抑制先天免疫应答和自身免疫的方法和组合物的制作方法

专利名称：抑制先天免疫应答和自身免疫的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本申请涉及免疫免疫调节性多核苷酸。其还涉及施用多核苷酸以调节免疫应答。
背景技术：
免疫一般分为先天免疫或适应性免疫。先天免疫应答一般在受到感染时立刻发生以提供对感染性疾病的早期屏障，而适应性免疫应答发生较晚，伴有抗原特异性效应细胞的产生以及长期的保护免疫。先天免疫应答不产生持久的保护性免疫，但是似乎在随后提高适应性免疫应答中起作用。
先天免疫使用种系编码的受体来识别许多病原体的共有特征并且活化导致效应分子表达的信号转导事件。这些效应分子中的一些分子最终诱导出适应性免疫应答。已知Toll样受体(TLR)家族与先天免疫应答信号转导有关，并且已经鉴定出了几种哺乳动物TLR的微生物配体。例如TLR2与胎聚糖、细菌脂肽和某些类型的脂多糖(LPS)相互作用，TLR3与双链RNA相互作用，TLR4与LPS相互作用并且TLR-5与细菌鞭毛蛋白相互作用。参见例如Poltorak等人，(1998)Science 2822085-2088；Akira等人，(2003)Immunol.Lett.8585-95；Alexopoulou等人，(2001)Nature413732-738；Hayashi等人，(2001)Nature 4101099-1103。TLR-7由鸟苷类似物、小的抗病毒化合物如咪唑喹啉、咪喹莫特和R-848以及单链RNA活化。TLR-8也由R-848和单链病毒RNA活化。参见例如Lee等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1006646-6651；Hemmi等人，(2002)Nat.Immunol.3196-200；Jurk等人，(2002)Nat.Immunol.3499；Heil等人，(2004)Science 3031526-1529；Diebold等人，(2004)Science 3031529-1531。已经证明，TLR-9识别免疫刺激性核酸分子，如细菌DNA和包含5′-CG-3′序列的免疫刺激性DNA。参见例如Hemmi等人，(2000)Nature408740-745；Bauer等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 989237-9242；Takeshita等人，(2001)J.Immunol.1673555-3558。此外，某些TLR(例如TLR-1、TLR-2和TLR-6)可以异源二聚体化、与它们的微生物配体相互作用并且导致细胞活化，从而扩大了TLR家族的配体库。Ozinsky等人，(2000)J.EndotoX1n Res.6393-396；Ozinsky等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci USA 9713766-13771。
免疫刺激性核酸(ISNA)分子，如细菌DNA或者包含非甲基化5′-CG-3′序列的多核苷酸，可以刺激先天免疫应答如细胞因子产生以及树突状细胞和巨噬细胞活化，然后导致产生Th1型免疫应答。免疫刺激性核酸分子通过与哺乳动物TLR9受体相互作用并通过其进行信号传导而刺激免疫应答。Hemmi等人，(2000)，同上。哺乳动物DNA通常不具有免疫刺激活性，这显然是因为其中CG序列出现频率低并且大多数CG序列具有甲基化的胞嘧啶。因此看来，哺乳动物免疫系统的细胞通过TLR9受体将细菌DNA与自身DNA区别开来。
免疫刺激性核酸分子参与关节炎的病理发生。已经证明，免疫刺激性核酸在自身反应性B细胞(例如产生称作类风湿因子(RF)的一类自身抗体的那些细胞)的活化中起作用。因此看来，此类免疫刺激性核酸在系统自身免疫中起作用。此外，免疫刺激性核酸可以增强LPS的毒性并且导致施用基因治疗用载体时出现副作用。参见例如Deng等人，(1999)Nature Med.5702-705，Leadbetter等人，(2002)Nature 416603-607，Cowdery等人，(1996)J.Immunol.1564570-4575，美国专利号6,225,292。
在这里仍然需要鉴定出控制有害的免疫活化包括有害的先天免疫应答活化的策略。
本文所引用的所有专利、专利申请和出版物在此全部引入作为参考。
发明公开本发明涉及免疫调节性多核苷酸以及使用这些多核苷酸抑制个体中免疫应答的方法，特别是抑制人中免疫应答的方法。
在一个方面，本发明提供了免疫调节性多核苷酸(IRP)。在某些实施方案中，本发明包括包含任意本文所述免疫调节性多核苷酸的组合物。组合物还包括例如可药用赋形剂或者任意多种其他成分。
在另一个方面，本发明提供了免疫调节性化合物(IRC)。在某些实施方案中，本发明包括包含任意本文所述免疫调节性化合物的组合物。组合物还包括例如可药用赋形剂或者任意多种其他成分。
在另一个方面，本发明提供了抑制免疫应答的方法，包括将免疫系统的细胞与包含免疫调节性序列(IRS)的多核苷酸接触，其中细胞与有效量的多核苷酸接触以抑制促成免疫应答的细胞产生应答。
在另一个方面，本发明提供了调节个体中免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体中免疫应答之数量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物。根据本发明方法，可以在个体(包括患有与先天免疫应答有害活化相关疾病的个体)中实现免疫调节。
在另一个方面，本发明提供了抑制个体中TLR7/8依赖性先天免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR7/8依赖性细胞因子产生之数量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物，其中IRP或IRC包含TLR7/8类的IRS。
在另一个方面，本发明提供了抑制个体中TLR9依赖性先天免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR9依赖性细胞因子产生之数量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物，其中IRP或IRC包含TLR9类的IRS。
在另一个方面，本发明提供了抑制个体中TLR9依赖性先天免疫应答和TLR7/8依赖性先天免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR9依赖性细胞因子产生和TLR7/8依赖性细胞因子产生之数量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物，其中IRP或IRC包含TLR7/8/9类的IRS。
在另一个方面，本发明提供了改善自身免疫病的一种或多种症状的方法，包括向患有自身免疫病的的个体施用有效量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物。按照本发明施用免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物改善了包括SLE和类风湿性关节炎在内的自身免疫病的一种或多种症状。在某些实施方案中，有效抑制SLE症状的免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物包含TLR7/8类或TLR9类或TLR7/8/9类的免疫调节性序列。
在另一个方面，本发明提供了防止或延缓自身免疫病发展的方法，包括向处于发展成自身免疫病危险中的个体施用有效量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物。按照本发明施用免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物防止或延缓了自身免疫病的发展。
在另一个方面，本发明提供了改善炎性疾病或失调的一种或多种症状的方法，包括向患有炎性疾病或失调的个体施用有效量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物。按照本发明施用免疫调节性多核苷酸改善了炎性疾病或失调的一种或多种症状。在某些实施方案中，本发明组合物有效改善了慢性炎性疾病或失调的症状。
在另一个方面，本发明提供了抑制慢性病原体刺激的方法，包括向患有慢性病原体感染或疾病的个体施用有效量的本发明免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物。按照本发明施用免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物抑制了个体包含中的慢性病原体刺激，包括与疟疾和慢性病毒感染有关的那些。在某些实施方案中，有效抑制慢性病原体刺激的免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物包含TLR7/8类的免疫调节性序列。
在一些实施方案中，本发明的组合物抑制B细胞或浆细胞样树突状细胞的应答。在一些实施方案中，通过本发明的组合物抑制的免疫应答包括抑制细胞产生细胞因子如IL-6、IL-12、IFN-α和/或TNF-α；抑制细胞成熟和/或抑制细胞增殖。在一些实施方案中，本发明的组合物抑制TLR9依赖性细胞应答、TLR7/8依赖性细胞应答和/或TLR7/8/9依赖性细胞应答。
优选地，本发明还涉及开展本发明方法的试剂盒。本发明的试剂盒一般包括本发明的免疫调节性多核苷酸和/或免疫调节性化合物(通常在适宜容器中)，并且还可以包含免疫调节性多核苷酸和/或免疫调节性化合物用于个体免疫调节的使用说明书。
此外，本文提供了包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。在寡核苷酸的一些实例中，X1是C或A。
本文提供了包含式GGNmX1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中m是从1至大约100或者从1至大约20的整数，每一个N是一个核苷酸，并且X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。在寡核苷酸的一些实例中，X1是C或A。
本文提供了包含式NiTCCNj(GG)kNmX1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，i是从1至大约50的整数，j是从1至大约50的整数，k是0或1，m是从1至大约20的整数，并且X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。在寡核苷酸的一些实例中，X1是C或A。
本文提供了包含式X1X2X3GGGGAA(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X3＝C或A，则X1X2不是GG。在上面寡核苷酸的一些实例中，至少一个G由Z′替换，其中Z′＝7-脱氮G。
本文提供了包含序列5′-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ IDNO＿(C661)或者包括该序列的至少10个碱基回文部分的片段的寡核苷酸。
本文提供了由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸(即，其中序列Nm包含至少一个GC二核苷酸)。在一些实施方案中，寡核苷酸由核苷酸序列5′-TGCNmA-3′组成。在另外的实施方案中，寡核苷酸由核苷酸序列5′-TGCNmCA-3′组成。在另外的实施方案中，寡核苷酸由核苷酸序列5′-TGCNmGCA-3′组成。
本文提供了包含核苷酸序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸并且m是从0至大约100的整数。在寡核苷酸的一些实例中，序列N1-Nm包含序列5′-TTGACAGCTTGACAGCA-3′(SEQ ID NO＿)的片段。
本文提供了包含核苷酸序列5′-TGCRRZNYY-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中Z是除C外的任意核苷酸，N是任意核苷酸，此外当Z不是G或肌苷时N是鸟苷或肌苷。
本文提供了包含核苷酸序列5′-TGCRRZNYm-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中Z是除C外的任意核苷酸，N是任意核苷酸，Y是嘧啶核苷酸，m是从2至100的整数，其中当Z不是G或肌苷时，N是鸟苷或肌苷。
此外，本文提供了抑制免疫应答的方法，包括将免疫系统的细胞与包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸接触，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA，其中细胞与有效抑制促成免疫应答的细胞的应答之数量的寡核苷酸接触。
本文提供了调节个体中免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体中免疫应答之数量的包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
本文提供了调节个体中免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体中免疫应答之数量的由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。
本文提供了调节个体中免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体中免疫应答之数量的包含核苷酸序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸并且m是从0至大约100的整数。
本文提供了抑制个体中TLR7/8依赖性先天免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR7/8依赖性细胞因子产生之数量的由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。
本文提供了抑制个体中TLR9依赖性先天免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR9依赖性细胞因子产生之数量的包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
本文提供了抑制个体中TLR9依赖性先天免疫应答和TLR7/8依赖性免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR9依赖性细胞因子产生和TLR7/8依赖性细胞因子产生之数量的由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。
本文提供了改善自身免疫病的一种或多种症状的方法，包括向患有自身免疫病的个体施用有效量的包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。在一些实例中，自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
本文提供了改善自身免疫病的一种或多种症状的方法，包括向患有自身免疫病的个体施用有效量的由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。
本文提供了改善自身免疫病的一种或多种症状的方法，包括向患有自身免疫病的个体施用有效量的包含核苷酸序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸并且m是从0至大约100的整数。在一些实例中，自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
本文提供了防止或延缓自身免疫病发展的方法，包括向处于发展成自身免疫病危险中的个体施用有效量的包含式X1GGGGX2X3(SEQ IDNO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
本文提供了防止或延缓自身免疫病发展的方法，包括向处于发展成自身免疫病危险中的个体施用有效量的由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。
本文提供了防止或延缓自身免疫病发展的方法，包括向处于发展成自身免疫病危险中的个体施用有效量的包含核苷酸序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸并且m是从0至大约100的整数。
本文提供了改善炎性疾病或失调的一种或多种症状的方法，包括向患有炎性疾病或失调的个体施用有效量的包含式X1GGGGX2X3(SEQ IDNO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
本文提供了改善炎性疾病或失调的一种或多种症状的方法，包括向患有炎性疾病或失调的个体施用有效量的由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。
本文提供了改善炎性疾病或失调的一种或多种症状的方法，包括向患有炎性疾病或失调的个体施用有效量的包含核苷酸序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸并且m是从0至大约100的整数。
本文提供了抑制慢性病原体刺激的方法，包括向患有慢性病原体感染或疾病的个体施用有效量的包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
此外，本文提供了试剂盒，其包含i包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA；ii由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸；或iii包含核苷酸序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQID NO＿)的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸并且m是从0至大约100的整数，其中寡核苷酸处于适宜容器中并且所述试剂盒包含使用寡核苷酸对个体进行免疫调节的使用说明书。
附图简述

图1A-1B显示IRP抑制免疫刺激性核酸(ISNA)所刺激细胞中IL-6和IL-12的产生。图1A描述用ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独刺激和与IRPSEQ ID NO＿(530)、IRP SEQ ID NO＿(C869)或对照SEQ IDNO＿(C532)一同刺激鼠脾细胞的结果。图1B描述用ISNA SEQ IDNO＿(C274)单独刺激或者与IRP SEQ ID NO＿(530)、IRP SEQ IDNO＿(C869)或对照SEQ ID NO＿(C532)一同刺激鼠CD11c+细胞的结果。
图2显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独刺激和与IRP SEQ IDNO＿(530)、IRP SEQ ID NO＿(C869)或对照寡核苷酸SEQ IDNO＿(C532)一起刺激的人B细胞中的IL-6产生。
图3显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独注射和与IRP SEQ IDNO＿(C869)或对照寡核苷酸一起注射以及IRP SEQ ID NO＿(C869)单独注射小鼠中血清IL-6水平。共同施用的IRP∶ISNA比或IRP∶对照寡核苷酸比在3∶1至1∶3间变化。
图4显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独注射和与IRP SEQ IDNO＿(C869)或对照寡核苷酸一起注射以及IRP SEQ ID NO＿(C869)单独注射小鼠中血清IL-12水平。共同施用的IRP∶ISNA比或IRP∶对照寡核苷酸比在3∶1至1∶3间变化。
图5显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独注射和与IRP SEQ IDNO＿(C869)或对照寡核苷酸一起注射以及IRP SEQ ID NO＿(C869)单独注射小鼠中血清TNF-α水平。共同施用的IRP∶ISNA比或IRP∶对照寡核苷酸比在3∶1至1∶3间变化。
图6显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)在一个位点皮下注射和用与对照寡核苷酸或IRP SEQ ID NO＿(C869)在同一位点或不同位点施用小鼠中血清IL-6水平。
图7显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)在一个位点皮下注射和用与对照寡核苷酸或IRP SEQ ID NO＿(C869)在同一位点或不同位点施用小鼠中血清IL-12水平。
图8A-8B显示对不同量HSV-1感染作出应答的鼠CD11c+脾细胞中IFN-α(图8A)和IL-12(图8B)的产生。
图9A-9C显示IRP抑制HSV-1所刺激细胞中的细胞因子产生。图9A描述在不同浓度IRP SEQ ID NO＿(C869)或对照寡核苷酸存在下鼠CD11c+脾细胞对HSV-1产生应答而产生的IFN-α。图9B描述在不同浓度IRP SEQ ID NO＿(C869)或对照寡核苷酸存在下鼠CD11c+脾细胞对HSV-1产生应答而产生的IL-12。图9C描述在不同浓度IRP SEQ IDNO＿(C869)或对照寡核苷酸存在下人PDC细胞对HSV-1产生应答而产生的IFN-α。
图10A-10B显示IRP抑制流感病毒(PR/8)所刺激细胞中的细胞因子产生。图10A显示人PDC对不同量流感病毒作出应答而产生的IFN-α。图10B显示在不同浓度IRP SEQ ID NO＿(C869)或对照寡核苷酸存在下人PDC对流感病毒作出应答而产生的IFN-α。
图11A-11B显示IRP抑制病毒刺激的人PDC细胞中IFN-α产生。显示了在单独的病毒、IRP SEQ ID NO＿(C869)、IRP SEQ ID NO＿(C661)或对照寡核苷酸存在下细胞对HSV-1(图11A，左图)和流感病毒(图11B，右图)作出应答而产生的IFN-α。
图12A-12B显示IRP对用ISNA(图12A)或LPS(一种TLR4刺激物)(图12B)所刺激脾细胞中IL-6产生的影响。所刺激细胞与单独的ISNA或LPS孵育以及与ISNA或LPS和IRPSEQ ID NO＿(530)、IRP SEQ IDNO＿(C869)或对照寡核苷酸一起孵育。
图13A-13D显示IRP对用罗唑利宾(一种TLR7刺激物)所刺激脾细胞中IL-6(图13A-13 B)和IL-12(图13C-13D)产生的影响。所刺激细胞与罗唑利宾单独孵育以及与罗唑利宾和不同量IRP SEQ ID NO＿(C869)(图13A、13C)或对照寡核苷酸(图13B、13D)一起孵育。
图14A-14D显示IRP对用一种TLR7/8刺激物雷西莫特(R848)所刺激脾细胞中IL-6(图14A-14 B)和IL-12(图14C-14D)产生的影响。所刺激细胞与R848单独孵育以及与R848和不同量IRP SEQ ID NO＿(C869)(图14A、14C)或对照寡核苷酸(图14B、14D)一起孵育。
图15A-15D显示IRP对用TLR刺激物ISNA(SEQ IDNO＿(1018))(图15A)、LPS(图15B)、罗唑利宾(图15C)和R848(图15D)所刺激脾细胞中IL-6产生的影响。所刺激细胞与所指出的TLR刺激物单独孵育以及与指出的TLR刺激物和IRP SEQ ID NO＿(C869)、IRP SEQID NO＿(C661)或对照寡核苷酸一起孵育。
图16A-16B显示IRP抑制ISNA SEQ ID NO＿(1018)所刺激细胞或R848所刺激细胞中IL-6的产生。图16A描述了用ISNA SEQ IDNO＿(1018)单独刺激以及用ISNA SEQ ID NO＿(1018)和IRP SEQ IDNO＿(869)、IRP SEQ ID NO＿(661)或IRP SEQ ID NO＿(954)一起刺激的鼠脾细胞的结果。图16B描述了用R848单独刺激以及用R848和IRPSEQ ID NO＿(869)、IRP SEQ ID NO＿(661)或IRP SEQ ID NO＿(954)一起刺激的鼠脾细胞的结果。
图17A-17B显示单独注射R848以及注射R848和IRP SEQ IDNO＿(954)或对照寡核苷酸1小时后小鼠血清中的IL-12(图17A)和TNF-α图17B)水平。
图18显示用D-半乳糖胺和ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独治疗以及与IRP SEQ ID NO＿(954)或IRP SEQ ID N O＿(869)或对照寡核苷酸一起治疗后存活小鼠百分数。
图19A-19B显示IRP抑制ISNA SEQ ID NO＿(1018)所刺激细胞或R848所刺激细中IL-6的产生。图19A描述了用ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独刺激以及用ISNA SEQ ID NO＿(1018)和IRP SEQ ID NO＿(954)、IRP SEQ ID NO＿(DV019N-1)、IRP SEQ ID NO＿(DV020N-2)、IRPSEQ ID NO＿(DV021N-3)、IRP SEQ ID NO＿(DV022N-4)、IRP SEQID NO＿(DV023N-5)或IRP SEQ ID NO＿(DV024N-6)一起刺激的鼠脾细胞的结果。图19B描述了用R848单独刺激以及用R848和IRP SEQ IDNO＿(954)、IRP SEQ ID NO＿(DV019)、IRP SEQ ID NO＿(DV020)、IRP SEQ TD NO＿(DV021)、IRP SEQ ID NO＿(DV022)、IRP SEQ IDNO＿(DV023)或IRP SEQ ID NO＿(DV024)一起刺激的鼠脾细胞的结果。
图20显示用15μg或45μg IRP SEQ ID NO＿(954)一周两次注射治疗或未治疗的(NZBxNZW)F1小鼠血清中抗dsDNA自身抗体水平。
图21显示一周3次注射100μg的IRP SEQ ID NO＿(954)或对照寡核苷酸的8-9月龄(NZBxNZW)F1小鼠的存活百分数。
图22A-22B显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)(图22A)或R848(图22B)单独刺激以及用ISNA SEQ ID NO＿(1018)或R848与IRP SEQ IDNO＿(869)、IRP SEQ ID NO＿(661)、IRP SEQ ID NO＿(954)或对照寡核苷酸一起刺激的人B细胞中的IL-6产生。
图23显示用UV失活HSV-1病毒单独刺激和用UV失活HSV-1病毒与IRP SEQ ID NO＿(954)或对照寡核苷酸一起刺激的人PDC细胞中IFN-α的产生。
图24显示用热失活流感病毒单独刺激和用热失活流感病毒与IRPSEQ ID NO＿(954)或对照寡核苷酸一起刺激的人PDC细胞中IFN-α的产生。
图25显示用含抗dsDNA免疫复合物的血清单独刺激和用其与IRPSEQ ID NO＿(954)或对照寡核苷酸一起刺激的人PDC细胞中IFN-α的产生。
图26显示用抗RNP免疫复合物单独刺激和用其与IRP SEQ IDNO＿(954)或对照寡核苷酸一起刺激的人PDC细胞中IFN-α的产生。
图27显示用ISNA SEQ ID NO＿(1018)单独刺激和用其与IRP SEQID NO＿(869)、IRP SEQ ID NO＿(661)、IRP SEQ ID NO＿(954)、IRPSEQ ID NO＿(983)、IRP SEQ ID NO＿(984)、IRP SEQ ID NO＿(985)、IRP SEQ ID NO＿(986)、IRP SEQ ID NO＿(987)、IRP SEQ IDNO＿(988)、IRP SEQ ID NO＿(989)、IRP SEQ ID NO＿(990)、IRP SEQID NO＿(991)或对照寡核苷酸一起刺激的鼠脾细胞中IL-6的产生。
图28显示用R848单独刺激和用其与IRP SEQ ID NO＿(869)、IRPSEQ ID NO＿(661)、IRP SEQ ID NO＿(954)、IRP SEQ ID NO＿(983)、IRP SEQ ID NO＿(984)、IRP SEQ ID NO＿(985)、IRP SEQ IDNO＿(986)、IRP SEQ ID NO＿(987)、IRP SEQ ID NO＿(988)、IRP SEQID NO＿(989)、IRP SEQ ID NO＿(990)、IRP SEQ ID NO＿(991)或对照寡核苷酸一起刺激的鼠脾细胞中IL-6的产生。
本发明的实施方式我们公开了免疫调节性多核苷酸以及使用这些免疫调节性多核苷酸调节个体、特别是人中免疫应答的方法。本发明的组合物包含本文所述的免疫调节性多核苷酸。特别地，本发明的免疫调节性多核苷酸抑制先天免疫应答，包括涉及通过TLR7/8和/或TLR9传导信号的那些先天免疫应答。
我们已经发现，本发明的免疫调节性多核苷酸以多种方式有效调节免疫细胞，包括人细胞。我们曾经观察到，本发明的免疫调节性多核苷酸可以有效地抑制人细胞产生细胞因子，包括IFN-α、IL-6、IL-12和TNF-α。本发明的免疫调节性多核苷酸抑制通过TLR7/8和/或TLR9受体刺激的细胞应答，包括细胞因子产生。我们还观察到，本发明的免疫调节性多核苷酸可以有效抑制用免疫刺激性核酸刺激的细胞(包括B细胞和浆细胞样树突状细胞)的增殖和/或成熟。因此，本发明的IRP可用于抑制对ISNA如由于感染所出现的微生物DNA的免疫应答或者用于抑制对基因治疗所施用核酸载体的免疫应答。
本发明还提供通过向个体施用免疫调节性多核苷酸而治疗和预防个体中自身免疫病和慢性炎性失调的方法。
还提供了试剂盒，其包含本发明的IRP和/或IRC。试剂盒还包含用于向受试者施用本发明的免疫调节性多核苷酸以进行免疫调节的使用说明书。
一般技术除非另外指出，采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术(这些技术均是本领域的现有技术)可以开展本发明。此类技术在文献中有全面说明，例如Molecular CloningALaboratory Manual，第2版(Sambrook等人，1989)；OligonucleotideSynthesis(MJ.Gait编，1984)；Animal Cell Culture(R.I.Freshney编，1987)；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和CC.Blackwell编)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人，eds.，1987)；PCRThe polymerase Chain Reaction，(Mullis等人编，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编，1991)；The Immunoassay Handbook(D.Wild编，Stockton Press NY，1994)；Bioconjugate Techniques(Greg T.Hermanson编，Academic Press，1996)；以及Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.Albert和N.A.Staines编，WeinheimVCH Verlags gesellschaft mbH，1993)。
定义如本文所使用，除非另外指出，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数。例如“an”IRP包括一种或多种IRP。
如本文互换使用，“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”包括单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)和双链RNA(dsRNA)、修饰寡核苷酸和寡核苷或者其组合。寡核苷酸可以是线性或环状形式，或者寡核苷酸可包含线性片段和环状片段。寡核苷酸通常是通过磷酸二酯键(虽然在寡核苷酸中可以使用替代的连接键如硫代磷酸酯键)连接的核苷多聚体。核苷由结合至糖上的嘌呤(腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)或其衍生物)或者嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或其衍生物)碱基组成。在DNA中四种核苷单位(或碱基)被称作脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷和脱氧胞苷。核苷酸是核苷的磷酸酯。
如本文所用的术语“免疫刺激性核酸”或“免疫刺激性多核苷酸”指影响和/促成如通过体外、体内和/或先体外后体内所测量的可检测免疫应答的核酸分子(例如多核苷酸)。可测量免疫应答的实例包括但不限于抗原特异性抗体产生、细胞因子分泌、淋巴细胞群如NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞等的活化或扩增。已知免疫刺激性核酸(ISNA)序列刺激先天免疫应答，具体而言，这些应答通过细胞中TLR-9传导信号而发生。如本领域所已知，免疫刺激性核酸(ISNA)分子可从微生物来源如细菌分离，可以存在于用于基因治疗的核酸载体中或者可以使用本文所述且本领域已知的技术和设备合成。通常，免疫刺激性核酸序列包括至少一个CG二核苷酸，其中该二核苷酸中的C是非甲基化的。因此，在一些情况下，微生物感染和所施用的DNA可导致刺激先天免疫应答。
如本文所用的术语“免疫刺激性的”和“刺激免疫应答的”包括刺激参与免疫反应的细胞类型以及增强对特异抗原物质的免疫应答。通过免疫刺激性核酸刺激的免疫应答通常是“Th1型”免疫应答，这与“Th2型”免疫应答相对。通常，Th1型免疫应答的特征在于对抗原的“迟发型超敏”反应和活化的巨噬细胞功能，并且由于Th1相关细胞因子如IFN-γ、IL-2，IL-12和TNF-β水平提高可以在生物化学水平检测。Th2型免疫应答通常与高水平的抗体产生，特别是IgE抗体产生和提高的嗜酸性粒细胞数量和活化以及Th2相关细胞因子如IL-4、IL-5和IL-13的表达有关。
如本文所用的术语“先天免疫应答”和“先天免疫”包括多种先天的抵抗机制，通过这些机制细胞和个体识别病原体的存在并对其作出反应。如本文所使用，“先天免疫应答”包括当细胞识别病原体相关分子模式和信号时发生的细胞内和细胞间事件和反应。如本文所述，在先天免疫应答中具有活性的细胞受体包括Toll样受体(TLR)家族，并且已经鉴定出了几种TLR的微生物配体。
如本文所用的术语“免疫调节性序列”或“IRS”指抑制和/或阻抑可测量的先天免疫应答(如通过体外、体内和/或先体外后体内所测量)的核酸序列。如本文所用的术语“免疫调节性多核苷酸”或“IRP”指包含至少一种抑制和/或阻抑可测量的先天免疫应答(如通过体外、体内和/或先体外后体内所测量)的IRS的多核苷酸。对TLR如TLR-7、TLR-8或TLR-9的抑制包括但不限于在受体位点的抑制(例如通过阻断配体-受体结合)和对配体-受体结合后下游信号途径的抑制。可测量的先天免疫应答的实例包括但不限于细胞因子分泌、淋巴细胞群如NK细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞的活化或扩增、细胞群体如浆细胞样树突状细胞等的成熟。
如本文所使用的术语“免疫调节性化合物”或“IRC”指具有免疫调节活性并且包含含有IRS的核酸部分的分子。IRC可以由包含一个以上IRS的、由IRS组成的、或者其自身不具有免疫刺激性活性的核酸部分组成。IRC可以由多核苷酸组成(“多核苷酸IRC”)或者其可以包含另外的部分。因此，术语IRC包括整合了一个或多个核酸部分的化合物，在其中至少一个核酸部分包含共价连接至非核苷酸间隔子部分的IRC。
术语“回文序列”或“回文”指反向重复的核酸序列，例如ABCDD′C′B′A′，其中碱基A和A′、B和B′、C和C′、D和D′能够形成Watson-Crick碱基对。此类序列可以是单链的，或者可以形成双链结构或者在一定条件下形成发夹环结构。例如，如本文所使用的“8碱基回文”指回文序列长度为8个碱基的核酸序列，例如ABCDD′C′B′A′。回文序列可以是还包含非回文序列的多核苷酸的部分。多核苷酸可以包含一个或多个回文序列部分和一个或多个非回文序列部分。备选地，多核苷酸序列可以是全部回文序列。在具有一个以上回文序列部分的多核苷酸中，回文序列部分可以彼此重叠，或者回文序列部分彼此不重叠。
术语“3′”通常指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或位置3′(下游)的区域或位置。术语“3′端”指多核苷酸的3′末端。
术语“5′”通常指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸的另一区域或位置5′(上游)的区域或位置。术语“5′端”指多核苷酸的5′末端。
术语“缀合”指其中IRP和/或IRC被连接的复合物。此类连接键包括共价和/或非共价键。
“佐剂”指当加入免疫原性试剂如抗原时非特异性提高或增强暴露于该混合物的受体宿主中对该试剂的免疫应答的物质。
术语“肽”是实现生物学应答如抗体产生或细胞因子活性的具有足够长度的多肽和组合物，而不管肽是否是半抗原。一般肽长度至少6个氨基酸残基。术语“肽”还包括修饰的氨基酸(无论是天然存在的还是非天然存在的)，此类修饰包括但不限于磷酸化、糖基化、聚乙二醇化、脂化和甲基化。
“递送分子”或“递送工具”是促进、许可和/或增强IRP和/或IRC向特定位点递送和/或在特定时限递送的化学部分。
“个体”是脊椎动物，例如鸟类，优选是哺乳动物，更优选是人。哺乳动物包括但不限于人、灵长类、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。
物质的“有效量”或“足够量”是足以实现有益结果或渴望结果(包括临床结果)的数量，照此，“有效量”取决于待使用的环境背景。在施用抑制TLR-9依赖性免疫应答的组合物的情况下，IRP的有效量是足以抑制或降低细胞对通过TLR-9的刺激作出应答的数量。在施用抑制TLR-7/8依赖性免疫应答的组合物的情况下，IRP的有效量是足以抑制或降低细胞对通过TLR-7/8的刺激作出应答的数量。有效量可以一次施用或者多次施用。
如本文所用的术语“共施用”指在时间上足够近地施用至少两种不同的物质以调节免疫应答。优选地，共施用指同时施用至少两种不同的物质。
应答或参数的“阻抑”或“抑制”包括当与除目的条件和参数外的相同条件相比，或者备选地与另一条件相比应答或参数降低。例如，与例如免疫刺激性核酸单独诱导的细胞因子产生相比，包含阻抑免疫刺激性核酸所诱导细胞因子产生的IRP的组合物降低了细胞因子的产生。又例如，与例如先天免疫应答单独产生的细胞因子程度和/水平相比，包含阻抑与先天免疫应答相关细胞因子产生的IRP的组合物降低了细胞因子产生程度和/或水平。B细胞“阻抑”包括例如B细胞增殖降低、B细胞活性降低和/或所刺激B细胞产生细胞因子如IL-6和/或TNF-α降低。TLR应答，如TLR-7、TLR-8或TLR-9应答包括但不限于在受体位点的抑制(例如通过防止或阻断配体-受体的有效结合)和下游信号途径(例如在配体-受体有效结合之后)的抑制。
应答或参数的“刺激”包括引出和/或增强该应答或参数。例如，对免疫应答如先天免疫应答或Th1应答的“刺激”意味着应答增强，其可以源自对应答的引出和/或增强。类似地，对细胞因子或细胞类型(例如CTL)的刺激意味着细胞因子或细胞类型数量或水平提高。对B细胞的“刺激”包括例如增强B细胞增殖、诱导B细胞活化和/或提高细胞因子如IL-6和/或TNF-α自所刺激B细胞的产生。
如本文所使用并且如本领域众所周知，“治疗”是得到有益结果或渴望结果，包括临床结果的方法。为了本发明的目的，有益或渴望临床结果包括但不限于可检测到的或检测不到的缓和或改善一种或多种症状、疾病范围缩小、稳定疾病状态(即不恶化)、防止疾病扩散、延缓或减慢疾病进程、改善或减轻疾病状态、和好转(不管是部分还是全部)。“治疗”还意味着与不接受治疗时的预期存活期相比，存活期延长。
“减轻”疾病或失调意味着与未治疗的失调相比，失调或疾病状态的程度和/或不需要的临床表现减少和/或进展的时间进程变慢或延长。特别是在自身免疫病的情况下，如本领域技术人员众所周知，当调节或降低有害免疫应答时则会出现减轻。此外，施用一次剂量没有必要出现减轻，常常是在施用一系列剂量时出现减轻。一次足以减轻应答或失调的数量可以一次或多次施用。
如本文所使用，术语“包含”和其同类词以其“包含性”的含义使用，这相当于术语“包括”和其相应同类词。
本发明的组合物本发明提供了用于调节个体中先天免疫应答的免疫调节性序列(IRS)、免疫调节性多核苷酸(IRP)和免疫调节性化合物(IRC)。每一种本发明的IRP和IRC包含至少一个IRS。
本发明的组合物包含单独的免疫调节性多核苷酸或免疫调节性化合物(或者两种或多种IRP和/或IRC的组合)。本发明的组合物可以包含IRP或IRC和可药用赋形剂。可药用赋形剂包括缓冲液，其在本文中描述并且为本领域所已知。RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing(2000)。
免疫调节性多核苷酸和免疫调节性化合物按照本发明，IRP或IRC包含至少一个免疫调节性序列。在一些情况下，免疫调节性序列(IRS)包含5′-G，C-3′序列。在一些情况下，IRS在多核苷酸的5′端或附近包含至少一个TGC三核苷酸序列(即5′-TGC)。在一些情况下，IRS包含5′-GGGG-3′序列。在一些情况下，IRS不包含5′-GGGG-3′序列。因此，在一些情况下，IRP或IRC不包含5′-GGGG-3′序列。在一些情况下，当以单链形式使用时，包含5′-GGGG-3′序列的IRP或IRC特别有效。在一些情况下，当主链是硫代磷酸主链时，包含5′-GGGG-3′序列的IRP或IRC特别有效。
如本文所证明，特定的IRP和IRC抑制TLR-7和/或TLR-8依赖性细胞应答。同样，特定的IRP和IRC抑制TLR-9依赖性细胞应答，并且特定性IRP和IRC抑制TLR-7/8依赖性细胞应答和TLR-9依赖性细胞应答。如本文所使用，“TLR-7/8”指“TLR-7和/或TLR-8”。因此，如本文所使用，“TLR-7/8/9”指“(TLR-7和/或TLR-8)和TLR-9”。在本文中还显示，某些IRP不抑制TLR4依赖性细胞应答。
免疫刺激性核酸和其他先天免疫应答刺激物已经在本领域中描述过，并且可以使用指示多方面先天免疫应答如细胞因子分泌、抗体产生、NK细胞活化、B细胞增殖、T细胞增殖、树突状细胞成熟的标准测定法容易地测定它们的活性。参见例如Krieg等人，(1995)Nature 374546-549；Yamamoto等人，(1992)J.Immunol.1484072-4076；Klinman等人，(1997)J Immunol.1583635-3639；Pisetsky(1996)J.Immunol.156421-423；Roman等人，(1997)Nature Med.3849-854；Hemmi等人，(2000)，同上；Lee等人(2003)，同上；WO 98/16247；WO 98/55495；WO 00/61151以及美国专利号6,225,292。因此这些方法和其他方法可用于鉴定、测试和/或证实免疫调节性序列、多核苷酸和/或化合物。例如当先天免疫应答已经被刺激的细胞或个体与IRP或IRC接触时可以确定IRP或IRC的影响。
如本文所明确表述，应当理解的是，对于本文所述的公式，可以独立选择任意参数和全部参数。例如，如果x＝0-2，y可以独立选择而不管x(或者公式中的任意其他选择参数)为何值。优选地，包含IRS的IRP或IRC是具有至少一个硫代磷酸主链键的寡核苷酸。
如本文所证明，所发现的一类IRS在抑制TLR9依赖性细胞刺激中特别有效。因此，具有该活性的IRS被称为“TLR9类”IRS。
在一些实施方案中，IRS可包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO1)的序列，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是X1＝C或A，则X2X3不是AA。在一些实施方案中，IRS可包含式SEQ ID NO1的序列，其中X1是C或A。在一些实施方案中，IRS可包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO2)的序列，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是X1＝C或A，则X2X3不是AA，并且其中X1是C或A。
在一些实施方案中，IRS可包含式GGNnX1GGGGX2X3(SEQ ID NO3)的序列，其中n是从1至大约100(优选从1至大约20)的整数，每一个N是一个核苷酸，并且X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是X1＝C或A，则X2X3不是AA。在一些实施方案中，IRS可包含式式SEQ ID NO3的序列，其中X1是C或A。
在一些实施方案中，IRS可包含式NiTCCNj(GG)kNmX1GGGGX2X3(SEQ ID NO4)的序列，其中每一个N是一个核苷酸，i是从1至大约50的整数，j是从1至大约50的整数，k是0或1，m是从1至大约20的整数，并且X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。在一些实施方案中，IRS可包含式SEQ ID NO4的序列，其中X1是C或A。
在一些实施方案中，IRS可包含式X1X2X3GGGGAA(SEQ ID NO5)的序列，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X3＝C或A，则X1X2不是GG。
包含SEQ ID NO1、2、3、4或5的寡核苷酸序列的实例包括下列序列5′-TCCTAACGGGGAAGT-3′(SEQ ID NO10(C827))；5′-TCCTAAGGGGGAAGT-3′(SEQ ID NO11(C828))；5′-TCCTAACGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO12(C841))；
5′-TCCTAACGGGGCTGT-3′(SEQ ID NO13(C842))；5′-TCCTCAAGGGGCTGT-3′(SEQ ID NO14(C843))；5′-TCCTCAAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO15(C844))；5′-TCCTCATGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO16(C845))；5′-TCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO17(C869))；5′-TCCTGGAGGGGCTGT-3′(SEQ ID NO18(C870))；5′-TCCTGGAGGGGCCAT-3′(SEQ ID NO19(C871))；5′-TCCTGGAGGGGTCAT-3′(SEQ ID NO20(C872))；5′-TCCGGAAGGGGAAGT-3′(SEQ ID NO21(C873))；和5′-TCCGGAAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO22(C874))。
在一些实施方案中，IRS可包含任意SEQ ID NO1、2、3、4或5的序列，其中至少一个G被7-脱氮-dG替代。例如，在一些实施方案中，IRS可包含序列5′-TCCTGGAGZ′GGTTGT-3′(Z′＝7-脱氮-dG；SEQ ID NO23(C920))。
包含SEQ ID NO1、2、3、4或5的多种IRP或包含SEQ ID NO1、2、3、4或5的IRP(其中至少一个G被7-脱氮-dG替代)在抑制TLR9依赖性细胞活化中特别有效。在抑制TLR9依赖性细胞信号同样有效的其它IRS序列包括下列序列5′-TGACTGTAGGCGGGGAAGATGA-3′(SEQ ID NO24(C533))；5′-GAGCAAGCTGGACCTTCCAT-3′(SEQ ID NO25(C707))；和5′-CCTCAAGCTTGAGZ′GG-3′(Z′＝7-脱氮-dG；SEQ ID NO26(C891))。
如本文所显示，一些IRS在抑制TLR7/8依赖性细胞刺激中特别有效。因此，具有该活性的IRS被称作“TLR7/8类”IRS。例如，包含序列5′-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO27(C661))的寡核苷酸抑制TLR7/8依赖性细胞刺激。
在一些实施方案中，IRS包含SEQ ID NOC661的片段并且包括至少10个碱基的其回文部分。例如，此类序列包括下列序列
5′-TGCTTGCAAGCTTGCAAG-3′(SEQ ID NO28(C921))；5′-TGCTTGCAAGCTTGCA-3′(SEQ ID NO29(C922))；5′-GCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO30(C935))；5′-CTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ 1D NO31(C936))；和5′-TTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO32(C937))。
在一些实施方案中，IRP由SEQ ID NO27(C661)或其片段组成。在一些实施方案中，IRP由SEQ ID NO27(C661)的片段组成并且包括至少10个碱基的其回文部分。
在一些实施方案中，有效抑制TLR7/8依赖性细胞刺激的IRP由序列5′-TGCNm-3′组成，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。在一些实施方案中，此IRP由序列5′-TGCNmA-3′、序列5′-TGCNmCA-3′或序列5′-TGCNmGCA-3′组成。例如，在一些实施方案中，IRP可以由下列序列组成5′-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-3′(SEQ ID NO33(C917))；5′-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-3′(SEQ ID NO34(C918))；5′-TGCTTGACAGCTTGACAGCA-3′(SEQ ID NO35(C932))；5′-TGCTTAGCAGCTATGCAGCA-3′(SEQ ID NO36(C933))；或5′-TGCAAGCAAGCTAGCAAGCA-3′(SEQ ID NO37(C934))。
在抑制TLR7/8依赖性细胞信号中同样有效的其它IRS序列包括下列序列5′-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAGCTT-3′(SEQ ID NO38(C793))；5′-TGCTGCAAGCTTGCAGATGAT-3′(SEQ ID NO39(C794))；5′-TGCTTGCAAGCTTGCAAGC-3′(SEQ ID NO40(C919))；5′-TGCAAGCTTGCAAGCTTGCAAT-3′(SEQ ID NO41(C923))；5′-TGCTTGCAAGCTTG-3′(SEQ ID NO42(C930))；5′-AGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO43(C938))；5′-TACTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO44(C939))；
5′-TGATTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO45(C940))；5′-AAATTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO46(C941))；5′-TGCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO47(C945))；5′-AAATTGACAGCTTGACAGCA-3′(SEQ ID NO48(C951))；5′-TGATTGACAGCTTGACAGCA-3′(SEQ ID NO49(C959))；5′-TGATTGACAGATTGACAGCA-3′(SEQ ID NO50(C960))；和5′-TGATTGACAGATTGACAGAC-3′(SEQ ID N051(C961))。
另一类IRS包括在抑制TLR7/8依赖性细胞刺激和TLR9依赖性细胞刺激两者中特别有效的那些。因此，具有该活性的IRS被称作“TLR7/8/9类”IRS。在一些情况下，TLR7/8类IRS与TLR9类IRS的组合导致产生TLR7/8/9类IRS。
TLR7/8/9类IRS包括包含序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO6)的那些，其中每一个N是一个核苷酸，m是从0至大约100、在一些情况下从0至大约50、优选从0至大约20的整数。
在一些实施方案中，IRS包含SEQ ID NO6，其中序列N1-Nm包含序列5′-TTGACAGCTTGACAGCA-3′(SEQ ID NO7)的片段。SEQ ID NO7的片段是该序列的任意部分，例如TTGAC或GCTTGA。在一些实施方案中，SEQ ID NO7的片段来自SEQ ID NO7的5′端，包括例如TTGAC或TTG。
在一些实施方案中，IRS包含序列5′-TGCRRZNYY-3′(SEQ IDNO8)，其中Z是除C外的任意核苷酸，N是任意核苷酸，当Z不是G或肌苷时N是鸟苷或肌苷。在另外的实施方案中，IRS包含序列5′-TGCRRZN聚(嘧啶)-3′(SEQ ID NO9)，其中Z是除C外的任意核苷酸，N是任意核苷酸，当Z不是G或肌苷时N是鸟苷或肌苷。
在抑制TLR7/8/9依赖性细胞信号中同样有效的IRS序列的实例包括下列序列5′-TGCTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO52(C954))；5′-TGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO53(C956))；
5′-TGCTTGACATCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO54(C957))；5′-TGCTTGACAGCTTGACAGTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ IDNO55(C962))；5′-TGCTTGACAGCTTGATCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ IDNO56(C963))；5′-TGCTTGACAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO57(C964))；5′-TGCTTGACAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ IDNO58(C965))；5′-TGCTTGACAGCTTGCTTGTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ IDNO59(C966))；5′-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO60(C967))；5′-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO61(C968))；5′-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGGT-3′(SEQ IDNO62(C969))；5′-TGCTTGACAGCTTGACAGCATCCTGGAGGGG-3′(SEQ IDNO63(C970))；5′-TGCTTGCAAGCTTGCTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ IDNO64(C971))；5′-TGCTTGCAAGCTTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ IDNO65(C972))；和5′-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCATCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO66(C908))。
如本文所述，一些IRP在抑制TLR9依赖性细胞应答中特别有效。此类IRP包括但不限于SEQ ID NO24(C533)；SEQ ID NO25(C707)；SEQID NO86(1019)；SEQ ID NO91(C891)；SEQ ID NO10(C827)；SEQ IDNO11(C828)；SEQ ID NO12(C841)；SEQ ID NO13(C842)；SEQ IDNO14(C843)；SEQ ID NO15(C844)；SEQ ID NO16(C845)；SEQ IDNO17(C869)；SEQ ID NO18(C870)；SEQ ID NO19(871)；SEQ IDNO20(C872)；SEQ ID NO21(C873)；SEQ ID NO22(C874)；SEQ IDNO23(C920)以及SEQ ID NO66(C908)。
如本文所述，一些IRP在抑制TLR7/8依赖性细胞应答中特别有效。此类IRP包括但不限于SEQ ID NO17(C869)；SEQ ID NO23(C920)；SEQ ID NO27(C661)；SEQ ID NO38(C793)；SEQ ID NO29(C794)；SEQ ID NO33(C917)；SEQ ID NO34(C918)；SEQ ID NO40(C919)；SEQ ID NO28(C921)；SEQ ID NO29(C922)；SEQ ID NO41(C923)和SEQ ID NO66(C908)。
IRP可以是单链或双链DNA以及单链或双链RNA或其他修饰的多核苷酸。IRP可以是线性的，可以是环状的或者包含环状部分和/或包括发夹环。IRP可以包含天然存在的碱基或者修饰的、非天然存在的碱基，并且可以包含修饰的糖、磷酸和/或末端。多种此类修饰在本文描述。
掺入IRP的杂环碱基或核酸碱基可以是天然存在的首要的嘌呤和嘧啶碱基(即上面提到的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤)以及所述首要碱基的天然存在修饰和合成修饰。因此，IRP可以包括2′-脱氧尿苷和/或2-氨基-2 ′-脱氧腺苷。
IRP可以包含至少一种修饰的碱基。如本文所使用，术语“修饰的碱基”与“碱基类似物”同义，例如“修饰的胞嘧啶”与“胞嘧啶类似物”同义。同样，“修饰的”核苷或核苷酸在本文定义为与核苷或核苷酸“类似物”同义。碱基修饰的实例包括但不限于向IRP的胞嘧啶C-5和/或C-6中加入吸电子部分。优选地，吸电子部分是卤素，例如5-溴胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-碘胞嘧啶。碱基修饰的另外实例包括但不限于向免疫调节性多核苷酸的尿嘧啶C-5和/或C-6中加入吸电子部分。优选地，吸电子部分是卤素。此类修饰的尿嘧啶可以包括但不限于5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-碘尿嘧啶。
碱基修饰的另外实例包括向碱基中加入一个或多个硫醇基，包括但不限于6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶和4-硫代尿嘧啶。碱基修饰的另外实例包括但不限于N4-乙基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和5-羟基胞嘧啶。参见例如Kandimalla等人，(2001)Bioorg.Med.Chem.9807-813。
IRP可以包含磷酸修饰的多核苷酸，已知其中一些磷酸修饰能稳定多核苷酸。因此，一些实施方案包括稳定的免疫调节性多核苷酸。例如，除了磷酸二酯键外，磷酸修饰包括但不限于甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、磷酰胺酯(桥连或非桥连)、磷酸三酯和二硫代磷酸酯并且可以任意组合使用。还可以使用另外的非磷酸键。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸仅包含硫代磷酸主链。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸仅包含磷酸二酯主链。在一些实施方案中，IRP在磷酸主链中包含磷酸酯键的组合，例如磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的组合。
本发明中使用的IRP可以包含一个或多个核糖核苷酸(包含作为唯一或首要糖成分的核糖)、脱氧核糖核苷酸(包含作为首要糖成分的脱氧核糖)，或者如本领域所知，在IRP中可掺入修饰的糖或糖类似物。因此，除了核糖和脱氧核糖以外，糖部分可以是戊糖、脱氧戊糖、己糖、脱氧己糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖以及糖“类似物”环戊基。糖可以是吡喃形式或呋喃形式。在IRP中，糖部分优选为核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖或2′-0-烷基核糖的呋喃糖苷，并且糖可以以α或β端基异构构型连接至各个杂环碱基上。糖修饰包括但不限于2′-烷氧基-RNA类似物、2 ′-氨基-RNA类似物、2′-氟-DNA和2 ′-烷氧基-RNA/DNA嵌合体或2′-氨基-RNA/DNA嵌合体。例如，IRP中糖修饰包括但不限于2′-O-甲基-尿嘧啶和2′-O-甲基-胞嘧啶。这些糖或糖类似物以及此类糖或类似物连接至杂环碱基(核酸碱基)的各个“核苷”的制备本身是已知的，不需要在此处描述，除非涉及到任何特定实例的制备。在IRP制备中，还可以进行糖修饰并且可以糖修饰和任何磷酸修饰的组合。
可以使用本领域众所周知的技术和核酸合成设备合成IRP，其中所述技术包括但不限于酶方法、化学方法以及较大寡核苷酸序列的降解。参见例如Ausubel等人，(1987)；以及Sambrook等人，(1989)。当使用酶学方法装配时，各个单元可以被连接起来，例如使用连接酶如T4 DNA连接酶或T4 RNA连接酶。美国专利号5,124,246。如在美国专利号4,650,675中所例证，寡核苷酸降解可以通过将寡核苷酸与核酸酶接触而实现。
可使用常规多核苷酸分离方法分离IRP。此类方法包括但不限于将探针与基因组文库或cDNA文库杂交以检测共享核苷酸序列、对表达文库进行抗体筛选以检测共享结构特征、以及通过聚合酶链式反应合成特定天然序列。
可分离或通过重组方法或化学合成方法合成环状免疫调节性多核苷酸。在环状IRP通过分离得到或通过重组方法得到的情况下，IRP优选是质粒。较小的环状寡核苷酸的化学合成可以使用文献中描述的任何方法实现。参见例如Gao等人，(1995)Nucleic Acids Res.232025-2029；以及Wang等人(1994)Nucleic Acids Res.222326-2333。
制备多核苷酸和修饰多核苷酸的技术是本领域已知的。包含磷酸二酯键的天然存在的DNA或RNA一般如下合成，即将适宜核苷亚磷酰胺与在3′-端连接至固相支持物上的生长端寡核苷酸的5′-羟基依次偶联，然后将中间的亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯。一旦合成了所期望的多核苷酸序列，则将多核苷酸从支持物上去除，磷酸三酯被脱保护成为磷酸二酯，并且使用氨水或其他碱将核苷碱基脱保护。参见例如Beaucage(1993)″寡脱氧ribo核苷酸Synthesis″，在Protocols for Oligonucleotids and Analogs，Synthesisand Properties中，(Agrawal编)Humana Press，Totowa，NJ；Warner等人，(1984)DNA 3401以及美国专利号4,458,066。
对于包含修饰磷酸键或非磷酸键的多核苷酸的合成是本领域已知的。对于综述参见Matteucci(1997)″Oligonucleotide Analogsan Overview″，在Oligonucleotide as Therapeutic Agents中，(DJ.Chadwick和G.Cardew编)John Wiley and Sons，New York，NY。可以连接至本发明多核苷酸中糖或糖类似物部分的磷衍生物(或修饰磷酸基)可以是一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、膦酸烷基酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等。上述磷酸类似物的制备以及它们向核苷酸、修饰核苷酸和寡核苷酸中的掺入本身也是本领域已知的，不需在此描述。Peyrottes等人，(1996)NucleicAcids Res.241841-1848；Chaturvedi等人(1996)Nucleic Acids Res.242318-2323；以及Schultz等人(1996)Nucleic Acids Res.242966-2973。例如，硫代磷酸酯寡核苷酸的合成类似于上述天然存在寡核苷酸的合成，只是氧化步骤换成硫化步骤(Zon(1993)″Oligonucleoside Phosphorothioates″，在Protocols for Oligonucleotides and Analogs，Synthesis and Properties中(Agrawal编)Humana Press，第165-190页)。类似地，也已经描述了其它磷酸类似物如磷酸三酯(Miller等人，(1971)JACS 936657-6665)、非桥连氨基磷酸酯(Jager等人，(1988)Biochem.277247-7246)、N3′至P5′的氨基磷酸酯(Nelson等人，(1997)JOC 627278-7287)以及二硫代磷酸酯(美国专利号5,453,496)的合成。还可使用其它基于非磷修饰的寡核苷酸(Stirchak等人，(1989)Nucleic Acids Res.176129-6141)。
本领域技术人员将认识到，包含多种杂环碱基和多种糖部分(和糖类似物)的“合成性”非天然核苷在本领域是可以获得的，并且IRP可以包括除天然存在核酸中的5种首要碱基成分以外的一种和多种杂环碱基，只要能够满足本发明的其他原则即可。然而，IRP中的杂环碱基优选包括但不限于尿嘧啶-5-基、胞嘧啶-5-基、腺嘌呤-7-基、腺嘌呤-8-基、鸟嘌呤-7-基、鸟嘌呤-8-基、4-氨基吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基、2-氨基-4-氧代吡咯并[2，3-d]嘧啶-3-基，其中嘌呤通过9-位与IRP中的糖部分连接，嘧啶通过1-位连接，吡咯并嘧啶通过7-位连接，吡唑并嘧啶通过1-位连接。
已经在例如美国专利号4,910,300、4,948,882和5,093,232中描述了碱基修饰核苷的制备以及使用所述碱基修饰核苷作为前体对修饰寡核苷酸的合成。对这些碱基修饰核苷进行设计，使得能够通过化学合成将其掺入到寡核苷酸的末端或内部。在寡核苷酸末端或内部存在的此类碱基修饰核苷可作为肽连接的位点。其糖部分经过修饰的核苷也已有描述(包括但不限于美国专利号4,849,513、5,015,733、5,118,800、5,118,802)并且同样可以使用。
在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸小于大约下列长度(表示为碱基或碱基对)10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；60；50；40；30；25；20；15；14；13；12；11；10；9；8；7；6；5；4。在一些实施方案中，免疫调节性多核苷酸小于大约下列长度(表示为碱基或碱基对)4；5；6，7，8，9，10；11；12；13；14；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500；10000；20000；50000。备选地，免疫调节性多核苷酸大小可以是具有上限10,000；5,000；2500；2000；1500；1250；1000；750；500；300；250；200；175；150；125；100；75；60；50；40；30；25；20；15；14；13；12；11；10；9；8；7；6；5；4和独立选择的下限4；5；6；7；8；9；10；11；12；13；14；15；20；25；30；40；50；60；75；100；125；150；175；200；250；300；350；400；500；750；1000；2000；5000；7500的任意范围，其中下限小于上限。在一些实施方案中，IRP长度优选大约200个碱基或更少。
本发明还提供了制备本文所述免疫调节性多核苷酸的方法。方法可以是本文所述那些方法中的任意方法。例如方法可以是IRP合成(例如使用固相合成)并且还可以包含任何纯化步骤。纯化方法是本领域已知的。
在某些实施方案中，本发明涉及具有免疫调节活性并包含含有IRS的核酸部分的免疫调节性化合物(IRC)。本发明的IRC包含一个或多个核酸部分和一个或多个非核酸间隔子部分。符合多种结构式的化合物可考虑用作IRC，包括在下面式I-VII中所述的核心结构。式I-III显示“线性IRC”的核心序列。式IV-VI显示“分支IRC”的核心序列。式VII显示“单间隔子IRC”的核心结构。
在本文提供的每一个结构式中，“N”指核酸部分(以5′→＞3′方向或者3′→5′方向)并且“S”指非核酸间隔子部分。破折号(“-”)指核酸部分与非核酸间隔子部分间的共价键。双破折号(“--”)指非核酸间隔子部分与至少2个核酸部分间的共价键。三破折号(“---”)指非核酸间隔子部分与多个(即至少3个)核酸部分间的共价键。下角标用于指出不同位置的核酸或非核酸间隔子部分。然而，使用下角标区分不同核酸部分不是表示部分必须具有不同的结构或序列。同样，使用下角标区分不同间隔子部分不是表示部分必须具有不同的结构。例如，在下式II中，N1和N2所指的核酸部分可以具有相同或不同的序列，S1和S2所指的间隔子部分可以具有相同或不同的结构。还考虑到，可以在核心结构的末端共价结合另外的化学部分(例如磷酸酯、一核苷酸、另外的核酸部分、烷基、氨基、硫代或二硫基或连接基团和/或间隔子部分)。
线性IRC具有如下结构，即核心结构中的非核酸间隔子部分与不超过2个核酸部分共价结合。例证性线性IRC符合下式N1-S1-N2(I)N1-S1-N2-S2-N3(II)N1-S1-N2-S2-[Nv-Sv]A(III)其中A是1至大约100间的整数，[Nv-Sv]指结合至非核酸间隔子部分的核酸部分的A个额外重复。下角标“v”指N和S独立地在[Nv-Sv]的每一重复中选择。“A”是1和大约10之间的次数，有时是1和3之间的次数，有时次数恰恰是1、2、3、4或5。在一些实施方案中，A是通过下限1、2、3、4或5与独立选择的上限10、20、50或100所定义的范围内的整数(例如在3和10之间)。
例证性的IRC包括N1-HEG-N2-OH (Ia)N1-HEG-N1-PO4(Ib)N1-HEG-N2-HEG (Ic)HEG-N1-HEG-N1-HEG (Id)N1-HEG-N2-HEG-N1(Ie)N1-HEG-N2-(HEG)4-N3(If)(N1)2-甘油-N1-HEG-N1(Ig)PO4-N1-HEG-N2(Ih)
N1-(HEG)15-T (Ii)(N1-HEG)2-甘油-HEG-N2(Ij)N1-HEG-T-HEG-T(Ik)其中HEG指六乙二醇。TEG指四乙二醇。
优选的线性IRC包括5′-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO67(C907，C661-HEG-C869)；5′-TGCTTGCAAGCTAGCAAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO68(C913，C917-HEG-C869)；5′-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ ID NO69(C914，C918-HEG-C869)；5′-TGCTTGCAAGCTTGCTAGCA-HEG-TCCTGGAGZGGTTGT-3′(SEQ ID NO70(C916，C661-HEG-C920)；和5′-TCCTGGAGGGGTTGT-HEG-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQ ID NO71(C928，C869-HEG-C661)。
分支IRC包含共价结合至至少3个核酸部分的多价间隔子部分(Sp)。例证性的分支IRC根据下式描述[Nv]A---Sp(IV)[Sv-Nv]A---Sp(V)(S1-N1)-Sp--(Nv)A(VI)其中Sp是共价结合至数量“A”个独立选择的核酸部分Nv、Sv-Nv(其包含共价结合至核酸部分的间隔子部分)上的多价间隔子。对于式IV和V，A至少为3。虽然A可以是通过下限约3、5、10、50或100与独立选择的上限约5、7、10、50、100、150、200、250或500所定义范围内的整数，或者备选地A可以大于500，但是在式IV和V的多个实施方案中A是3和100(包括)之间的整数。对于式VI，A至少为2，或者是通过下限2、5、10、50或100与独立选择的上限5、10、50、100、150、200、250或500所定义范围内的整数，或者大约500。
例证性的分支IRC包括(N1)2-甘油-N1(IVa)(N2-HEG)2-甘油-N1(IVb)(N1-HEG-N2)2-甘油-N1(IVc)[(N1)2-甘油-N1]2-甘油-N1(IVd)。
优选的分支IRC包括(5′-N1-3′-HEG)2-甘油-HEG-5′-N1-3′和(5′-N1-3′-HEG)2-甘油-HEG-5′-N1。
单一间隔子IRC包含单一核酸部分与单一间隔子部分共价连接的结构，即N1-S1(VII)。
在优选的实施方案中，S1具有包含更小单位(例如HEG、TEG、甘油、1′2′-二脱氧核糖、C2烷基-C12烷基亚单位等)的、一般通过酯键(例如磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接的多聚体结构，例如如下文所述。参见例如下式VIIa。多聚体可以是异聚体或同聚体。在一个实施方案中，间隔子是通过酯键(例如磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接的单体单位(例如HEG、TEG、甘油、1′2′-二脱氧核糖、C2烷基至C12烷基接头等)的异聚体。参见下式VIIb。
例证性的单间隔子IRC包括N1-(HEG)15(VIIa)N1-HEG-丙基-HEG-丙基-HEG (VIIb)。
在某些实施方案中，IRC的末端结构共价连接(例如核酸部分-与-核酸部分连接；间隔子部分-与-间隔子部分连接；或者核酸部分-与-间隔子部分连接)，导致产生环状构象。
用于免疫调节性本发明的组合物中的IRC包括至少一个核酸部分。如本文所使用的术语“核酸部分”指核苷酸单体(即单核苷酸)或多聚体(即包含至少2个连续核苷酸)。如本文所使用，核苷酸包含(1)连接至糖的嘌呤或嘧啶碱基(连接磷酸基的酯键)或(2)类似物(其中碱基和/或糖和/或磷酸酯被类似物替代)，例如如下文所述。在包含一个以上核酸部分的IRC中，核酸部分可以相同或者不同。
掺入到免疫调节性组合物中的IRC中使用的核酸部分可以包含本文公开的任意IRS任何序列，并且可以是6个碱基对或更少的序列。本发明考虑了，在包含多个核酸部分的IRC中，核酸部分的长度可以相同或不同。在IRC包含一个以上核酸部分的某些实施方案中，仅一个部分需要包含IRS。
本发明考虑了，在包含多个核酸部分的IRC中，核酸部分可以相同或不同。因此，在不同的实施方案中，掺入到免疫调节性组合物中的IRC包含(a)具有相同序列的核酸部分、(b)核酸部分的一个以上重复、或者(c)两个或多个不同核酸部分。此外，单一核酸部分可以包含一个以上IRS，它们可以是邻近的、重叠的或通过核酸部分内的另外的核苷酸碱基分开的。
如本文所述，一些IRP在抑制TLR9依赖性细胞应答中特别有效，而一些IRP在抑制TLR7/8依赖性细胞应答中特别有效。由于IRC可以包含一个以上的IRP，所以可以组合具有不同活性的IRP产生具有特定活性的IRC用于特定用途。
在一些情况下，IRC中两种IRP的组合导致IRC的免疫调节活性不同于单独的IRP。例如IRC SEQ ID NO68(C913)包含通过HEG部分连接的IRP SEQ ID NO.33(C917)和IRP SEQ ID NO17(C869)。IRP SEQ IDNO33(C917)抑制TLR-7/8依赖性细胞应答但不抑制TLR-9依赖性细胞应答。IRP SEQ ID NO17(C869)对TLR-9依赖性细胞应答的抑制活性比对TLR-7/8依赖性细胞应答的抑制活性大。然而，IRC SEQ ID NO68(C913)在抑制TLR-7/8依赖性细胞应答和TLR-9依赖性细胞应答两者中非常活跃。对于IRC SEQ ID NO69(C914)及其成分IRP SEQ ID NO34(C918)和SEQ ID NO17(C869)亦如此。
IRC包含共价结合至核酸部分的一个或多个非核酸间隔子部分。为方便起见，非核酸间隔子部分在本文中有时简称为“间隔子”或“间隔子部分”。间隔子分子量通常为大约50至大约50,000，一般从大约75至大约5000，最经常地从大约75至大约500，在不同的实施方案中其共价结合至一个、两个、三个或三个以上核酸部分。多种试剂适宜连接核酸部分。例如，在科学文献中被称作“非核酸接头”、“非核苷酸接头”或“化合价平台分子”的多种化合物可用作IRC中的间隔子。在某些实施方案中，间隔子包含多个共价连接的亚单位，并且可以具有同多聚体或异多聚体结构。应当意识到，单核苷酸和多核苷酸不包括对非核酸间隔子的定义，没有这种排除，则核酸部分和邻近的非核酸间隔子部分没有不同。
在某些实施方案中，间隔子可包含一个或多个无碱基核苷酸(即缺乏核苷酸碱基，但具有糖和磷酸部分)。例证性的无碱基核苷酸包括1′2′-二脱氧核糖、1′-脱氧核糖、1′-脱氧阿拉伯糖和它们的聚合物。
其他适宜间隔子包含任选取代的烷基、任选取代的聚乙二醇、任选取代的聚胺、任选取代的多元醇、任选取代的聚酰胺、任选取代的聚醚、任选取代的聚亚胺、任选取代的聚磷酸二酯(例如聚(1-二氧磷基-3-丙醇))等。任选的取代基包括醇、烷氧基(如甲氧基、乙氧基和丙氧基)、直链或支链烷基(例如C1-C12烷基)、胺、氨基烷基(如氨基C1-C12烷基)、亚磷酰胺、磷酸、硫代磷酸、酰肼、肼、卤素(如F、Cl、Br或I)、酰胺、烷基酰胺(如酰胺C1-C12烷基)、羧酸、羧酸酯、羧酸酐、羧酸卤化物、磺酰卤、亚胺酯、异氰酸、异硫氰酸、haloformate、碳二亚胺加合物、醛、酮、巯基、卤代乙酰基、烷基卤化物、烷基磺酸、NR1R2(其中R1R2为-C(＝O)CH＝CHC(＝O))(马来酰亚胺)、硫醚、氰基、糖(如甘露糖、半乳糖和葡萄糖)、α，β-不饱和羰基、烷基汞、α，β-不饱和砜。
适宜的间隔子可以包含多环分子，例如包含苯环或环己基的那些。间隔子可以是聚醚如聚磷酸丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇，双功能多环分子如可以被取代或修饰的双功能并环戊二烯、茚、萘、、庚搭烯、亚联苯基、asymindacene、sym-indacene、苊、芴、phenalene、菲、蒽、荧蒽、acephenathrylene、醋蒽烯、苯并[9，10]菲、芘、chrysene、并四苯、噻蒽、异苯并呋喃、色烯、吨、phenoxathiin，或者聚醚和多环分子的组合。多环分子可以被C1-C5烷基、C6烷基、烯基、羟烷基、卤素或卤烷基取代或多取代。含氮的多杂环分子(例如中氮茚)一般不是适宜间隔子。间隔子可以是多元醇，如甘油或季戊四醇。在一个实施方案中，间隔子包含1-磷丙烷)3-磷酸或1-磷丙烷)4-磷酸(也称作四磷丙烷二醇和五磷丙烷二醇)。在一个实施方案中，间隔子包含衍生的2，2′-乙烯二氧二乙胺(EDDA)。
可用于IRC的非核酸间隔子的特定实例包括描述于Cload等人，(1991)J Am.Chem.Soc.1136324；Richardson等人，(1991)J Am.Chem.Soc.1135109；Ma等人，(1993)Nucleic Acids Res.212585；Ma等人，(1993)Biochemistry 321751；McCurdy等人，(1991)Nucleosides & 核苷酸s10287；Jaschke等人，(1993)Tetrahedron Lett.34301；Ono等人，(1991)Biochemistry 309914；以及国际公布号WO 89/02439中的“接头”。
其它适宜间隔子包括描述于Salunkhe等人，(1992)J.Am.Chem.Soc1148768；Nelson等人，(1996)Biochemistry 355339-5344；Bartley等人，(1997)Biochemistry 3614502-511；Dagneaux等人，(1996)Nucleic AcidsRes.244506-12；Durand等人，(1990)Nucleic Acids Res.186353-59；Reynolds等人，(1996)Nucleic Acids Res.24760-65；Hendry等人，(1994)Biochem.Biophys.Acta 1219405-12；Altmann等人(1995)Nucleic AcidsRes.234827-35中的接头。还有一些其它间隔子描述于欧洲专利号EP0313219B1以及美国专利号6,117,657中。
例证性的非核酸间隔子包括寡乙二醇(例如三乙二醇、四乙二醇、六乙二醇间隔子以及包含高达约10、约20、约40、约50、约100和约200个乙二醇单位的其它多聚体)、烷基间隔子(例如丙基、丁基、己基以及其它C2-C12烷基间隔子，如通常为C2-C10烷基、最经常为C2-C6烷基间隔子)、无碱基核苷酸间隔子、衍生自甘油、季戊四醇和1，3，5-三羟基环己烷的对称和不对称间隔子(例如本文描述的对称双重和三重间隔子部分)、间隔子还可以包含上述化合物的异聚和同聚寡聚体和多聚体(例如通过酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键、磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、氨基磷酸酯键、磷酸三酯键、二硫代磷酸酯键、甲基膦酸键和其它键)。
适宜间隔子部分可赋予IRC电荷和/或疏水性，赋予IRC有利的药物代谢动力学特性(例如改善的稳定性、在血液中具有更长的滞留时间)和/或导致IRC靶向特定细胞和器官。可选择和修饰间隔子部分以便使IRC对于渴望的施用模式(例如口服施用)具有渴望的药物代谢动力学特性或稳定性。应当意识到，为了方便起见，间隔子(或间隔子成分)有时通过间隔子成分从其衍生的成分的化学名称(例如六乙二醇)提到，应当理解，IRC实际上包含化合物和邻近核酸部分或其它间隔子部分成分的缀合。
在包含一个以上间隔子部分的IRC中，间隔子可以相同或不同。因此，在一个实施方案中，IRC中的所有非核酸间隔子部分具有相同的结构。在一个实施方案中，IRC包含具有至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个或以上不同部分的非核酸间隔子部分。
在本发明的一些预期实施方案中，IRC的间隔子部分被限定为不含某些结构。因此，在本发明的一些实施方案中，间隔子不是无碱基核苷酸或无碱基核苷酸多聚体。在本发明的一些实施方案中，间隔子不是寡聚(乙二醇)(例如HEG、TEG等)或多聚(乙二醇)。在一些实施方案中，间隔子不是C3烷基间隔子。在一些实施方案中，间隔子不是多肽。因此，在一些实施方案中，免疫原性分子如蛋白质或多肽不适宜用作间隔子部分成分。然而，如下文所讨论，在某些实施方案中考虑了，IRC是“蛋白质IRC”，即包含含有多肽的间隔子部分。然而，在一些实施方案中，间隔子部分不是蛋白质和/或不是抗原(即如果与IRC分离则间隔子部分不是抗原)。
通常，适宜间隔子部分不会使包含其的IRC在水溶液(例如PBS，pH7.0)中不溶。因此，间隔子定义排除了微米载体或纳米载体。此外，具有低溶解度的间隔子部分，如十二烷基间隔子(当以二醇前体1，12-二羟基十二烷测定时溶解度＜5mg/ml)不是优选的，因为其降低了IRC的亲水性和活性。优选地，当以二醇前体测定时，间隔子部分的溶解度远远大于5mg/ml(例如＞20mg/ml，＞50mg/ml或者＞100mg/ml)。
IRC的电荷可以由核酸部分的磷酸、硫代磷酸或其它基团以及非核酸间隔子部分中的基团提供。在本发明的一些实施方案中，非核酸间隔子部分带有净电荷(例如在pH7测定时带有净正电荷或净负电荷)。在一个有用的实施方案中，IRC具有净负电荷。在一些实施方案中，IRC的间隔子部分中负电荷通过如本文所述的衍生间隔子亚单位增加。例如，甘油可以共价结合至两个核酸部分，剩余的醇可以与活化亚磷酰胺反应，然后分别氧化或硫化以形成磷酸酯或硫代磷酸酯。在某些实施方案中，由IRC的非核酸间隔子部分提供的负电荷(即多于1个间隔子的电荷之和)大于IRC的核酸部分所提供的负电荷。电荷可以基于分子式计算或者通过实验确定，如通过毛细管电泳确定(Li编，1992，Ca丸剂ary electrophoresis，Principles，Practice and Application Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands，第202-206页)。
如上所述，适宜间隔子可以是较小的非核酸(例如非核苷酸)成分(例如如本文所述的其本身可用作间隔子的那些，包括通常称作非核苷酸“接头”的化合物)的多聚体。此类多聚体(即“多单位间隔子”)可以是异聚体或同聚体，常常包含通过酯键(例如磷酸二酯键或硫代磷酸酯键)连接的单体单位(例如HEG、TEG、甘油、1′2′-脱氧核糖等)。因此，在一个实施方案中，间隔子包含非核苷酸单位的多聚体(例如异多聚体)结构(例如从2至大约100单位，备选地从2至大约50，例如从2至大约5，备选地例如从大约5至大约50，例如从大约5至大约20)。
例如，包含SEQ ID NO17(C869)和多单位间隔子的IRC包括5′-TCCTGGAGGGGTTGT-(C3)15-T，5′-TCCTGGAGGGGTTGT-(甘油)15-T，5′-TCCTGGAGGGGTTGT-(TEG)8-T，5′-TCCTGGAGGGGTTGT-(HEG)4-T，其中，(C3)15意思是指通过硫代磷酸酯连接的15个丙基接头；(甘油)15意思是指通过硫代磷酸酯连接的15个甘油接头；(TEG)8意思是指通过硫代磷酸酯连接的8个三乙二醇接头；(HEG)4意思是指通过硫代磷酸酯连接的4个六乙二醇接头。应当意识到，一定的多单位间隔子具有净负电荷，并且负电荷可以通过提高酯连接的单体单位而增加。
在某些实施方案中，间隔子部分是多价非核酸间隔子部分(即“多价间隔子”)。如本文所使用，包含多价间隔子的IRC包含共价结合至3个或多个核酸部分的间隔子。多价间隔子有时在本领域称作“平台分子”。多价间隔子可以是多聚体或非多聚体。适宜分子实例包括甘油或取代甘油(例如2-羟甲基甘油、乙酰丙酰基-甘油)；四氨基苯、七氨基β环化糊精、1，3，5-三羟基环己烷、季戊四醇和季戊四醇衍生物、四氨基季戊四醇、1，4，8，11-四氮杂环十四烷(Cyclam)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷(Cyclen)、聚乙烯亚胺、1，3-二氨基-2-丙醇和取代衍生物、丙氧甲基]乙基化合物(例如“trebler”)、聚乙二醇衍生物如所谓的“Star PEG”和“bPEG”(参见例如Gnanou等人，(1988)Makromol.Chem.1892885；Rein等人，(1993)Acta Polymer44225；美国专利号5,171,264)以及树突状物(dendrimer)。
树突状物是本领域已知的并且在化学上被定义为是球状分子，一般通过多功能单体的逐步反应或反复反应得到枝状结构而制备(参见例如Tomalia等人，(1990)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.29138-75)。已知多种树突状物，例如胺结尾的聚酰胺胺、聚乙烯亚胺和聚丙烯亚胺树突状物。可用于本发明的例证性树突状物包括“dense star”多聚体或“starburst”多聚体，如美国专利号4,587,329；5,338,532；以及6,177,414中描述的那些，包括所谓的“聚(酰胺胺)(“PAMAM”)树突状物”。适宜在本发明中使用的其它多聚体间隔子分子包括化学限定的、非多聚体化合价平台分子，例如在美国专利号5,552,391；以及PCT申请公布WO 00/75105、WO96/40197、WO 97/46251、WO 95/07073和WO 00/34231中公开的那些。许多其它多价间隔子可以使用并且也是本领域技术人员已知的。
核酸部分与平台分子的缀合可通过任何多种方式实现，一般涉及核酸分子和台分子上的一个或多个交联剂或功能基。连接基团通过标准的合成化学技术加入至平台中。连接基团可使用标准合成技术加入至核酸部分中。
具有多个化合价的多价间隔子可用于本发明实践中，并且在不同的实施方案中，IRC的多价间隔子结合至大约3个和大约40个核酸部分上，常常结合至3-100个、有时3-50个、常常3-10个并且有时多于400个核酸部分上。在不同的实施方案中，多价间隔子被缀合至多于10、多于25、多于50或多于500个核酸部分上(其可以相同或不同)。应当意识到，在IRC包含多价间隔子的某些实施方案中，本发明提供了分子结构稍稍不同的一群IRC。例如，当使用树突状物作为高化合价制备IRC时，产生了包含不同数量(在或主要在可确定范围内)的连接至每一树突状物分子的核酸部分的多价间隔子IRC，即稍微异质的分子混合物。
衍生化以允许连接至核酸部分的多糖可以用作IRC中的间隔子。适宜的多糖包括天然存在的多糖(例如葡聚糖)和合成的多糖(例如菲可)。例如，氨乙基羧甲基-菲可(AECM-Ficoll)可通过Inman(1975)J.Imm.114704-709中的方法制备。然后，AECM-Ficoll与异双功能交联剂如6-马来酰亚胺基己酸乙酰N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，然后缀合至硫醇衍生的核酸部分上(参见Lee等人，(1980)Mol.Imm.17749-56)。其它多糖可以同样被修饰。
通过本说明书的指导以及根据本领域的知识，本领域技术人员能够使用常规方法制备IRC。制备核酸部分(例如寡核苷酸和修饰寡核苷酸)的技术是已知的。使用包括但不限于酶学方法和化学方法以及酶学方法与化学方法的组合在内的技术可以合成核酸部分。例如，通过顺序地将合适的核苷亚磷酰胺偶联至在3′连接至固相支持物上的正在生长的寡核苷酸的5′-羟基上，然后将中间产物亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯来化学合成包含磷酸二酯键的DNA或RNA。用于DNA合成的有用的固相支持物包括可控孔径玻璃(Controlled Pore Glass)(Applied Biosystems，Foster City，CA)、聚苯乙烯珠基质(Primer Support，Amersham Pharmacia，Piscataway，NJ)以及Tent凝胶剂(Rapp Polymere GmbH，Tubingen，Germany)。一旦合成了所希望的寡核苷酸序列，则将寡核苷酸从支持物上去除，将磷酸三酯基团脱保护成磷酸二酯并且使用氨水或其它碱将核苷碱基脱保护。
例如，包含磷酸二酯键的DNA或RNA多核苷酸(核酸部分)一般通过反复重复下列步骤合成a)从3′-固相支持物所结合核苷或核酸的5′-羟基去除保护基，b)将活化核苷亚磷酰胺偶联至5′-羟基上，c)将亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯，以及d)将非反应5′-羟基去端基。包含硫代磷酸酯键的DNA或RNA可如上所述制备，不同之处是将氧化步骤换成硫化步骤。一旦合成了所希望的寡核苷酸序列，则将寡核苷酸从支持物上去除，将磷酸三酯基团脱保护成为磷酸二酯，并且使用氨水或其它碱将核苷碱基脱保护。参见例如Beaucage(1993)“Oligodexoxyribonucleotide Synthesis”，在PROTOCOLS FOR OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGS，SYNTHESIS AND PROPERTIES(Agrawal编)中，Humana Press，Totowa，NJ；Warner等人，(1984)DNA 3401；Tang等人，(2000)Org.Process Res.Dev.4194-198；Wyrzykiewica等人，(1994)Bioorg.& Med.Chem.Lett.41519-1522；Radhakrishna等人，(1989)J.Org.Chem.554693-4699以及美国专利号4,458,066。可普遍得到自动化合成特定序列核酸部分的程序化机器。实例包括Expedite 8909自动DNA合成仪(Perseptive Biosystem，Framington MA)；ABI 394(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)；以及OligoPilot II(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。
可以使用例如包含酸敏感5′-保护基和3′-亚磷酰胺的碱基保护核苷(单体)以3′至5′方向装配多核苷酸。此类单体的实例包括′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基)-保护的核苷-3′-O-(N，N-二异丙基氨基)2-氰乙基亚磷酰胺，其中所保护核苷的实例包括但不限于，N6-苯甲酰腺苷、N4-苯甲酰胞苷、N2-异丁酰鸟苷、胸苷和尿苷。在该情况下，所使用的固相支持物包含3′-连接的保护的核苷。备选地，可以使用包含酸敏感3′-保护基和5′-亚磷酰胺的碱基保护核苷以5′至3′方向装配多核苷酸。此类单体的实例包括3′-O-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基)-保护的核苷-5′-O-(N，N-二异丙基氨基)2-氰乙基亚磷酰胺，其中所保护核苷的实例包括但不限于N6-苯甲酰腺苷、N4-苯甲酰胞苷、N2-异丁酰鸟苷、胸苷和尿苷(Glen Research，Sterling，VA)。在该情况下，所使用的固相支持物包含5′-连接的保护核苷。可分离或通过重组方法或化学合成方法合成环状核酸成分。化学合成可以使用文献中描述的任何方法进行。参见例如Gao等人，(1995)Nucleic Acids Res.232025-2029以及Wang等人，(1994)Nucleic Acids Res.222326-2333。
非核酸间隔子部分的加入可使用常规方法实现。用于加入特定间隔子部分的方法在本领域中已知并且描述于例如上面引用的参考文献中。参见例如Durand等人，(1990)Nucleic Acids Res.186353-6359。间隔子部分和核酸部分间的共价键可以是多种类型，包括磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、酰胺键、酯键、醚键、硫醚键、二硫键、氨基磷酸酯键、磷酸三酯键、二硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键和其它键。使用与核酸部分合成所用相同的亚磷酰胺类型化学可以方便地组合间隔子部分和核酸部分。例如，使用自动DNA合成仪(例如Expedite 8909；Perseptive Biosystems，Framington，MA)并使用亚磷酰胺化学(参见例如Beaucage，1993，同上；CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry，同上)可方便地合成本发明的IRC。然而，技术人员将会理解，如果期望的话，也可以手工开展通过自动DNA合成仪所开展的相同(或等效)合成步骤。在此种合成中，一般地间隔子(或者用于多聚体间隔子的间隔子亚单位)的一端用4，4′-二甲氧基三苯基甲基保护，而其它端包含亚磷酰胺基。
具有所需要保护基和反应基的多种间隔子可商业获得，例如三乙二醇间隔子或 9-O-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基)三乙二醇-1-O-[(2-“TEG间隔子” 氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research，22825 Davis Drive，Sterling，VA)六乙二醇间隔子或 18-O-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基)六乙二醇-1-O-“HEG间隔子” [(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA)丙基间隔子 3-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基氧基)丙氧基-1-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA)丁基间隔子 4-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基氧基)丁氧基-1-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺]
(Chem Genes Corporation，Ashland TechnologyCenter，200 Homer Ave，Ashland，MA)己基间隔子6-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基氧基)己氧基-1-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺]2-(羟甲基)乙基间 1-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基氧基)-3-(乙酰丙酰基隔子或“HME间 oxy)-丙氧基-2-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷隔子”酰胺]；也称作“不对称分支”间隔子“无碱基核苷酸间 5-O-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基)-1，2-脱氧核糖隔子”或“无碱基 -3-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺]间隔子” (Glen Research，Sterling，VA)“对称分支间隔1，3-O，O-双(4，4′-二甲氧基三苯基甲基)甘油子”或“甘油间隔 -2-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺]子” (Chem Genes，Ashland，MA)“trebler间隔子” 2，2，2-O，O，O-三[3-O-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基氧基)丙氧甲基]乙基-1-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA)“对称doubler间 1，3-O，O-双[5-O-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基氧基)隔子”戊酰胺基]丙基-2-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA)“十二烷基间隔 12-(4，4′-二甲氧基三苯基甲基氧基)十二烷氧基子”-1-O-[(2-氰乙基)N，N-二异丙基亚磷酰胺](Glen Research，Sterling，VA)这些间隔子部分和大量的其它受保护间隔子部分前体(例如包含DMT和亚磷酰胺保护基)可以购买或者使用常规方法合成来制备本文所公开的IRC。按照生产商的说明书将设备进行程序化控制以便以预期顺序加入核苷酸单体和间隔子。
虽然使用亚磷酰胺化学可方便制备某些IRC，但是应该意识到，本发明的IRC不限于通过任何特定合成方法或制备方法制备的化合物。
在一个实施方案中，制备了带有缀合质一种以上类型核酸部分的多价间隔子的IRC。例如，已经描述了包含两个马来酰亚胺基团(其可以与包含硫醇的多核苷酸反应)以及两个活化酯基(其可以与包含氨基的核酸反应)的平台(参见例如PCT申请公布WO 95/07073)。这两个活化基可以彼此独立地反应。这导致产生包含总共4个核酸部分(每一序列两个)的IRC。
包含两个不同核酸序列的带有多价间隔子的IRC也可以使用上述对称分支间隔子和常规亚磷酰胺化学制备(例如使用手工或自动方法)。对称分支间隔子包含亚磷酰胺基和相同且同时去除的两个保护基。例如，在一个方法中，合成第一个核酸并偶联至对称分支间隔子上，同时保护基从间隔子上去除。然后，在间隔子上合成两个额外的核酸(相同序列)(在每一步骤中使用合成单一核酸部分所用数量的两倍量的试剂)。
可使用相似方法将三个不同核酸部分(以下称作核酸I、II和III)连接至多价平台(例如不对称分支间隔子)。这可以使用自动DNA合成仪方便进行。在一个实施方案中，不对称分支间隔包含亚磷酰胺基和两个可以独立去除的正交保护基。首先，合成核酸I，然后将不对称分支间隔子与核酸I偶联，然后在选择性去除一个保护基之后加入核酸II。将核酸II脱保护和封端，然后去除间隔子上的另外的保护基。最后，合成核酸III。
在一些实施方案中，使用标准合成化学技术合成了核酸部分并且加入了活性连接基团(例如氨基、羧化物、硫代、二硫化物等)。将活性连接基团(其被认为形成所得到的间隔子部分的一部分)偶联至另外的非核酸化合物上以形成间隔子部分。使用标准的核酸合成方法并采用文献所述或商业可得的多种试剂将连接基团加入至核酸上。实例包括包含受保护氨基、羧基、硫醇基或二硫基以及亚磷酰胺基。一旦这些化合物通过活化亚磷酰胺基掺入到核酸中并脱保护，则提供了具有氨基、羧化物或硫醇反应性的核酸。
多种长度的亲水接头可用于例如连接核酸部分和平台分子。多种适宜的接头是已知的。适宜的接头包括但不限于乙二醇的线性寡聚体或多聚体。此类接头包括具有式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2的接头，其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保护基如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基如4-硝基苯基酯。这些接头可用于连接包含硫醇活性基如卤代乙酰、马来酸酰胺等的一个分子(通过硫醚键)与包含氨基的第二个分子(通过酰胺键)。连接顺序可变，即硫醚键可在酰胺键形成之前或之后形成。另外的有用接头包括Sulfo-SMCC(硫代琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]-环己烷-1-羧化物)Pierce Chemical Co.产品22322；Sulfo-EMCS(N-[ε-马来酰亚胺基己酰氧基硫代琥珀酰亚胺酯]Pierce Chemical Co.产品22307；Sulfo-GMBS(N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]硫代琥珀酰亚胺酯)PierceChemical Co.产品22324(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)以及通式马来酰亚胺基-R-C(O)NHS酯的类似化合物，其中R＝烷基、环烷基、乙二醇多聚体等。
用于共价连接核酸部分和多价间隔子的特别有用的方法描述于上面引用的参考文献中。
在某些实施方案中，多肽用作多价间隔子部分，在其上共价连接(直接或通过接头)有众多核酸部分以形成“蛋白质IRC”。多肽可以是载体(例如白蛋白)。通常，蛋白质IRC包含至少一个、常常几个或许多个核酸部分，所述核酸部分(a)长度为2个和7个之间、更常见4个和7个之间的核苷酸、备选地2个和6个、2个和5个、4个和6个或4个和5个之间的核苷酸和/或(b)具有下面分离的免疫调节活性或不具有分离的免疫调节活性。制备蛋白质IRC的方法对于阅读了本发明公开的技术人员而言是显而易见的。例如，通过本领域已知的方法可以将核酸共价连接至多肽间隔子部分，包括在核酸部分的3′或5′端(或者在核酸部分内部的适当修饰的碱基处)和具有适合活性基(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯，其可以与胞嘧啶残基的N4氨基直接反应)的多肽形成键。又例如，可以通过已经掺入到核酸部分中的氨基、硫醇或羧基将多肽连接至核酸部分的游离5′-末端。备选地，如本文所述，可将多肽连接至间隔子部分。此外，在一端包含保护的氨基、硫醇或羧基并包含亚磷酰胺的连接基团可共价连接至多核苷酸的羟基上，然后脱保护，其可用于将IRC与肽共价连接。
IRP和/或IRC复合物和组合物可将IRP或IRC直接施用于个体，或者将它们以组合物或复合物施用以提高IRP或IRC向细胞的递送和/或被细胞的吸收。组合物或复合物还可用于提高两种或多种不同IRP和/或IRC向细胞的共递送。在某些实施方案中，IRC和IRP混合物可以复合以致于递送至少一种IRC和IRP。此类递送组合物或复合物包括但不限于本文所述和本领域已知的包封复合物和胶体分散系统。此类递送组合物的实例包括水包油乳状液、胶束和脂质体。递送组合物或复合物还包括如本文所述连接至接头分子、平台分子、纳米颗粒或微米颗粒的IRP和/或IRC。此类连接键包括共价键和非共价键。除非另外指出，用于与IRP一起使用的本文所述复合物和组合物制剂还适宜与IRC一起使用。
在一些实施方案中，IRP和/或IRC被缀合至接头分子。IRP和/或IRC部分可以与缀合物的接头部分以多种方式偶联，包括共价和/或非共价相互作用。部分之间的连接可以在IRP和/或IRC的3′或5′端进行或者在IRP和/或IRC内部的适当修饰碱基处进行。如果接头是肽并包含合适的活性基(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯)，它可以与胞嘧啶残基的N4氨基直接反应。取决于IRP和/或IRC中胞嘧啶残基的数量和位置，可以实现在一个或多个残基处的特异偶联。
备选地，如本领域已知的修饰寡核苷酸可以掺入到IRP和/或IRC的末端或内部位置。这些修饰的寡核苷酸可包含封闭的官能团，当这些官能团去封闭后可与存在于或连接至目的接头的多种官能团反应。
在接头是肽的情况下，缀合物的该部分可以通过固相支持物化学连接至IRP和/或IRC的3′端。例如，IRP部分可以连接至已经在支持物上预先合成的肽部分上。Haralambidis等人，(1990a)Nucleic Acids Res.18493-499；以及Haralambidis等人，(1990b)Nucleic Acids Res.18501-505。备选地，IRP可以以这样一种方式合成，即IRP通过从3′端延伸的可断裂接头与固相支持物相连。当从支持物上化学断裂IRP时，末端硫醇基留在寡核苷酸的3′端(Zuckermann等人，(1987)Nucleic Acids Res.155305-5321；以及Corey等人，(1987)Science 2381401-1403)或末端氨基留在寡核苷酸的3′端(Nelson等人，(1989)Nucleic Acids Res.171781-1794)。氨基修饰IRP和/或IRC与肽氨基的缀合可以如Benoit等人，(1987)Neuromethods 643-72中所述进行。硫醇修饰IRP和/或IRC与肽羧基的缀合可以如Sinah等人，(1991)Oligonucleotide AnaloguesAPractical Approach，IRL Press中所述进行。带有附加马来酰亚胺的寡核苷酸与肽的半胱氨酸残基的硫醇侧链的偶联也已有描述。Tung等人，(1991)Bioconjug.Chem.2464-465。
缀合物的肽接头部分可以通过已经在合成过程中掺入到寡核苷酸中的氨基、硫醇或羧基连接至IRP和/或IRC的5′端。优选地，当寡核苷酸被固定在固相支持物上时，在一端包含已保护的氨基、硫醇或羧基并且在另一端包含亚磷酰胺的连接基团被共价连接至5′-羟基。Agrawal等人，(1986)Nucleic Acids Res.146227-6245；Connolly(1985)Nucleic Acids Res.134485-4502；Kremsky等人，(1987)Nucleic Acids Res.152891-2909；Connolly(1987)Nucleic Acids Res.153131-3139；Bischoff等人，(1987)Anal.Biochem.164336-344；Blanks等人，(1988)Nucleic Acids Res.1610283-10299；以及美国专利号4,849,513、5,015,733、5,118,800和5,118,802。在脱保护之后，氨基、硫醇和羧基官能团可用于共价连接寡核苷酸和肽。Benoit等人，(1987)；以及Sinah等人，(1991)。
IRP和/或缀合物还可以通过非共价相互作用如离子键、疏水相互作用、氢键和/或范德华力形成。
非共价连接的缀合物可包括非共价相互作用，例如生物素-链霉亲合素复合物。生物素基团可以连接至例如IRP和/或IRC的修饰碱基。Roget等人，Nucleic Acids Res.177643-7651。向肽部分中掺入链霉亲合素部分允许在链霉亲合素缀合肽与生物素化寡核苷酸之间形成非共价结合复合物。
非共价结合还可以通过IRP和/或IRC中的离子相互作用和使用包含带电残基(能与寡核苷酸相互作用)的接头部分发生。例如，非共价缀合在通常带负电荷的IRP和/或IRC与肽接头的带正电荷的氨基酸残基如多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚组氨酸残基间发生。
可以使用标准方法将IRP和/或IRC与脂连接。这些方法包括但不限于寡核苷酸-磷脂缀合物的合成(Yanagawa等人，(1988)Nucleic AcidsSymp.Ser.19189-192)、寡核苷酸-脂肪酸缀合物的合成(Grabarek等人，(1990)Anal.Biochem.185131-135；以及Staros等人，(1986)Anal.Biochem.156220-222)、以及寡核苷酸-固醇缀合物的合成。Boujrad等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905728-5731。
可以使用标准方法将寡核苷酸与寡糖连接。这些方法包括但不限于寡核苷酸-寡糖缀合物的合成，其中寡糖是免疫球蛋白的部分。O′Shannessy等人，(1985)J.Applied Biochem.7347-355。
环状IRP和/或IRC与肽接头的连接可以以多种方式形成。在使用重组方法或化学方法合成环状IRP和/或IRC的情况下，修饰核苷是适宜的。Ruth(1991)，Oligonucleotides and AnaloguesA Practical Approach，IRLPress。因此，标准连接技术可用于连接环状IRP和/或IRC与肽。Goodchild(1990)Bioconiug.Chem.1165。在环状IRP和/或IRC是分离的或通过重组方法或化学方法合成的情况下，可通过化学活化或光活化已经掺入到肽中的活性基团(例如卡宾，自由基)形成连接。
用于肽以及其它分子与寡核苷酸连接的另外方法可在美国专利号5,391,723；Kessler(1992)″Nonradioactive labeling methods for nucleicacids″在Kricka(编)Nonisotopic DNA Probe Techniques，AcademicPress；以及Geoghegan等人，(1992)Bioconjug.Chem.3138-146中找到。
IRP和/或IRC可以以其它方式邻近结合。在一些实施方案中，通过包封IRP和/或IRC邻近结合。在另外的实施方案中，通过连接至平台分子IRP和/或IRC邻近结合。“平台分子”(也称作“平台”)是包含允许IRP和/或IRC结合的位点的分子。在另外的实施方案中，IRP和/或IRC通过吸附于表面、优选载体颗粒上而邻近结合。
在一些实施方案中，本发明方法采用与IRP和/或IRC有关的包封剂。优选地，包含IRP和/或IRC以及包封剂的组合物为佐剂水包油乳剂、微颗粒和/或脂质体形式。更加优选地，包封IRP和/或IRC的佐剂水包油乳剂、微颗粒和/或脂质体是大小为0.04μm至大约100μm的颗粒形式，优选任何下列范围的颗粒形式从大约0.1μm至大约20μm；从大约0.15μm至大约10μm；从大约0.05μm至大约1.00μm；从大约0.05μm至大约0.5μm。
胶体分散系统如微球体、珠、大分子复合物、纳米胶囊以及基于脂的系统如水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体可为包含IRP和/或IRC的组合物提供有效的包封。
包封组合物还包含任何多种成分。这些成分包括但不限于矾、脂类、磷脂、脂膜结构(LMS)、聚乙二醇(PEG)以及其它多聚体如多肽、糖肽和多糖。
适宜用作包封成分的多肽包括本领域已知的任何包封成分，包括但不限于脂肪酸结合蛋白。修饰多肽包含任意多种修饰，包括但不限于糖基化、磷酸化、豆蔻酰化、硫化和羟基化。如本文所使用，合适的多肽是保护包含IRP和/或IRC的组合物保留其免疫调节活性的多肽。结合蛋白的实例包括但不限于白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)和豌豆白蛋白。
其它适宜的多聚体包括任何制药领域已知的多聚体，其包括但不限于天然存在的多聚体，如葡聚糖、羟乙基淀粉和多糖以及合成的多聚体。天然存在多聚体的实例包括蛋白质、糖肽、多糖、葡聚糖和脂类。另外的多聚体可以是合成的多聚体。适宜在本发明中使用的合成多聚体的实例包括但不限于聚烷基乙二醇(PAG)如PEG、聚氧乙基化乙二醇(POP)如聚氧乙基化甘油(POG)、聚三亚甲基乙二醇(PTG)、聚丙二醇(PPG)、聚羟乙基异丁烯酸酯、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸、聚乙基唑啉、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氨基酸、聚氨基甲酸酯和聚磷腈。合成的多聚体还可以是线性的或分支的、取代的或非取代的、同聚体、共聚体或者两种或多种合成单体的嵌段共聚物。
用于本发明包封组合物中的PEG或者从化学品供应商购买或者使用本领域技术人员已知的技术合成。
如本文所使用，术语“LMS”意思是指层状脂颗粒，其中极性脂的极性头部基团面向界面水相排列以形成膜结构。LMS的实例包括脂质体、胶束、脂质双层卷(Cochleates)(即一般的圆柱脂质体)、微乳、单室囊泡、多室囊泡等。
本发明的任选胶体分散系统是脂质体。如本文所使用，“脂质体”或“脂质囊泡”是通过一个且可能多于一个的双层脂质膜封起的小囊泡。脂质体是从磷脂、糖脂、脂类、类固醇如胆固醇、相关分子或其组合通过本领域已知的任何技术人工制造的，所述技术包括但不限于超声处理、挤出或从脂-去污剂复合物中去除去污剂。脂质体还可以任选包含另外的成分，例如靶向组织的成分。应当理解，“脂膜”或“脂双层”无需全部由脂组成，它还可以包含任何合适的其它成分，包括但不限于胆固醇和其它类固醇、脂溶性化学品、任何长度的蛋白质以及其它两性分子，只要膜的一般结构是两个亲水表面的薄片(中间夹着疏水核心)即可。对于膜结构的一般讨论，参见The Encyclopedia of Molecular Biology，J.Kendrew(1994)。对于合适的脂类参见例如Lasic(1993)“Liposomesfrom Physics toApplications”Elsevier，Amsterdam。
制备包含IRP和/或IRC组合物的脂质体的方法是本领域已知的。脂质囊泡可以通过本领域已知的任何合适技术制备。方法包括但不限于微囊化、微射流、LLC方法、乙醇注射、氟利昂注射、“起泡”方法、去污剂透析、水合作用、超声处理以及反相蒸发。在Watwe等人，(1995)Curr.Sci.68715-724中综述。可将技术组合以提供具有最满意特性的囊泡。
本发明包括包含靶向组织或细胞的成分的LMS的用途。此类靶向成分是LMS的成分，当施用于完整的动物、器官或细胞培养物中时该成分优先增强了某些组织或细胞位点的积累。靶向成分一般接近于脂质体外面，因此优选结合至外表面或插入至外面的脂双层中。其中，靶向成分可以是肽、较大的肽的区域、细胞表面分子或标志特异性的抗体或其抗原结合片段、核酸、糖类、复合糖的区域、特别的脂或小分子如药物、激素或抗原(连接至任何上述分子)。具有细胞类型特异细胞表面标志特异性的抗体在本领域已知并且通过本领域已知方法容易地制备。
LMS可靶向于治疗所定向的任何细胞类型，例如可调节和/或参与免疫应答的细胞类型。此类靶细胞和器官包括但不限于APC如巨噬细胞、树突状细胞和淋巴细胞，淋巴结构如淋巴结和脾，以及非淋巴结构、特别是发现树突状细胞的那些结构。
本发明的LMS组合物还可以包含表面活性剂。表面活性剂可以是阳离子的、阴离子的、兼性的或非离子性的。优选的一类表面活性剂是非离子表面活性剂；特别优选的是水溶性的那些表面活性剂。
在IRP和/或IRC通过连接键与平台分子邻近结合的一些实施方案中，平台可以是蛋白质性的或非蛋白质性的(即有机的)。蛋白质性平台的实例包括但不限于白蛋白、丙种球蛋白、免疫球蛋白(IgG)和卵清蛋白。Borel等人，(1990)Immunol.Methods 126159-168；Dumas等人，(1995)Arch.Dematol.Res.287123-128；Borel等人，(1995)Int.Arch.Allergy Immunol.107264-267；Borel等人，(1996)Ann.N.Y Acad.Sci 77880-87。平台是多价的(即包含一个以上结合位点或连接位点)以适合结合一个以上的IRP和/或IRC。因此，平台可以包含2个或以上、3个或以上、4个或以上、5个或以上、6个或以上、7个或以上、8个或以上、9个或以上、10个或以上结合位点或连接位点。多聚体平台的其它实例是葡聚糖、聚丙烯酰胺、菲可、羧甲基纤维素、聚乙烯醇以及聚D-谷氨酸/D-赖氨酸。
使用平台分子的原理在本领域已充分理解。通常，平台包含(或被衍生以便包含)适当的IRP和/或IRC结合位点。此外或备选地，IRP和/或IRC被衍生以提供适当的连接基团。例如，简单的平台是双功能的接头(即具有两个结合位点)，例如肽。另外的实例在下面讨论。
平台分子可以是生物学稳定的，即它们常常表现出数小时至数天至数月的体内排泄半衰期，从而赋予治疗功效。并且平台分子优选地由合成的限定组合物的一条链组成。它们的分子量一般在大约200至大约1,000,000的范围内，优选地在下列任何范围内从大约200至大约500,000；从大约200至大约200,000；从大约200至大约50,000(或更低，如30,000)。化合价平台分子的实例是多聚体(或由多聚体组成)，例如聚乙二醇(PEG；优选具有大约200至大约8000的分子量)、聚-D-赖氨酸、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、D-谷氨酸和D-赖氨酸(比例为3∶2)。可以使用的其它分子是白蛋白和IgG。
适宜在本发明中使用的其它平台分子是在美国专利号5,552,391中公开的化学限定的、非多聚体化合价平台分子。适宜在本发明中使用的其它均相化学限定的化合价平台分子是衍生的2，2′-乙烯二氧二乙胺(EDDA)和三乙二醇(TEG)。
另外的适宜化合价平台分子包括但不限于四氨基苯、七氨基β环化糊精、四氨基季戊四醇、1，4，8，11-四氮杂环十四烷(Cyclam)以及1，4，7，10-四氮杂环十二烷(Cyclen)。
通常，这些平台可通过标准化学合成技术产生。PEG需衍生成或制成多价的，这通过标准技术实现。适宜缀合物合成的一些物质，如PEG、白蛋白以及IgG是商业可得的。
IRP和/或IRC与平台分子的缀合可以以任意多种方式实现，一般涉及IRP和/或IRC以及平台分子上的一个或多个交联剂和官能团。平台以及IRP和/或IRC必须具有合适的连接基团。使用标准合成化学技术向平台中加入连接基团。使用标准固相合成技术或重组技术向多肽平台以及IRP和/或IRC中加入连接基团。重组方法需要翻译后修饰以便加入接头，此类方法是本领域已知的。
例如，多肽包含含有官能团如氨基、羧基或巯基的氨基酸侧链部分，所述的官能团作为将多肽与平台偶联的位点。如果多肽不包含具有此类官能团的残基，则可将这些残基加入到多肽中。此类残基可通过固相合成技术或重组技术掺入，这两种技术在肽合成领域是众所周知的。当多肽具有糖侧链(或者平台是糖)时，则可以通过常规化学将功能性的氨基、巯基和/或醛基加入到其中。例如，主要的氨基可以通过在氰基硼氢钠存在下氧化糖与乙二胺反应掺入；巯基可以通过胱胺二盐酸盐的反应然后用标准二硫化物还原剂还原引入；而醛基可通过高碘酸氧化产生。如果平台分子不具有合适的官能团时，可以以相似的方式将平台分子衍生以包含官能团。
长度可变的亲水接头可用于连接IRP和/或IRC与平台分子。适宜的接头包括乙二醇的线性寡聚体或多聚体。此类接头包括具有式R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2的接头，其中n＝0-200，m＝1或2，R1＝H或保护基如三苯甲基，R2＝H或烷基或芳基，例如4-硝基苯基酯。这些接头用于连接包含硫醇活性基如卤代乙酰、马来酸酰胺等的一个分子(通过硫醚键)与包含氨基的第二个分子(通过酰胺键)。这些接头在连接顺序上是灵活的，即硫醚可以最先或最后形成。
在IRP和/或IRC通过吸附至表面而邻近结合的实施方案中，表面可以是用无机或有机核心制成的载体颗粒形式(例如纳米颗粒)。此类纳米颗粒的实例包括但不限于纳米晶体颗粒、通过烷基氰基丙烯酸酯的聚合作用制成的纳米颗粒以及通过亚甲基丙二酸酯的聚合作用制成的纳米颗粒。可以吸附IRP和/或IRC的另外的表面包括但不限于活化的碳颗粒以及蛋白质陶瓷质纳米片(protein-ceramic nanoplate)。载体颗粒的另外实例在本文提供。
将多核苷酸和多肽吸附至表面以便将所吸附分子递送至细胞在本领域中众所周知。参见例如Douglas等人，(1987)Crit.Rev.Ther.Drug.CarrierSyst.3233-261；Hagiwara等人，(1987)In Vivo 1241-252；Bousquet等人，(1999)Pharm Res.16141-147；以及Kossovsky等人，美国专利号5,460,831。优选地，构成吸附表面的材料是生物可降解的。IRP和/或IRC与表面的吸附可通过非共价相互作用发生，包括离子相互作用和/或疏水相互作用。
通常，载体如纳米颗粒的特性，如表面电荷、颗粒大小以及分子量取决于聚合过程中的聚合条件、单体浓度以及稳定剂的存在(Douglas等人，1987)。载体颗粒的表面可以修饰，例如进行表面包被，以便允许或增强对IRP和/或IRC的吸附。带有所吸附IRP和/或IRC的载体颗粒可进一步用其它物质包被。如本文所述，此类其它物质的加入可以例如延长颗粒在施用于受试者后的半衰期和/或将颗粒靶向特异细胞类型或组织。
IRP和/或IRC可以吸附的纳米晶体表面也已有描述(参见例如美国专利号5,460,831)。纳米晶体核心颗粒(直径1μm或更小)用促进多肽、多核苷酸和/或其它药剂吸附的表面能量修饰层包被。另一种吸附表面是通过烷基氰基丙烯酸酯聚合制成的纳米颗粒。烷基氰基丙烯酸酯可以在酸化水介质中通过阴离子聚合反应而聚合。取决于聚合条件，小的颗粒趋向于具有20至3000nm范围的大小，并且可以制成具有特定表面特性和特定表面电荷的纳米颗粒(Douglas等人，1987)。例如，在疏水阳离子如四苯基氯化或季铵盐如十六烷基三甲基溴化铵存在下，寡核苷酸可以吸附至聚异丁基氰基丙烯酸酯和聚异己基氰基丙烯酸酯纳米颗粒。寡核苷酸吸附于这些纳米颗粒是通过核酸链的带负电荷的磷酸基团与疏水阳离子间形成离子对介导的。参见例如Lambert等人，(1998)Biochimie 80969-976，Chavany等人，(1994)Pharm.Res.111370-1378；Chavany等人，(1992)Pharm.Res.9441-449。另一种吸附表面是通过亚甲基丙二酸酯聚合产生的纳米颗粒。
IRP或IRC可以以微载体(MC)复合物的形式施用。因此，本发明提供了包含IRP/MC复合物或IRC/MC复合物的组合物。IRP/MC复合物包含结合至微载体表面的IRP(即IRP没有包封在MC内)，并且优选包含结合至每一微载体上的多个IRP分子。在某些实施方案中，不同IRP的混合物可以与微载体复合，从而微载体结合至一种以上的IRP。IRP和MC之间的结合可以是共价的或非共价的。本领域技术人员将理解，IRP可以被修饰或衍生，并且可以选择和/或修饰微载体的组成成分以适应于IRP/MC复合物形成的预期类型结合。该相同的描述应用于IRC/MC复合物。在某些实施方案中，IRC和IRP的混合物可以与微载体复合，以致于微载体结合至至少一种IRC和IRP。
可用于本发明的微载体大小小于大约150、120或100μm，更一般地小于大约50-60μm，优选地小于大约10μm，并且在纯水中是可溶的。虽然非生物降解的微载体是可以接受的，但是可用于本发明的微载体优选是可以生物降解的。虽然可以考虑液相微载体如包含生物可降解多聚体的水包油乳剂或油，但是微载体通常为固相，例如“珠”或其它颗粒。可用作微载体的多种生物可降解和非生物降解材料在本领域众所周知。
用于本发明组合物或方法的微载体大小通常小于大约10μm(例如具有小于大约10μm的平均直径或者至少大约97％的颗粒通过10μm滤网)并且包括纳米载体(即载体大小小于1μm)。优选地，选择的微载体大小在上限大约9、1、5、2或1μm或900、800、700、600、500、400、300、250、200或100nm以及独立选择的下限大约4、2或1μm或大约800、600、500、400、300、250、200、150、100、50、25或10nm范围内，其中下限小于上限。在一些实施方案中，微载体大小为大约1.0-1.5μm、大约1.0-2.0μm或大约0.9-1.6μm。在某些优选的实施方案中，微载体大小为大约10nm至大约5μm或大约25nm至大约4.5μm、大约1μm、大约1.2μm、大约1.4μm、大约1.5μm、大约1.6μm、大约1.8μm、大约2.0μm、大约2.5μm或大约4.5μm。当微载体是纳米载体时，优选实施方案包括大约25至大约300nm、50至大约200nm、大约50nm或大约200nm的纳米载体。
固相生物可降解微载体可以从如下生物可降解多聚体制造，所述的生物可降解多聚体包括但不限于生物可降解聚酯，如聚乳酸、聚乙醇酸以及其共聚物(包括嵌段共聚物)以及聚乳酸与聚乙二醇的嵌段共聚物；聚原酸酯，如基于3，9-二亚乙基-2，4，8，10-四氧杂螺环[5，5]十一烷(DETOSU)的多聚体；聚酸酐，如基于相对亲水单体如癸二酸的聚酸酐多聚体；聚酸酐亚胺，如掺入氨基酸(即通过氨基末端氮的二酰亚胺键连接至癸二酸)如甘氨酸或丙氨酸的基于癸二酸衍生单体的聚酸酐多聚体；聚酸酐酯；聚磷腈，特别是包含水解敏感性酯基团(可通过产生羧酸基而催化多聚体主链降解)的聚磷腈(Schacht等，(1996)Biolechnol.Bioeng.1996102)；以及聚酰胺，如聚(乳酸-共-赖氨酸)。
还已知许多适宜制造微载体的非生物降解材料，包括但不限于聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、硅、陶瓷、聚丙烯酰胺、葡聚糖、羟磷灰石、乳胶、金以及铁磁体或顺磁性物质。某些实施方氨排除了金、乳胶和/或磁珠。在某些实施方案中，微载体可以由用第二种物质(例如聚苯乙烯)包封的第一种物质(例如磁性物质)制成。
固相微球体用本领域已知的技术制备。例如，可以通过乳化-溶剂提取/蒸发技术制备。通常，在该技术中，生物可降解多聚体如polyanhydrates、聚(烷基-α-氰基丙烯酸酯)和聚(α-羟基酯)，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)和聚己内酯溶解于合适的有机溶剂如二氯甲烷中，以构成乳剂的分散相(DP)。通过在过量体积的水性连续相(CP)中高速匀化将DP乳化，在所述水性连续相中包含融解的表面活性剂，例如聚乙烯醇(PVA)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。CP中的表面活性剂是为了保证不连续且适宜大小乳状小滴的形成。然后将有机溶剂提取进入CP中，随后通过提高系统温度进行蒸发。然后，通过离心或过滤分离固相微颗粒，通过例如冻干或使用真空将其干燥，然后储藏于4℃。
可以确定干燥微球体的物理-化学特性，例如平均大小、大小分布以及表面电荷。大小特性通过例如动力学光散射技术确定，表面电荷通过测定ζ电位测定。
液相微载体包括脂质体、胶束、油滴和其它掺入了生物可降解多聚体或油的基于脂或油的颗粒。在某些实施方案中，生物可降解多聚体是表面活性剂。在另一个实施方案中，液相微载体是生物可降解的，因为液相微载体包含了生物可降解油，例如鲨烯或植物油。一个优选的液相微载体是水包油乳剂中的油滴。优选地，用作微载体的水包油乳剂包含生物可降解取代基如鲨烯。
可使用本领域已知的任何共价交联技术将共价结合的IRP/MC复合物连接起来。一般地，IRP部分被修饰，或者掺入另外的分子(例如游离胺、羧基或巯基)或掺入修饰的(例如硫代磷酸酯)核苷酸碱基，以便为IRP部分提供与微载体连接的位点。复合物中IRP部分和MC部分之间的连接可以在IRP的3′或5′段产生或者在IRP内部位置的适当修饰碱基处发生。虽然微载体中正常存在的官能团也可以利用，但是通常还可将微载体修饰以掺入通过其可形成共价键的部分。在允许共价复合物形成的条件下(例如在交联剂存在下或者通过使用包含活化部分(其将与IRP形成共价键)的活化微载体)将IRP与微载体孵育形成IRP/MC。
多种交联技术本领域已知，并且包括与氨基、羧基和巯基交联反应。对于本领域的技术人员显而易见，对交联剂和交联方法酸选择会取决于IRP和微载体的构型以及预期的IRP/MC复合物的最终构型。交联可以是同源双功能的或者异源双功能的。当使用同源双功能交联剂时，在IRP和MC上使用相同分子(例如醛基交联剂用于共价连接IRP和MC，其中IRP和MC均包含一个和多个游离胺)。异双功能交联剂利用IRP和MC上的不同部分(例如马来酰亚胺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯可用于共价连接IRP上的游离巯基和MC上的游离胺)并且优选地使微载体内部连接键的形成最小化。在大多数情况下，优选地通过微载体上的第一个交联部分和IRP上的第二个交联部分连接，其中第二个交联部分不存在于微载体上。产生IRP/MC复合物的一个优选方法是通过与异双功能交联剂孵育而“活化”微载体，然后通过在适于反应的条件下将IRP与活化MC孵育而形成IRP/MC复合物。在交联剂的反应部分之间可掺入一个“间隔子”臂或者交联剂的两个反应部分直接连接。
在一个优选的实施方案中，IRP部分包含用于与微载体交联的至少一个游离巯基(例如通过5′-硫醇修饰碱基或接头提供)，而微载体包含游离胺基。异双功能交联剂与这两种基团反应(例如包含马来酰亚胺基团和NHS-酯的交联剂)，例如琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧化物用于活化MC，然后共价连接IRP形成IRP/MC复合物。
非共价IRP/MC复合物可通过任何非共价结合和相互作用连接，非共价结合和相互作用包括离子(静电)键、疏水相互作用、氢键、范德华力或者两种或三种不同相互作用的组合，当结合对是为了连接IRP和MC时通常如此。
优选的非共价IRP/MC复合物一般通过疏水相互作用或静电(离子)相互作用或其组合来复合(例如通过IRP和结合至MC的多核苷酸间的碱基配对)。由于多核苷酸主链的亲水性质，依赖于疏水相互作用形成复合物的IRP/MC复合物一般需要修饰复合物中的IRP部分，使其掺入高疏水部分。优选地，疏水部分是生物兼容的、非免疫原性的并且天然存在于组合物旨在施用于其的个体中(例如存在于哺乳动物、特别是人中)。优选的疏水部分的实例包括脂类、类固醇、固醇如胆固醇以及萜烯。当然，连接疏水部分与IRP的方法会取决于IRP的构型以及疏水部分的特性。疏水部分可以在任何方便的位点加入到IRP中，优选在5′或3′末端；在向IRP中加入胆固醇部分的情况下，优选使用常规化学反应将胆固醇部分加入到IRP的5′末端(参见例如Godard等人，(1995)Eur.J.Biochem.232404-410)。优选地，用于通过疏水结合连接的IRP/MC复合物中的微载体由疏水材料，如油滴或疏水多聚体制成，虽然也可使用经过修饰掺入疏水部分的亲水材料。当微载体是脂质体或包含腔的其它液相微载体并且期望将IRP结合至MC外表面时，IRP/MC复合物如下形成制备MC，之后将IRP与MC混合，之所以这样制备是避免在MC制备过程中将IRP包封起来。
通过静电结合的非共价IRP/MC复合物使用了高负电荷的多核苷酸主链。因此，在非共价结合IRP/MC复合物中使用的微载体通常在生理pH下(例如大约pH6.8-7.4)带正电荷(阳离子)。微载体可以天然具有正电荷，但是从一般不带有正电荷的化合物制成的微载体可以被衍生和修饰变成带正电荷(阳离子)。例如，用于制造微载体的多聚体可以被衍生而加入带正电荷基团，如伯胺。备选地，在制造过程中，带正电荷的化合物可以掺入到微载体制剂中(例如在制造聚乳酸/聚乙醇酸共聚物中可使用带正电荷的表面活性剂从而使所得到的微载体颗粒带有正电荷)。
例如，为了制备阳离子微球体，可将阳离子脂类或多聚体如1，2-二油酰-1，2，3-三甲基氨丙烷(DOTAP)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)或聚赖氨酸按照它们在这些相中的溶解度加入到DP或CP中。
优选地在水性混合物中通过多核苷酸与颗粒孵育而吸附至阳离子微球体来制成IRP/MC复合物。此种孵育可在任何预期条件下进行，包括在室温下(例如大约20℃)或在冷藏条件下(例如4℃)。由于阳离子微球体与多核苷酸结合相对较快，孵育时间可以是任何方便的时间阶段，例如5、10、15分钟和以上，包括过夜孵育和更长时间的孵育。例如，可以通过在4℃在水溶液中将多核苷酸与颗粒过夜孵育而将IRP吸附到阳离子微球体上。然而，由于阳离子微球体与多核苷酸天然结合，所以可以通过简单地共施用多核苷酸和MC来形成IRP/MC复合物。在微球体与多核苷酸结合之前和之后，确定微球体的大小和表面电荷特征。然后，在例如人外周血单核细胞(PBMC)或小鼠脾细胞测定法中评价所选择批次相对于合适对照的活性。还可以在合适的动物模型中评价制剂。
通过核苷酸碱基配对连接的非共价IRP/MC复合物可以使用常规方法产生。通常，使用包含结合的、优选共价结合的与IRP至少部分互补的多核苷酸(“捕获多核苷酸”)的微载体产生碱基配对的IRP/MC复合物。IRP与捕获核苷酸之间的互补片段优选至少6、8、10或15个连续碱基对、更优选至少20个连续碱基对。捕获核苷酸可以通过本领域已知的任何方法结合至MC，并且优选地在5′或3′末端与IRP共价结合。在一些实施方案中，包含5′-GGGG-3′序列的IRP会保留序列的该部分作为单链。
在另外的实施方案中，结合对可用于连接IRP/MC复合物中的IRP和MC。结合对可以是受体与配体、抗体与抗原(或表位)或者以高亲和力(例如Kd小于大约10-8)结合的任何其它结合对。一种类型的优选结合对是生物素与链霉亲合素或者生物素与抗生物素蛋白，它们形成非常紧密的复合物。当使用结合对来介导IRP/MC复合物结合时，则通常用结合对的一个成员通过共价键将IRP衍生，并且用结合对的另一成员将MC衍生。混合两个衍生的化合物导致形成IRP/MC复合物。
本发明方法本发明提供了调节个体、优选哺乳动物、更优选人中免疫应答的方法，包括向个体施用如本文所述的包含IRS的多核苷酸。本发明所提供的免疫调节方法包括阻抑和/或抑制先天免疫应答的那些，所述的先天免疫应答包括但不限于通过免疫刺激性核酸分子如细菌DNA刺激的免疫应答。本发明还提供了抑制TLR7/8和/或TLR9所诱导细胞应答的方法。本发明还提供了改善与有害免疫活化相关的症状的方法，所述症状包括但不限于与自身免疫相关的症状。
以足以调节免疫应答的数量施用包含IRS的多核苷酸。如本文所述，对免疫应答的调节可以是体液性的和/或细胞性的，并且可以使用本领域的标准技术并如本文所述测定。
在某些实施方案中，个体患有与有害免疫活化相关的疾病，例如过敏性疾病或病症、变态反应或哮喘。含有过敏性疾病或哮喘的个体是具有现有过敏性疾病或哮喘的可识别症状的个体。
在某些实施方案中，个体患有与有害免疫活化相关的疾病，例如自身免疫病和炎性疾病。患有自身免疫病或炎性疾病的个体是具有现有自身免疫病或炎性疾病的可识别症状个体。
自身免疫病可分成两大类器官特异性的和全身性的。自身免疫病包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、I型糖尿病、II型糖尿病、多发性硬化(MS)、免疫性不孕不育如卵巢早衰、硬皮病、斯耶格伦病、白斑、脱发(秃发)、多腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退症、多肌炎、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、炎症性肠病包括克隆病和溃疡性结肠炎、自身免疫性肝炎包括与乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)相关的那些、腺垂体功能减退症、移植物抗宿主病(GvHD)、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤疾病、葡萄膜炎、恶性贫血以及甲状旁腺功能减退。
自身免疫病还包括但不限于桥本甲状腺炎、I型和II型自身免疫性多腺体综合征、副肿瘤性天疱疮、大疱性类天疱疮、疱疹样皮炎、线状IgA疾病、获得性大疱性表皮松解症、结节性红斑、妊娠类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、特发性混合性冷球蛋白血症、儿童慢性大疱性皮肤病、溶血性贫血、血小板减少性紫癜、古德帕斯丘综合征、自身免疫性粒细胞减少症、重症肌无力、伊-兰肌无力综合征、僵人综合征、急性播散性脑脊髓炎、吉-巴综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经根神经病、伴有传导阻滞的多灶性运动神经病、带有单克隆丙种球蛋白病的慢性神经病、斜视眼阵挛-肌阵挛综合征、小脑变性、脑脊髓炎、视网膜病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、麸质过敏性肠病、强直性脊柱炎、活动性关节炎、多肌炎/皮肌炎、混合性结缔组织病、贝赫切特综合征、银屑病、结节性多动脉炎、变应性血管炎与肉芽肿(Churg-Strauss病)、多血管炎重叠综合征、过敏性血管炎、Wegener肉芽肿、颞动脉炎、高安动脉炎、川崎病、中枢神经系统单一性血管炎(isolated vasculitis of the central nervous system)、血栓闭塞性脉管炎、结节病、肾小球肾炎和寒冷病。这些疾病是医学领域众所周知的并且描述于例如Harrison′s Principles of Internal Medicine，第14版，Fauci A S等人编，New YorkMcGraw-Hill，1998。
全身性疾病SLE特征在于存在抗几乎每一种细胞中大量存在的抗原的抗体，例如抗染色质抗体、抗剪接体抗体抗体、抗核糖体抗体和抗DNA抗体。结果SLE的影响出现于多种组织中，例如皮肤和肾脏。自反应性T细胞也在SLE中起作用。例如，在鼠狼疮模型中的研究已经表明，非DNA核小体抗原如组蛋白刺激自反应性T细胞，其驱动产生抗DNA抗体的B细胞。已经在SLE患者中观察到IFN-α血清水平增加，并且已经表明这与疾病的活动性和严重性(发烧和皮肤疹)以及与疾病过程中的必需标志(例如抗dsDNA抗体滴度)相关。还已经表明，循环中存在的免疫复合物可激发这些患者中的IFN-α，从而使提高的IFN-α的缓慢存在。已经描述了两种不同类型的免疫复合物人PDCDNA/抗DNA抗体复合物以及RNA/抗核糖核蛋白-RNA抗体复合物对IFN-α的激发。由于DNA是TLR-9的配体而RNA是TLR-7/8的配体，因此预计这两种途径分别利用TLR-9和TLR-7/8信号，以长期诱导IFN-α并参与SLE的发病机制。因此，在抑制TLR-7/8和TLR-9应答中有效的IRP和/或IRC组合物在治疗SLE中特别有效。
在某些实施方案中，个体处于发展成自身免疫病的危险中，并且IRP或IRC以有效延缓或防止自身免疫病的数量施用。处于发展成自身免疫病的危险中的个体包括例如具有发展成自身免疫病的遗传素质或其它素质的那些个体。在人类中，对特定自身免疫病的易感性与HLA类型有关，一些与特定的II类MHC等位基因强烈相关，而另一些与特定的I类MHC等位基因相关。
例如，强直性脊柱炎、急性前葡萄膜炎以及幼年型类风湿性关节炎与HLA-B27相关，古德帕斯丘综合征以及MS与HLA-DR2相关，格雷夫斯病、重症肌无力以及SLE与HLA-DR3相关，类风湿性关节炎以及寻常型天疱疮与HLA-DR4相关，桥本甲状腺炎与HLA-DR5相关。易患自身免疫病的其它遗传素质是本领域已知的，并且可以通过本领域已知的测定法和方法检查个体是否存在此类素质。因此，在一些情况下，处于发展成自身免疫病危险的个体可以被鉴定出来。
如本文所述，本发明的IRP可以显著地抑制细胞因子(包括但不限于IL-6、IL-12、TNF-α和/或IFN-α)的产生，并且可以阻抑B细胞增殖和/或浆细胞样树突状细胞活化。因此，本发明的IRP和IR在阻抑个体对免疫刺激性核酸的免疫应答中特别有效。
用于研究自身免疫病的动物模型在本领域中是已知的。例如，与人自身免疫病最相似的动物模型包括自发发育成具有特定疾病高发病率的动物品系。此类模型实例包括但不限于非肥胖性糖尿病(NOD)小鼠(发展成类似于I型糖尿病的疾病)以及狼疮样疾病倾向动物，例如新西兰杂交MRL-Faslpr与BXSB小鼠。已经诱导出自身免疫病的动物模型包括但不限于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)(其为多发性硬化模型)、胶原诱导性关节炎(CIA)(其为类风湿性关节炎模型)、以及实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)(其为葡萄膜炎模型)。自身免疫病的动物模型也已经通过基因操作产生，包括例如IL-2/IL-10敲除小鼠(对于炎性肠病)、Fas或Fas配体敲除动物(对于SLE)、以及IL-1受体拮抗物敲除动物(对于类风湿性关节炎)。
因此，可以获得本领域中标准的动物模型用于筛选筛选和/或评价本发明方法和组合物在治疗自身免疫病中的活性和/或效力。
在某些实施方案中，个体患有与慢性炎症反应有关的疾病。IRP的施用导致产生免疫调节，降低了一种或多种先天免疫应答相关细胞因子的水平，这导致炎症反应减弱。对具有与所述疾病相关的有害免疫应答的个体进行免疫调节导致减少或改善疾病的一种或多种症状。
本发明的另外的实施方案涉及对接触或感染病毒的个体进行免疫调节性治疗。向接触或感染病毒的个体施用IRP或IRC阻抑了病毒诱导的细胞因子的产生。作为对病毒的反应而产生的细胞因子导致在环境上利于病毒感染。阻抑病毒诱导的细胞因子的产生则限制或防止病毒感染。
在某些实施方案中，个体患有与慢性病原体刺激有关的疾病或病症，例如与慢性病毒感染以及与疟疾有关的疾病或病症。有效抑制TLR-7/8应答的IRP和/或IRC组合物在治疗与慢性病原体刺激有关的疾病和症状中特别有效。
本发明方法可以与其它的标准治疗法组合实施，所述的其它治疗法例如施用抗炎性剂，如全身皮质类固醇治疗(如可的松)。
在一些情况中，对自身抗原的外周耐受丧失(或被破坏)，继而发生自身免疫应答。例如，在EAE动物模型中，通过先天免疫受体TLR9或TLR4使抗原呈递细胞(APC)活化则打破了自身耐受并诱导产生EAE(Waldner等人，(2004)J.Clin.Invest.113990-997)。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了阻抑或降低TLR9依赖性细胞刺激的方法。IRP的施用阻抑了TLR9依赖性细胞应答，包括降低一种或多种TLR9相关细胞因子的水平。适宜用于阻抑TLR9依赖性细胞刺激的IRP是抑制或阻抑TLR9相关细胞应答的那些IRP。
在一些实施方案中，本发明提供了阻抑或降低TLR7/8依赖性细胞刺激的方法。IRP的施用阻抑了TLR7/8依赖性细胞应答，包括降低一种或多种TLR7/8相关细胞因子的水平。适宜用于阻抑TLR7/8依赖性细胞刺激的IRP是抑制或阻抑TLR7/8相关细胞应答的那些IRP。
如本文所证明，一些IRP阻抑TLR9依赖性细胞应答和TLR7/8依赖性细胞应答两种细胞应答。一些IRP阻抑TLR9依赖性细胞应答但不阻抑TLR7/8依赖性细胞应答。一些IRP阻抑TLR7/8依赖性细胞应答但不阻抑TLR9依赖性细胞应答。因此，可以施用特定的IRP以调节特定的免疫应答。
施用以及对免疫应答的评价IRP或IRC可以与本文所述的另外的药剂组合施用，并且可以与生理可接受载体组合施用(因此本发明包括这些组合物)。IRP或IRC可以是本文所述的那些。
由于具有用于调节免疫应答的所有成分，特定IRP或IRC的有效量和施用方法会基于个体、待治疗疾病以及本领域技术人员已知的其它因素的不同而不同。需要考虑的因素包括IRP或IRC是否与递送分子一起施用或者IRP或IRC是否共价连接至递送分子、施用途径以及待施用剂量的数量。此类因素是本领域已知的，并且本领域的技术人员无需过度实验就能确定。适宜的剂量范围是能提供预期的免疫应答(例如阻抑作为对免疫刺激性核酸的应答而出现的IFN-α或其它细胞因子的产生)的剂量范围。当希望阻抑对免疫刺激性核酸产生的免疫应答时，适宜的剂量范围是对免疫刺激性核酸所产生的免疫刺激达到所希望阻抑的剂量范围。通常，剂量是通过施用于患者的IRP的量确定，而不是通过所施用的包含IRP的组合物的总体数量确定。有用的IRP的剂量范围(以递送的IRP的量计)可以是例如下列任何范围0.5-10mg/kg、1-9mg/kg、2-8mg/kg、3-7mg/kg、4-6mg/kg、5mg/kg、1-10mg/kg、5-10mg/kg。给予每一患者的绝对数量取决于药理特性如生物利用度、清除率以及施用途径。
特定IRP或IRC制剂的有效量以及施用方法会基于患者个体、想得到的结果和/或疾病类型、疾病阶段和本领域技术人员已知的其它因素的不同而不同。在特定应用中有益的施用途径对本领域技术人员而言是显而易见的。施用途径包括但不限于局部施用、皮肤施用、经皮施用、经粘膜施用、表皮施用、肠胃外施用、肠胃施用以及鼻咽施用和肺部施用(包括经支气管施用和经肺泡施用)。适宜的剂量范围是提供足够的含IRP组合物以达到大约1-50μM的组织浓度(如通过血液水平所测定)的剂量范围。给予每一患者的绝对数量取决于药理学特性如生物利用度、清除率以及施用途径。
如本文所述，正在发生或可能会发生有害免疫活化的组织是优选的IRP或IRC靶。因此，淋巴结、脾脏、骨髓、血液以及接触病毒的组织是施用IRP或IRC的优选部位。
本发明提供了适于局部应用的IRP或IRC制剂，包括但不限于生理可接受的植入剂、软膏剂、霜剂、漂洗剂以及凝胶剂。例证性的皮肤施用途径是侵害最小的那些途径，例如经皮传递、表皮施用以及皮下注射。
经皮施用通过应用能够使IRP或IRC穿透皮肤进入血液的霜剂、漂洗剂、凝胶剂等实现。适宜经皮施用的组合物包括但不限于可药用混悬剂、油、霜剂和软膏剂，其直接应用于皮肤或者掺入到保护性载体如经皮装置(所谓的“贴剂”)中。适宜的霜剂、软膏剂等的实例可在例如Physician′s DeskReference中找到。经皮传递还可以通过电离子透入疗法实现，例如使用商业可得的贴片，该贴片可以在几天或更长时间内经破损皮肤持续递送产品。使用该方法可以控制药物组合物以相对大的浓度递送，允许灌注组合药物并允许同时使用吸收促进剂。
肠胃外施用途径包括但不限于电注射(电离子透入疗法)或直接注射，例如向中心静脉管内直接注射、静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮内注射或皮下注射。适宜肠胃外施用的IRP或IRC制剂一般用USP水或者适于注射的水配制，并且还包含pH缓冲液、盐类填充剂(salts bulkingagents)、防腐剂以及其它可药用赋形剂。用于肠胃外注射的免疫调节性多核苷酸可用可药用无菌等渗溶液，如注射用盐水和磷酸缓冲盐水配制。
胃肠途径施用包括但不限于摄取途径和直肠途径，并且可以包括使用用于摄取的可药用散剂、丸剂或液体剂以及用于直肠施用的栓剂。
鼻咽及肺部施用通过吸入实现，并且包括鼻内途径、经支气管途径以及经肺泡途径。本发明包括适宜通过吸入施用的IRP或IRC制剂，包括但不限于用于形成气溶胶的液体剂、混悬剂以及用于干粉末吸入递送系统的散剂。适宜通过吸入IRP或IRC制剂施用的装置包括但不限于喷雾器、蒸发器、雾化器以及干粉末吸入递送设备。
如本领域众所周知，用于如本文所述施用途径的溶液剂或混悬剂可以包括一种或多种下列成分无菌稀释剂如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。PH可用酸或碱，如盐酸或氢氧化钠调节。肠胃外制剂可以装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量瓶中。
如本领域众所周知，适于注射的药物组合物包括无菌水溶液(在水可溶解的情况下)或用于临时制备无菌注射溶剂或分散液的分散剂和无菌散剂。对于静脉内注射施用，适宜的载体包括生理盐水、制菌水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且具有一定程度的流动性以便能够注射。其在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液体聚乙二醇等)以及它们的适宜混合物的分散介质。例如通过使用涂料如卵磷脂以通过维持所需颗粒大小(对于分散剂而言)或者通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。防止微生物作用可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂如尼泊金、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等实现。优选地组合物包含等渗剂，如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。延长注射组合物的吸收可以通过向组合物中加入延缓吸收的试剂如单硬脂酸铝和明胶实现。
如本领域众所周知，无菌注射溶液可如下制备将需要量的活性化合物与一种上面所列成分或成分组合(根据需要)加入到合适的溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散剂如下制备向包含基本的分散介质和所需要的其它成分(来自上面所列成分)的无菌媒介物中加入活性化合物。对于用于制备无菌注射溶液的无菌散剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而从先前的过滤灭菌的溶液中得到活性成分与任何其它预期成分的散剂。
上面提到的组合物和施用方法旨在描述而非限制施用本发明IRP和IRC制剂的方法。生产多种组合物的方法和设备是本领域技术人员已知的在此无需详细描述。
对IRP或IRC阻抑免疫刺激活性的分析(定性和定量)可通过本文所述且本领域已知的任何方法进行，所述方法包括但不限于测定对特定细胞群如B细胞增殖的阻抑或降低、测定对特定细胞群如树突状细胞(包括浆细胞样树突状细胞)和T细胞成熟的阻抑、以及测定对细胞因子(例如但不限于IFN-α、TNF-α、IL-6和/或IL-12)产生的阻抑。对特定类型细胞数量的测定可使用例如荧光激活细胞分选(FACS)实现。对特定群体细胞成熟的测定可以通过测定细胞成熟特定阶段特异性的标志(如细胞表面标志)的表达来实现。细胞标志的表达可以通过测定RNA表达来测定或者使用例如FACS分析测定特定标志在细胞表面上的表达来测定。对树突状细胞成熟的测定可以如Hartmann等人，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci USA 969305-9310中所述进行。细胞因子浓度可以通过例如ELISA测定。评价对免疫应答(包括先天免疫应答)阻抑的这些测定法以及其它测定法在本领域是众所周知的。
本发明的试剂盒本发明提供了试剂盒。在某些实施方案中，本发明的试剂盒一般包含含有本文所述的任何IRP和/或IRC的一个或多个容器。试剂盒还包含与根据本文所述任何方法使用IRP和/或IRC相关的适当的说明书，通常是书面说明书(例如阻抑对免疫刺激性核酸的应答、阻抑TLR-7/8和/或TLR-9依赖性应答、改善自身免疫病的一种或多种症状、改善慢性炎性疾病的症状、降低对病毒应答而产生的细胞因子)。
试剂盒可包含包装在任何适宜的方便包装内的IRP和/或IRC。例如，如果IRP或IRC是干燥的制剂(例如冻干的或干燥的散剂)，一般使用带有弹力塞子的瓶，以致于可以用注射液体通过弹性塞子容易地将IRP或IRC重悬浮。带有非弹性的可去除封闭物(例如密封玻璃)或弹性塞子的安瓿瓶最方便用于IRP或IRC的液体制剂。还考虑了用于组合特定装置，如吸入器、鼻使用装置(例如喷雾器)、注射器或者输注装置如微泵的包装。
与IRP和/或IRC使用相关的说明书一般包括对于所计划使用方法的剂量、剂量方案和施用途径信息。IRP或IRC容器可以是单位剂量、批量包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。在本发明试剂盒中提供的说明书一般是在标签上的或包装内的书面说明书(例如试剂盒内的纸片)，但是也可以是机器可读说明书(例如在磁盘或光盘上的说明书)。
在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含产生用于施用的IRP和/或IRC复合物的材料，例如包封材料、微载体复合材料等。通常，试剂盒包括盛有IRP或IRC以及复合材料的分开的容器。IRP或IRC以及复合物优选以如下形式提供，即当将所提供的IRP或IRC以及复合材料混合时允许形成IRP-复合物或IRC-复合物。当IRP-复合物或IRC-复合物通过非共价结合连接时，这种配置方式是优选的。当IRP-复合物或IRC-复合物通过异双功能交联剂交联时，这种配置方式也是优选的；其中所提供的IRP/IRC或复合物是“活化”形式(例如连接至异双功能交联剂，从而得到与IRP/IRC反应的部分)。
提供下列实施例以举例说明本发明，但不限制本发明。
实施例实施例1通过包含IRS的多核苷酸调节细胞的先天免疫应答分析了免疫调节性多核苷酸(IRP)(即，包含至少一个IRS的多核苷酸)或对照样品对人和小鼠细胞先天免疫应答的免疫调节(IR)活性。通过测定先天免疫应答的几种指示物分析IR活性，所述指示物包括细胞因子应答、细胞成熟和细胞增殖。除非另外说明，所测试的多核苷酸是完全修饰的硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。
向细胞培养物中加入免疫刺激性核酸(ISNA)，从而刺激所测试细胞的先天免疫应答。然后向细胞培养物中加入IRP或对照样品。在与细胞孵育之后，测试了培养基中的特定细胞因子水平、细胞成熟状态和/或细胞增殖。
对于小鼠细胞的分析，将消化的BALB/c或C57Bl/6小鼠脾片段加压通过金属筛来机械分散。离心沉淀分散的脾细胞，然后重悬于新鲜培养基中(含10％胎牛血清、50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素、2mM谷氨酰胺以及0.05mMβ-巯基乙醇的RPMI 1640)。对于一些分析，在分析中使用了纯化的鼠CD11c+细胞，该细胞是使用Miltenyi Biotec的CD11c包被微珠(Auburn，CA，目录号130-052-501)并按照产品说明书从脾细胞中分离的。
将小鼠脾细胞加入到96孔板的孔中(7×107个细胞/ml)。向细胞中加入ISNA，如SEQ ID NO＿(1018)或SEQ ID NO＿(C274)，浓度为0.7μM，并向细胞中加入IRP测试样品或对照样品。将细胞孵育48小时。收获每一孔中的培养基，并使用免疫测定ELISA测定细胞因子IL-6和IL-12的浓度。为了开展ELISA，我们使用了抗IL-6抗体(目录号554400和554402，Pharmingen，SanDiego，CA)和抗IL-12抗体(目录号551219和554476，Pharmingen，SanDiego)并且使用了制造商推荐的方法。测试了不同浓度(包括1.4μm、0.7μM、0.14μM和0.07μM)以及不同IRP∶ISNA比(2∶1、1∶1、1∶5和1∶10)的IRP。根据实验涉及测试了其它的比率。对照样品包括单独的ISNA、单独的IRP、单独的培养基以及既不含ISNA也不含IRS的对照寡核苷酸SEQ ID NO＿(C532)。
IRP抑制ISNA刺激的鼠脾细胞以及CD11c+细胞的IL-6和IL-12分泌。使用鼠细胞的此类分析的结果示于图1A-1B。图1A描述用ISNA SEQID NO75(1018)单独刺激和用ISNA SEQ ID NO75(1018)与不同数量的两种IRP，即SEQ ID NO92(530)和SEQ ID NO17(C869)以及对照序列SEQ ID NO76(C532)一同刺激脾细胞的结果。图1B描述用ISNA SEQ IDNO5′-TCG TCG AAC GTT CGA GAT GAT-3′(C274)单独刺激或者用ISNA SEQ ID NO＿(C274)与两种不同IRP(SEQ ID NO92(530)和SEQID NO17(C869))以及对照序列SEQ ID NO76(C532)一同刺激CD11c+细胞的结果。如图1A和1B所示，任一个IRP的存在导致细胞对ISNA而产生的IL-6和IL-12数量降低。IRP对细胞因子产生的抑制是IRP剂量响应性的。
对于人细胞测定法，使用肝素化注射器静脉穿刺从志愿者中收集外周血。血液在FICOLL(Amersham Pharmacia Biotech)垫上分层并离心。收集位于FICOLL界面的PBMC，然后用冷磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次。将细胞重悬并且在48或96孔板中培养，细胞密度为2×106个细胞/mL，培养基是含10％热灭活人AB血清、50单位/mL青霉素、50μg/mL链霉素、300μg/mL谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠以及1×MEM非必需氨基酸(NEAA)的RPMI 1640。
使用Marshall等人，(2003)J.Leukoc Biol.73781-92中描述的方法分离人B细胞和人PDC。将人B细胞分散并培养，从每一孔中收集培养基，并如Marshall等人，(2003)中所述通过ELISA测定细胞因子IL-6的浓度。测试了不同浓度(包括2.8μM、0.7μm和0.175μM)以及不同IRP∶ISNA比(4∶1、1∶1以及1∶4)的IRP SEQ ID NO92(530)以及SEQ ID NO17(869)。对照样品包括单独的ISNA SEQ ID NO75(1018)、单独的IRP(SEQ IDNO92(530)和SEQ ID NO17(869))、单独的培养基以及即不含ISNA又不含IRS的对照寡核苷酸(SEQ ID NO76(532))。
如图2中所示，任一IRP的存在导致由ISNA刺激的纯化人B细胞产生的IL-6数量降低。
在小鼠中检查了IRP的体内活性。将每组小鼠(每组5只)皮下注射下列之一仅25μg ISNA SEQ ID NO75(1018)，25μg ISNA SEQ ID NO75(1018)与75μg、25μg或8.5μg对照寡核苷酸或IRP SEQ ID NO17(C869)组合。以3∶1、1∶1以及1∶3的IRP∶ISNA比向动物共施用。其它对照组用单独的盐水、单独的对照寡核苷酸或单独的IRP SEQ ID NO17(C869)注射。注射核酸2小时后收集血清，使用先前描述的对于IL-6和IL-12的免疫测定法以及使用小鼠抗TNF-α Quantikine(R&D System，Inc.，Minneapolis，MN)测定血清IL-6、IL-12以及TNF-α水平。这些分析的结果示于图3-5。施用单独的IRP和ISNA导致血清中每一细胞因子的数量相对于接受单独的ISNA的动物的血清细胞因子数量降低。
如图3所示，施用任何测试比例的IRP与ISNA导致与单独施用ISNA相比血清IL-6水平降低至少约6倍。图4证明，IRP对IL-12产生的抑制是剂量依赖性的，所测试的所有比例的IRP∶ISNA导致与单独施用ISNA相比细胞因子降低。图5证明，所测试的所有比例的IRP∶ISNA导致与单独施用ISNA相比TNF-α降低。
将IRP和ISNA在不同部位分别施用于动物，检查IRP的体内活性。在该实验中，比较了单独皮下注射25μg ISNA SEQ ID NO75(1018)与皮下注射25μg ISNA SEQ ID NO75(1018)和25μg IRP SEQ ID NO17(C869)的每组小鼠(每组5只)中的细胞因子应答。在所有动物中，ISNA均皮下注射，IRP在与注射ISNA相同的腰窝(SC1)皮下注射、在与注射ISNA的位置对侧的腰窝(SC2)皮下注射、腹膜内注射(IP)、静脉内注射(IV)、肌肉内注射(IM)或鼻内注射(IN)。对照组用盐水、单独的IRP SEQ ID NO17(C869)或对照寡核苷酸与ISNA SEQ ID NO75(1018)在同一腰窝皮下注射。
注射核酸2小时后收集血清，测定血清中的IL-6和IL-12水平。如图6所示，在所有测试部位(即SC1、SC2、IP、IV、IM和IN)施用IRP导致明显阻抑对ISNA应答所产生的IL-6的数量。如图7所示，在所有测试部位施用IRP还导致阻抑对ISNA应答所产生的血清IL-12的数量。
在体外和体内开展的分析法证明，IRP与ISNA无需在同一时间或同一部位共同施用而能够使IRP抑制ISNA的刺激活性。
实施例2IRP活性和TLR依赖性细胞应答如本文所证明，IRP抑制与TLR-9信号相关的活性或应答。开展实验以进一步研究与TLR-9和其它TLR相关的IRP活性和应答。
被1型单纯疱疹病毒(HSV-1)感染的鼠脾细胞和人PBMC及PDC细胞通过产生IFN-α而产生应答，并且该应答依赖于TLR-9信号。被流感病毒(菌株PR/8)感染的鼠脾细胞和人PBMC及PDC细胞也通过产生IFN-α而产生应答。然而，该应答依赖于TLR-7/8信号而不依赖于TLR-9。检查了IRP对感染细胞的天然免疫应答细胞因子产生的影响。
如上所述制备鼠CD11+脾细胞，用不同量的HSV-1感染。测定了细胞所产生的IFN-α(通过免疫分析法(PBL Biomedical Laboratories，Piscataway，NJ)测定)和IL-12的数量并且与用于感染的病毒数量相比较。图8A-8B描述了感染HSV-1数量(感染复数，MOT)对IFN-α和IL-12产生的实例。用10 MOI的HSV-1感染细胞明显产生了IFN-α和IL-12。
在不同数量IRP SEQ ID NO17(C869)(7、3.5或1.75μM)或对照寡核苷酸存在下用10 MOI HSV-1感染鼠CD11+脾细胞，测定所产生的IFN-α和IL-12的数量。如图9A和9B所示，每一种测试浓度的IRP SEQ IDNOC869明显抑制脾细胞产生IFN-α和IL-12。如图9C所示，IRP SEQ IDNO17(C869)也抑制HSV-1感染的人PDC细胞产生IFN-α。这些结果与IRP SEQ ID NO17(C869)抑制TLR-9依赖性细胞应答一致。
也用不同数量的流感病毒(菌株PR/8)感染人PDC。测定了细胞所产生的IFN-α数量，并与用于感染的病毒数量相比较。图10A描述了用于感染的流感病毒数量(感染复数，MOI)对IFN-α产生的实例。用10 MOI流感病毒(菌株PR/8)感染的细胞明显地对感染产生应答而产生IFN-α。
在不同数量IRP SEQ ID NO17(C869)(7、3.5或1.75μm)或对照寡核苷酸存在下用10 MOI流感病毒(菌株PR/8)感染人PDC细胞，然后测定产生的IFN-α数量。如图10B所示，IRP SEQ ID NO17(C869)以剂量依赖方式明显地抑制细胞产生IFN-α。这些结果与IRP SEQ ID NO17(C869)也抑制TLR-7/8依赖性细胞应答一致。
发现SEQ ID NO27(C661)在抑制HSV-1和流感病毒(PR/8)刺激的细胞中不同。在SEQ ID NO17(C869)、SEQ ID NO27(C661)或对照寡核苷酸存在下用30 MOI的HSV-1感染人PDC。在一些实验中，使用其它浓度的HSV-1得到了相似结果。如Duramad等人，(2003)Blood 1024487中所述富集PDC并与致死性UV照射的HSV-1一起孵育。如图11A-11B所示，虽然IRP SEQ ID NO17(C869)完全抑制IFN-α的产生，但是SEQ IDNO27(C661)对细胞产生IFN-α没有抑制作用。在SEQ ID NO17(C869)、SEQ ID NO27(C661)或对照寡核苷酸存在下用10 MOI的流感病毒(PR/8)感染人PDC。如图11A-11B所示，SEQ ID NO27(C661)对细胞产生IFN-α的抑制性作用与IRP SEQ ID NO17(C869)的作用是可比的。因此，不同的IRP可以具有对细胞不同的抑制作用。例如IRP SEQ ID NO27(C661)抑制TLR-7/8依赖性细胞应答但不抑制TLR-9细胞应答。
鼠脾细胞通过TLR-4刺激而对LPS应答产生IL-6。测试了IRP SEQID NO17(C869)和SEQ ID NO92(530)以及对照寡核苷酸对LPS所刺激脾细胞产生IL-6的影响。如图12A-12B所示，IRP均不抑制LPS所刺激脾细胞对IL-6的产生。相反，浓度低4倍的IRP抑制ISNA所刺激脾细胞对IL-6的产生。因此，IRP SEQ ID NO17(C869)或IRP SEQ ID NO92(530)均不抑制该种TLR-4依赖性细胞应答。
使用两种TLR激活剂进一步研究IRP SEQ ID NO17(C869)对TLR-7/8依赖性应答的影响。罗唑利宾(7烯丙基-7，8-二氢-8-氧代-鸟苷)在抗肿瘤应答种作为合成的辅助物起作用。已经证明其通过TLR-7依赖性信号途径选择性的活化细胞的先天免疫系统(Heil等人，(2003)Eur.J.Immunol 332987-2997)。在不同浓度IRP SEQ ID NO17(C869)或对照寡核苷酸存在下用罗唑利宾(100μM)刺激鼠脾细胞，并且测定所产生的IL-6和IL-12的数量。如图13A-13D所示，IRP SEQ ID NO17(C869)以剂量依赖方式抑制TLR-7诱导的IL-6产生，但是不影响细胞对IL-12的产生。
Resiquimod(R-848)是TLR-7和TLR-8信号的刺激物。在不同浓度IRP SEQ ID NO17(C869)或对照寡核苷酸存在下用R-848(1μM)刺激鼠脾细胞，并检测所产生的IL-6和IL-12的数量。如图14A-14D所示，IRPSEQ ID NO17(C869)以剂量依赖方式抑制TLR-7/8诱导的IL-6产生，但不影响细胞产生IL-12。
当测试对不同TLR刺激的抑制时，再次发现SEQ ID NO27(C661)抑制TLR-7/8依赖性细胞应答，但不抑制TLR-4依赖性或TLR-9依赖性细胞应答。如图15A-15D所示，IRP SEQ ID NO27(C661)抑制用100μM罗唑利宾所刺激脾细胞和用1μM R848所刺激脾细胞对IL-6的产生。这表明，SEQ ID NO27(C661)在抑制TLR-7/8依赖性细胞应答中是有效的。然而，图15A-15D还表明，SEQ ID NO27(C661)不抑制ISNA所刺激脾细胞或LPS所刺激脾细胞对IL-6的产生。因此，SEQ ID NO27(C661)在抑制TLR-9或TLR-4依赖性细胞应答中是无效的。
IRP SEQ ID NO17(C869)抑制作为对ISNA刺激、病毒感染和化合物刺激产生应答而产生TLR-7/8和TLR-9依赖性细胞因子。IRP SEQ IDNO27((C661)抑制作为对病毒感染、化合物和刺激ISNA刺激产生应答而产生TLR-7/8依赖性细胞因子，但是不抑制作为对病毒感染、化合物和刺激ISNA刺激产生应答而产生TLR-9依赖性细胞因子。IRP SEQ ID NO17(C869)、IRP SEQ ID NO92(530)或IRP SEQ ID NO27(C661)均不抑制TLR-4依赖性IL-6产生。
实施例3包含IRS的多核苷酸的TLR依赖性活性在一系列实验中，用R848(TLR-7/8信号)或ISNA SEQ ID NO75(1018)(TLR-9信号)与不同的IRP或对照寡核苷酸刺激小鼠脾细胞。表1包括来自2个实验的结果。数值表示为与对单独R848应答产生的IL-6相比，在IRP或对照寡核苷酸存在下应答产生的IL-6百分比。
表1.用R848和IRP刺激的脾细胞对IL-6的产生

表2包括源自ISNA SEQ ID NO75(1018)(TLR-9信号)刺激细胞的结果。数值表示为与对对单独ISNA应答而产生IL-6或IL-12相比，在IRP或对照寡核苷酸存在下IL-6或IL-12应答百分比。
表2.用ISNA和IRP刺激的脾细胞对IL-6和IL-12的产生

表3包括来自3个实验的结果。数值表示为与对单独R848应答(TLR-7/8信号)产生的IL-6相比，在IRP或对照寡核苷酸存在下应答产生的IL-6百分比。
表3.用R848和IRP刺激的脾细胞对IL-6的产生

表4和表5包括来自ISNA SEQ ID NO75(1018)(TLR-9信号)所刺激细胞的结果。数值表示为与对单独ISNA应答产生的IL-6或IL-12相比，在IRP或对照寡核苷酸存在下应答产生的IL-6(表4)或IL-12(表5)百分比。
表4.用ISNA和IRP刺激的脾细胞对IL-6的产生

表5.用ISNA和IRP刺激的脾细胞对IL-12的产生

表6列出了示例性IRS以及它们在抑制TLR信号中的功效。
表6.免疫调节性DNA序列(IRS)序列

Z′＝7-脱氮-dG；+++至-指从活性非常高至无活性的活性范围；ND未测定。
在一系列剂量-效应实验中，用R848(TLR-7/8信号)或ISNA SEQ IDNO75(1018)(TLR-9信号)与不同的IRP或对照寡核苷酸刺激小鼠脾细胞。表7包括在不同比IRP∶ISNA存在下IL-6产生的结果。数值表示为与对单独ISNA应答产生的IL-6相比，在IRP或对照寡核苷酸存在下应答产生的IL-6百分比。
表7.用ISNA和IRP刺激的脾细胞对IL-6的产生

表8包括在不同比IRP∶ISNA存在下IL-12自小鼠脾细胞产生的结果。数值表示为与对单独ISNA应答产生的IL-12相比，在IRP或对照寡核苷酸存在下应答产生的IL-12百分比。
表8.用ISNA和IRP刺激的脾细胞对IL-12的产生

表9包括在不同浓度IRP和R848(TLR 7/8信号)存在下IL-6自小鼠脾细胞产生的结果。数值表示为与对R848应答产生的IL-6相比，在IRP或对照寡核苷酸存在下应答产生的IL-6百分比。
表9.用R848和IRP刺激的脾细胞对IL-6的产生

如表7-9所示，SEQ ID NO52(C954)、SEQ ID NO53(C956)、SEQ IDNO54(C957)以及SEQ ID NO55-65(C962-C972)在抑制TLR-7/8和TLR-9依赖性细胞应答中特别有效。
实施例4用单独的ISNA SEQ ID NO75(1018)(0.7μM)或R848(1μM)或者与增加量的IRP SEQ ID NO17(869)、IRP SEQ ID NO27(661)、IRP SEQID NO52(954)活化鼠脾细胞。如图16A-16B所示，IRP SEQ ID NO17(869)和IRP SEQ ID NO52(954)是作为对ISNA SEQ ID NO75(1018)应答的IL-6产生的有效抑制剂，IRP SEQ ID NO27(661)和IRP SEQ IDNO52(954)是R848活化的有效抑制剂。
将一组小鼠单独皮下注射2.5μgR848或者皮下注射2.5μgR848与450-500μg或100-150μg对照寡核苷酸或IRP SEQ ID NO52(954)。注射R848 1小时后收集血清，并使用先前描述的免疫分析法测定血清IL-12和TNF-α水平。这些分析的结果示于图17A-17B。施用IRP与R848导致与接受单独R848的动物的血清细胞因子数量相比，血清中每一细胞因子数量降低。
6-12周龄BALB/c小鼠腹膜内注射20mg D-半乳糖胺(在盐水中)，并且单独皮下注射50μg ISNA SEQ ID NO75(1018)或者皮下注射50μgISNA SEQ ID NO75(1018)与200μg、100μg或50μg IRP SEQ ID NO52(954)或IRP SEQ ID NO17(869)或对照寡核苷酸ODN。然后，评价小鼠的7天阶段存活情况。在正常小鼠中，50μg ISNA SEQ ID NO75(1018)不诱导死亡，然而，当小鼠用D-半乳糖胺预处理时则变得对炎症高度敏感并迅速死亡。如图18中所示，IRS可以以剂量依赖方式预防死亡，而无活性的对照-ODN则不能。在最高剂量(200μgIRS)，小鼠被100％保护，在100μgIRS时几乎90％被保护，在1∶1的比例时仍然超过60％被保护。因此，这些数据说明IRS具有强的体内活性。
小鼠脾细胞用单独的ISNA SEQ ID NO75(1018)(图19A)或R848(图19B)以及与IRP SEQ ID NO52(954)或IRP SEQ ID NO52(954)降解产物IRP SEQ ID NO＿(DV019)、IRP SEQ ID NO＿(DV020)、IRP SEQ IDNO＿(DV021)、IRP SEQ ID NO＿(DV022)、IRP SEQ ID NO＿(DV023)以及IRP SEQ ID NO＿(DV024)一起活化。
DV0序列是“IRS 954 N minus序列”(从3′末端缺失N＝1-6个核苷酸的IRS 954)SEQ ID NODV0195′-TGC TCC TGG AGG GGT TGSEQ ID NODV0205′-TGC TCC TGG AGG GGT TSEQ ID NODV0215′-TGC TCC TGG AGG GGTSEQ ID NODV0225′-TGC TCC TGG AGG GGSEQ ID NODV0235′-TGC TCC TGG AGG GSEQ ID NODV0245′-TGC TCC TGG AGG。
如图19A和19B所示，当在IRP SEQ ID NO52(954)、IRP SEQ IDNO＿(DV0 19)、IRP SEQ ID NO＿(DV020)、IRP SEQ IDNO＿(DV021)、IRP SEQ ID NO＿(DV022)、IRP SEQ ID NO＿(DV023)存在下培养细胞，IL-6的产生降低，施用IRP SEQ ID NO＿(DV024)抑制很少或不抑制。这表明，甚至序列的3′末端被降解以后，仍然保留了IRPSEQ ID NO52(954)的活性。
将(NZBxNZW)F1小鼠用15μg或45μg IRP SEQ ID NO52(954)一周两次治疗或者不进行治疗。在小鼠4-5月龄(疾病的第一个症状出现)时开始治疗。如图20所示，在不治疗的情况下，血清中抗dsDNA自身抗体水平随时间而增加。注射IRP SEQ ID NO52(954)的小鼠自身抗体水平降低，这说明其具有影响该种易患狼疮的小鼠中疾病进展的能力。
向8-9月龄并且已经患病的(NZBxNZW)F1小鼠一周三次注射100μgIRP SEQ ID NO52(954)或对照寡核苷酸。如图21所示，与用对照寡核苷酸治疗相比，用IRP SEQ ID NO52(954)治疗降低了小鼠的死亡率。
用单独的ISNA SEQ ID NO75(1018)或R848以及与IRP SEQ IDNO17(869)、IRP SEQ ID NO27(661)、IRP SEQ ID NO52(954)或对照寡核苷酸一起活化纯化的人B细胞。如图24所示，在小鼠和人中，这些寡核苷酸的抑制活性的模式是相似的。具体而言，IRP SEQ ID NO52(954)抑制用两种刺激物所刺激的人B细胞对IL-6的产生。
用UV灭活HSV-1病毒(MOI5)单独感染以及与IRP SEQ IDNO52(954)或对照寡核苷酸一起感染人PDC。图23描述了IRP SEQ IDNO52(954)强烈抑制IFN-α产生(作为对单独病毒的应答)的实例。
用热灭活流感病毒(MOI2)单独感染以及与IRP SEQ ID NO52(954)或对照寡核苷酸一起感染人PDC。图24描述了IRP SEQ ID NO52(954)强烈抑制IFN-α产生(作为对单独病毒的应答)的实例。
在UV灭活(60mJ)U937细胞、10％抗dsDNA阳性SLE患者血清单独存在下以及与IRP SEQ ID NO52(954)或对照寡核苷酸共同存在下培养人PDC。如图25所示，含抗dsDNA的血清可以活化PDC并诱导IFN-α。然而，当在培养中加入IRP SEQ ID NO52(954)能抑制IFN-α应答，而对照寡核苷酸无影响。这表明，在这种使用来自SLE患者样品的体外分析法中，IRP SEQ ID NO52(954)能显著抑制PDC活化。
在UV灭活(60mJ)U937细胞、0.5mg/ml来自抗RNP阳性SLE患者的纯化IgG单独存在下以及与IRP SEQ ID NO52(954)或对照寡核苷酸共同存在下培养人PDC。使用HiTrap Protein G HP柱(GE Healthcare，Waukesha，WI)从患者血清纯化IgG。IgG一旦纯化，将其脱盐并定量。如图26所示，抗RNP特异性IgG可以活化PDC并诱导IFN-α。然而，当在培养中加入IRP SEQ ID NO52(954)能抑制IFN-α应答，而对照寡核苷酸无影响。这表明，在这种使用来自SLE患者样品的体外分析法中，IRPSEQ ID NO52(954)能显著抑制PDC活化。
鼠脾细胞用ISNA SEQ ID NO75(1018)或R848单独活化以及用其与IRP SEQ ID NO17(869)、IRP SEQ ID NO77(661)、IRP SEQ ID NO52(954)、IRP SEQ ID NO＿(983)、IRPSEQ ID NO＿(984)、IRP SEQ IDNO＿(985)、IRP SEQ ID NO＿(986)、IRP SEQ ID NO＿(987)、IRP SEQID NO＿(988)、IRP SEQ ID NO＿(989)、IRP SEQ ID NO＿(990)、IRPSEQ ID NO＿(991)或对照寡核苷酸一起活化。如图27和图28所示，加入非核苷酸基团虽然改变了应答水平但是没有导致活性完全丧失。
虽然为了更清楚和更容易理解的目的在上面已经以图解和实施例的方式详细描述了本发明，但是对本领域技术人员显而易见，可以对本发明进行一定的修改和修饰。因此，以上描述和实施例不构成对本发明范围的限制。
权利要求
1.包含式X1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
2.权利要求1所述的寡核苷酸，其中X是C或A。
3.权利要求1所述的寡核苷酸，包含式GGNmX1GGGGX2X3(SEQ IDNO＿)的核苷酸序列，其中m是从1至大约100或者从1至大约20的整数，每一个N是一个核苷酸，并且X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
4.权利要求3所述的寡核苷酸，其中X是C或A。
5.寡核苷酸，包含式NiTCCNj(GG)kNmX1GGGGX2X3(SEQ ID NO＿)核苷酸序列，其中每一个N是一个核苷酸，i是从1至大约50的整数，j是从1至大约50的整数，k是0或1，m是从1至大约20的整数，并且X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X1＝C或A，则X2X3不是AA。
6.权利要求5所述的寡核苷酸，其中X是C或A。
7.包含式X1X2X3GGGGAA(SEQ ID NO＿)核苷酸序列的寡核苷酸，其中X1、X2和X3是核苷酸，其前提条件是如果X3＝C或A，则X1X2不是GG。
8.权利要求1所述的寡核苷酸，其中至少一个G被替换成Z’，其中Z′＝7-脱氮G。
9.权利要求3所述的寡核苷酸，其中至少一个G被替换成Z’，其中Z′＝7-脱氮G。
10.权利要求5所述的寡核苷酸，其中至少一个G被替换成Z’，其中Z′＝7-脱氮G。
11.权利要求7所述的寡核苷酸，其中至少一个G被替换成Z’，其中Z′＝7-脱氮G。
12.寡核苷酸，包含序列5′-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA-3′(SEQID NO＿(C661)或者包括该序列的至少10个碱基回文部分的片段。
13.由核苷酸序列5′-TGCNm-3′组成的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸，m是从5至大约50的整数并且序列N1-Nm包含至少一个GC二核苷酸。
14.权利要求13所述的寡核苷酸，其由核苷酸序列5′-TGCNmA-3′组成。
15.权利要求13所述的寡核苷酸，其由核苷酸序列5′-TGCNmCA-3′组成。
16.权利要求13所述的寡核苷酸，其由核苷酸序列5′-TGCNmGCA-3′组成。
17.包含核苷酸序列TGCNmTCCTGGAGGGGTTGT-3′(SEQ IDNO＿)的寡核苷酸，其中每一个N是一个核苷酸并且m是从0至大约100的整数。
18.权利要求17所述的寡核苷酸，其中序列N1-Nm包含序列5′-TTGACAGCTTGACAGCA-3′(SEQ ID NO＿)的片段。
19.包含核苷酸序列5′-TGCRRZNYY-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中Z是除C外的任意核苷酸，N是任意核苷酸，此外当Z不是G或肌苷时N是鸟苷或肌苷。
20.包含核苷酸序列5′-TGCRRZNYm-3′(SEQ ID NO＿)的寡核苷酸，其中Z是除C外的任意核苷酸，N是任意核苷酸，Y是嘧啶核苷酸，m是从2至100的整数，并且其中当Z不是G或肌苷时，N是鸟苷或肌苷。
21.抑制免疫应答的方法，包括将免疫系统的细胞与权利要求1所述的寡核苷酸接触，其中细胞与有效抑制促成免疫应答的细胞的应答之数量的寡核苷酸接触。
22.调节个体中免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体中免疫应答之数量的权利要求1所述的寡核苷酸。
23.调节个体中免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体中免疫应答之数量的权利要求13所述的寡核苷酸。
24.调节个体中免疫应答的方法，包括向个体施用足以调节所述个体中免疫应答之数量的权利要求17所述的寡核苷酸。
25.抑制个体中TLR7/8依赖性先天免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR7/8依赖性细胞因子产生之数量的权利要求13所述的寡核苷酸。
26.抑制个体中TLR9依赖性先天免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR9依赖性细胞因子产生之数量的权利要求1所述的寡核苷酸。
27.抑制个体中TLR9依赖性先天免疫应答和TLR7/8依赖性免疫应答的方法，包括向个体施用足以抑制所述个体中TLR9依赖性细胞因子产生和TLR7/8依赖性细胞因子产生之数量的权利要求13所述的寡核苷酸。
28.改善自身免疫病的一种或多种症状的方法，包括向患有自身免疫病的个体施用有效量的权利要求1所述的寡核苷酸。
29.权利要求28所述的方法，其中自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
30.改善自身免疫病的一种或多种症状的方法，包括向患有自身免疫病的个体施用有效量的权利要求13所述的寡核苷酸。
31.权利要求30所述的方法，其中自身免疫病选自SLE和类风湿性关节炎。
32.改善自身免疫病的一种或多种症状的方法，包括向患有自身免疫病的个体施用有效量的权利要求17所述的寡核苷酸。
33.权利要求32所述的方法，其中自身免疫病选自系统性红斑狼疮(SLE)和类风湿性关节炎。
34.防止或延缓自身免疫病发展的方法，包括向处于发展成自身免疫病危险中的个体施用有效量的权利要求1所述的寡核苷酸。
35.防止或延缓自身免疫病发展的方法，包括向处于发展成自身免疫病危险中的个体施用有效量的权利要求13所述的寡核苷酸。
36.防止或延缓自身免疫病发展的方法，包括向处于发展成自身免疫病危险中的个体施用有效量的权利要求17所述的寡核苷酸。
37.改善炎性疾病或失调的一种或多种症状的方法，包括向患有炎性疾病或失调的个体施用有效量的权利要求1所述的寡核苷酸。
38.改善炎性疾病或失调的一种或多种症状的方法，包括向患有炎性疾病或失调的个体施用有效量的权利要求13所述的寡核苷酸。
39.改善炎性疾病或失调的一种或多种症状的方法，包括向患有炎性疾病或失调的个体施用有效量的权利要求17所述的寡核苷酸。
40.抑制慢性病原体刺激的方法，包括向患有慢性病原体感染或疾病的个体施用有效量的权利要求1所述的寡核苷酸。
41.试剂盒，包含在合适容器中的权利要求1所述的寡核苷酸以及使用寡核苷酸对个体进行免疫调节的使用说明书。
42.试剂盒，包含在合适容器中的权利要求13所述的寡核苷酸以及使用寡核苷酸对个体进行免疫调节的使用说明书。
43.试剂盒，包含在合适容器中的权利要求17所述的寡核苷酸以及使用寡核苷酸对个体进行免疫调节的使用说明书。
全文摘要
本发明提供了免疫调节性多核苷酸以及施用免疫调节性多核苷酸对个体进行免疫调节的方法。
文档编号A61K31/7115GK101052643SQ200580037417
公开日2007年10月10日 申请日期2005年8月24日 优先权日2004年9月1日
发明者F·巴拉特, R·L·考夫曼 申请人:戴纳瓦克斯技术公司