)的抗体。
示例性抗原包括(但不限于)如下分子如肾素；生长素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白；胰岛素A-链；胰岛素B-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和血管性血友病因子；抗凝血因子如蛋白C；心房钠尿因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；RANTES(对正常活化T-细胞的表达和分泌的调节)；人巨噬细胞炎症蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian-抑制性物质；松弛素A-链；松弛素B-链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物的蛋白质如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子，如骨源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如αFGF和βFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGFβ，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19和CD20；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)、例如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T-细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如AIDS包膜蛋白的部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整合素如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2、HER3或HER4受体；凋亡途径成员和以上所列任一多肽的片段。
优选的抗原包括(但不限于)CD蛋白如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34；ErbB受体家族成员如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、包括其a或多个亚基的a4/p7整合素和(Xv/p3整合素(例如抗CD11a、抗CD18或抗CD11b抗体)；生长因子如VEGF；组织因子(TF)；α干扰素(a-IFN)；白介素如IL-8；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。
任选地与其他分子缀合的可溶性抗原或其片段可用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子，例如受体或其片段(例如受体的细胞外结构域)可用作免疫原。备选地，表达跨膜分子的细胞可用作免疫原。此类细胞可源自天然来源(例如癌细胞系)或是已经通过重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。用于制备抗体的其他抗原及其形式对于本领域人员是显而易见的。
(ii)多克隆抗体本发明提供具有变体Fc区的多克隆抗体。例如，可将含有已修饰G1恒定区的人免疫球蛋白库移植给免疫球蛋白失活小鼠，产生表达含有已修饰Fc区的人免疫球蛋白库的小鼠(见例如Mendez，MJ等，Nature Genetics15146(1997)，此处引用作为参考)。多克隆抗体优选地在动物中通过多点皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂产生。可以使用双功能剂或衍生剂(例如通过半胱氨酸残基缀合的马来酰亚胺苯甲酰基磺基琥珀酰亚胺酯、通过赖氨酸残基缀合的N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2或R1N＝C＝NR，其中R和R1是不同烷基)将相关抗原与在待免疫物种中具有免疫原性的蛋白质(例如钥孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制物)缀合。
用于兔和鼠的示例性的常规免疫方法如下。通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(例如分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混合并将该溶液皮内多点注射，来对动物实施针对抗原、免疫原性缀合物或衍生物的免疫。一个月后，用混于弗氏完全佐剂中的最初量1/5或1/10的肽或缀合物皮下多点注射强化免疫该动物。7至14天后，从该动物采血并测定血清抗体滴度。将动物加强免疫直至滴度达到平台期。优选地，用不同蛋白质和/或经不同交联剂缀合的同一抗原缀合物强化免疫动物。缀合物还可以作为蛋白融合物在重组细胞培养物中产生。此外，诸如明矾的聚集剂适用于增强免疫应答。
(iii)单克隆抗体本发明提供具有变体Fc区的单克隆抗体。可以多种方式产生单克隆抗体，包括使用杂交瘤方法(例如Kohler等，Nature，256495，1975所述，此处引用作为参考)或通过重组DNA方法(例如美国专利号4,816,567，此处引用作为参考)。
在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其他适宜宿主动物如仓鼠或猕猴，以引发出产生或能够产生可特异性结合免疫所用蛋白质的抗体的淋巴细胞。备选地，可体外免疫淋巴细胞。随后使用合适融合剂，如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。然后将如此制备的杂交瘤细胞在合适培养基中接种和生长，其中培养基优选含有一种或多种抑制未融合的母体骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若母体骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，用于此杂交瘤的培养基一般将包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是有效融合的、通过所选择的抗体产生细胞稳定高水平生产抗体的并且对培养基如HAT培养基敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如从Salk研究所细胞销售中心(SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California，美国)获得的MOPC-21和MPC-11鼠肿瘤衍生的那些以及从美国典型培养物保藏中心(Rockville，Maryland，美国)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞。还已经描述过用于生产人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异种骨髓瘤(heteromyeloma)(例如Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)，此处引用作为参考)。
为产生针对抗原的单克隆抗体，测定杂交瘤细胞正生长于其中的培养基。优选地，杂交瘤细胞所产生单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定。在鉴定出可产生具有期望特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可将该克隆通过有限稀释法进行亚克隆并且通过标准方法生长。适用于此目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，可将杂交瘤细胞作为动物腹水肿瘤在体内生长。由亚克隆所分泌的单克隆抗体经常规免疫球蛋白纯化方法从培养基、腹水或血清中适当地分离，其中常规免疫球蛋白纯化方法例如A蛋白-琼脂糖法、羟基磷灰石层析法、凝胶电泳法、透析法或亲和层析法。
使用常规方法(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离编码单克隆抗体的DNA和测序。杂交瘤细胞作为该DNA的优选来源。一旦分离了DNA，可将该DNA置于表达载体内，随后将该载体转染宿主细胞，如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。如下更详细地描述抗体的重组生产。
在一些实施方案中，从使用如McCafferty等，Nature，348552554(1990)所述技术生成的抗体噬菌体文库中分离抗体或抗体片段。Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597(1991)分别描述了使用噬菌体文库对鼠和人抗体的分离。随后的出版物描述了通过链改组法(Marks等，BioTechnology，10779-783(1992))以及作为构建极其巨大噬菌体文库策略的组合性感染和体内重组法(例如Waterhouse等，Nuc.Acids.Res.，212265-2266(1993))生产高亲和性(nM级)人抗体。因此，这类技术和类似技术有效替代了用于单克隆抗体分离的常规单克隆抗体杂交瘤技术。
同样，可通过用人重链和轻链恒定区的编码序列替代同源的鼠序列(例如美国专利号4,816,567和Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci USA，816851(1984)，均在此处引用作为参考)或通过将免疫球蛋白编码序列与全部或部分非免疫球蛋白多肽编码序列共价连接来修饰DNA。
一般地，此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定区或者替代抗体中一个抗原结合位点的可变结构域，从而产生嵌合双价抗体，该嵌合双价抗体包含对一个抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同的抗原具有特异性的另一抗原结合位点。
(iv)人源化抗体和人抗体本发明提供具有变体Fc区的人源化抗体和人抗体。在优选的实施方案中，人源化抗体包含人抗体氨基酸序列以及非人抗体的氨基酸残基。在一些实施方案中，人源化抗体中的人序列包含骨架区(FR)并且非人抗体序列或残基包含一个或多个互补决定区(CDR)。
值得注意的是，可基于重链和轻链可变区内的氨基酸残基编号定义FR和CDR。术语“互补决定区”或CDR旨在指在重链和轻链多肽可变区内存在的非连续性抗原结合位点。这些区域已经由Kabat等(J.Biol.Chem.2526609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(1991)；“Kabat”)、Chothia等(J.Mol.Biol.196901-917(1987)；“Chothia”)和MacCallum等(J.Mol.Biol.262732-745(1996)“MacCallum”)定义，其中该定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或亚型。然而，在提及抗体(包括人源化抗体)的CDR时，任何这些单独定义(例如，Kabat定义)或组合定义(例如，Kabat和Chothia的组合性定义)的应用均处于如此处所描述和使用的术语范围内。包含由以上引用每一文献所定义CDR的氨基酸残基列于下表6以便比较。
表6CDR定义

另外，术语“骨架”当用来指抗体可变区时旨在指抗体可变区中CDR区域以外的所有氨基酸残基。因此，可变区骨架长度在大约100-120个氨基酸之间，但其仅旨在指CDR区域以外的那些氨基酸。术语“骨架区”旨在指由CDR所分隔的骨架的每一结构域。因此，如Kabat所定义，对于重链可变区和CDR的特定实例而言，骨架区1(FRI)对应于包含第1-30位氨基酸的可变区结构域；骨架区2(FR2)对应于包含第36-49位氨基酸的可变区结构域；骨架区3(FR3)对应于包含第66-94位氨基酸的可变区结构域；骨架区4(FR4)对应于从第103位氨基酸至可变区末尾的可变区结构域。类似地，轻链骨架区由每一轻链可变区CDR分隔。类似地，使用Chothia或MacCallum的CDR定义或CDR定义的任何组合，骨架的边界由如上所述的各个CDR末端分隔。尽管存在多种CDR的定义，但是在一些实施方案中，优选使用Kabat定义对CDR进行定义。
人源化抗体中非人抗体残基可以是从另一物种(包括但不限于小鼠)中输入或衍生的残基或序列，或者这些序列是插入到人源化抗体序列中的随机氨基酸序列(例如从随机化核酸序列产生)。如上所述，人源化抗体中的人氨基酸序列优选地是骨架区，而非人抗体残基(不管是来自另一个物种还是随机氨基酸序列)优选地对应于CDR。然而，在一些实施方案中，一个或多个骨架区可含有一个或多个非人类的氨基酸残基。以对人类骨架进行改变或修饰(例如通过导入非人的残基)为例，改变的或修饰的骨架区可以与来自另一个物种的修饰的CDR或随机CDR序列毗邻，而在其他实施方案中，改变的骨架区与来自另一个物种的改变的CDR或随机CDR序列不毗邻。在一些实施方案中，人源化抗体的骨架序列完全是人的骨架序列(即对人的骨架未作任何改变)。在优选的实施方案中，人源化抗体的骨架序列完全是人类种系的骨架序列(即对人类种系骨架未作任何的改变)。
将来自另一物种或随机序列的非人类的氨基酸残基常称作“输入”残基，该残基一般从“输入”可变结构域中获得。可按照Winter及其合作者(例如Jones等，Nature，321522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)，所有文献在此处引用作为参考)的方法通过用啮齿类(或其他哺乳动物)CDR或CDR序列替代人抗体的相应序列基本实现人源化。此外，还可生成这样的抗体，其中在该抗体中大大小于完整人可变结构域的可变结构域由来自非人物种的对应序列替代(例如4,816,567，此处引用作为参考)。实际上，人源化抗体一般是这样的人抗体，即其中一些CDR残基和可能的一些FR残基由啮齿类抗体中相似位点的残基替代，或者如上所述，其CDR序列由随机序列替代。例如，向抗体的受者可变区骨架提供供者CDR结合亲和性的方法描述于WO 01/27160 A1(此处引用作为参考)以及美国专利申请09/434,870和09/982,464(此处全部引用作为参考)。
在产生人源化抗体中，对人轻链和重链可变结构域的选择重要的是降低抗原性。根据所谓“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域的完整文库筛选待人源化的啮齿类抗体的可变结构域序列。将最接近啮齿类的人序列用作人源化抗体的人骨架区(FR)(例如Sims等，J.Immunol.，1512296(1993)和Chothia等，J.Mol.Biol.，196901(1987)，两篇文献此处引用作为参考)。另一种方法是使用从特定亚类轻链和重链中的全部人抗体一致序列衍生的特定骨架。同一骨架可用于几个不同的人源化抗体(例如Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285(1992)；Presta等，J.Immunol.，1512623(1993)，两篇文献此处引用作为参考)。
在其他实施方案中，无需“预选”特定的人抗体骨架(即无需选择与待人源化的特定候选抗体在同源性或序列同一性上最接近的人骨架)。在这些实施方案，常见或通用的人骨架可用于接受一个或多个非人的CDR。在优选的实施方案中，将一个通用的完全人骨架用作所有待人源化抗体的骨架，而不考虑该骨架与候选抗体骨架序列的同源性。就此而言，可生成骨架区内没有任何变化的人源化抗体。这种通用的完全人骨架随后可接受一个或多个CDR序列。在一个实施方案中，一个或多个CDR序列是来自另一物种(例如小鼠或大鼠)抗体的CDR序列，其中与来自另一物种的完整抗体中相应CDR序列相比，CDR序列已经被修饰(即将导入通用的人骨架的CDR同时进行导入和修饰)。修饰对应着与来自另一物种完整抗体中的相应CDR相比一处或多处氨基酸的变化(在修饰的CDR内)。在一个实施方案中，所述CDR内的全部氨基酸残基被纳入文库，而在其他实施方案中，并非所有CDR中的氨基酸残基均纳入文库。在另一个实施方案中，一个或多个CDR序列是替代CDR序列的随机序列。
在优选的实施方案中，抗体人源化后保留了对抗原的高亲和性和其他有利的生物学特性。在一些实施方案中，人源化抗体对抗原的亲和性高于相应非人源化抗体、完整抗体或其片段或部分(例如候选的啮齿类抗体)的亲和性。就此而言，在一些实施方案中，通过使用母体序列和人源化序列的三维模型分析对母体序列和多种概念性人源化产物进行分析的方法产生人源化抗体。免疫球蛋白三维模型通常是本领域技术人员可以获得的且熟悉的。图解并显示所选择的候选免疫球蛋白序列的三维构象结构的计算机程序是可得的。检查这些显示的结构可分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。以如此方式，可选择出FR残基并将来自受者的FR残基和输入序列组合获得预期的抗体特征，如提高的对靶抗原的亲和性。通常，CDR残基直接并且最大限度地影响抗原结合。
本领域技术人员众所周知的多种具体方法可用于向抗体骨架中导入抗体CDR(或替代抗体CDR的随机序列)(见例如，US专利申请09/434,879和09/982,464)。在一些实施方案中，相互重叠的寡聚物用于合成抗体基因或其部分(例如，编码人源化抗体的基因)。在其他实施方案中，可使用Kunkel方法(见下)实施对抗体模板的诱变，以导入修饰的CDR和随机序列以替代CDR。在一些实施方案中，轻链和重链可变区分别经过人源化，然后作为人源化的可变区共表达。在其他实施方案中，人源化的可变区组成了完整抗体可变区。在一些实施方案中，包含人源化可变区的完整抗体的Fc区已经被修饰(例如在该Fc区中已经进行了至少一处氨基酸修饰)。例如，已经用随机化CDR进行人源化并且骨架未变动的抗体可在Fc区中包含至少一处氨基酸修饰。
在其他实施方案中，使用了在缺乏内源免疫球蛋白产生的情况下当免疫时能够产生全套人抗体的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经描述，在嵌合突变小鼠和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯含性缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人类种系的免疫球蛋白基因列阵转移至该种系突变小鼠中将导致在抗原刺激后产生人抗体(见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551(1993)以及Jakobovits等，Nature，362255-258(1993)，两篇文献此处引用作为参考)。还可以从噬菌体展示文库中衍生人抗体(例如Hoogenboom等，J.Mol.Biol.，227381(1991)以及Vaughan等Nature Biotech 14309(1996)，两篇文献此处引用作为参考)。
本发明提供产生(与具有Fc区的母体多肽相比)在Fc区内包含至少一处氨基酸修饰的人源化抗体(和抗体片段)的方法。以下讨论用于产生此类人源化抗体的另外方法。本发明还提供包含由这些方法产生的抗体和抗体片段的组合物。重要的是，以下讨论的人源化方法和其他人源化方法(例如以上讨论)可组合地用于本发明的Fc变体。就此而言，根据本发明可构建具有改变的、独特Fc区的人源化抗体。
在一些实施方案中，提供了构建一群编码改变的重链可变区的核酸的方法，其包括A)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；B)合成a)第一个寡核苷酸，其编码受者重链可变区中骨架区的部分，其中当与第二个参考序列比较时，骨架区的部分未被修饰；以及b)第二个寡核苷酸群体，其中每个寡核苷酸编码i)已被修饰的第一个互补决定区的至少一部分，其中第一个互补决定区选自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比，已经修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，和ii)未修饰骨架区的一部分或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸杂交；C)将第二个寡核苷酸群体与第一个寡核苷酸混合以产生重叠性寡核苷酸；和D)在使得可构建一群编码改变的重链可变区的核酸的条件下处理重叠性寡核苷酸，其中由改变的重链可变区编码核酸编码的骨架区相对于第二个参考序列而言是未修饰的。
在一些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达一群改变的重链可变区编码核酸和轻链可变区编码核酸，以产生改变的异聚性可变区的不同群体。在一些实施方案中，合成包括化学性合成。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，处理步骤D)包括通过聚合酶进行的延伸。
在其他实施方案中，提供了构建一群编码改变的轻链可变区的核酸的方法，其包括A)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；B)合成a)第一个寡核苷酸，其编码受者轻链可变区中骨架区的一部分，其中与第二个参考序列相比，骨架区的一部分未被修饰；以及b)第二个寡核苷酸群体，其中每个寡核苷酸编码i)已修饰的第一个互补决定区的至少一部分，其中第一个互补决定区选自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比已修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，和ii)未修饰骨架区的一部分或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸杂交；C)将第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸群体混合以产生重叠性寡核苷酸；和D)在可构建已改变的轻链可变区编码核酸群体的条件下处理重叠性寡核苷酸，其中由改变的轻链可变区编码核酸编码的骨架区相对于第二个参考序列而言是未修饰的。
在一些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达一群已改变的轻链可变区编码核酸和重链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的不同群体。在一些实施方案中，合成包括化学性合成。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，处理步骤D)包括通过聚合酶进行的延伸。
在一些实施方案中，考虑了构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，其包括A)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；B)合成a)第一个寡核苷酸群，其中每个寡核苷酸编码选自HCDR1、HCDR2和HCDR3的第一个互补决定区的至少一部分，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比，已修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处包含不同的氨基酸；b)第二个寡核苷酸，其编码i)受者重链可变区中骨架区的一部分，其中与第二个参考序列相比，骨架区的一部分未被修饰，和ii)互补决定区的一部分或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群体杂交；C)将第一个寡核苷酸群与第二个寡核苷酸混合以产生重叠性寡核苷酸；和D)在可构建已改变的重链可变区编码核酸群的条件下处理重叠性寡核苷酸，其中所述由已改变的重链可变区编码核酸编码的骨架区与第二个参考序列相比未被修饰。
在一些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达已改变的重链可变区编码核酸群和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的不同群体。在一些实施方案中，合成包括化学性合成。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，处理步骤D)包括通过聚合酶进行的延伸。
在其他实施方案中，考虑了构建已改变的轻链可变区编码核酸群的方法，其包括A)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；B)合成a)第一个寡核苷酸群，其中每个寡核苷酸编码选自LCDR1、LCDR2和LCDR3的第一个互补决定区的至少一部分，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比，已修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处包含不同的氨基酸；b)第二个寡核苷酸，其编码i)受者轻链可变区中骨架区的一部分，其中与第二个参考序列相比，骨架区的一部分未被修饰，和ii)互补决定区的一部分或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群体杂交；C)将第一个寡核苷酸群与第二个寡核苷酸混合以产生重叠性寡核苷酸；和D)在可构建已改变的轻链可变区编码核酸群的条件下处理重叠性寡核苷酸，其中由改变的轻链可变区编码核酸编码的骨架区相对于第二个参考序列而言是未修饰的。
在一些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达一群已改变的轻链可变区编码核酸和重链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，合成包括化学性合成。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，处理步骤D)包括通过聚合酶进行的延伸。
在其他实施方案中，考虑了构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，其包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个互补决定区；第二个参考序列包含一个重链可变区序列；b)合成已改变重链可变区抗体基因序列群，其中已改变重链可变区的骨架区与第二个参考序列的骨架区完全一致，并且已改变重链可变区中的至少第一个CDR已被修饰，其中与第一个参考序列中相应的供者CDR相比，经修饰的第一个CDR在一个或多个位置处包含不同的氨基酸。
在一些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达一群已改变的重链可变区编码核酸和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，合成涉及互相重叠的寡核苷酸的使用。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义描述。
在其他实施方案中，考虑了构建已改变的轻链可变区编码核酸群的方法，其包括A)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个互补决定区；第二个参考序列包含一个含有骨架区的受者轻链可变区序列；b)合成已改变轻链可变区抗体的基因序列群，其中已改变轻链可变区的骨架区与第二个参考序列的骨架区完全一致，并且已改变的抗体轻链可变区中至少第一个CDR已被修饰，其中与第一个参考序列中相应的供者CDR相比，经修饰的第一个CDR在一个或多个位置处包含不同的氨基酸。
在一些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达一群已改变的轻链可变区编码核酸和重链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，合成涉及互相重叠的寡核苷酸的使用。
还在其他实施方案中，考虑了构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，其包括a)提供参考氨基酸序列的表现形式，该参考序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；b)合成已改变重链可变区抗体基因序列群，其中已改变重链可变区的骨架区与参考序列骨架区完全一致，并且已改变抗体重链可变区中至少第一个CDR包含随机氨基酸序列。
在一些实施方案中，参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达已改变的重链可变区编码核酸群和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，合成涉及互相重叠的寡核苷酸的使用。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义描述。
在其他实施方案中，考虑了构建已改变的轻链可变区编码核酸群的方法，其包括a)提供参考氨基酸序列的表现形式，其中参考序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；b)合成已改变轻链可变区抗体基因序列群，其中已改变轻链可变区的骨架区与参考序列骨架区完全一致，并且已改变抗体轻链可变区中至少第一个CDR包含随机氨基酸序列。
在一些实施方案中，参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达已改变的轻链可变区编码核酸群和重链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，受者是人。在一些实施方案中，合成涉及互相轻叠的寡核苷酸的使用。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义描述。
还在其他实施方案中，考虑了构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，其包括a)提供参考氨基酸序列的表现形式，其中参考序列包含含有骨架区的人类受者重链可变区序列；b)合成已改变重链可变区抗体基因序列群，其中已改变重链可变区的骨架区与人类参考序列骨架区完全一致，并且已改变抗体重链可变区中至少第一个CDR包含随机氨基酸序列。在一些实施方案中，人类参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达已改变的重链可变区编码核酸群和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，合成涉及互相重叠的寡核苷酸的使用。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义描述。
在其他实施方案中，考虑了构建已改变的轻链可变区编码核酸群的方法，其包括a)提供参考氨基酸序列的表现形式，其中参考序列包含含有骨架区的人类受者轻链可变区序列；b)合成已改变轻链可变区抗体基因序列群，其中已改变轻链可变区的骨架区与人类参考序列骨架区完全一致，并且已改变抗体轻链可变区中至少第一个CDR包含随机氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述人类参考序列的表现形式为电子形式。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达已改变的轻链可变区编码核酸群和重链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，合成涉及互相重叠的寡核苷酸的使用。在一些实施方案中，CDR由Kabat定义描述。
在一些实施方案中，在修饰一个或多个骨架区的同时导入一个或多个已修饰的CDR。在其他实施方案中，已修饰骨架与已修饰的CDR毗邻。
在一些实施方案中，本发明提供构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考氨基酸序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；b)合成a)第一个寡核苷酸群，其包含编码已修饰的重链可变区的骨架区或其部分的寡核苷酸，其中与受者骨架区参考序列相比，重链可变区的骨架区或其部分在一个或多个位置处含有多个已改变的氨基酸，其中被改变的骨架位置选自第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架位置相比在相应位置不同的受者骨架位置；以及b)第二个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码i)至少一个已修饰的互补决定区或其部分，其中与相应的供者互补决定区氨基酸参考序列相比，已修饰的互补决定区或其部分在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，以及ii)相邻骨架区的一个或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群杂交；c)将所述第一个和第二个寡核苷酸群混合，以产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的重链可变区编码核酸群的条件下处理重叠性寡核苷酸。在某些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在其他实施方案中，方法还包括步骤(e)共表达已改变的重链可变区编码核酸群和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在另外的实施方案中，合成包括化学性合成。在一些实施方案中，受者是人。在优选的实施方案中，一个或多个已改变的异聚性可变区的多样群体是包含Fc区的抗体的一部分，其中与具有Fc区的母体多肽相比，所述Fc区包含至少一处氨基酸修饰。
在其他实施方案中，本发明提供构建一群编码改变的轻链可变区的核酸的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考氨基酸序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；b)合成a)第一个寡核苷酸群，其包含编码已修饰的轻链可变区的骨架区或其部分的寡核苷酸，其中与受者骨架区参考序列相比，轻链可变区的骨架区或其部分在一个或多个位置处含有多个已改变的氨基酸，其中被改变的骨架位置选自第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架位置相比在对应位置上不同的受者骨架位置；以及b)第二个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码i)至少一个已修饰的互补决定区或其部分，其中与相应的供者互补决定区氨基酸参考序列相比，已修饰的互补决定区或其部分在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，以及ii)相邻骨架区的一个或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群杂交；c)将第一个和第二个寡核苷酸群混合，以产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的轻链可变区编码核酸群的条件下处理重叠性寡核苷酸。在其他实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在另外的实施方案中，方法还包括步骤(e)共表达一群编码已改变的轻链可变区的核酸和重链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。
在一些实施方案中，方法包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考氨基酸序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；b)合成a)第一个寡核苷酸群，其包含编码已修饰的重链可变区的骨架区或其部分的寡核苷酸，其中与受者骨架区参考序列相比，重链可变区的骨架区或其部分在一个或多个位置处含有多个已改变的氨基酸，其中被改变的骨架位置选自第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架位置相比在相应位置上不同的受者骨架位置，以及b)第二个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码i)至少一个已修饰的互补决定区或其部分，其中与相应的供者互补决定区氨基酸参考序列相比，已修饰的互补决定区或其部分在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，以及ii)相邻骨架区的一个或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群杂交；c)将第一个和第二个寡核苷酸群混合，以产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的重链可变区编码核酸群的条件下，用DNA聚合酶延伸重叠性寡核苷酸。
仍在一些实施方案中，本发明提供构建一群编码改变的轻链可变区的核酸的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考氨基酸序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；b)合成a)第一个寡核苷酸群，其包含编码已修饰的轻链可变区的骨架区或其部分的寡核苷酸，其中与受者骨架区参考序列相比，轻链可变区的骨架区或其部分在一个或多个位置处含有多个已改变的氨基酸，其中被改变的骨架位置选自第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架位置相比在相应位置上不同的受者骨架位置；以及b)第二个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码i)至少一个已修饰的互补决定区或其部分，其中与相应的供者互补决定区氨基酸参考序列相比，已修饰的互补决定区或其部分在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，以及ii)相邻骨架区的一个或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群杂交；c)将第一个和第二个寡核苷酸群混合，以产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的轻链可变区编码核酸群的条件下用DNA聚合酶延伸重叠性寡核苷酸。
在一些实施方案中，在向骨架区引入一个或多个修饰的同时导入一个或多个已修饰的CDR。与参考序列的相应CDR相比，修改的CDR可包含一处或多处氨基酸改变。在某些实施方案中，本发明提供构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考氨基酸序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；b)合成i)第一个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码至少一个已修饰的互补决定区，其中与相应的供者互补决定区氨基酸参考序列相比，已修饰的互补决定区在一个或多个位置处含有不同的氨基酸，以及ii)第二个寡核苷酸群，其包含编码重链可变区骨架的已修饰部分的寡核苷酸，其中与受者骨架区参考序列相比，已修饰部分在一个或多个位置处包含多个已改变的氨基酸，其中被改变的骨架位置选自第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架位置相比在相应位置上不同的受者骨架位置；c)在使得寡核苷酸中的一部分发生杂交的条件下将第一个和第二个寡核苷酸群混合，以至于产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的重链可变区编码核酸群的条件下处理重叠性寡核苷酸。在某些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在其他实施方案中，方法还包括步骤(e)共表达已改变的重链可变区编码核酸群和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。在一些实施方案中，受者是人。
在其他实施方案中，本发明提供构建一群编码改变的轻链可变区的核酸的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考氨基酸序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；b)合成i)第一个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码至少一个已修饰的互补决定区，其中与相应的供者互补决定区氨基酸参考序列相比，已修饰的互补决定区在一个或多个位置处含有不同的氨基酸，以及ii)第二个寡核苷酸群，其包含编码轻链可变区骨架的已修饰部分的寡核苷酸，其中与受者骨架区参考序列相比，已修饰部分在一个或多个位置处含有多个已改变的氨基酸，其中被改变的骨架位置选自第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架位置相比在相应位置上不同的受者骨架位置；c)在使得寡核苷酸中的至少一部分发生杂交的条件下将第一个和第二个寡核苷酸群混合，以至于产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的轻链可变区编码核酸群的条件下处理重叠性寡核苷酸。
在某些实施方案中，可产生包含Fc变体和改变的重链变体区域的抗体或抗体片段。例如，在一些实施方案中，本发明提供构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；b)合成A)第一个寡核苷酸，其编码受者重链可变区中骨架区的一部分，其中与第二个参考序列相比，骨架区的一部分未被修饰；以及B)第二个寡核苷酸群，其中每个寡核苷酸编码i)已修饰的第一个互补决定区的至少一部分，其中第一个互补决定区选自HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比，已修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，以及ii)未修饰骨架区的一部分或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸杂交；c)将第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸群混合以产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的重链可变区编码核酸群的条件下，处理重叠性寡核苷酸，其中相对于第二个参考序列而言，由已改变的重链可变区编码核酸所编码的骨架区是未被修饰的。在一些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达已改变的重链可变区编码核酸群和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。
在其他实施方案中，本发明提供构建一群编码改变的轻链可变区的核酸的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；b)合成a)编码受者轻链可变区中骨架区的一部分的第一个寡核苷酸，其中与第二个参考序列相比，骨架区的一部分未被修饰；以及b)第二个寡核苷酸群，其中每个寡核苷酸编码i)已被修饰的第一个互补决定区的至少一部分，其中第一个互补决定区选自LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比，已修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，以及ii)能够与第一个寡核苷酸杂交的未修饰骨架区的一个或多个部分；c)将第一个寡核苷酸与第二个寡核苷酸群混合，以产生重叠性寡核苷酸；和d)在可构建已改变的轻链可变区编码核酸群的条件下，处理重叠性寡核苷酸，其中相对于第二个参考序列而言，由已改变的轻链可变区编码核酸所编码的骨架区未被修饰。
在其他实施方案中，本发明提供构建已改变的重链可变区编码核酸群的方法，包括A)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者重链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者重链可变区序列；B)合成a)第一个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码选自HCDR1、HCDR2和HCDR3的第一个互补决定区的至少一部分，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比，已修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处含有不同氨基酸，以及b)第二个寡核苷酸，其编码i)受者重链可变区内的骨架区的一部分，其中与参考序列相比，骨架区的一部分未被修饰和ii)互补决定区的一个或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群杂交，C)将第一个寡核苷酸群与第二个寡核苷酸混合，以至于产生重叠性寡核苷酸；以及d)在可构建已改变的重链可变区编码核酸群的条件下，处理重叠性寡核苷酸，其中相对于第二个参考序列而言，由已改变的重链可变区编码核酸的编码的骨架区未被修饰。在某些实施方案中，方法还包括步骤(E)共表达已改变的重链可变区编码核酸群和轻链可变区编码核酸，以产生经改变的异聚性可变区的多样群体。
在其他实施方案中，本发明提供构建一群编码改变的轻链可变区的核酸的方法，包括A)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，其中第一个参考序列包含供者轻链可变区序列，该供者可变区包括i)骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考序列包含含有骨架区的受者轻链可变区序列；B)合成a)第一个寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码选自LCDR1、LCDR2和LCDR3的第一个互补决定区的至少一部分，其中与第一个参考序列中相应的供者互补决定区相比，已修饰的第一个互补决定区在一个或多个位置处包含不同的氨基酸，以及b)第二个寡核苷酸，其编码i)受者轻链可变区内的骨架区的一部分，其中与参考序列相比，骨架区的一部分未被修饰和ii)互补决定区的一个或多个部分，其能够与第一个寡核苷酸群杂交；C)将第一个寡核苷酸群与第二个寡核苷酸混合，以产生重叠性寡核苷酸；以及d)在构建已改变的轻链可变区编码核酸群的条件下，处理重叠性寡核苷酸，其中由已改变的轻链可变区编码核酸所编码的骨架区相对于第二个参考序列而言未被修饰。
在其他实施方案中，本发明提供改善突变的人源化抗体可变区的结合亲和性的方法，包括a)提供编码第一个已突变人源化抗体可变区的核酸序列，已突变可变区包含(i)野生型人抗体骨架，(ii)三个非人类重链互补决定区，以及(iii)三个非人类轻链互补决定区，其中互补决定区如Kabat和Chothia的组合性定义描述，其中至少一个轻链互补决定区是含有突变的轻链互补决定区，与相应的野生型非人类互补决定区相比，其在至少一个位置处包含至少一个不同的氨基酸，并且其中第一个已突变抗体可变区具有高于相应未突变的抗体可变区的结合亲和性；b)在使得第二个已突变人源化抗体可变区编码的条件下，将编码第一个已突变抗体可变区的核酸序列突变，其中第二个已突变人源化抗体可变区在含有突变的轻链互补决定区中的至少一处位置上包含至少一个额外的不同氨基酸，额外突变与第一个突变一起导致产生更高的结合亲和性。在一些实施方案中，第一个已突变人源化抗体可变区中含有突变的轻链互补决定区是互补决定区3(LCDR3)。在其他实施方案中，第一个已突变人源化抗体可变区中的至少一个非人类重链互补决定区包含一个突变，以致于当与相应的野生型非人类互补决定区相比，在至少一个位置处编码不同的氨基酸。在另外的实施方案中，重链互补决定区突变位于HCDR3。
在一些实施方案中，本发明提供在构建已改变的重链可变区编码核酸群的同时修饰至少一个互补决定区(CDR)和至少一个骨架区(FR)的方法，包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，第一个参考氨基酸序列包含供者重链可变区序列，其中供者可变区包括i)四个骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含了如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的含有四个骨架区的受者重链可变区序列；b)合成i)对于待修饰的每个骨架区的寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码一个修饰的骨架区或其部分，已修饰的骨架区或其部分与受者重链可变区参考序列相比，在一个或多个位置处含有多个改变的氨基酸，其中被改变的骨架区位置选自于第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架区位置相比在相应位置不同的受者骨架位置；和ii)对于待修饰的每个互补决定区的寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码一个修饰的互补决定区或其部分，其中修饰的互补决定区与供者互补决定区氨基酸参考序列相比在一个或多个位置处含有不同的氨基酸；和iii)对于任一剩余的和未修饰的骨架区的寡核苷酸，寡核苷酸编码骨架区或其部分，并具有与第二个参考受者序列的相应骨架区相同的序列；和iv)对于任一剩余的和未修饰的互补决定区的寡核苷酸，寡核苷酸编码互补决定区或其部分，并具有与第一个参考供者序列的相应互补决定区相同的序列，其中编码重链可变区中毗邻部分的从(i)至(iv)的各个寡核苷酸在其末端具有重叠的序列；以及c)将步骤b)中所合成的寡核苷酸和寡核苷酸群在使得各个寡核苷酸的重叠序列发生杂交条件下混合，以至于产生重叠的寡核苷酸，和d)在使得已改变的重链可变区编码核苷酸群形成的条件下处理重叠的寡核苷酸。在某些实施方案中，第一个和第二个参考序列的表现形式为电子形式。在又一些实施方案中，待修饰的骨架区选自HFR1、HFR2和HFR3。在其他实施方案中，待修饰的互补决定区是HCDR3。在其他实施方案中，方法还包括步骤e)共表达重链可变区编码核酸群与轻链可变区编码核酸，以致于产生已改变的异聚可变区的多样群体。在不同的实施方案中，方法还包括步骤e)共表达重链可变区编码核酸群与轻链可变区编码核酸群，以致于产生已改变的异聚可变区的多样性群体。
在其他实施方案中，应用了在构建已改变的轻链可变区编码核酸群时同时修饰至少一个互补决定区(CDR)和至少一个骨架区(FR)的方法，其中所述方法包括a)提供第一个和第二个参考氨基酸序列的表现形式，第一个参考氨基酸序列包含供者轻链可变区序列，其中供者可变区包括i)四个骨架区和ii)三个如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的互补决定区；第二个参考氨基酸序列包含了如Kabat和Chothia的组合性定义所定义的含有四个骨架区的受者轻链可变区序列；b)合成i)对于待修饰的每个骨架区的寡核苷酸群，每个寡核苷酸编一个修饰的骨架区或其部分，修饰的骨架区或其部分与受者轻链可变区参考序列的相应骨架区相比在一个或多个位置处含有多个改变的氨基酸，其中被改变的骨架区位置选自于第二个参考序列中与第一个参考序列的供者骨架区位置相比在相应位置不同的受者骨架位置；和ii)对于待修饰的每个互补决定区的寡核苷酸群，每个寡核苷酸编码一个已修饰的互补决定区或其部分，其中已修饰的互补决定区与相应的供者互补决定区氨基酸参考序列相比在一个或多个位置处含有不同的氨基酸；和iii)对于任一剩余的和未修饰的骨架区的寡核苷酸，寡核苷酸编码骨架区或其部分，并寡核苷酸具有与第二个参考受者序列的相应骨架区相同的序列；和iv)对于任一剩余的和未修饰的互补决定区的寡核苷酸，寡核苷酸编码互补决定区或其部分并具有与第一个参考供者序列的对应互补决定区相同的序列，其中编码轻链可变区中毗邻部分的从(i)至(iv)的各个寡核苷酸在其末端具有重叠的序列；和c)将步骤b)中所合成的寡核苷酸和寡核苷酸群在使得各个寡核苷酸的重叠序列杂交的条件下混合，以至于产生重叠寡核苷酸，和d)在使得已改变的轻链可变区编码核苷酸群形成的条件下处理所述重叠的寡核苷酸。在某些实施方案中，所述方法还包括步骤e)共表达轻链可变区编码核酸群和重链可变区编码核酸群，以致于产生已改变的异聚可变区的多样性群体。
(v)多特异性抗体本发明提供包含变体Fc区的多特异性抗体。多特异性抗体具有针对至少两种不同抗原的结合特异性。尽管此类分子通常仅仅结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，当在此处使用时，本表述还包括具有额外特异性的抗体，如三特异性抗体。BsAb的实例包括(但不限于)这样的BsAb，即一条臂针对肿瘤细胞抗原而另一条臂针对细胞毒性启动分子的抗体，如抗FcγRI/抗CD15、抗p185HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B-细胞(1D10)、抗CD3/抗p185HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞雌激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白质(FBP)/抗CD3、抗胰腺癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；一条臂特异性结合肿瘤抗原和一条臂结合毒素的BsAb，如抗鞘脂激活蛋白/抗id-1、抗CD22/抗鞘脂激活蛋白、抗CD7/抗鞘脂激活蛋白、抗CD38/抗鞘脂激活蛋白、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素-a(IFN-a)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱；转化受酶活化的前体药物的BsAb，如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化丝裂霉素磷酸酯前体药物转化为丝裂霉素醇)；可用作纤溶剂的BsAb，如抗纤维蛋白/抗组织纤溶酶原激活物(tPA)、抗纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb，如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcRγII或FcRγIII)；治疗传染性疾病的BsAb，如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T-细胞受体CD3复合物/抗流感病毒、抗FcyR/抗HIV；用于肿瘤体外或体内检测的BsAb，如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb；以及作为诊断性工具的BsAb，如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗P物质、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的实例包括(但不限于)抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)2双特异性抗体)。
产生双特异性抗体的方法为本领域所知。传统的全长双特异性抗体生产基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个链具有不同特异性(例如Millstein等，Nature，305537-539(1983)，此处引用作为参考)。由于免疫球蛋白重链和轻链随机搭配，这些杂交瘤(四杂交留(quadromas))产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种分子具有正确的双特异性结构。可通过亲和层析步骤纯化正确分子。类似方法公开于WO93/08829和Traunecker等，EMBO J.，103655-3659(1991)，两篇文献此处引用作为参考。
在另一方法中，具有预期结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列发生融合。优选地，与包含至少一部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域融合。在至少一种融合物中出现含有轻链结合所需位点的第一个重链恒定区(CH1)为优选的。将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA以及根据需要编码免疫球蛋白轻链的DNA分别插入表达载体并且共转染至合适宿主生物内。当在构建中所用的三种多肽链的不等比例提供最佳产量时，这种方式可为实施方案中调整三种多肽片段的相互比例提供极大灵活性。然而，当等比例表达至少两种多肽链导致高产量或当比例无特别意义时，可以将两种或全部三种多肽链的编码序列插入一个表达载体内。在该方法的优选的实施方案中，双特异性抗体由一条臂内具有第一种特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂内的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成(见例如WO 94/04690)。根据WO 96/27011(此处引用作为参考)中所描述的另一种方法，可将一对抗体分子间的界面设计成使从重组细胞培养中回收的异二聚体的百分数最大化。双特异性抗体还包括交联的或“异缀合体(heteroconjugate)”抗体。例如异缀合体中的抗体之一可与亲合素偶联，而另一个抗体与生物素偶联。
B.免疫粘附素分子本发明还提供包含变体Fc区的免疫粘附素分子。一种免疫粘附素设计类型是联合粘附素的结合结构域(例如受体的细胞外结构域(ECD))与免疫球蛋白重链的Fc区(例如变体的Fc区)。通常，当制备本发明的免疫粘附素时，编码粘附素结合结构域的核酸的C末端与编码免疫球蛋白恒定结构域序列N末端的核酸融合，然而，也可以是N末端融合。
一般地，在此类融合中，所编码的嵌合多肽将至少保留免疫球蛋白重链恒定区中的功能活性铰链、CH2和CH3结构域。还可与恒定结构域Fc部分的C末端或紧邻重链CH1的N末端或轻链的相应区域融合。融合的精确位点并不重要；特定的位点是众所周知的，并且可以选择特定位点以优化免疫粘附素的生物学活性、分泌或结合特征。
在一些实施方案中，粘附素序列与免疫球蛋白G1的变体Fc区的N末端融合。可以将整个重链恒定区与粘附素序列融合。然而，在优选的实施方案中，在融合中使用了这样一种序列，即从紧邻化学性界定IgG Fc的木瓜蛋白酶切割位点(即残基216，重链恒定区第一个残基为114)或其它免疫球蛋白的类似位点上游的铰链区开始的序列。在某些优选的实施方案中，粘附素氨基酸序列与lgG重链的(a)铰链区和CH2及CH3或者(b)CH1、铰链、CH2和CH3结构域融合。在一些实施方案中，免疫粘附素是双特异性的。
备选地，粘附素序列可在免疫球蛋白重链和轻链序列之间插入，以致于获得包含嵌合重链的免疫球蛋白。在此类实施方案中，粘附素序列可在免疫球蛋白的每一条臂内与免疫球蛋白重链的3’末端融合，或者位于铰链和CH2结构域之间，或者位于CH2和CH3之间(见例如Hoogenboom等，Mol.Immunol.281027-1037(1991)，此处引用作为参考)。
虽然在本发明的免疫粘附素内无需存在免疫球蛋白轻链，但是可以出现与粘附素-免疫球蛋白重链融合多肽共价性结合或直接与粘附素融合的免疫球蛋白轻链。在前一种情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA一般与编码粘附素-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共表达。一旦分泌，杂交的重链和轻链共价结合以提供包含由两个二硫键所连接的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构物。适于制备此类结构物的方法公开于如美国专利号4,816,567，此处引用作为参考。
在优选的实施方案中，通过编码粘附素部分的cDNA序列按符合阅读框的方式与免疫球蛋白cDNA序列融合，构建免疫粘附素。然而，还可使用与基因组免疫球蛋白片段的融合。通常，后一类型的融合需要存在用于表达的Ig调节序列。基于已公开序列，通过杂交或者通过聚合酶链式反应(PCR)技术可以从来自脾和外周淋巴细胞的cDNA文库分离编码IgG重链恒定区的cDNA。编码免疫粘附素中“粘附素”和免疫球蛋白部分的cDNA可以串联方式插入到在选定宿主细胞中指导高效表达的质粒载体内。
VI.编码Fc区变体的核酸序列本发明还提供编码Fc区变体的核酸序列，以及包含编码Fc区变体核酸序列的组合物、载体和宿主细胞。本发明还提供产生Fc区变体的重组方法。
通常，对于变体的重组生产，将编码变体的核酸分离并插入载体。将载体转染宿主细胞，因此使该核酸序列扩增和/或产生变体肽。编码本发明肽变体的核酸序列可使用常规方法分离和测序(例如使用能够特异性结合编码该变体的核酸的寡核苷酸探)。通常，编码变体的核酸序列有效地与其他元件连接，如信号序列(例如分泌性信号序列)、复制起点、至少一种标记基因、增强子、启动子或转录终止子。在某些实施方案中，宿主细胞用编码变体的核酸稳定转染，以产生表达特定变体的细胞系。在优选的实施方案中，变体在CHO、NSO、Sp2/0、PER.C6或HEK293细胞中表达。重组方法为本领域众所周知。
可将核酸序列突变以至于产生变体Fc区。例如，可将编码母体Fc区的核酸序列(例SEQ ID NO32)突变，以致于表达该核酸序列时至少一处氨基酸发生改变。也可将编码母体Fc区的至少一部分的核酸序列突变，以产生包含至少一部分Fc区变体的氨基酸序列。例如，可突变SEQ IDNO32，以致于得到至少一种氨基酸序列(见例如SEQ ID NO38、SEQ IDNO39、SEQ ID NO40、SEQ ID NO41、SEQ ID NO42、SEQ ID NO43、SEQ ID NO44、SEQ ID NO45、SEQ ID NO46、SEQ ID NO47、SEQ IDNO48、SEQ ID NO49、SEQ ID NO50、SEQ ID NO51、SEQ ID NO52、SEQ ID NO53、SEQ ID NO54、SEQ ID NO55和SEQ ID NO56)。
在某些实施方案中，使用了基于密码子的合成以便产生突变的序列。基于密码子的合成的实例包括例如在美国专利5,264,563、5,523,388和5,808,022中描述的那些实例，所有专利此处引用作为参考。简而言之，基于密码子的合成可通过在分开的支持物上顺序连接单体进行，以形成至少两种不同的三联体。可在分开的反应容器内进行连接，然后将来自反应容器的支持物混合，并且将已混合的支持物分配至两个或多个分开的反应容器内，并且在所述反应容器内重复连接、混合及分配步骤一次或多次，以混合或分配步骤结束。此外，可从支持物上切下寡核苷酸。
VII.治疗性用途和制剂在一些实施方案中，本发明提供包含此处所述变体的治疗性制剂。本发明将不受限于治疗性组合物的特定性质。例如，此类组合物可包括与生理上可耐受液体、胶体、固体载体、稀释剂、佐剂和赋形剂及其组合一起提供(见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编.(1980)，此处引用作为参考)的多肽变体(或其部分)。
此外，多肽变体可与其他治疗剂共同使用，治疗剂包括但不限于水杨酸、类固醇、免疫抑制剂、抗体或抗生素。可与本发明的变体共同使用的特定治疗剂包括但不限于下列治疗剂偶氮苯化合物(美国专利号4,312,806，此处引用作为参考)、苄基取代的罗丹明衍生物(美国专利号5,216,002，此处引用作为参考)、L-肌肽锌(美国专利号5,238,931，此处引用作为参考)、3-苯基-5-羧基吡唑和异噻唑(美国专利号5,294,630，此处引用作为参考)、IL-10(美国专利号5,368,854，此处引用作为参考)、喹啉白三烯合成抑制物(美国专利号5,391,555，此处引用作为参考)、2’-卤代-2，脱氧腺苷(美国专利号5,506,213，此处引用作为参考)、酚和苯甲酰胺化合物(美国专利号5,552,439，此处引用作为参考)、甘油三丁酸酯(美国专利号5,569,680，此处引用作为参考)、某些肽(美国专利号5,756,449，此处引用作为参考)、Ω-3多不饱和酸(美国专利号5,792,795，此处引用作为参考)、VLA-4封阻剂(美国专利号5,932,214，此处引用作为参考)、脱氢皮质醇金属硫代苯甲酸酯(美国专利号5,834,021，此处引用作为参考)、细胞因子抑制剂(美国专利号5,888,969，此处引用作为参考)和烟碱(美国专利号5,889,028，此处引用作为参考)。
多肽变体可与降低细胞活性或增殖能力的制剂共同使用。降低细胞活性或增值潜力的制剂可以多种方式起作用，包括例如抑制DNA合成、抑制细胞分裂、诱导细胞凋亡或诱导非凋亡性细胞死亡。细胞毒剂和细胞生长抑制剂的特定实例包括但不限于美洲商陆抗病毒蛋白、相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白和这三种蛋白的A链；阿霉素、顺铂、碘-131、钇-90、铼-188、铋-212、紫杉醇、5-氟尿嘧啶VP-16、博来霉素、氨甲蝶呤、长春地辛、羟基柔红霉素、长春新碱、长春碱、BCNU、丝裂霉素和环磷酰胺以及某些细胞因子如TNF-α和TNF-β。因此，细胞毒剂或细胞生长抑制剂可包括如放射性核素、化学治疗药物、蛋白质和凝集素。
治疗性组合物可含有例如通常所用的添加剂，如粘合剂、填充剂、载体、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂和赋形剂，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物一般含有1％-95％的活性组分，优选2％-70％的活性组分。
本发明的多肽变体还可以与兼容的和可生理耐受的稀释剂或赋形剂混合。合适的稀释剂和赋形剂例如水、盐水、葡萄糖、甘油等或其组合。此外，如果需要，组合物可含有少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、稳定剂或pH缓冲剂。
在一些实施方案中，将本发明的治疗性组合物制备成液体溶液或混悬液、喷雾剂或固体形式。口服制剂通常包括通常所用的添加剂，如粘合剂、填充剂、载体、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂和赋形剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物通常采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂的形式，并且一般含有1％-95％的活性组分，优选2％-70％的活性组分。一个用于递送本发明治疗性组合物的口服组合物的实例描述于美国专利号5,643,602中(此处引用作为参考)。
另一些适合其它施用方式(如局部施用)的制剂包括油膏剂、酊剂、乳膏剂、洗剂、透皮贴剂和栓剂。对于油膏和乳膏剂，常用粘合剂、载体和赋形剂可包括例如聚二醇或甘油三酯。局部递送方法的一个实例描述于美国专利号5,834,016(此处引用作为参考)。还可使用其他的脂质体递送方法(见例如美国专利号5,851,548和5,711,964，两篇文献此处引用作为参考)。
制剂还可含有一种以上对于被治疗的特定适应症所需的活性化合物，优选那些具有彼此不妨害的互补性活性的化合物。此类分子以对于预期目的有效的量组合存在。
还可制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有多肽变体的固体疏水聚合物半透性基质，其中基质为成形的形式，如膜，或微胶囊。缓释基质的实例包括但不限于聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸酯共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮异瑞林组成的可注射微球)以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸可使分子释放超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质的时间段较短。
本发明的多肽变体可用于治疗受试者。此类治疗可向患有疾病的受试者施用，或者向受试者(例如易患疾病的受试者)预防性施用。可治疗的实例包括但不限于癌(例如其中多肽变体结合HER2受体、CD20或血管内皮生长因子(VEGF))；过敏性疾病如哮喘(用抗IgE抗体)和LFA-1-介导性疾病(例如其中多肽变体是抗LFA-1或抗ICAM-1抗体)等。
在优选的实施方案中，用于治疗受试者的变体包含抗体或免疫粘附素。而且在优选的实施方案中，所治疗的疾病是抗体或免疫粘附素应答性疾病。抗体应答性疾病的实例包括疾病和医学状态，如淋巴瘤(证实可用抗CD20的抗体RITUXAN治疗)、传染病(证实可用针对呼吸道合胞体病毒F蛋白的抗体SYNAGIS治疗)、肾移植(证实抗IL-2受体的抗体ZENAPAX是有益的)、克隆病和类风湿关节炎(证实可用抗TNFα的抗体REMICADE治疗)、乳腺癌(证实可用抗HER2的抗体HERCEPTIN治疗)和结肠癌(证实可用抗17-1A的抗体EDRECOLOMAB抗体治疗)。
在一些实施方案中，将具有改善ADCC活性的多肽变体(例如P247L或I332K变体)用于治疗需要将组织或外来微生物破坏或消灭的疾病或病症。例如，变体可用于治疗癌；炎性疾病；感染(例如细菌性、病毒性、真菌性或酵母感染)和其他的需要去除组织的疾病(如甲状腺肿)。在其他实施方案中，多肽变体具有降低的ADCC活性(例如I332R或I332K变体)。此类变体可用于治疗这样的疾病或病症，即在疾病或病症中需要具备长半寿期的含有Fc区的多肽，但是多肽优选地不具有不良效应子功能。例如，含Fc区多肽可以是抗组织因子(TF)抗体；抗IgE抗体和抗整合素抗体(例如抗α4β7抗体)。此类含Fc区多肽的预期作用机制是阻断配体-受体结合对。此外，具有降低ADCC活性的含有Fc区多肽可以是激动剂抗体。
本发明的多肽变体可通过任何适宜方法施用，包括肠胃外、皮下、局部、腹膜内、肺内和鼻内和伤口内施用(例如用于局部免疫抑制治疗)。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。此外，多肽变体通过脉冲输注施用，尤其以递减的多肽变体剂量。优选地，通过注射给药，最优选地通过静脉内注射或皮下注射给药，这部分地取决于所述施用是短期的还是长期的。
对于预防或治疗疾病，多肽变体的适宜剂量将取决于待治疗疾病类型、疾病的严重性和病程、多肽变体是否为预防性或治疗性施用、先前治疗、患者临床史和对多肽变体的反应以及主治医师的判断。多肽变体在次治疗或一系列治疗中合适地施与患者。
例如，根据疾病类型和严重性，向患者施用的起始候选剂量为大约1μg/kg至15mg/kg(例如0.120mg/kg)的多肽变体，无论是一次或多次分别施用还是持续输注施用。一般日剂量范围从大约1μg/kg至100mg/kg或者更高，这取决于以上提及的因素。对于经过数日或更长时间的反复施用，取决于所述的疾病状况治疗将持续直至症状明显减弱或消失。该治疗的过程通过常规技术和测定法可容易地监测，并且可用于调整剂量以实现治疗效果。
待施用多肽变体的有效治疗量是为了减弱被治疗疾病症状患者所需要的剂量水平。多肽变体不必、但任选地可与一种或多种目前用于预防或治疗所述疾病的药剂一起配制成制剂。此类其他药剂的有效量取决于制剂中多肽变体的量、疾病或治疗类型以及上述其他的因素。
VIII.变体Fc区的额外用途本发明的变体、编码变体的核酸序列可以多种方式使用。例如，本发明的变体可用于药物筛选测定法。例如，可通过将变体与候选化合物接触并测定该候选化合物与变体的结合，来评估这些候选化合物改变或干扰Fc效应子功能的能力。所述变体可用本领域所知的方法固定化，如将GST-变体融合蛋白与含有谷胱苷肽的聚合物珠结合。通过编码目的变体的DNA和编码GST羧基末端的DNA的融合构建编码GST融合蛋白的嵌合基因(见例如Smith等，Gene 6731 )。然后将融合构建体转化至合适的表达系统内(例如大肠杆菌(E.coli)XA90)，在该表达系统中可用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导GST融合蛋白表达。IPTG的诱导产生作为可溶性细胞蛋白主要成分的融合蛋白。该融合蛋白可由本领域技术人员所知的方法纯化，包括通过谷胱苷肽亲和层析纯化。候选化合物与变体的结合与该化合物破坏一种或多种效应子功能的能力有关。
在另一筛选方法中，使用本领域所知方法固定变体或所选择的FcR，如吸附于塑料微量滴定板或GST-融合蛋白特异性结合含有谷胱苷肽的聚合物珠。例如，GST-变体结合到谷胱苷肽-琼脂糖珠上。固定化的变体随后与Fc受体和候选化合物接触。然后去除未结合的肽并且溶解和分析复合物以测定结合所标记肽的量。结合的降低表明候选化合物抑制变体与Fc受体的相互作用。这种筛选方法尤其用于本发明的具有提高的Fc受体结合水平的变体(例如由于许多母体Fc受体为低亲和性受体，如FcγRIII、FcγRIIb和FcγRIIa)。本方法的变例可用于筛选能破坏先前形成的变体/Fc受体复合物的化合物。例如，在一些实施方案中，如上所述，将包含结合了Fc受体的变体复合物固定化并且与候选化合物接触。该候选化合物对所述复合物的分解与该化合物破坏或抑制测试变体和测试受体间相互作用的能力相关。就此而言，可鉴定具有治疗功效(例如在人体中)的化合物(例如用于治疗人疾病如自身免疫疾病的化合物)。
用于药物筛选的另一技术可高通量地筛选对变体肽具有合适结合亲和性的化合物，其详细描述于WO 84/03564中，此处引用作为参考。简而言之，在固体底物(如塑料针或一些其他表面)上合成较大数量的不同的小肽测试化合物。然后这些肽测试化合物与变体肽反应并且洗涤。然后用本领域众所周知的方法检测已结合的变体肽。
另一项技术使用了针对变体肽的抗体。此类能够特异性结合变体肽的抗体同测试化合物竞争性结合特定受体。以这种方式，该抗体可用于检测与变体肽共有一个或多个抗原决定簇的任何肽的存在。
本发明考虑了筛选化合物的众多其它方法。仅描述以上提供的实例以说明大量技术是可以利用的。本领域的技术人员将理解，可使用许多其他筛选方法。
具体而言，本发明考虑了细胞系的用途，其中细胞系用编码至少一种Fc区变体的核酸转染，其用于筛选具有活性的化合物，并且具体而言是用于高通量地从组合文库(例如含有超过104种化合物的文库)中筛选化合物。本发明的细胞系可用于众多筛选方法。
本发明的变体可用作亲和纯化试剂。例如，可使用本领域众所周知的方法在固相上固定化变体，如在Sephadex树脂或滤纸上。随后将固定化的变体与含有待纯化抗原的样品接触，然后用适宜溶剂(基本上去除了样品中除已与固定化多肽变体结合的待纯化抗原以外的其他所有物质)洗涤。最后，用另一种合适溶剂如pH 5.0的甘氨酸缓冲液洗涤，该缓冲液将抗原从多肽变体中释放。
多肽变体还可用于诊断性测定法(例如用于检测特定细胞、组织或血清中目的抗原的表达)。对于诊断性应用，通常将变体用可检测部分标记(此类标记还可用于上述的Fc区测定法)。可利用众多的标记，其包括但不限于放射性同位素(例如35S、14C、125I、3H和131I)、荧光标记(例如稀土螯合物(铕螯合物)或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹酰、丽丝胺、藻红蛋百和德州红)以及多种酶-底物标记(见例如美国专利号4,275,149，此处引用作为参考，以及萤光素酶、萤光素、2，3-二氢2，3-二氮杂萘二酮(2，3-dihydrophthalazinediones)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳酸过氧化物酶、微过氧化物酶等)。酶-底物组合的实例包括例如(i)辣根过氧化物酶(HRPO)与作为底物的过氧化氢，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为生色底物的对硝基苯磷酸盐，以及(iii)-D-半乳糖苷酶(R-D-Gal)与生色底物或荧光底物。
本发明的变体还可用于体内诊断性测定法。例如，将变体用放射性核素标记以便可使用免疫闪烁照相法定位抗原或表达该抗原的细胞。
实施例提供如下实施例旨在说明或进一步图解说明本发明的某些优选的实施方案和方面，并且不得解释为限制其范围。
在后续的试验性公开中，使用如下缩写N(正常)；M(摩尔浓度)；mM(毫摩尔浓度)；μM(微摩尔浓度)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；pmol(皮摩尔)；g(克)；mg(毫克)；ug(微克)；ng(纳克)；l或L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；DS(硫酸葡聚糖)和C(摄氏度)。
实施例1在ADCC测定法中筛选变体本实施例描述如何在ADCC测定法中筛选变体。所筛选的全部变体为抗CD20抗体(基于可变区特异性)。
i.PBMC(外周血单核细胞)分离从健康供者取得大约50mL外周血并用pH 7.0的磷酸盐缓冲盐水(PBS)1∶2稀释。温和旋转试管混合该溶液。在已稀释的血液样品下小心铺一层大约12ml的Histopaque-1077(Sigma目录号No.1077-1)，随后用吊桶式转头在Sorvall RT6000B离心机内以1000转/分离心10分钟，同时关闭制动。将梯度的上层相抽吸弃去，收集白色的含有PBMC的中间相，用Hanks平衡盐溶液溶液(Gibco目录号No.14025-092)洗涤3次。将洗涤后的细胞沉淀在20mL含有10％胎牛血清(FBS)(Omega Scientific目录号FB-01)的RPMI 1640培养基中重悬。将重悬后的PBMC分置于两个T-175培养瓶内，并向每个培养瓶内添加30mL含有10％FBS的RPMI，随后在5％CO2培养箱内于37℃培养过夜。次日，将未粘附的PBMC收集至50mL Falcon管内，离心同上并且在含1％FBS的无酚红RPMI中重悬。将所重悬细胞的一小部分稀释10倍并且用血细胞计数器计数。将其余PBMC置于培养箱内直至需要。
ii.靶细胞系(对于抗CD20ADCC测定法特异的细胞)表达CD20的B-细胞系Wil.2和SKW6.4自ATCC获得并按推荐方式培养。在使用前一天，将细胞2分法分瓶。次日将细胞数调整至4×105细胞/mL并且将50μL等份(20,000细胞/孔)加入96孔组织培养板中。
iii.IgG稀释液在筛选前，表达IgG变体并用标准酶联免疫吸附测定法(ELISA)定量。对于初级单点ADCC筛选，将IgG变体在含1％FBS的无酚红RPMI培养基中稀释。测定法中IgG的终浓度按4倍方式稀释(即终浓度10ng/mL)。向靶细胞中加入50μl等份的IgG，并且在将效应细胞加入已调理的靶细胞之前于37℃温育大约15分钟。
当滴定IgG时，IgG浓度在大约0.0001至1μg/mL范围内变动。使用96孔微量滴定板，在含1％FBS的无酚红RPMI培养基中稀释样品制备IgG稀释液。随后向含有靶细胞的测定法平板中加入已稀释的IgG样品。
iv.效应细胞调整PBMC的浓度使效应细胞与靶细胞之比为10-20∶1(即2-4×106细胞/mL)。向每一个含有已调理靶细胞的孔内加入100μl重悬的PBMC。将平板在存在5％CO2的情况下于37℃温育3-4小时。
v.乳酸脱氢酶(LDH)释放的检测通过检测从受损细胞的细胞浆释放至培养上清液的乳酸脱氢酶来测定靶细胞裂解。在将调理的靶细胞与效应细胞温育后，将测定平板以2000转/分离心5分钟。将大约75lμL的细胞培养上清液小心去除并避开沉淀的细胞和残片。向微量滴定板中直接加入该上清液，并且向该上清液中加入75μL的LDH检测试剂(Roche目录号1 644 793)。然后将微量滴定板温育大约15-30分钟，并用Molecular Devices的Vmax动力学微孔滴定板读数仪读取490nm处的吸收度。
vi.数据分析所有单点ADCC筛选测定法一式二份进行。每个测定平板含有自发靶细胞裂解对照、在无IgG时自发的效应细胞和靶细胞裂解对照以及靶细胞全部裂解对照。向靶细胞中加入1％的Triton X-100实现靶细胞全部裂解。在每个测定平板中包含三个野生型对照并且将ADCC测定信号平均。从每个样品中减去从自发裂解对照中所获得的背景值。从每个样品中减去从稀释IgG得到的背景值。基于自发裂解对照和全部裂解对照，将所述数据从吸收度值转换为特异性裂解的百分数。特异性裂解的百分数用下式计算特异性裂解百分数＝(试验A490-背景A490)/(最大A490-背景A490)×100，其中背景A490是从无IgG时的效应细胞和靶细胞中所获得的A490加上因粗提的IgG上清液中存在的污染性LDH所致的IgG背景总和。将Fc变体活性的百分数相对于已平均的野生型对照进行归一化。将两个测定平板的归一化活性百分数加以平均，并且对每个样品计算各个测定平板间的标准差。
vii.结果相对ADCC比活性示于表2。如实施例4中所述，产生该表内所报道的CDC值，并且如实施例5中所述，产生该表中所报道的FcRn结合测定值。
表2

图7A显示了滴定IgG变体后所获得的代表性ADCC数据。在此实验中，用单氨基酸Fc区IgG变体和双氨基酸Fc区IgG变体调理SKW6.4细胞，随后以15∶1的比例加入PBMC。将测定平板在5％CO2存在情况下于37℃温育3小时，然后离心。收集部分上清液并转移至微量滴定板，通过加入等体积LDH底物测定上清液中的LDH活性。显色后，读取490nm处的吸收度。测量因粗提IgG上清液中存在的污染性LDH所致的背景，并且从原始A490中减去这些背景值，得到图7A中所示的数据。这些数据显示，与野生型抗CD20抗体相比，单氨基酸变体A330K、A330R和I332E的ADCC活性增强。而A330K或A330R与I332E的组合变体进一步改善了ADCC活性。非特异性IgG在这些测定条件下没有活性。其中糖基化被改变的类似测定法的结果示于图7B中。具体而言，7B(标记为GnTIII的样品)显示，I332变体的活性在糖基化作用改变后(例如通过提高等分性GlcNAc的含量)可进一步增强。
图8显示了使用纯化的IgG所获得的代表性ADCC数据。该图显示了细胞毒性百分数对非特异性IgG、野生型抗CD20以及Fc区变体I332D和I332E的IgG浓度。细胞毒性百分数基于下式计算％细胞毒性＝(试验A490-背景A490)/(最大A490-背景90)×100，其中背景A490从无IgG时的效应细胞和靶细胞中获得。该数据显示，I332D和I332E变体的活性较野生型增加。本实验中所用的靶细胞是SKW6.4，并且在标准3小时的ADCC测定法中使用15∶1的效应细胞与靶细胞比。
图9显示除了使用较低亲和性可变区以外(AME 6F1，而不是AME33)相同类型的ADCC活性。此图说明，用该特定抗CD20特异性以及Wil-2和SKW6.4细胞系的ADCC活性独立于可变区亲和性。
图10显示FcγRI受体结合。在HEK-293A细胞中表达人FcγRI受体(CD64)的细胞外部分，其中加入了C末端6-his标签以替代假定的跨膜结构域，并且使用Ni柱纯化。该受体在ELISA平板上4℃包被过夜，随后用Superblock封闭该平板。封闭和洗涤之后，制备IgG稀释液并且加入到至受体包被的平板中，随后于37℃温育2小时。未结合的IgG通过洗涤去除并且用1∶1000的抗人κ碱性磷酸酶缀合的二级抗体检测结合的抗体。洗涤后，通过加入磷酸酶底物(单磷酸酚酞)(PPMP)(JBL Scientific)检测结合的IgG，用VMAX微孔板读数仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)比色测定560nm处的吸收度。将数据以IgG浓度的对数值对吸收度作图。
实施例2在全血测定法中筛选损耗B细胞的变体本实施例描述了在全血测定法中筛选损耗B细胞的变体。
i.FcγRIIA基因分型用QiaAmp试剂盒(Qiagen，目录号51104)从外周血液样品中分离基因组DNA。通过使用引物(5’GGAAAATCCCAGAAATTCTCGC 3’-SEQ ID NO61)和(5’CAACAGCCTGACTACCTATTACGCGGG 3’-SEQ ID NO62)的PCR扩增FcγRIIA。PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28006)纯化并用限制性酶BstUI于60℃消化12小时。已消化的样品在3％琼脂糖凝胶上分析。所有PCR产物在不依赖于H或R基因型的一个内部BstUI位点被切割。拥有R等位基因的产物在额外一个BstUI位点处被切割。结果为出现一个337bp的片段则鉴定为H/H，出现337bp和316bp的两个片段则鉴定为H/R且出现一个316bp的片段则鉴定为R/R。
ii.FcγRIIIA基因分型用QiaAmp试剂盒(Qiagen，目录号51104)从外周血液样品中分离基因组DNA。通过使用引物(5’ATATTTACAGAATGGCA3’-SEQIDNO63)和(5’GGTGATGTTCACAGTCTCTGAAGACACATTTTTACTGTCAA3’-SEQ ID NO64)的PCR扩增FcγRIIIA。PCR产物用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen，目录号28006)纯化，并以限制性酶HincII于37℃消化16小时。已消化的样品在3％的NuSieve琼脂糖凝胶上分析。HincII切割V等位基因，但不切割F等位基因。因此F/F产生一个148bp的片段，F/V产生148、109和39bp的三个片段，而V/V产生109和39bp的两个片段。
iii.B细胞损耗测定法(使用全血)从健康志愿者中抽取已肝素化的外周血。将血液与用FACS缓冲液(磷酸缓冲盐水+2％胎牛血清)稀释的变体、Rituxan或非特异性IgG(阴性对照)混合。将管于37℃温育4小时，随后以荧光素-抗CD45(鉴定白细胞)(BD，目录号555482)和藻红蛋血-抗CD19(鉴定B细胞)(BD，目录号555413)室温染色30分钟。通过加入BD PharmLyse(BD，目录号555899)裂解红细胞，使用用于Becton Dickinson FACSort流式细胞仪的FACS缓冲液洗涤并重悬样品。邻近分析前，向样品中添加终浓度为的0.1μg/ml碘化丙锭(PI)，以区分活细胞和死细胞。对照包含已与FACS缓冲液单独温育的细胞、未染色的样品、单一染色的样品。每种样品重复三次并且收集10,000个落入淋巴细胞前向/侧向散射(FSC/SSC)门内的PI-阴性事件。用WinMDI软件分析数据。为了分析，基于CD45阳性染色、PI阴性和FSC/SSC特征鉴定活淋巴细胞。在每个样品中，鉴定具有这些特征的CD19+细胞的百分数。将数据表示为CD19+细胞百分数平均值加/减1个标准差。备选地，为了便于在供者间比较，将数据表示为剩余的起始CD19+细胞的百分数，即(处理后剩余的CD19+淋巴细胞的百分数)/(在FACS缓冲液处理后样品中的CD19+淋巴细胞的百分数)×100％。
图12显示代表性B细胞损耗数据，表明I332E变体在含有W(高亲和性)基因型的FcγRIIIa受体的全血样品中较Rituxan更有力地并且更大程度地损耗B细胞。
图13显示代表性B细胞损耗数据，表明I332E变体在含有FF(低亲和性)基因型的FcγRIIIa受体的全血样品中较Rituxan更有力地并且更大程度地损耗B细胞。当用表现为受体VF(杂合)基因型FcγRIIIa受体或HH、HR或RR基因型FcγRIIa受体的全血实施该测定时，获得了类似结果(表3)。
表3.在最大损耗时剩余B细胞的百分数


图14显示代表性B细胞损耗数据，表明与在体外ADCC和CDC测定法中具有相等或更强活性的变体相比，A378D变体出乎意料地更有力且更大程度地损耗B细胞。
实施例3变体的亲和性测定本实施例描述如何测定FcγRIIIa(FF基因型)与野生型或者母体Fc以及变体I332E之间相互作用的亲和性(Kd)。
i.FcγRIIIa/IgG Kd分析在293细胞中表达人FcγRIIIa(158F)可溶性细胞外结构域并通过Ni-NTA树脂(结合在其中所设计的6-组氨酸标签)纯化。
在pH 9.3碳酸氢钠缓冲液中将一管Azlactone珠(Sapidyne)与1mg的FcγRIII(158F)偶联。该浆液于4℃翻动过夜，用PBS洗涤两遍，并且用封闭缓冲液(1M Tris pH 7.4+1％BSA)室温封闭1小时。随后将该珠用PBS洗涤三次并且在50ml含0.01％叠氮化物的PBS中重悬。在运行缓冲液(PBS pH 7.4，0.1％BSA，0.01％叠氮化物)中制备均含有7.5nMIgG和滴定为4μM至1.95nM的FcγRIII的12个平衡物并且在室温平衡16小时。所有实验均在室温的运行缓冲液中进行，流速0.5ml/分。在装置的流动室中装填FcγRIII珠后，从第一个平衡物中捕获游离IgG。然后洗涤所述珠子并且用山羊抗人Fc(Fab’)2-FITC缀合物(JacksonImmunochemicals)检测所结合的IgG。随后对剩余11个平衡物重复实施该过程并且用Kinexa Pro软件分析测定Kd。利用这种方法，所测定的FcγRIIIa(FF基因型)与野生型或母体Fc间相互作用的亲和性为387nM，而与变体I332E的亲和性是52nM。糖化设计的抗体(GnTIII)的Kd是83nM，而组合变体(L256P、I332E)的Kd为21nM。
实施例4变体CDC活性的表征本实施例描述如何测定多种Fc区变体的CDC活性。
i.测定法本测定法使用人补体(Quidel Corp.，目录号A113)在Ramos(RA#1)细胞(ATCC目录号CRL-1596)上实施。Ramos细胞在37℃和5％CO2条件下于含有10％FBS的Gibco RPMl1640培养基中培养。分析前一天，将细胞以1×106个细胞接种于T175瓶。次日，将细胞在含有1％FBS的无酚红RPMI1640中重悬至3.57×105细胞/ml。向Costar 3917平底培养板内每孔中加入70μl的细胞。对于滴定曲线，在RPMI1640培养基中进行3倍系列稀释来准备变体IgG。对于单点文库筛选测定法，将培养物上清液内瞬时表达的IgG变体在模仿培养基中标准化至1μg/ml。向靶细胞添加30微升变体IgG(即终浓度200ng/ml)和以1∶5稀释于RPMI1640+1％FBS中的50μl人补体(Quidel Corp.，目录号A113)，并且用移管温和吹吸充分混合。将该平板在5％CO2存在下于37℃温育1.5小时。加入15μl/孔Alamar蓝(Serotec，目录号BUF012B)后，继续温育过夜。次日早晨，用PerkinElmer的EnVision 2100多重标记读数仪以560nm激发光和590nm发射光测量荧光信号。
ii.数据分析所有的单点测定法重复两次实施。每个测定培养板含有无IgG时由人补体所致的自发靶细胞裂解对照和存在1％Triton X-100时靶细胞的最大裂解对照。每个测定培养板内包含三个野生型对照，并且将CDC测定信号平均。从每个样品中减去从自发裂解对照所获得的背景值。基于自发裂解对照和最大裂解对照，将数据从荧光信号转化为特异性裂解百分数。从下式计算特异性裂解百分数特异性裂解百分数＝(试验荧光信号-自发信号)/(最大裂解信号-天然信号)×100。随后计算Fc变体超过三个野生型对照平均值的活性百分数。将两次测定培养板中的超过野生型的百分活性加以平均并且计算各个测定培养板之间的标准差。
图11A、B和C显示在IgG变体滴定后所获得的代表性CDC数据。在本实验中，用单一氨基酸Fc区IgG变体或双氨基酸Fc区IgG变体和人补体裂解Romas细胞。将测定培养板在5％CO2存在下于37℃温育1.5小时，随后加入15μl Alamar蓝并温育过夜。测量荧光信号并且对IgG浓度作图。这些数据显示，与野生型抗CD20抗体相比，CDC活性在单氨基酸变体I332D、I332E(图11A)的情况下稍稍增强，并且在T256P和S440Y(图11B)以及T256P和I332E组合(图11C)的情况下显著增强。在变体A378D的情况下CDC活性减弱(图11C和表2)。
实施例5对FcRn结合的表征本实施例描述用于Fc新生儿受体(FcRn)结合变体IgG的测定法。于4℃下，用溶于50mM碳酸盐缓冲液(pH 9.3)中的2μg/ml中性链亲和素(Pierce Biotechnology，目录号31000)以每孔50μl将U形底96孔ELISA平板包被过夜。移去未结合的中性链亲和素并且用PBST(含有0.1％Tween 20的PBS)洗涤平板三次。向每孔中加入50μl的2.5μg/ml(溶于PBS)的生物素标记的可溶性FcRn并且室温温育1小时。随后向平板中加入75μl酪蛋白封闭缓冲液(Pierce Biotechnology，目录号37528)封闭1小时。随后用PBST洗涤ELISA板并且与50μl/孔的变体IgG温育。对于滴定曲线，在FcRn结合缓冲液(不同pH(从6.0至7.4)的100mMNaPO4，0.05％Tween-20)中3倍系列稀释准备变体IgG。对于单点筛选，将培养物上清液中瞬时表达的变体IgG归一化至50ng/ml(对于pH 7.4结合为200ng/ml)并用FcRn结合缓冲液调整pH至6.0。在以下步骤中，使用相应pH的FcRn结合缓冲液洗涤平板和稀释试剂。室温进行结合反应1小时。三次洗涤之后，用山羊(Fab’)2抗人-Fab-HRP缀合物检测已结合的IgG 1小时。HRP活性在Pierce的HRP底物(TurboTMB-ELISA，目录号34022)中显色5-30分钟。加入50μl的2M H2SO4终止反应并且用VMAX微量滴定板读数仪(Molecular Devices)读取450nm处的吸收度。
实施例6抗CD20-I332E Fc变体的人体治疗体外研究和鼠肿瘤模型(Clynes RA，等Nat Med.6443(2000))提供了ADCC在抗CD20抗体(如RITUXAN)的抗肿瘤效应中起作用的证据。可用抗CD20-I332E Fc变体抗体(图15和16)或RITUXAN以与Cartron等，Blood 99754(2002)(此处引用作为参考)中所公开类似的方式治疗人类患者。例如，表现为Ann-Arbor分类中第II至IV期疾病的患者(具有至少一个可测量的疾病位点，并且根据GELF标准具有低的肿瘤负荷)可通过静脉内输注(第1、8、15和22天)总共4次大约375mg/m2剂量的抗CD20-I332E Fc变体或RITUXAN来治疗。主要的功效终点是目标反应率，即根据最近由国际专家委员会提出的标准，实现完全缓解(CR)、未证实的CR(Cru)或部分反应(PR)的患者比例。临床反应可在第2个月(M2)进行评估。还可在一年时(M12)在患者中评估进程。
可将RITUXAN或抗CD20-I332E治疗的患者在M2和M12时的目标反应率进行比较，以致于可定量由I332E变体所提供的改善的ADCC活性。该实施例可用其他抗CD20变体(例如I332D、P247L A330K、A339T、A378D或如表1中所示组合)重复。
另外，变体的增强功效允许进行不同途径施用、较低频率注射和/或较小剂量施用。
将以上说明书中所提到的全部出版物和专利在此处引用作为参考。对于本领域技术人员而言显而易见，本发明中所述方法和系统的多种修改和变化并未脱离本发明的范围和构思。虽然本发明已经通过特定优选的实施方案得以描述，应当理解如所要求的本发明不应当过分地受限于此类特定的实施方案。实际上，为实施本发明对已描述模式的多种修改(其对化学、分子生物学或相关领域技术人员显而易见的)将处于如下的权利要求范围内。
序列表序列表<110>应用分子进化公司(Applied Molecular Evolution)<120>Fc区变体<130>X-16757<150>60/535,764<151>2004-01-12<160>56<170>PatentIn版本3.3<210>1<211>218<212>PRT<213>人<400>1Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro1 5 10 15Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys20 25 30Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp35 40 45Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu50 55 60Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu65 70 75 80His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn85 90 95Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly100 105 110Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu115 120 125Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr130 135 140
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn145 150 155 160Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe165 170 175Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn180 185 190Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr195 200 205Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys210 215<210>2<211>217<212>PRT<213>人<400>2Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys1 5 10 15Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val20 25 30Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr35 40 45Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu50 55 60Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His65 70 75 80Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys85 90 95Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln100 105 110Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met115 120 125
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20 25 30Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp35 40 45Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg50 55 60Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser His Leu Pro Ile Gln65 70 75 80His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn85 90 95Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly100 105 110Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Gln115 120 125Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe Asn130 135 140Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu Glu145 150 155 160Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe165 170 175Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr Asp180 185 190Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu195 200 205Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys210 215<210>8<211>218<212>PRT<213>鼠<400>8
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1 5 10 15Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys20 25<210>20<211>29<212>PRT<213>人<400>20Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp1 5 10 15Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys20 25<210>21<211>29<212>PRT<213>人<400>21Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp1 5 10 15Tyr Val Ala Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys20 25<210>22<211>29<212>PRT<213>人<400>22Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp1 5 10 15Tyr Val Lys Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys20 25<210>23<211>30<212>PRT<213>人<400>23
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权利要求
1.一种包含母体人Fc区变体或其部分的抗体，其中与母体Fc区相比，变体包含至少一处氨基酸替代，并且其中氨基酸替代位于对应于选自如下的人Fc序列的位置247、251、256、268、280、330、332、339、378和440。
2.权利要求1所述的抗体，其中替代选自247L、247H、247I、251F、256M、256P、258E、268D、280A、280K、330K、330R、332E、332D、332K、332R、339T、378D和440Y。
3.权利要求1所述的抗体，其中在变体Fc区内的至少一处氨基酸替代位于对应于人Fc序列的332位置。
4.权利要求3所述的抗体，其中替代选自332E、332D、332K和332R。
5.权利要求1所述的抗体，其中在变体Fc区内的至少一处氨基酸替代是378D。
6.权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中在效应细胞存在时，包含母体Fc区变体的抗体比包含母体Fc区的抗体更有效地介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。
7.权利要求6所述的抗体，其中在同一测定法中，当包含母体Fc区的抗体表现为100的相对ADCC比活性时，包含变体Fc区的抗体表现出大于100的相对ADCC比活性值。
8.权利要求6所述的抗体，其中在同一测定法中，当包含母体Fc区的抗体表现为100的相对ADCC比活性时，包含变体Fc区的抗体表现出小于100的相对ADCC比活性值。
9.权利要求1-5中任一项所述的抗体，其中包含母体Fc区变体的抗体比包含母体Fc区的抗体更有效地介导补体依赖性细胞毒作用(CDC)。
10.权利要求9所述的抗体，其中在同一测定法中，当包含母体Fc区的抗体显示为100的相对CDC比活性时，包含母体Fc区变体的抗体表现出大于100的相对CDC比活性值。
11.权利要求9所述的抗体，其中在同一测定法中，当包含母体Fc区的抗体表现为100的相对CDC比活性时，包含母体Fc区变体的抗体表现出小于100的相对CDC比活性值。
12.权利要求1-11中任一项所述的抗体，其中母体Fc区是选自IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的一类。
13.权利要求1-12中任一项所述的抗体，其中母体Fc区是选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的一个亚类。
14.权利要求1-13中任一项所述的抗体，其中抗体是单克隆抗体。
15.权利要求14所述的单克隆抗体，其中单克隆抗体包含两条相同的重链多肽和两条相同的轻链多肽。
16.权利要求1-15中任一项所述的抗体，其中抗体与人CD20特异性结合。
17.一种单克隆抗体，其中单克隆抗体包含轻链多肽，并且其中轻链多肽包含具有SEQ ID NO57中所示序列的多肽。
18.权利要求17所述的单克隆抗体，其还包含重链多肽，其中重链多肽包含具有SEQ ID NO58中所示序列的多肽。
19.包含权利要求1-18中任一项所述抗体的药物组合物。
全文摘要
本发明提供多肽Fc区变体和编码Fc区变体的寡核苷酸。具体而言，本发明提供包含新Fc区变体的组合物、鉴定有用Fc区变体的方法以及应用Fc区变体治疗疾病的方法。
文档编号A61K39/395GK1918178SQ200580004924
公开日2007年2月21日 申请日期2005年1月10日 优先权日2004年1月12日
发明者B·W·艾伦, D·M·马奎斯, Y·唐, J·D·沃特金斯 申请人:应用分子进化公司