生产流感疫苗的方法

专利名称：生产流感疫苗的方法
技术领域：
本发明一般性地涉及一种工业规模的方法，其用于生产预防、诊断、免疫治疗或治疗目的用的流感病毒或者抗原。特别地，本发明提供一种了用于流感疫苗生产和更特别用于含有流感类型A和B的人疫苗生产的衍生自马-达氏犬肾(Madin-Darby Canine Kidney)(MDCK)的、基于细胞培养的方法。
背景技术：
传统上，通过在含胚的鸡蛋中生长疫苗病毒株来生产商用流感疫苗。从尿囊液中收集该病毒并进行加工来制造疫苗。但是，该方法的缺点是劳动密集且每个鸡蛋的产量低，这些因素在流行病发期间会存在严重的限制。因此需要克服含胚鸡蛋法的费用、时间和产量方面的缺点，大规模生产流感病毒疫苗。
一种上述方法的备选方法涉及使用细胞培养来生产流感病毒颗粒或者病毒蛋白。
据信用细胞培养物生产的流感疫苗比鸡蛋中生产的那些要更安全，并且不会诱导儿童和成人受到的对鸡蛋基疫苗的超敏性。由于据认为在细胞培养中病毒复制的忠实性优于在鸡蛋中，因此这样的疫苗赋予对更广谱的野生株的更好的保护作用，尤其是在老龄群体中(Katz，J.M.，等，J.Infect Diseases 160191，1989)。此外，在流行病发或者全国流行病发的时候，可以提供比因目前可能的鸡蛋供应限制更多的流感疫苗供应。
已经在许多组织培养系统中证实了流感A和B病毒的繁殖，这些系统包括切碎的鸡胚胎，人胚胎肺和肾，猴肾和牛胚胎肾。
特别地，尽管产量低，即不足以满足疫苗生产目的，犬肾细胞被建议用于生产流感病毒。
犬肾细胞最初在1958年由S.H.Madin和N.B.Darby得自表面正常的成年雌性Cocker Spaniel的肾(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，7th edition，p.21，1992)。MDCK细胞系于1964年保藏(No.CCL 34)在ATCC，并且被鉴定为容许包括水泡性口炎症、牛痘、柯萨奇病毒、呼肠孤病毒和腺病毒在内的几种病毒的复制。
流感病毒类型B的系列繁殖在1962年首先在MDCK细胞系中由Green得到证实(Science 13842，1962)。繁殖的证据是细胞病变效应和流感病毒的主要糖蛋白血凝素(HA)出现在6个连续组织培养途径的每一个中，以及通过组织培养流体中的蛋-感染力滴度得以证实。然而，这些数据限制于小规模且不提供实现疫苗目的的病毒颗粒或者蛋白的大规模生产。Gaush等在1966年证实MDCK细胞还对流感病毒A感染敏感。然而，该文章仅仅报道了感染性并且并没有提到病毒在此培养基中的繁殖问题(Gaush等，Proc.Soc.Exp.Biol.and Med.，122931，1966)。
在1975年，Tobita等首先描述了在含胰蛋白酶的涂覆培养基中建立的MDCK细胞系中多种流感A病毒的生长。尽管存在以前的传代，该病毒繁殖仍然形成了界限分明的菌斑，而且据建议，胰蛋白酶切割HA多肽并因此加速了流感病毒的成熟。但是尽管使用提供的胰蛋白酶有如此优点，在琼脂培养基中分离该病毒无法提供实现大规模病毒生长的手段。在相同的文献中，还成功地使用MDCK细胞从患者咽喉洗出物中初级分离流感A病毒。
随后，Reuveny等在批培养物中纤维素基微载体上的MDCK细胞上生长流感病毒类型A(Develop.Biol.Standard 50115，1982)。得到的流感病毒滴度类似于含胚卵中含胰蛋白酶培养基中的滴度。
U.S.专利4,500,513(Brown等)描述了一种通过在病毒培养过程中在培养物中包含入一种例如胰蛋白酶的蛋白水解酶而在相同液体培养物的连续数量的细胞中复制流感病毒的方法。
需要蛋白水解酶造成HA有功能并且从而克服过去液体培养技术的一步生长循环。这是对从液体细胞培养中“工业”生产流感疫苗可能的首次描述。
然而，目前考虑溶液中存在胰蛋白酶具有引起一定比例MDCK细胞被从其固体支持物中“提起”的缺点。因此，尽管该被专利保护的方法的潜在有效性，对胰蛋白酶的要求对流感疫苗的工业生产是一个严重的限制。因此仍然需要用于流感疫苗生产的工业的基于细胞培养的方法。这一需求可以被如下Kodihalli等在(J.Virol.69(8)4888，1995)″Embryonatedchicken eggs are currently the only host in which sufficientquantities of virus can be cultivated economically and within theshort time necessary to ensure a vaccine supply″中的陈述所支持。
同样在1995年，世界卫生组织(WHO)公布了对发生在1995年夏天的讨论的总结备忘录，该领域的专家聚在一起评价与基于细胞培养的方法生产流感疫苗相关的新近进展(Bull.W.H.O.73(4)431，1995)。该文献倡议进一步工作以在容许快速递增的细胞培养体系中实现快速生产大规模流感疫苗。
对于研究目的的细胞培养中的病毒生长，MDCK和Vero细胞最常被认为是几种病毒的良好生产者。但是，对于大规模生产目的，几种因素影响着对特殊细胞系选择，例如对一种或者多种病毒的敏感性，病毒滴度的产出，贴壁依赖，致瘤性等等。
尽管MDCK细胞对几种病毒株敏感，但是得到的较差的滴度可能限制了该细胞系在大规模生产目的中的有用性。
已经对MDCK系的特性进行了一些研究。在1970年，Leighton等(Cancer 261022)报道MDCK细胞在胶原涂覆的纤维素海绵上的三维组织培养物的组织病理学制剂中呈现乳头状腺癌的形态学模式。当发现被注射到11或者12天龄小鸡胚胎的细胞悬液产生许多脑转移病灶的时候，证实了细胞系的致瘤性质。
为了评价其被用于生产生物产品的合理性，细胞系的致瘤性评价是重要的。美国食品和药品管理局的生物学评价和研究中心(The Center forBiologics Evaluation and Research of the US Food and DrugAdministration)公布了考虑将细胞培养物作为基质用于生物学生产的评分(见Points to Consider in the Characterization of Cell Lines Usedto Produce Biologicals，Office of Biologics Research and Review，Center for Drugs and Biologics，FDA(USA)，1993)。一个这样的分是所用细胞系的致瘤性，并且FDA已经设计了用于体内致瘤性测试的指南。包括其它事情在内，该指南还要求在裸鼠(nu/nu)内通过皮下或者肌肉内途径给予来测试细胞。
发明简述因此，本发明涉及一种用于大规模生产流感病毒颗粒或者蛋白的方法，其包括下列步骤a.生长能够复制所述流感病毒的MDCK细胞系；b.用流感病毒细胞株感染MDCK细胞培养物并培育以容许该病毒复制；c.收获所述复制的病毒并且从其中纯化病毒颗粒或者蛋白。
本发明还提供了一种衍生自MDCK细胞系的细胞系，其对病毒感染高度敏感并且以高于其亲本细胞系的滴度生产流感病毒。


图1是本发明灌流装置(perfusing means)中使用的倾析器的正面剖视图；图2是该倾析器的顶部正视图；和图3是该倾析器的底部正视图。
发明详述在一个实施方案中，本发明的MDCK衍生的细胞系允许流感病毒的多步复制。在另一个实施方案中，本发明的MDCK细胞系是贴壁依赖和非致瘤性的。
本发明提供了对病毒感染超敏感的MDCK克隆的衍生物。“超敏感”的描述被用来表明对至少一种病毒高度敏感、因而产生比亲本MDCK细胞系更高病毒颗粒滴度的MDCK衍生的细胞系。MDCK.5F1这一衍生的克隆于1996年2月8日被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号CRL-12042。在一个实施方案中，在依照FDA指南进行的测试中，本发明的MDCK衍生的细胞系是非致瘤的，并且因此可适用于制备用于预防、诊断、免疫治疗或者治疗目的的病毒或者抗原。已经对该细胞系进行了是否存在污染微生物的测试并且结果没发现任何污染存在。
本发明还提供了一种用于大规模生产流感病毒颗粒或者蛋白用于疫苗生产的方法。
本发明的一个方面提供了大规模、细胞培养的、基于微载体的工业方法，该方法用于生产用来生产流感疫苗的流感病毒颗粒或者蛋白。
本发明的方法通过使用用于流感病毒多重复制的MDCK细胞系来进行。在一个实施方案中，在本发明方法中使用的MDCK细胞系具有与ATCC细胞系No.CRL-12042的那些相同的生物学活性。在一个实施方案中，本方法使用的细胞系是内部命名为MDCK.5F1、以保藏号ATCC CRL-12042保藏的MDCK细胞系克隆。
本发明的MDCK衍生的细胞系对病毒感染高度敏感。在此上下文中，对病毒感染“高度敏感”指的是该细胞系能够对至少一种病毒株产生比亲本细胞系更高的滴度。
在一个实施方案中，“高敏感性”被定义为这样的细胞系，其能够生产的病毒滴度是亲本细胞系生产的病毒滴度的大约1.2倍。在一个实施方案中，较高敏感的细胞系是选自由下列组成的组的克隆3B5，5F1，1D11，5H12，9C2，9D9，P79，9E9，7C1，和P123。
在又一个实施方案中，较高的敏感性被定义为这样的细胞系，对于这些相同的病毒，其能够生产的多个病毒的滴度是亲本细胞系生产这些病毒的滴度的至少2倍。在一个实施方案中，该克隆选自由下列组成的组3B5，5F1，5H12，9C2，7C1，和P123。
在一个实施方案中，较高的敏感性被定义为这样的细胞系，其能够生产的相同病毒的2个不同株的滴度是亲本病毒滴度的至少大约2倍。在一个实施方案中，该克隆能够生产2倍的呼吸道合胞病毒和流感类型A和B的亲本病毒滴度。在一个实施方案中，该克隆选自由下列组成的组5F1和5H12。
在一个实施方案中，该细胞系能够被选自由下列组成组的病毒感染流感，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，副流感病毒，水泡性口炎，牛痘，柯萨奇病毒(Coxsackie)，呼肠孤病毒，细小病毒，腺病毒，脊髓灰质炎，麻疹，狂犬病，疱疹，和其它病毒。
在一个实施方案中，病毒选自由下列组成的组流感类型A，B，和C；呼吸道合胞病毒；乳多空病毒；水泡性口炎(印度株)；柯萨奇病毒B-5；呼肠孤病毒类型2，和3；和腺病毒类型4，和5。
在一个实施方案中，病毒选自由下列组成的组流感类型A，B，和C，和呼吸道合胞病毒。
在一个实施方案中，病毒选自人、马、猪或者禽类流感株。
在一个实施方案中，病毒选自人流感类型A，B或者C。
在一个实施方案中，本发明的细胞系能被人流感病毒类型A或者B感染。
在一个实施方案中，本发明的细胞系能够被人流感病毒类型A和B感染。
在一个实施方案中，本发明的细胞系容许添加蛋白水解酶的流感病毒的多步复制，所述的蛋白水解酶例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和羧肽酶。在一个实施方案中，这样的细胞系容许添加胰蛋白酶的流感病毒的多步复制。
或者，本发明的细胞系容许不需要添加蛋白水解酶的流感病毒的多步复制，所述的蛋白水解酶例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶和羧肽酶。在一个实施方案中，这样的细胞系容许不需要添加胰蛋白酶的流感病毒的多步复制。
本领域的技术人员明显知晓哪种病毒或者病毒株可能需要使用蛋白水解酶。
尽管可能在悬液中培养本发明的细胞系，优选其以贴壁依赖的方式生长。在一个实施方案中，其也能够生长在微载体珠上，从而容许在细胞培养中获得高密度的细胞。
在一个实施方案中，本发明的MDCK衍生的细胞系是非致瘤的。在本发明的一个实施方案中，本发明的细胞系在软琼脂中以最小的效率生长(即＜1％效率)。在一个实施方案中，本发明的细胞系在裸鼠中至少3个月观察不到结节产生。
本发明还考虑将本发明的细胞系用来大量生长病毒颗粒或者病毒蛋白。
这样的病毒颗粒或者蛋白可以被用来生产用于在宿主中预防病毒感染的疫苗。在一个实施方案中，所述的宿主是哺乳动物。哺乳动物包括例如人、马、猪种类。在另一个实施方案中，所述的宿主是人。在另一个实施方案中，所述的宿主是禽类(例如鸡或者鸭)。
本发明的方法可以在有或者没有胰蛋白酶的存在的情况下进行，只要胰蛋白酶的存在不影响贴壁依赖MDCK在培养物中生长的能力。在一个实施方案中，本方法在大约或者小于4μg/ml胰蛋白酶浓度存在时进行。或者，本发明可以在没有胰蛋白酶存在时进行。
本发明描述的方法意欲用于生产呼吸道合胞病毒以及许多流感病毒例如流感病毒的人、马、猪和禽株。在一个实施方案中，本发明描述的方法意欲用于人流感类型A，B，或者C的生产。在一个实施方案中，本发明描述的方法意欲用于人流感类型A或者B的生产。在一个实施方案中，本发明描述的方法意欲通过使用可能被其任一类型病毒感染的MDCK细胞系用于人流感类型A或者B的生产。
本发明方法提供的产量范围为4μg HA/106MDCK细胞。如实施例9所描述，该方法产出的病毒蛋白量高于4μgHA/106MDCK细胞，更特别地，范围为9μg HA/106MDCK细胞。
“大规模方法”指的是用于生长大量流感病毒的过程。这样的过程通常在生物反应器中进行而不是在培养瓶中。这样的生物反应器的大小不同，取决于需要的最终产量/剂量。例如，这样的生物反应器可以是大约5升大小(工作体积为大约4升)，或者，其可以高达5000升。当然，大规模基于细胞培养的疫苗生产领域的技术人员显然会根据生物反应器的大小调节所有反应物、培养基、养分、细胞浓度、微载体浓度、灌流率等等。
本发明的方法可以在悬液培养中执行，但是优选在微载体装置上进行以增加细胞浓度(并从而增加病毒输出)。例如，可以选择本领域通常知晓的微载体珠如葡聚糖聚合物(CytodexTM)。可以以大约10-25g/L的浓度范围使用这些微载体。在一个实施方案中，所述微载体的浓度范围是大约15-20g/L。
将灌流装置引入以最大化所述方法中的细胞生长和病毒复制。灌流容许在恒定供应养分的同时提供装置来避免培养基中潜在毒性副产品的累积。通过灌流，养分的类型和量在所述过程的各种阶段可以是变化的。例如，可以将血清在生长期引入到细胞中，但是理想地，血清应该在细胞连片生长时和病毒引入前被清除。在细胞生长过程中逐步增加灌流流动率以提供足够的养分供应。在病毒复制过程中连续灌流。
取决于所述过程的阶段，灌流率被调节到大约0.5到4生物反应器体积/天。
将灌流装置加入到生物反应器。其包括将培养基连续引入生物反应器的入口装置和两个将用过的培养基连续从生物反应器中移除的出口装置(从而使培养基连续流过生物反应器中的微载体悬液)，以及与出口装置相连的倾析器。这里描述和本发明方法中使用的倾析器是被特别设计用于5L(3.7L工作体积)生物反应器的，这是因为意识到当使用上面建议的灌流装置并使用超过10g/L的微载体浓度时，细胞生长被微载体向上移动并且或逃出或阻塞出口装置的趋势所限制。因此，为了实现更高的微载体浓度，建造具有下列特点的倾析器，其能够将在倾析器内的湍流最小化并实现了快于悬液向上流动速度的微载体沉降速度。
按照本发明优选的实施方案，倾析器10示于图1中，其含有通过辐板3连接到较大上室2的下室1。两个出口装置4连接到倾析器顶部的上室2。下室1和上室2的形状是半圆柱体形并且环绕一个轴向中心的圆腔5，该腔意欲容纳生物反应器的中心转轴以及各种引入生物反应器来监测反应过程的各种探试器。固体的金属壁将该倾析器整体配齐。
图2图解了上述元件2，4，和5的顶部正视图。
图3显示了倾析器下室1的底部正视图。该下室1具有多个规则分布的纵向通道6，这些通道被辐向纵向隔板7分开，这些纵向通道通过倾析器的上室2和辐板3相互连接。在一个实施方案中，纵向通道6是相同的并且每个都具有圆的横截面。此外，多个纵向通道6规则分布在轴向中心圆腔5周围，周围的纵向通道6被辐向纵向隔板7相互分开。
在感染时，将灌流装置的出口装置由废物槽转换为收集器。连续收集直到复制完成(大约4-5天)。
本发明的方法是通过将病毒以10∶1-1∶1010的多重感染(multiplicityof infection)(M.O.I.)种植于MDCK细胞培养物而进行的。在一个实施方案中，该方法以1∶10-1∶108的M.O.I.进行。在一个实施方案中，该方法以约1∶104-1∶107的M.O.I.进行。在一个实施方案中，该方法以约1∶105-1∶106的M.O.I.进行。
在一个实施方案中，本发明方法中MDCK细胞的生长在大约33-40℃下进行大约7-10天。在一个实施方案中，本发明方法中MDCK细胞的生长在大约36-38℃下进行大约7天。
在一个实施方案中，本发明方法中MDCK细胞的生长在大约37℃下进行大约7天。在一个实施方案中，本发明方法中病毒复制在大约30-37℃下进行大约4-6天。在一个实施方案中，本发明方法中病毒复制在大约32-34℃下进行大约5天。在一个实施方案中，本发明方法中病毒复制在大约33℃下进行。
以如下方法纯化病毒颗粒或者蛋白。病毒收获物滤过后用甲醛使滤过物失活。随后将所得到的失活病毒悬液离心并选择富集的病毒级分用于疫苗制备。
还提供了一种用于在哺乳动物中预防流感感染的方法，包含给予本发明的疫苗的步骤。
还提供了一种方法，其中使用纯化的病毒颗粒或者蛋白来生产用于检测流感病毒感染的诊断试剂盒。
还提供了分离的大量病毒颗粒或者蛋白在生产用来在哺乳动物中检测和诊断流感病毒感染的试剂盒的应用。
以下讨论本发明的方法以及选择的人流感病毒类型A和B的株的繁殖的具体实例。很明显在不离开本发明精髓和范围或者以丧失本发明重要优点为代价的情况下，可以改变本发明的组成和安排方式，下面的描述仅仅是优选的或者例举性的实施方案。
实施例实施例1描述了克隆MDCK.5F1的衍生。实施例2涉及MDCK.5F1细胞系的纯度。实施例3描述了在有和没有胰蛋白酶时流感病毒在MDCK.5F1细胞系上的生长。实施例4是对MDCK.5F1致瘤性研究的总结。实施例5讨论在用MDCK.5F1细胞悬液接种无胸腺裸鼠后的结果。实施例6逐步描述了所述方法的具体实施方案。实施例7描述了使用亲本MDCK细胞和流感株A/Shanghai/11/87和胰蛋白酶进行测试的结果。实施例8描述了使用MDCK.5F1细胞和流感株A/Shanghai/11/87但是没有胰蛋白酶时进行测试的结果。实施例9描述了使用MDCK.5F1细胞和流感株B/Harbin/7/94但是没有胰蛋白酶时进行测试的结果。
实施例1克隆MDCK.5F1衍生MDCK细胞No.CCL 34获自美国典型培养物保藏中心Rockville，Maryland。收到1ml含3.4×106细胞的安瓿中冷冻状态的贮存液。该细胞系在其第54代。
传代后，在64代收集MDCK细胞并在有营养成分的培养基中稀释，所述的培养基由1∶1比例的Dulbecco改良的Eagel培养基(DMEM)和培养基199组成(DMEM-199)，其含有10％(v/v)的胎牛血清(FBS)。随后将稀释的细胞悬液等分到96孔板中，从而使每个孔接受少于1个细胞，认为细胞均匀地分布在溶液中。将板置于37℃的二氧化碳孵箱中并且为了评价这些孔的生长得分，在光学显微镜下以每周的间隔对其进行检查。
在克隆中寻求的特性选自如下1.对病毒感染具有比亲本细胞系更高的敏感性(即克隆比亲本细胞系产生更高的病毒滴度)；2.对超过一种病毒的更高的敏感性(在一个实施方案中，对流感病毒的几种株敏感)；3.容许流感病毒多步复制而不需要加入蛋白水解酶如胰蛋白酶的能力；和，任选地，
4.贴壁依赖(即在培养物中获得更高细胞浓度)。
表1描述了在没有加胰蛋白酶的情况下，几种克隆对流感病毒类型A和B病毒感染的敏感性。
表1对流感类型A和B病毒感染的克隆敏感性

“高敏感的”被定义为当用TCID50评价时，至少为亲本细胞系敏感性的约1.2倍。克隆3B5，5F1，1D11，5H12，9C2，9D9，P79，9E9，7C1，和P123被鉴定为高度敏感。克隆3B5，5F1，1D11，5H12，9C2，9D9，7C1，和P123被鉴定为至少为亲本细胞系敏感性的两倍。
克隆5F1和5H12被选为两种最高敏感的，5F1被选择来建立内部命名为MDCK.5F1的细胞系。
在克隆时，细胞世代数被定义为零，并且在每个随后的细胞培养中通过细胞计数来计算世代数。培养物最初在多孔培养板中传代并最后转移到塑料烧瓶中。
另外，用呼吸道合胞病毒的实验来测定亲本MDCK细胞系和MDCK.5F1克隆对这种病毒感染的敏感性。病毒滴度表明虽然MDCK细胞系对病毒的感染要比呼吸道合胞病毒宿主Hep2细胞系敏感得多，但是MDCK.5F1克隆对该病毒感染的敏感性要比亲本MDCK细胞系高大约10倍。
实施例2MDCK.5F1克隆性(clonality)的确定确定任何挑选的特殊克隆的克隆性的参数，是挑选了所述克隆的多孔板上的百分比生长。从该百分比确定被选培养物实际为纯系的概率(即，P(l))(见Coller和Coller，Methods in Enzymology，vol.121，pp.412-417(Academic Press，1986).)。
由于在该克隆中5％的孔显示生长，细胞系MDCK.5F1衍生自单细胞的概率是≥97.5％。
从MDCK.5F1细胞系制备299安瓿Master细胞库(MCB)和283安瓿生产商的Working细胞库(WCB)。这些库按照加拿大的对食品生产实践原则指南来制备，并且评价是否污染了真菌、酵母、支原体、细菌和病毒制剂。没有发现任何一种污染。
从制备的细胞库和细胞系中获得持续、可存活的培养物，其被测定了WCB外50个种群对的产品生产的稳定性、形态学、致瘤性、和同工酶特性。结果显示，所述细胞系的这些特性是稳定的。
实施例3阐述MDCK.5F1克隆中的流感病毒在有和没有添加胰蛋白酶时的生长的实验进行实验以确定在有或者没有胰蛋白酶存在的时候，流感病毒在克隆MDCK.5F1培养物中繁殖的能力。三个使用流感病毒株A/Johannesburg，A/Texas和B/Harbin的结果见表2。
表2有和没有胰蛋白酶的MDCK.5F1克隆培养物中不同流感株的生长

这些结果揭示，如血细胞凝集(HA)滴度值所示，当使流感病毒在有与没有胰蛋白酶的细胞培养物中复制时，没有实质差别。
实施例4体外致瘤性研究总结按照Furesz等(Develop.Biol.Stand.vol.70，pp.233-243，S.Kargel ed.，Basel，1989)描述的方法，将4ml含10％(v/v)FBS，0.6％琼脂的DMEM-199培养基置于包含6个35mm直径孔的组织培养皿中。安置后，用3ml含有0.3％W/V的保持在42℃的未胶凝的琼脂和60,000细胞/ml细胞浓度的培养基覆盖这些孔。将板在37℃用5％的二氧化碳培育。在3，7，10和14天进行光学显微镜观察。集落由4个或者多个在软琼脂中形成球状组细胞组成。百分比效率通过用计算的细胞克隆数除以接种的总细胞数得到的比率来确定。
表3软琼脂中的克隆形成

表3的结果显示MDCK.5F1细胞系在软琼脂中以最小的效率生长，这表明其在动物中是非致瘤的。这一性质保留到18代以后，表明其表型是稳定的。
为了进一步支持这一非致瘤性的结果，我们还测试了MDCK.5F1细胞系在无胸腺裸鼠中的肿瘤形成潜力。
实施例5在用MDCK.5F1克隆细胞悬液皮下接种无胸腺裸鼠(nu/nu)后肿瘤形成评价裸(nu/nu)无胸腺小鼠不能发动细胞介导的指向外来物质的应答，因此将支持同种异型或者不同种(heterogeneic)肿瘤细胞系的生长。这样容许评价接种物在体内形成瘤的能力。
将大约1×107细胞的试验样品MDCK.5F1皮下注射接种给6周龄的雌性裸鼠，临床随诊84天并且进行尸检。类似处理用阳性对照细胞和阴性对照细胞接种的裸鼠。对接种点(皮肤)、肺、肩胛淋巴结和总损害进行处理、切片、染色和显微检查。实验的进一步细节如下所示。
接种测试和对照材料对每只笼子中的所有小鼠进行相同处理。
如下所描述，对每只小鼠经皮下在肩胛骨之间接种0.2ml适当的接种物。将22口径的针用于接种并且所有动物在同一天接种。
组1和2试验样品，MDCK.5F1(浓度5×107细胞/ml)。
组3和4阳性对照(18C1-10T细胞，浓度5×107细胞/ml)。
组5和6阴性对照(SHE细胞，浓度1×107细胞/ml)。
所有动物每隔一工作日进行观察并且每周两次地对接种点进行触诊达84天的阶段。
结果临床结果处死所有的阳性对照小鼠并且在接种后14天进行尸检，因为其都在接种位点具有至少一个尺度大于1cm的大胞块。
将所有阴性对照小鼠处死并在接种后84天进行尸检。
将10只试验样品(5F1)小鼠中的9只处死并在接种后84天进行尸检。处死5F1接种小鼠中的一只并在接种后33天尸检，因为在接种位点有损害，其进展开始恢复。后来揭示该损害是囊肿。
触诊用阳性对照样品接种的10只裸鼠有可触知的损害，在接种后14天至少一个尺寸大于1cm。
小的不进展的损害在10只阴性对照样品接种的裸鼠的接种位点是可触知的。这些损害首先在接种后4天被注意到，在观察期的过程中，在10只阴性对照小鼠中的8只中，损害继续存在。
触诊的结果总结在表4。
自接种后4天，所有10只5F1小鼠均有损害。在10只5F1小鼠中的9只中，损害小且不发展。接种后56天，试验样品小鼠中有8只没有可触知的损害。一只5F1接种小鼠在接种位点有损害，该损害在25-28天在尺寸上进展显著，并且在接种后32天大小显著降低。该损害通过显微检查被鉴定为囊肿(见表6)。另一只出现损害的小鼠有局部发炎。
表4触诊结果

总尸检结果在表5中总结了治疗相关的总尸检结果。
表5治疗相关的总结果

在所有阳性对照动物中的接种位点发现了胞块。在10只5F1小鼠中有3只、在10只阴性对照小鼠中有6只发现了胞块或者结节。
显微结果在表6中总结了有关的损害。
表6治疗相关的显微结果

在所有阳性对照小鼠的接种位点诊断出瘤形成(纤维肉瘤)。纤维肉瘤是由交织模式的可变密度的束排列的纺锤样(spindoid)细胞组成的。胶原沉积是最小的。临近的组织虽然受压，但是很少被瘤侵袭。
在任何阴性对照小鼠中没有诊断出瘤。但是，在两个阴性对照样品小鼠中的接种位点处注意到骨增殖病灶。这被认为代表作为阴性对照接种的SHE细胞的选择分化和生长。
在任何5F1小鼠中没有诊断出瘤。但是，在一只小鼠中注意到囊肿并且在一只另外的5F1小鼠中注意到亚急性炎症。
结论在所有10只阳性对照小鼠的接种位点诊断出纤维肉瘤。
在任何阴性对照或者试验样品小鼠中均不存在瘤。
在上述研究的条件下，试验样品MDCK.5F1不认为是致瘤的。
实施例6总体步骤a.细胞繁殖在被植入生物反应器前，将MDCK.5F1(ATCC No.CRL-12042)细胞传代几次用于细胞扩增。将大约5-10×106细胞融化在37℃的水浴中，并将其转移到具有营养培养基的聚苯乙烯细胞培养瓶中并培育在37℃。3-4天后，分离该瓶中的细胞并用于植入5个其它烧瓶。随后用这5个烧瓶去以相同方式种植20个烧瓶。用于细胞生长的营养培养基是去离子水中制备的1∶1的Dulbecco改良的Eagle培养基和培养基199，其含有4.5g/L的葡萄糖，0.58g/L的谷氨酰胺和1g/L的碳酸氢钠(DMEM-199)。该营养培养基补充有10％γ照射的胎牛血清(I-FBS)。分离烧瓶中细胞以用于细胞传代的溶液是在不含镁和钙的磷酸缓冲液(PBS)中制备的具有0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)的0.25％胰酶溶液。
使20个烧瓶中的细胞生长3-4天，胰蛋白酶消化，收集并用于种植含有3-5g/L微载体珠的1000ml spinner烧瓶中的3个微载体细胞培养物。将spinner烧瓶培育在37℃，保持大约50rpm的搅拌。连续生长细胞5-7天，而后将细胞从微载体上用胰蛋白酶消化下来用于种植5L生物反应器(CelliGenTMby New Brunswick of Edison，N.J.)。
以如下方式将细胞从微载体上胰蛋白酶消化下来。用PBS和0.02％EDTA溶液清洗微载体细胞培养物两遍。在第二次细胞清洗后，将大约200ml的胰蛋白酶溶液倒入烧瓶并在37℃下搅动保持大约20分钟。用光学显微镜确定细胞分离完成后，使用含2％I-FBS的DMEM-199将细胞从自由的微载体上回收，随后沉淀并重悬于含10％1-FBS的DMEM-199中。进行细胞计数并且用适当数量的细胞(大约1010)种植生物反应器。
用于细胞培养的球形珠或者微载体由Pharmacia(Sweden)生产，并且以商品名Cytodexl销售。Cytodexl微载体的密度是1.03(0.9％NaCl中g/ml)，其大小介于131-220μm，平均180μm。细胞生长的大约表面积是4,500cm2/g微载体(干重)，1g含有大约6.8×106个微载体。
b.生物反应器中的细胞种植和生长将15-25g/L Cytodex 1浓度的微载体引入5L生物反应器中(3.7L工作体积)。如下种植生物反应器。将大约获得自先前准备的贮存液(参见上文)中的4×109-1×1010的细胞置于管形玻璃瓶中。从20g/L微载体的无菌溶液，用DMEM-199清洗55.5-92.5g(取决于培养物中需要的浓度)的微载体两遍并且将细胞加入到玻璃瓶中。随后用含有10％I-FBS的DMEM-199填充瓶得到3.7L的终体积。随后将瓶中的物质(DMEM-199中的细胞和微载体)倒入生物反应器容器中，用中心杆以约20rpm搅动。当容器被填满时，将搅动增加到50rpm，将温度调节到37℃并且将溶解的氧含量保持在5-50％空气饱和度。培养物的pH也保持在6.8-7.4。在第一天，使用含2.5％I-FBS和0.5g/L硫酸镁的DMEM-199以0.5体积/天开始灌流微载体细胞培养物。连续生长细胞大约7-10天并且将灌流流动率逐步增加到2体积/天。
c.病毒感染在病毒加入微载体细胞培养物之前，灌流在感染那天被增加到4无血清体积/天。温度降低到33℃并且将氧分压控制在15％空气饱和度。细胞连片生长时和病毒感染前立刻(在同一天)，用相同的无血清培养基替代培养基，并且将灌流率增加到4体积/天7小时。这可以保证培养物的血清物质在感染前被降低到最小水平。在该阶段后，停止灌流并且将人流感病毒类型A或者B引入到微载体细胞培养物中。在引入生物反应器前，用营养培养基(含6.5g葡萄糖/L的DMEM-199)正常稀释病毒以获得范围为1∶10-1∶108的M.O.I.。第二天，将灌流保持在2体积/天直到完成细胞病变效应。通常在5天内观察到MDCK细胞整个破坏。随后收集含有流感病毒悬液的流出物，并进而进行疫苗生产，这在本领域是熟知的。
d.灭活和纯化以如下方式进行单效价流感病毒的纯化。收集自通常为15-30L的生物反应器的病毒收获物首先通过1.2μm的滤器(Sartorius Sartopure GF，长10英寸，0.6m2)净化以移除大的细胞碎片。随后通过加入0.125％(V/V)甲醛(终浓度)16个小时使含有流感病毒的净化的悬液失活。随后将失活的病毒悬液通过离子交换、DNA酶处理和凝胶过滤纯化。
选择富集的病毒级分，其代表用于疫苗制备的优质材料。随后将这些级分聚集在一起并进行稀释以得到作为目前国际权威推荐的15μg HA/株/剂量的终浓度。
e.疫苗制备病毒蛋白被稀释到15μg/剂量疫苗。加入硫柳汞(0.01％)分别用于防腐和稳定，从而完成疫苗制备。
对于标准的三效价疫苗，三个循环株中每个的单效价剂量将被混和并如上所述加入防腐剂和稳定剂。
其它已知的防腐剂例如氨基甲基丙醇，山梨酸和聚氨基丙基双胍，硝酸苯汞(phenymercuric nitrate)，硼酸苯汞，2-苯氧乙醇与甲醛，酚，苯索氯铵，和2苯氧乙醇可以用于疫苗制备。这些防腐剂的浓度需要符合工业标准。
实施例7使用株A/Shanghai/11/87并添加胰蛋白酶感染亲本细胞系将来自亲本系的MDCK细胞在CelliGenTM生物反应器中生长。该生物反应器的工作体积是3.7L，微载体浓度是25g/L，并在50rpm搅动。在第七天，用名为A/Shanghai/11/87的人流感株感染培养物。M.O.I.是1∶133,000并且将2.5μg/ml的胰蛋白酶加入以提高病毒复制。表7列出了测试的相关数据，表8概括了结果。疫苗产量是15μg HA的9,828单效价剂量，这基于18L总收获体积和7.38μg HA/ml和9μg HA/ml的单辐射扩散(SRD)测定值。(见表8.)表7使用亲本细胞系和株A/Shanghai/11/87并添加胰蛋白酶进行测试的数据

以如下方式计算感染时刻细胞的总数9.34×106MDCK细胞/ml×3700ml等于34,558×106细胞。
表8使用亲本细胞系和株A/Shanghai/11/87并添加胰蛋白酶进行测试的结果

以如下方式计算HA的总量9,828剂量×15μg/剂量＝总共147,420μg HA。再除以34558×106细胞＝4.26μgHA/106MDCK细胞。
实施例8使用株A/Shanghai/11/87并不添加胰蛋白酶感染MDCK.5F1克隆在微载体浓度为25g/L的CelliGenTM生物反应器中生长衍生自克隆MDCK.5F1(ATCC保藏号CRL-12042)的细胞。该生物反应器的工作体积是3.7L并且在50-55rpm搅动。在第七天，用名为A/Shanghai/11/87的人流感病毒株感染培养物。生物反应器中不加入胰蛋白酶来提高病毒生长。M.O.I.是1∶133,000并且该测试生产出了32L，其SRD值为9.2μg HA/ml，得到19,626单效价剂量。表9总结了该测试的数据并且表10列出了结果。
表9使用MDCK.5F1克隆和株A/Shanghai/11/87在没有胰蛋白酶时进行测试的数据

以如下方式计算感染时刻细胞的总数16,8×106MDCK细胞/ml×3700ml等于62,160×106细胞。
表10使用MDCK.5F1克隆和株A/Shanghai/11/87在没有胰蛋白酶时进行测试的结果


以如下方式计算HA的总量19,626剂量×15μg/剂量＝总共294,390μg HA。再除以62,160×106细胞＝4.73μg HA/106MDCK细胞。
实施例9用株B/Harbin/7/94在没有胰蛋白酶的情况下感染MDCK.5F1克隆衍生自克隆MDCK.5F1的细胞如实施例3所述的那样生长，只是微载体的浓度是15g/L。在第八天，用名为B-Harbin/7/94的人流感病毒感染培养物。M.O.I.是1∶10,000。没有加入胰酶以促进病毒复制。来自该测试的数据和结果见表11和12。基于35L的收获物和16.35μg HA/ml的SRD值，产量是38,150剂量。
表11.使用MDCK.5F1克隆和株B-Harbin/7/94在没有胰蛋白酶时进行测试的数据


以如下方式计算感染时刻细胞的总数16.7×106MDCK细胞/ml×3700m1等于61,790×106细胞。
表12.使用MDCK.5F1克隆和株B-Harbin/7/94在没有胰蛋白酶时进行测试的结果

以如下方式计算HA的总量38,150剂量×15μg/剂量＝总共572,250μgHA。再除以61,790×106细胞＝9.26μg HA/106MDCK细胞。
再一次，这里表明本发明方法得到的产量等于或者高于任何需要胰酶存在的现有技术方法所得到的产量。
权利要求
1.一种马-达犬肾(MDCK)衍生的细胞系，特征在于其对病毒感染具有比其亲本MDCK细胞系更高的敏感性。
2.根据权利要求1的细胞系，其中所述的更高的敏感性被定义为至少是所述亲本细胞系中生产病毒滴度的大约1.2倍。
3.根据权利要求2的细胞系，其中所述的病毒选择由下列组成的组流感，呼吸道合胞病毒，乳多空病毒，副流感病毒，水泡性口炎，牛痘，柯萨奇病毒，呼肠孤病毒，细小病毒，腺病毒，脊髓灰质炎，麻疹，狂犬病，和疱疹病毒。
4.根据权利要求3的细胞系，其中所述的病毒是流感或者呼吸道合胞病毒。
5.根据权利要求4的细胞系，其中所述的流感病毒包括人，马，猪或者禽类株。
6.根据权利要求5的细胞系，其中所述的流感病毒选自人流感病毒类型A，B，或者C。
7.根据权利要求6的细胞系，其中所述的流感病毒选自类型A或者B。
8.根据权利要求7的细胞系，其中所述的细胞系对流感病毒类型A和B都高度敏感。
9.一种MDCK衍生的细胞系，特征在于其是非致瘤性的。
10.根据权利要求1-8任何一项的细胞系，特征在于其是非致瘤性的。
11.根据权利要求10的细胞系，其中所述的非致瘤性被定义为在大约3个月的观察后在裸鼠中没有可触知的结节。
12.一种细胞系，其具有ATCC CRL-12042的生物学特性。
13.一种细胞系，定义为ATCC CRL-12042。
14.根据权利要求1-13任何一项的细胞系，特征还在于其是贴壁依赖的。
15.根据权利要求1-14任何一项的细胞系在生产用于预防、诊断、免疫治疗或者治疗目的的病毒颗粒或者病毒蛋白中的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中所述的病毒颗粒或者蛋白用于生产用来预防病毒感染的疫苗。
17.根据权利要求16的用途，其中所述的病毒感染是由流感病毒引起的。
18.根据权利要求17的用途，其中所述的流感病毒包括人、马、猪、或者禽类株。
19.根据权利要求18的用途，其中所述的流感病毒选自人流感病毒类型A、B或者C。
20.根据权利要求19的用途，其中所述的病毒是人流感病毒类型A或者B。
21.被定义为ATCC CRL-12042的细胞系在生产病毒颗粒或者病毒蛋白中的用途，所述的病毒颗粒或者病毒蛋白用于预防流感病毒感染用的疫苗的制造。
22.根据权利要求21的用途，其中所述的病毒感染是由人流感病毒类型A或者B引起的。
23.根据权利要求21的用途，其中所述的病毒感染是由人流感病毒A和B引起的。
24.一种生产流感病毒颗粒或者蛋白的方法，其包括a.生长能够复制所述流感病毒的马-达犬肾(MDCK)细胞系；b.用流感病毒株感染所述细胞系；和c.培育以容许该病毒复制；和收获所述复制的病毒。
25.根据权利要求24的方法，还包括从中纯化病毒颗粒或者蛋白。
26.根据权利要求24的方法，其中所述的MDCK细胞系被定义为具有ATCC No.CRL-12042的生物学活性。
27.根据权利要求24的方法，其中所述的MDCK细胞系被定义为ATCCNo.CRL-12042。
28.根据权利要求24的方法，其中所述的流感病毒包括人、马、猪、或者禽类株。
29.根据权利要求24的方法，其中所述的病毒选自由人流感病毒类型A、B和C组成的细。
30.根据权利要求24的方法，其中所述的方法在生物反应器中进行。
31.根据权利要求30的方法，其中所述的生物反应器的大小为大约5升。
32.根据权利要求30的方法，其中所述的生物反应器的大小为大约5-5000升。
33.根据权利要求24的方法，其中在步骤a中，所述的细胞生长在含有微载体装置的培养基内；并且在步骤b中，所述的培育在灌流装置中进行。
34.根据权利要求33的方法，其中所述的灌流装置含有倾析器以避免所述收获物中微载体的泄露。
35.根据权利要求33的方法，其中所述的微载体装置包含浓度为大约5-25g/L的微载体珠。
36.根据权利要求35的方法，其中所述的微载体珠的浓度范围为大约10-25g/L。
37.根据权利要求35的方法，其中所述的微载体珠的浓度范围为大约15-20g/L。
38.根据权利要求34的方法，其中所述的灌流是以大约0.5-4.0生物反应器体积/天的速率进行的。
39.根据权利要求24的方法，其中在步骤b中，以大约10∶1-1∶1010的多重感染种植所述的流感病毒。
40.根据权利要求24的方法，其中以大约1∶10-1∶108的多重感染种植所述的流感病毒。
41.根据权利要求24的方法，其中以大约1∶104-1∶107的多重感染种植所述的流感病毒。
42.根据权利要求24的方法，其中以大约1∶105-1∶106的多重感染种植所述的流感病毒。
43.根据权利要求24的方法，其中在步骤a中，所述的MDCK细胞系生长了大约7天。
44.根据权利要求43的方法，其中所述的MDCK细胞系在大约33-40℃的温度范围下生长。
45.根据权利要求43的方法，其中所述的MDCK细胞系在大约36-38℃的温度范围下生长。
46.根据权利要求24的方法，其中在步骤b中，所述的流感病毒在大约30-37℃的温度复制。
47.根据权利要求43的方法，其中所述的流感病毒在大约32-34℃的温度复制。
48.根据权利要求43的方法，其中所述的流感病毒在大约33℃的温度复制。
49.根据权利要求24的方法，其中所述的纯化的病毒颗粒或者蛋白被用于生产用来预防流感病毒感染的疫苗。
50.一种用来在哺乳动物中预防流感病毒感染的疫苗，其如权利要求49的方法制造。
51.根据权利要求50的疫苗，其中所述的哺乳动物是人。
52.一种用来在哺乳动物中预防流感感染的方法，包括给予权利要求50或者51的疫苗的步骤。
53.一种用于在哺乳动物中预防流感病毒感染的疫苗，包含混合有防腐剂的根据权利要求24分离的病毒颗粒或者病毒蛋白。
54.根据权利要求24的方法的用途，其用于疫苗生产。
55.根据权利要求24的方法，其中所述的纯化的病毒颗粒或者蛋白被用于生产检测流感病毒感染的诊断试剂盒。
56.根据权利要求24分离的大量病毒颗粒或者蛋白的用途，其用于生产在哺乳动物中检测和诊断流感病毒感染的试剂盒。
全文摘要
本发明涉及一种工业规模的方法，其用于生产预防、诊断、免疫治疗或治疗目的用的流感病毒或者抗原。特别地，本发明提供了马－达氏犬肾(MDCK)衍生的细胞系和用于流感疫苗生产和更特别用于含有流感类型A和B的人疫苗生产的基于细胞培养的方法。
文档编号A61K39/12GK101094915SQ200580024752
公开日2007年12月26日 申请日期2005年5月20日 优先权日2004年5月20日
发明者P·特勒帕尼尔, R·迪格雷, T·哈塞尔 申请人:益得生物医学公司