治疗狗的关节炎状况的方法

专利名称：：治疗狗的关节炎状况的方法
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：骨关节炎(OA)是特征在于疼痛、软骨损失和关节强直的退化性关节疾病。它是影响所有年龄的狗的常见疾病，然在老年动物中最普遍。它可以是原发疾病，即一般的磨损和撕裂的结果，或者是继发性疾病，即损伤、感染、不愈合的骨折或发育异常的结果。髋关节发育疾病是狗的发育疾病，其中股骨头和髋臼之间的畸形产生了关节不稳定性，使得股骨头过度运动。这是狗中的常见状况，特别是在大的品种中。确切的原因还不知道，但有遗传因素。尽管该疾病可能是遗传的，但缺陷的表达很大程度收到诸如营养、生长速度、肥胖和运动的因素的影响。最初，观察到髋关节发育不良表现为关节紧密程度丧失，使得股骨头围绕髋臼球的运动过度。在肢体中，关节半脱臼。随着时间，这些异常的关节相互作用产生了覆盖相对骨末端的关节软骨的损伤和侵蚀。存在关节的疼痛、关节肿胀、关节间隙变窄、骨质象牙化(骨上的骨关节)和结构改变，包括髋臼变浅、股骨头重塑和骨赘发生。可以通过使用非甾体类抗炎药以不同的效力控制与该疾病相关的疼痛。用镇痛剂可以获得更强的疼痛缓解。但是，这些治疗纯粹是缓解性的，不能防止骨关节炎的进展。最终，必须考虑手术去除股骨头或完全的髋关节置换，作为有效缓解疼痛的唯一治疗。交叉韧带的断裂或损害通常是由于运动中后腿膝关节的突然旋转或过度伸展而发生的。这通常涉及前交叉韧带，并且可能是非常疼痛的，并且涉及对关节的其它损伤。如果韧带断裂，其导致的关节不稳定通常导致退化性关节改变，包括关节增厚、半月板软骨退化、关节间隙变窄和关节周围骨赘形成。如果诊断出交叉韧带断裂，则需要进行稳定关节的手术。在不进行手术或手术不成功的狗中，容易发生慢性关节不稳定，导致骨关节炎的发生。用于治疗髋关节发育不良的镇痛剂的选择适用于患有累及后腿膝关节的骨关节炎的狗。镇痛剂缓解不适，但不治疗原发病症。发明概述本发明涉及引发对犬科动物中的关节炎状况的疾病缓解作用的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明也涉及引发对犬科动物髋关节发育不良或后腿膝关节不稳定、与髋关节发育不良相关的疼痛、关节肿胀、髋臼变浅、软骨下骨硬化的疾病缓解作用、预防犬科动物中骨赘形成和预防关节破坏的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。发明详述本发明涉及引发对犬科动物中关节炎状况的疾病缓解作用的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及治疗犬科动物中与十字韧带破坏相关的髋关节发育不良或后腿膝关节不稳定导致的骨关节炎的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及治疗与犬科动物中髋关节发育不良或后腿膝关节不稳定相关的疼痛的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及减少犬科动物中关节肿胀的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及预防犬科动物中髋臼变浅的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及预防犬科动物中骨赘形成的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及治疗犬科动物中软骨下骨硬化的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及预防犬科动物中关节恶化的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明涉及引发对犬科动物中关节炎状况的疾病缓解作用的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸和治疗有效量的非甾体类抗炎药。本发明进一步涉及包含双膦酸和非甾体类抗炎药的药物组合物。″双膦酸(bisphosphonate)″包括但不限于以下化学式的化合物其中n是0-7的整数，并且其中A和X独立地选自H、0H、卤素、NH2、SH、苯基、C1-C30烷基、C3-C30带有支链的烷基或环烷基、含有两个或三个N的双环结构、C1-C30取代的烷基、C1-C10烷基取代的NH2、C3-C10带有支链的烷基或环烷基取代的NH2、C1-C10二烷基取代的NH2、C1-C10烷氧基、C1-C10烷硫基、苯硫基、卤代苯硫基、C1-C10烷基取代的苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯烷基、咪唑基、咪唑并吡啶基和苄基，使得当n是0时，A和X都不选自H或OH；或A和X与它们连接的碳原子一起形成C3-C10环。在前面的化学式中，烷基可以是直链的、带有支链的或环状的，前提是化学式选择了足够的原子。C1-C30取代的烷基可以包括多种取代基，非限定性的实例包括选自以下基团的那些苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯烷基、咪唑基、NH2、C1-C10烷基或二烷基取代的NH2、OH、SH和C1-C10烷氧基。前述化学式也意欲包括复杂的碳环、芳族和杂原子结构用于A和/或X取代基，其非限定性实例包括萘基、喹琳基、异喹琳基、金刚烷基和氯苯硫基。此处也可以使用双膦酸的可药用盐和衍生物。盐的非限定性实例包括选自下组的那些碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和一、二、三或四C1-C30烷基取代的铵盐。优选的盐是选自下组的那些钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铵盐。更优选的是钠盐。衍生物的非限定性实例包括选自酯、水合物和酰胺的那些。应当指出的是，此处用到的涉及本发明的治疗剂的术语“双膦酸”也包括二膦酸盐/酯、双膦酸和二膦酸，以及这些物质的盐和衍生物。涉及双膦酸的特定命名的使用不意欲限制本发明的范围，除非特别指出。由于本领域技术人员目前使用的混合的命名系统，对本发明中双膦酸化合物的特定重量或百分比是以酸活性重量为基础，除非特别指出相反的意思。例如，“以阿仑膦酸(alendronicacid)活性重量为基础，约5mg选自阿仑特罗(alendronate)、其可药用盐及其混合物的骨重吸收抑制性双膦酸”表示选择的双膦酸化合物的选择是基于5mg阿仑膦酸计算的。用于此处的双膦酸的非限定性实例包括以下这些阿仑特罗，其也称作阿仑膦酸、阿仑膦酸钠或三水合阿仑膦酸一钠、4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-双膦酸和三水合4-氨基-1-羟基亚丁基-1，1-双磷酸一钠，其描述于1990年5月1日授权的Kieczykowski等的美国专利4,922,007，1991年5月28日授权的Kieczykowski等的5,019,651；1996年4月23日授权的Dauer等的5,510,517；1997年7月15日授权的Dauer等的5,648,491，在此全文引入作为参考。1990年11月13日授权的Isomura等的美国专利4,970,335中描述的环庚基氨基亚甲基-1，1-双膦酸，即YM175，Yamanouchi(incadronate，以前称作cimadronate)，在此全文引入该文献作为参考。1，1-二氯亚甲基-1，1-双膦酸(clodronicacid)和二钠盐(clodronate，ProcterandGamble)描述于比利时专利672,205(1966)和J.Org.Chem32，4111(1967)，在此全文引入这两篇文献作为参考。1-羟基-3-(1-吡咯烷基)-亚丙基-1，1-双膦酸(EB-1053)。1-羟基乙烷-1，1-双膦酸(etidronicacid)。1-羟基-3-(N-甲基-N-戊基氨基)亚丙基-1，1-双膦酸，也称作BM-210955，Boehringer-Mannheim(ibandronate)，描述于1990年5月22日授权的美国专利No.4,927,814，在此全文引入作为参考。1-羟基-2-咪唑并-(1，2-a)吡啶-3-基亚乙基(minodronate)。6-氨基-1-羟基亚己基-1，1-双膦酸(neridronate)。3-(二甲基氨基)-1-羟基亚丙基-1，1-双膦酸(olpadronate)。3-氨基-1-羟基亚丙基-1，1-双膦酸(pamidronate)。-1，1-双膦酸(piridronate)描述于美国专利4,761,406，在此全文引入作为参考。1-羟基-2-(3-吡啶基)-亚乙基-1，1-双膦酸(risedronate)。描述于1989年10月24日授权的Breliere等的美国专利4,876,248中的(4-氯苯基)硫甲烷-1，1-双膦酸(tiludronate)。1-羟基-2-(1H-咪唑-1-基)亚乙基-1，1-双膦酸(zoledronate)。双膦酸的非限定性实例包括阿仑特罗、cimadronate、clodronate、etidronate、ibandronate、incadronate、minodronate、neridronate、olpadronate、pamidronate、piridronate、risedronate、tiludronate和zolendronate，及其可药用盐和酯。特别优选的双膦酸是阿仑特罗，特别是阿仑膦酸的钠、钾、钙、镁或铵盐。示例的优选的双膦酸是阿仑膦酸的钠盐，特别是阿仑膦酸的水合钠盐。可以用整数摩尔的水或非整数摩尔的水对盐进行水合。优选的双膦酸的进一步的示倒是阿仑膦酸的水合钠盐，特别是水合盐是三水合阿仑膦酸一钠。公知的是可以使用两种或多种双膦酸的混合物。定义“关节炎状况”是指炎性病变限于关节的疾病，或指关节的任何炎性状况。“关节肿胀”是指关节外径的扩张，这是由于渗出到关节间隙或由于关节囊和周围结构的外部增厚。“髋臼变浅”是指髋臼形状的重塑，使得股骨头正常情况下相对的杯的深度变浅，杯形状变扁平。“关节间隙变窄”是指关节内组成关节的相对骨之间的距离明显减少。这是覆盖骨的关节表面的软骨厚度减少的的结果，该减少使得正常关节中骨彼此更接近。这里用到的“软骨下骨硬化”是指软骨下区域中骨密度和体积的增加。这里用到的“骨赘“是指位于关节边缘的新形成的骨性结构，它们的出现与骨关节炎进展的晚期强相关。目前的假设是骨赘由活化的骨膜产生，导致新的软骨向外正常，最终通过软骨内骨形成的过程变成骨。这里用到的“关节破坏”是指关节软骨的破坏。术语“疾病缓解作用”是指可以减缓、延迟或防止疾病进展的药剂。例如，在骨关节炎的情况下，疾病缓解作用可以包括减缓软骨的损失和防止骨赘形成。“非甾体类抗炎药(NSAID)”是指限制炎症形成的非甾体类治疗药物。NSAIDS的非限定性实例包括但不限于卡洛芬、依托度酸、布洛芬、酮洛芬、美洛昔康、萘普生和选择性环加氧酶-2抑制剂(COX-2抑制剂)。COX-2抑制剂的非限定性实例包括塞来昔布、deracoxib、etoricoxib、firocoxib、lumaricoxib、parecoxib、洛芬昔布和valdecoxib。此处用到的术语“组合物”意欲包括含有指定量的指定成分的产品，以及通过将指定量的指定成分进行组合而直接或间接得到的任何产品。此处用到的术语“治疗有效量”表示研究者、兽医、医生或其它临床人员采用的在组织、系统、动物或人类中引起生物或医学反应的活性化合物或药剂的量。此处用到的疾病的“治疗”包括预防疾病，即，在可能暴露于疾病或倾向于疾病，但还没有经历或表现出疾病症状的犬科动物中导致不发生疾病的临床症状；抑制疾病，即，使疾病的发展或其临床症状停滞或减少；或缓解疾病，即，使疾病或其临床症状消退。此处用到的术语“可药用盐”包括作为形成的无机或有机酸的本发明的化合物的常规无毒盐。例如，常规无毒盐包括衍生自无机酸，如盐酸、硼酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等的盐，和从有机酸，如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、唾液酸、对氨基苯磺酸、2-乙氧基-苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸、三氟乙酸等制备的盐。上述可药用盐和其它典型可药用盐的制备更全面描述于Bergetal.，″PharmaceuticalSalts，″J.Pharm.Sci.，1977661-19，在此全文引入作为参考。可以通过常规化学方法，从含有碱性或酸性部分的本发明的化合物合成本发明的化合物的可药用盐。通常，碱性化合物的盐是通过离子交换色谱或通过将游离碱与合适的溶剂或溶剂的多种组合中的化学当量或过量的所需成盐无机或有机酸反应而制备的。类似地，酸性化合物的盐是通过与合适的无机或有机碱反应而形成的。用途本发明的组合物和方法可以用于引发对关节炎状况的疾病缓解作用，特别是用于引发对犬科动物的骨关节炎和髋关节发育不良的疾病缓解作用，包括治疗与髋关节发育不良相关的疼痛、减少关节肿胀和防止髋臼变浅、软骨下骨重吸收、骨赘形成和最终关节恶化/破坏。本发明的方法在犬科动物中关节状况的治疗中具有出乎意料的疾病缓解作用。本发明的组合物可以以诸如片剂、胶囊(均包括持续释放或控释制剂)、丸剂、粉末、颗粒、酏剂、糊剂、酊剂、无菌溶液或悬浮液、糖浆、调味的咀嚼片(treats)和乳状液等口服剂型施用。同样，它也可以以静脉内(单次浓注或输注)、腹膜内、局部(如滴眼液)、鼻内、吸入、皮下、肌内或经皮(如贴剂)形式、计量的气溶胶或液体喷雾、滴、管形瓶、自动注射器装置或栓剂施用，均采用制药领域中的普通技术人员公知的形式。可以采用有效但无毒量的所需组合物。组合物用于口服施用、肠胃外施用、鼻内施用、舌下施用或直肠施用，或用于通过吸入或吹入施用。本发明的组合物的制剂可以方便地由本领域公知的方法实施，例如，如Remington′sPharmaceuticalSciences，17thed.，1995中所述。根据多种因素选择利用本发明的组合物的剂量方案，所述因素包括受试者的类型、物种、年龄、体重、性别和医学状况；要治疗的状况的严重程度；施用的途径；受试者的肾和肝功能；和使用的特定化合物及其盐。本领域的熟练兽医或临床医生可以容易地确定预防、抵消或停滞所述状况进展的有效量的药物并开出处方。有利地，可以通过每季度、每月、每周或每日给药一次施用本发明的化合物，或者可以以每日两次、三次或四次的分开的剂量施用全部的每日剂量。此外，可以通过局部使用合适的鼻内载体以鼻内形式施用本发明的化合物，或通过经皮途径，采用本领域技术人员公知的经皮皮肤贴剂的形式施用本发明的化合物。为了以经皮送递系统的形式施用，定量施用当然应该是连续的，而不是通过剂量方案进行的间断施用。施用可以是每日单次施用，或可以每日两次、三次或四次分开施用全部的每日剂量。此外，基于选择用于施用的各个化合物的特性，施用可以是较不频繁的，如每周、每两周或每月。当然，对于较不频繁的施用，单位剂量当然相应地较大。双膦酸的精确剂量将根据给药方案、选择的特定双膦酸的口服效能、犬科动物的年龄、体型、性别和状况、要治疗的病症的性质和严重程度，以及其它相关的医学和物理因素而改变。对于犬科动物，双膦酸的有效口服剂量通常是大约1.5-大约20,000μg/kg体重，优选是大约10-大约10,000μg/kg体重。在替代的施用方案中，可以以除每日以外的间隔施用双膦酸，例如，每周一次施用、每周两次施用、两周一次施用，和每月两次施用。在每周一次的施用方案中，三水合阿仑膦酸一钠的施用剂量是大约2.5mg/周-大约280mg/周。非限定性的剂量实例包括140mg/周和280mg/周。双膦酸也可以每月施用、每6个月施用、每年施用，或更不频繁地施用，参见WO01/97788(2001年12月27日公开)和WO01/89494(2001年11月29日公开)。根据本发明的进一步的方面，可能需要用双膦酸和适于治疗特定状况的一种或多种其它药理学活性剂的组合治疗任何前述状况。双膦酸和其它药理学活性剂可以是同时、序贯或组合施用于受试者。例如，本发明的化合物可以直接与其它活性剂组合使用，或它可以在施用其它活性剂之前、同时或之后施用。通常，用于所述组合的公知治疗剂的目前可获得的剂型是合适的。施用本发明的组合物并且实施本发明的方法，直到获得需要的疗效。能够在本发明中有用的双膦酸的鉴定可以由本领域公知的方法容易地确定，不需要过度的实验，如此处描述的测定。测定材料和方法骨关节炎模型和治疗-所有的程序都是根据默克研究实验室中的实验动物护理和使用委员会指导进行的。将95只20周龄的雄性Sprague-Dawley大鼠(Taconic，NJ)用于以下实验。在20周龄的雄性大鼠膝关节或7-10月龄的雄性NZ白兔中手术诱导骨关节炎(OA)模型。简言之，用异氟烷麻醉动物。给右膝关节去毛，用碘酊消毒，通过内侧髌骨麻痹方法暴露。将髌骨外侧脱位，将膝关节置于完全屈曲位。所有的手术程序都是用手术寸镜进行的。用微型剪刀切断前交叉韧带(ACL)。为了证实ACL的完全切断，进行Lachman检测。手术后，用无菌盐水溶液洗涤关节表面，用Vicryl4-0(Ethicon，Edinburgh，UK)，即一种可吸收的缝线和单丝4-0尼龙线(Ethicon，Edinburgh，UK)缝合关节囊和皮肤。在假手术中，在髌骨半脱位和盐水洗涤后逐层关闭伤口。将盐酸丁丙诺啡(0.1mg/kg)(Reckitt&ColmanProductsLtd.，Hull，England)作为镇痛剂.在具有软垫的塑料笼中使动物自由活动。通过皮下注射或口服给药而施用测试化合物。在预防模式中，在手术前给药于狗。在治疗模式中，在手术后1或2周给药。终点是组织学分析、组织形态测定和血清标志物评估。在所有研究中，动物总是包括以下组ACL切断和载体、ACLT和低和更高剂量的药物、假手术和载体，以及假手术和高剂量的药物。在手术后2周和10周用CO2处死动物。在两个时间点，在尸体解剖前3天给大鼠注射10mg/kg钙黄绿素。在一个独立的研究中，相同组的动物接受假手术或ACLT手术，并且给予或不给予药物治疗，用于TGF-β测定。这些动物在手术后2周处死。大体形态学、组织制备和组织学-在右膝关节切断术后，小心清洁股骨和胫骨，使其不带有肌肉，在溶于磷酸缓冲液(PBS)的4％低聚甲醛(FisherScientific，NJ)中固定24小时。通过具有1∶4Nikkor透镜(Nikon，Japan)的数码相机(DIX，Nikon，Japan)摄下远端股骨的大体外观，以便评估骨赘形成。然后用带锯(EXAKTTechnologies，Inc，Norderstedt，Germany)在关节表面的中心将胫骨切成额切面带有内侧副韧带的两半。将前部重新浸入4％的低聚甲醛另外24小时，用于石蜡包埋。后部改为浸入70％的乙醇，然后用甲基丙烯酸甲酯包埋。按照以前的描述用Masson′strichrome染料对5μm厚的切片进行染色，参见Gruber，H.E.，G.J.Marshall，L.M.Nolasco，M.E.Kirchen，andD.L.Rimoin，1988，″Alkalineandacidphosphatasedemonstrationinhumanboneandcartilageeffectsoffixationintervalandmethacrylateembedments，″StainTechnol.63299-306和Yamamoto，M.，J.E.Fisher，M.Gentile，J.G.Seedor，C.T.Leu，S.B.Rodan，andG.A.Rodan，1998，″Theintegrinligandechistatinpreventsbonelossinovariectomizedmiceandrats″Endocrinology.1391411-9。用随机分配的标示号标记各个标本，使研究者在后续的测量过程中不知道分组情况。为进行石蜡包埋，在0.5M乙二次氮基-四乙酸溶液(pH7.6，FisherScientific，NJ)中对组织脱钙7-10天，然后用分级的乙醇系列处理，随后用二甲苯处理，然后按照以前的描述在石蜡(FisherScientific，NJ)中包埋，参见Nakase，T.，K.Takaoka，K.Hirakawa，S.Hirota，T.Takemura，H.Onoue，K.Takebayashi，Y.Kitamura，andS.Nomura，1994，″Alterationsintheexpressionofosteonectin，osteopontinandosteocalcinmRNAsduringthedevelopmentofskeletaltissuesinvivo，″BoneMiner.26109-22和Hayami，T.，N.Endo，K.Tokunaga，H.Yamagiwa，H.Hatano，M.Uchida，andH.E.Takahashi，2000，″Spatiotemporalchangeofratcollagenase(MMP-13)mRNAexpressioninthedevelopmentoftheratfemoralneck，″JBoneMinerMetab.18185-93。对石蜡包埋的标本进行切片，通过组织学分析和免疫组织化学进行检验。用甲苯胺蓝-O(0.2％甲苯胺蓝-O/0.1M乙酸钠缓冲液，pH4.0)对石蜡切片进行染色，检测蛋白聚糖成分。有时也按照以前的描述用抗酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)染料对切片进行染色，以对破骨细胞进行定位，参见Nakamura，Y.，A.Yamaguchi，T.Ikeda，andS.Yoshiki，1991，″Acidphosphataseactivityisdetectedpreferentiallyintheosteoclasticlineagebypre-treatmentwithcyanuricchloride，″JHistochemCytochem.391415-20。组织病理学评分(改进的Mankin评分)-根据改进的Mankin评分系统进行半定量的组织病理学分级，该系统是OA研究中确立的分级系统，进行了一些修改，参见Cake，M.A.，R.A.Read，B.Guillou，andP.Ghosh，2000，″Modificationofarticularcartilageandsubchondralbonepathologyinanovinemeniscectomymodelofosteoarthritisbyavocadoandsoyaunsaponifiables(ASU)，″OsteoarthritisCartilage.8404-11；Little，C.，S.Smith，P.Ghosh，andC.Bellenger，1997，″Histomorphologicalandimmunohistochemicalevaluationofjointchangesinamodelofosteoarthritisinducedbylateralmeniscectomyinsheep，″JRheumatol.242199-209；Wenz，W.，S.J.Breusch，J.Graf，andU.Stratmann，2000，″Ultrastructuralfindingsafterintraarticularapplicationofhyaluronaninacaninemodelofarthropatby，″JOrthopRes.18604-12。Mankin评分通常由5个亚类组成，包括结构、软骨细胞数、软骨细胞簇集、蛋白聚糖成分(甲苯胺蓝-O的染色能力)和软骨下板和/或包括软骨中血管侵入的标志性改变。由于血管在软骨中的侵入是用Masson′strichrome染色独立评估的，我们在Mankin评分中省略了该类。在每个样品中测量了距离100μm的三个切片。总的可能的评分是26，采用盲法，根据5分标准(Cakeetal.2000)由单个观察者进行评分。总分低与微小的退化性软骨病变一致，而总分高表明更显著的软骨区。在甲苯胺蓝-O染色能力方面，我们使用了以前描述的术语(Little，etal.1997)，当甲苯胺蓝-O染色减少，具有完整的关节表面时是“轻度”，当甲苯胺蓝-O染色减少，并且表面纤维化和裂缝延伸到但不到中区下时是“中度”，当软骨向下损失到钙化软骨的水平时是“重度”。骨组织形态测定法-为了定量组织学参数，我们采用了ImageProplus(第4版，MediaCybernetics，MD)图像分析程序。用带有×4物镜的Olympus荧光显微镜(BX51，Japan)检验关节软骨和软骨下骨的图像，用CCD/RGB彩色摄像机(RTSliderSPOT，Diagnosticinstrument.Inc.，MI)记录。在每个膝关节两个距离100μm的独立切片中确定内侧和外侧胫骨坪的组织形态测定法测量值。由于报道软骨下区在OA发展中受影响，我们开发了宏观方法测量每个组织区域的软骨下骨体积。测量来自内侧或外侧胫骨坪的600μm深×800μm宽的两个区域，其中根据胫骨表面的宽度半自动化确定胫骨坪的中心。为了一致地放置要测量的区域，矩形的顶端总是沿着关节软骨的表面水平排列，其侧面沿着胫骨中线垂直排列。合并来自内侧或外侧胫骨坪的两个区域的数据，在每组中对每组6个膝关节的测量值求平均值。通过组织形态测定法测量软骨下区中的骨小粱体积(BV/TV骨内膜骨和骨样和矿化骨占据的骨髓腔的百分比)，该方法遵照命名法，并且根据ASBMR指南进行计算，参见Parfitt，A.M.，M.K.Drezner，F.H.Glorieux，J.A.Kanis，H.Malluche，P.J.Meunier，S.M.Ott，andR.R.Recker，1987，″Bonehistomorphometrystandardizationofnomenclature，symbols，andunits，″ReportoftheASBMRHistomorphometryNomenclatureCommittee.JBoneMinerRes.2595-610。为了检测软骨下区的活性骨重塑表面，我们也在尸体解剖前3天给大鼠注射钙黄绿素(10mg/kg)。塑料切片中的标记的矿化表面可以按照上文所述用相同的Olympus荧光显微镜进行观察。钙化软骨中的血管侵入-按照以前的描述，对钙化软骨接触软骨下骨髓腔的次数进行计数，从而对钙化软骨中的血管侵入进行定量，参见O′Connor，K.M.，1997，″Unweightingacceleratestidemarkadvancementinarticularcartilageatthekneejointofrats，″JBoneMinerRes.12580-9。测量间隔100μm的两个切片的结果。破骨细胞评分-在钙化软骨和骨赘区对TRAP阳性细胞进行计数。测量来自每个样品的间隔100μm的两个切片的TRAP阳性细胞数，然后取每组6个膝关节的平均数。骨赘评分和面积-骨赘定义为胫骨坪中关节边缘发生的骨和软骨的向外生长。为了评估骨赘形成的事件(骨赘评分)，评估了来自每个膝关节的间隔100μm的5个切片的总骨赘数，其中包括3个石蜡切片(胫骨的前部)和2个塑料切片(胫骨的后部)。用图像分析人工确定Masson′strichrome染色的切片中每个骨赘的表面积。评估了间隔100μm的两个切片。COMP、CTX-I和CTX-II的血清-和尿水平-在手术后2周和10周，从每次尸体解剖的心脏穿刺获得血液。收集血清样品，在-70℃以等分物冷冻。按照以前描述的改进的酶联免疫吸附测定，通过AnaMarMedicalAB(Uppsala，Sweden)确定血清软骨寡聚基质蛋白(COMP)，参见Larsson，E.，A.Mussener，D.Heinegard，L.Klareskog，andT.Saxne，1997，″Increasedserumlevelsofcartilageoligomericmatrixproteinandbonesialoproteininratswithcollagenarthritis，″BrJRheumatol.361258-61和Saxne，T.，andD.Heinegard，1992，″Cartilageoligomericmatrixproteinanovelmarkerofcartilageturnoverdetectableinsynovialfluidandblood，″BrJRheumatol.31583-91。所有测定都进行双份。在手术后2周从各个动物的代谢笼中收集24小时尿样。离心样品，在-70℃以等分物冷冻。根据制造商的说明书，在我们的实验室中进行来自I型胶原的C末端端肽的骨相关降解产物的测定(CTX-I/Ratlaps，NordicBioscienceDiagnostics，Denmark).由NordicBioscienceDiagnostics，Denmark进行II型胶原的软骨相关C末端端肽的测定(CTX-II/CartiLaps)。测量每个样品的尿肌酸酐作为正常尿排出的测试。在针对样品中的肌酸浓度进行标准化后，报道CTX-I和CTX-II值。免疫组化-在二甲苯中对组织切片进行脱石蜡，在分级乙醇中水合，然后用500U/ml睾丸透明质酸酶(Sigma，MO)在37℃处理20分钟。然后按照以前的描述用抗大鼠CD31mAb(Endogen，MA)或仅仅识别活性形式的TGF-β1、2和3的抗活化TGF-β(R&D)温育组织切片，参见Fernandez，T.，S.Amoroso，S.Sharpe，G.M.Jones，V.Bliskovski，A.Kovalchuk，L.M.Wakefield，S.J.Kim，M.Potter，andJ.J.Letterio，2002，″Disruptionoftransforminggrowthfactorbetasignalingbyanovelligand-dependentmechanism，″JExpMed.1951247-55，按照以前的描述用抗MMP-13Ab、抗MMP-9Ab在4℃温育过夜，参见Hayami，T.，H.Funaki，K.Yaoeda，K.Mitui，H.Yamagiwa，K.Tokunaga，H.Hatano，J.Kondo，Y.Hiraki，T.Yamamoto，L.T.Duong，andN.Endo，2003，″Expressionofthecartilage-derivedanti-angiogenicfactorChondromodulin-Idecreasesintheearlystageofexperimentalosteoarthritis，″J.Rheumatol.(出版中)。在CD31免疫染色中，在含有0.3％Tween20的PBS中漂洗后，用生物素偶联的抗小鼠Ab(LSAB2试剂盒，Dako，CA)将其温育10分钟，然后用碱性磷酸酶偶联的链亲和素(Dako，CA)温育10分钟。用PBS漂洗这些切片，然后用fastred底物系统(Dako，CA)显色5分钟，用苏木精复染。按照以前的描述用MMP-9/MMP-13和TGF-βAbs进行双标记的免疫组化染色，参见Hayami，T.，H.Funaki，K.Yaoeda，K.Mitui，H.Yamagiwa，K.Tokunaga，H.Hatano，J.Kondo，Y.Hiraki，T.Yamamoto，L.T.Duong，andN.Endo，2003，″Expressionofthecartilage-derivedanti-angiogenicfactorChondromodulin-Idecreasesintheearlystageofexperimentalosteoarthritis，″J.Rheumatol.(出版中)。简言之，用TGF-βmAb温育组织切片，然后用AP偶联的抗小鼠Ab温育，用AP蓝(VectorLaboratories，CAUSA)显色为蓝色。用含有0.3％Tween20的PBS将其清洗两次，用抗MMP-9或MMP-13多克隆Ab温育，然后用HRP-抗兔Ab(DAKO，CA)温育，由0.5mg/ml四盐酸3，3′-二氨基联苯胺显色为棕色。作为阴性对照，在没有第一抗体的条件下，或使用小鼠mAbIgG代替第一抗体进行相同的程序。来自胫骨坪/髌骨器官培养物的上清液中TGF-β的貂肺上皮生长抑制测定-从采用或不采用药物治疗的ACLT或假手术关节分离髌骨和胫骨坪。对髌骨进行脱位和解剖后，小心除去胫骨的软组织。通过骨锯(BuehlerIsomet，IL)在距离关节表面480μm厚度的位置切下关节软骨和软骨下骨组织。将解剖的髌骨和胫骨坪转移到24孔培养皿，用0.1％BSAα-MEM清洗3次，然后在相同的培养基中37℃下在5％CO2中温育。收集温育12小时后的上清液，在-70℃下冷冻。按照以前的描述，通过貂肺上皮细胞生物测定测量活性TGF-β，参见Docagne，F.，N.Colloc′h，V.Bougueret，M.Page，J.Paput，M.Tripier，P.Dutartre，E.T.MacKenzie，A.Buisson，S.Komesli，andD.Vivien，2001，″Asolubletransforminggrowthfactor-beta(TGF-beta)typeIreceptormimicsTGF-betaresponses，″JBiolChem.27646243-50。简言之，将貂肺细胞(Mv1Lu，ATCC，MD)以10,000细胞/孔铺板于96孔CytoStar闪烁微量滴定板(Amersham，NJ)中的含有丙酮酸钠和非必须氨基酸的E-MEM，10％FBS中。24小时后，在α-MEM(1∶4)中将TGF-β稀释到终浓度，将50μl加入作为对照的双份孔中，然后加入条件培养基(50μl/孔)。20小时后，将[14C甲基]-胸苷加入每个孔，达到0.5μCi/ml的最终稀释度。4小时和24小时后对板进行计数。报道的数据来自24小时时间点。统计学分析-用Statview(SASInstituteInc.，NC)进行统计学比较。表1-3的所有数据表示为平均值±SD。结果表示为平均值±SEM。用单因素方差分析(ANOVA)评估组间差异的显著性，以分析跨治疗组的方差，用Fisber′s最小显著性差异分析(Fisher′sPLSD)比较治疗组平均值(除特别指明之处)。当P值＜0.05时，认为数值的差异是显著的。实施例以下实施例进一步描述和证明了本发明范围内的实施方案。实施例仅仅是为了说明目的而给出的，不解释为限制本发明，因为可以对其进行许多变化，而不离开本发明的精神和范围。药片组合物按照1994年10月25日授权的Bechard等的美国专利No.5,358,941的描述，用标准混合和成形技术制备药片，在此全文引入该文献作为参考。用以下相对重量的成分制备以活性阿仑膦酸为基础的含大约6.5mg三水合阿仑膦酸一钠的药片。得到的药片可以用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的犬科动物中与髋关节发育不良或交叉韧带破坏相关的骨关节炎，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的药片。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的药片如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的药片。非基于牛肉的咀嚼片(ChewableTreats)得到的咀嚼片用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的狗中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的咀嚼片。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的咀嚼片如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的咀嚼片。悬浮液得到的悬浮液用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的悬浮液。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的悬浮液如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的悬浮液。溶液得到的溶液用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的溶液。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的溶液如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的溶液。油膏得到的油膏用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的油膏。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的油膏如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的油膏。凝胶得到的凝胶用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的凝胶。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的凝胶如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的凝胶。糊剂得到的糊剂用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的糊剂。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的糊剂如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的糊剂。用于经皮送递的组合物得到的组合物用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的组合物。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的组合物如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的组合物。用于经皮送递的组合物(皮肤贴剂)得到的组合物用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的组合物。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的组合物如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的组合物。注射液(IV/IM，SC/IP)得到的注射液用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的注射液。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的注射液如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的注射液。得到的组合物用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的组合物。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的组合物如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的组合物。持续释放药片得到的药片用于根据本发明的方法施用，用于抑制有需要的哺乳动物中的骨关节炎病变，即，对其进行治疗或降低其风险。类似地，制备了包含阿仑膦酸活性重量基础上的其它相对重量的阿仑特罗的药片。也类似地制备了包含合适活性水平的其它双膦酸的药片如cimadronate、ibandronate、neridronate、olpandronate、risedronate、piridronate、pamidronate、zolendronate及其可药用盐。此外，类似地制备了包含双膦酸的组合的药片。除了上文举例说明的成分，在必要时，制剂也可以包含其它合适的缓冲剂、色素、分散剂、调味剂、稳定剂和防腐剂。权利要求1.治疗狗中由犬科动物中髋关节发育不良或交叉韧带破坏相关的关节不稳定导致的骨关节炎的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的双膦酸。2.权利要求1的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗、cimadronate、clodronate、etidronate、ibandronate、incadronate、minodronate、neridronate、olpadronate、pamidronate、piridronate、risedronate、tiludronate、zolendronate或其组合。3.权利要求2的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗或其可药用盐。4.治疗犬科动物中与骨关节炎相关的疼痛的方法，所述骨关节炎与髋关节发育不良或交叉韧带破坏相关，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的双膦酸。5.权利要求4的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗、cimadronate、ciodronate、etidronate、ibandronate、incadronate、minodronate、neridronate、olpadronate、pamidronate、piridronate、risedronate、tiludronate、zolendronate或其组合。6.权利要求5的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗或其可药用盐。7.减少犬科动物中关节肿胀的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的双膦酸。8.权利要求7的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗、cimadronate、clodronate、etidronate、ibandronate、incadronate、minodronate、neridronate、olpadronate、pamidronate、piridronate、risedronate、tiludronate、zolendronate或其组合。9.权利要求8的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗或其可药用盐。10.预防犬科动物的髋关节中髋臼变浅的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的双膦酸。11.权利要求10的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗、cimadronate、clodronate、etidronate、ibandronate、incadronate、minodronate、neridronate、olpadronate、pamidronate、piridronate、risedronate、tiludronate、zolendronate或其组合。12.权利要求11的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗或其可药用盐。13.防止犬科动物的髋关节或后腿膝关节中骨赘形成的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的双膦酸。14.权利要求13的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗、cimadronate、clodronate、etidronate、ibandronate、incadronate、minodronate、neridronate、olpadronate、pamidronate、piridronate、risedronate、tiludronate、zolendronate或其组合。15.权利要求14的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗或其可药用盐。16.治疗犬科动物中与髋关节发育不良或交叉韧带破坏相关的骨关节炎的方法，该方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的双膦酸和非甾体类抗炎剂。17.权利要求16的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗、cimadronate、clodronate、etidronate、ibandronate、incadronate、minodronate、neridronate、olpadronate、pamidronate、piridronate、risedronate、tiludronate、zolendronate或其组合；并且所述非甾体类抗炎剂是卡洛芬、依托度酸、布洛芬、酮洛芬、美洛昔康、萘普生、塞来昔布、deracoxib、etoricoxib、firocoxib、lumaricoxib、parecoxib、洛芬昔布或valdecoxib。18.权利要求17的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗或其可药用盐，并且所述非甾体类抗炎剂是洛芬昔布。19.权利要求17的方法，其中所述双膦酸是阿仑特罗或其可药用盐，并且所述非甾体类抗炎剂是firocoxib。全文摘要本发明涉及引发对犬科动物的髋关节或后腿膝关节中的关节炎状况的疾病缓解作用的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。本发明也涉及引发对犬科动物中髋关节发育不良或后腿膝关节不稳定、与髋关节发育不良或后腿膝关节不稳定相关的疼痛、关节肿胀、髋臼变浅、关节间隙变窄、软骨下骨硬化的疾病缓解作用、预防犬科动物中骨赘形成和预防关节破坏的方法，该方法包括给犬科动物施用治疗有效量的双膦酸。文档编号A61K31/185GK1964715SQ200580014490公开日2007年5月16日申请日期2005年5月3日优先权日2004年5月6日发明者D·汤森,P·汉森申请人:默克公司,默里尔有限公司