Il-21配体的制作方法

Il-21配体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及与IL-21分子表面上的不连续表位结合的IL-21配体及其用途。
【专利说明】IL-21配体
[0001]本发明涉及存在于IL-21上的不连续表位和与该表位结合的配体。
[0002]IL-21是对先天性免疫应答和获得性免疫应答两者都发挥多效作用的I型细胞因子。它主要由活化⑶4+ T细胞、滤泡T细胞和天然杀伤细胞产生。另外，最新证据表明Thl7 细胞可产生大量的IL-21。
[0003]IL-21提高⑶8+ T细胞的细胞毒性，在抗原存在下可促进⑶8+细胞增殖。IL-21 受IL-6 (—种已知促进Thl7细胞发育的细胞因子)的诱导。IL-21以促进其自身产生和支持T辅助细胞分化成为Thl7细胞的自分泌方式作用于T辅助细胞。与此一致，IL-21缺陷型小鼠显示Thl7反应受损。IL-21还作用于B细胞，并增加抗体产生；然而，IL-21不是功能性抗体产生所必需的，而IL-21Ra阴性小鼠显示增殖降低以及CD8+细胞的细胞毒性受损两者。最新的系列研究表明，由CD4+细胞产生的IL-21对CD8+ T细胞控制病毒感染的能力至关重要。
[0004]IL-21提高免疫力的能力在IL-21的治疗应用中激起了极大关注。最近在针对转移性黑素瘤类型和肾癌的临床试验中对其进行了评价。动物研究证实IL-21和肿瘤特异性抗体之间的协同效应，这可能表明IL-21作为抗肿瘤抗体的增效剂的未来治疗应用。此夕卜，IL-21在自身免疫病中起复杂作用。IL-21减量调节IgE产生的能力表明，它可治疗性地用于对抗哮喘和变态反应。动物研究结果支持这个观点。另一方面，IL-21促进Thl7发育的能力使之成为促炎细胞因子，而且目前针对在治疗各种不同的自身免疫病中的可能应用，对多种不同的IL-21和IL-21Ra抑制剂进行了研究。
[0005]IL-21具有4个螺旋束结构，以I类细胞因子典型的上-上-下-下的拓扑结构排列。IL-21通过由专用链(private chain) IL_21Ra和共用Y C链组成的异二聚体受体复合物发出信号，后者由IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15所共用。IL_21Ra链以高亲和力结合IL-21，并提供大部分结合能。然而，信号传导需要与Y C链相互作用，而且结合IL-21R a 但不能与Y C适当相互作用的IL-21突变体是IL-21信号传导的有效拮抗剂。IL-2和IL-15 两者分别利用第三受体链IL-2Ra和IL-15Ra。这些受体对于信号传导是消耗性的，但是在发生YC募集后，用作俘获IL-2或IL-15并将其提供给IL-2R3的受体复合物的高亲和力组分。
[0006]对IL-21有特异性的单克隆抗体是本领域已知的，例如W02007111714和 W02010055366 (Zymo-Genetics, Inc.)的单克隆抗体。具体地说，W02010055366 描述了以克隆号362.78.1.44命名的抗IL-21抗体，其对其关联抗原具有高亲和力并具有其它所需性质，对人和食蟹猴(cynomolgus monkey) IL.-21显示特异性。在W02010055366 中，克隆362.78.1.44以与人IL-21上的不连续表位结合为特征，所述表位包含来自跨越 W02010055366 中 SEQ ID N0.2 所示 IL-21 序列的残基 Ile45_Leu56 和 Glul29_Leul44 的两个肽的氨基酸。
[0007]发明概述
我们在本文定义了被较高亲和力配体特征性结合的IL-21的新的表位。配体与该表位的结合使人IL-21 (hIL-21)的螺旋C稳定。这导致IL-21的整体稳定，这被认为促进高亲和力结合和/或IL-21诱导作用的有效抑制。
[0008]本发明的表位被天然IL-21受体IL-21Ra (SEQ ID N0.14)结合。我们鉴定出 IL-21和IL-21Ra之间负责两个分子相互作用的结合界面，因此设计出通过破坏IL-21与其关联受体间的相互作用而抑制IL-21活性的抗体靶标。
[0009]我们还描述了与本发明的表位特异性结合的配体，例如抗体，以及制备和使用这类配体的方法。
[0010]发明详述
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，否则本发明的实践采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。
[0011]附图简述
图1:本文提及的序列。
[0012]图2:通过质谱法监测的HX鉴定出参与NNC 0114-0005和NNC 0114-0019结合的 hIL-21的区域。(A)对应于位于螺旋A的肽片段29-44即MQGQDRHMIRMRQLID的质/荷谱 (Mass/charge spectra) (m/z = 676.68, z= 3)。(B)对应于位于螺旋 C 的肽片段 93-98 即ERIINV的质/荷谱(m/z = 743.47, z= I)。对于所有波谱,上组图显示非氣化对照,第二组图显示与D2O交换100秒钟后的肽，第三组图和下组图显示分别在NNC 0114-0005或 NNC 0114-0019存在下交换100秒钟后的肽。
[0013]图3:在NNC 0114-0005或NNC 0114-0019不存在或存在时hIL_21的代表性肽的氢交换时间曲线。在不存在( )或存在NNC 0114-0005 (X)或NNC 0114-0019 (A)时， hIL-21肽的氘掺入(Da)以对数标度针对时间作图。肽Q30-M39表示其中NNC 0114-0005和 NNC 0114-0019两者结合的hIL-21螺旋A的区域。肽E93-V98表示其中仅NNC 0114-0005 而非NNC 0114-0019结合的hIL-21螺旋C的区域。肽R40-N51和F136-S162表示其中NNC 0114-0005 和 NNC 0114-0019 无一结合的 hIL-21 的区域。然而，当 NNC 0114-0005 而非 NNC 0114-0019与hIL-21结合时，观察到hIL-21结构显著稳定，如在300秒钟以上长的时间点上氘交换显著降低所显示的。
[0014]图4:在NNC 0114-0005存在和不存在时hIL_21的HX分析的肽的序列覆盖(Sequence coverage)。在HX分析的肽(表示为水平棒)上方显示原始序列。在 NNC 0114-0005存在和不存在两种情况下显示类似交换模式的肽以白色显示，而在NNC 0114-0005结合时显示氘掺入减少的肽着黑色。用框标出的序列区界定表位。
[0015]图5:在NNC 0114-0019存在和不存在时hIL-21的HX分析的肽的序列覆盖。在 HX分析的肽(表示为水平棒)上方显示原始序列。在NNC 0114-0019存在和不存在两种情况下显示类似交换模式的肽以白色显示，而在NNC 0114-0019结合时显示氘掺入减少的肽着黑色。用框标出的序列区界定表位。
[0016]图 6:在 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 或-0042 不存在或存在时 hIL-21 的代表性肽的氢交换时间曲线。在不存在( ， )或存在-0005 (X) ,-0038 ( A ) >-0039 (□ )、-0040 (+)、-0041 (〇)或-0042 (-)时，将hIL-21肽的氘掺入(Da)以对数标度针对时间作图。肽 M29-D44 表示其中 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 和-0042 结合的hIL-21螺旋A的区域。肽I45-N51表示这样的hIL-21区域，其中在早期时间点上0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041和-0042的结合可看作是极弱的氘交换差异。此外，通过在300秒钟以上长的时间点上氘交换的明显降低，观察到在0114-0005、-0038、-0039、-0 040、-0041或-0042与hIL-21结合时hIL-21结构的显著稳定。肽E93-V98表示其中011 4-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 和-0042 结合的 hIL-21 螺旋 C 的区域。肽 E138-S162 表示其中无一 mAb 结合的 hIL-21 的区域。然而，当 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 或-0042与hIL-21结合时观察到hIL-21结构稳定，如在300秒钟以上长的时间点上显示的氘交换降低。
[0017]图7:在 0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041 和-0042 存在和不存在时 hIL-21 的HX分析的肽的序列覆盖。在HX分析的肽(表示为水平棒)上方显示原始序列。在所研究的任何mAb结合时，所有肽显示类似的交换特性。在0114-0005、-0038、-0039、-0040、-00 41或-0042存在和不存在的两种情况下，在早期时间点上显示类似交换模式的肽以白色显示，而在0114-0005、-0038、-0039、-0040、-0041或-0042结合时显示氘掺入减少的肽着黑色。
[0018]定义
本文所用术语“治疗”是指医学治疗有需要的任何人或其它动物受试者。预期所述受试者已由医学和兽医从业人员进行了身体检查，医师已做出了可表明采用所述具体治疗有益于所述人或其它动物受试者健康的试验性或确定性诊断。根据受试者的健康现状，所述治疗的时机和目的可在个体与个体间不同。因此，所述治疗可为预防性、治标性的、针对症状的和/或治愈性的。
[0019]就本发明而言，预防性、治标性、针对症状的和/或治愈性治疗可表示本发明的各个方面。
[0020]已通过X射线晶体学和HX-MS界定了被抗体NNC 0114-0005结合的hIL_21的表位，本文进行了描述。
[0021]在该上下文中，在免疫球蛋白分子的情况下，特异性结合是由于免疫球蛋白结合部位(通过作为免疫球蛋白可变结构域的部分的至少一个⑶R所形成)与表位之间相互作用而发生的结合。优选特异性结合由于形成免疫球蛋白结合部位的免疫球蛋白轻链的一个或多个(例如2个或3个)CDR和免疫球蛋白重链的一个或多个(例如2个或3个)CDR 与表位之间相互作用而发生。
[0022]特异性结合还可表征为以规定的结合亲和力产生的结合。例如，结合常数优选为 I U M或更小的数量级，例如100nM、IOnM, InM、100pM、IpM或更小。
[0023]“不连续”表位是由多肽的两个或更多个间隔区域形成的表位，所述间隔区域在线性肽序列中彼此不相邻，但在多肽的三维结构中排列形成表位。
[0024]本文所用“分离的”化合物是从其天然环境移出的化合物。“纯化的”化合物是纯度提高的化合物，使得化合物以比其天然环境存在时更纯的形式存在。
[0025]抗体
可用于本发明的优选配体以免疫球蛋白为基础。适于本发明的免疫球蛋白包括抗体和 T细胞受体(TCR)分子。
[0026]本文所用术语“抗体”、“单克隆抗体”和“mAb”欲指具有与抗原特异性结合的能力的本发明的免疫球蛋白分子及其片段。全长抗体包含4条多肽链，通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文简称为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文简称为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由I个结构域CL组成。VH和VL区可进一步细分成超变性区，称为互补决定区(CDR)，散布在称为构架区(FR)的更保守的区域内。VH和VL 各由3个⑶R和4个FR组成，按下列顺序从氨基端到羧基端排列:FR1、⑶Rl、FR2、⑶R2、 FR3、⑶R3、FR4。可通过将序列与已知可变区数据库进行比对来鉴定抗体序列中的可变区和⑶R (构架区和⑶R在本文按照Kabat编号方案定义一Kabat，EA, Wu，TT, Perry, HM 等.Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版.US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH 公布号 91-3242，1991)。
[0027]抗体的片段可结晶区(“Fe区”/”Fc结构域”)是与细胞表面受体(称为Fe受体)和补体系统的一些蛋白质相互作用的抗体尾区。该性质允许抗体激活免疫系统。然而， Fe结构域可包含导致这些效应子功能改变的氨基酸突变。优选修饰的Fe结构域包含一个或多个、优选所有的下列突变:可分别导致对某些Fe受体的亲和力降低(L234A、L235E和 G237A)和Clq介导的补体结合降低(A330S和P331S)(残基编号按照EU指数)。这类Fe 结构域仍可保持长的体内半衰期。
[0028]抗体的其它部分，称为“Fab区”/”Fab结构域”/”Fab片段”含有界定抗体可结合的特定靶标的可变部分。可采用众所周知的方法，例如通过用酶例如木瓜蛋白酶(产生Fab 片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)进行蛋白水解性切割，从完整抗体产生这些片段。 或者，可采用标准重组DNA和蛋白质表达技术，重组产生抗体片段。
[0029]因此，包括在术语“抗体”内的结合片段的实例包括但不限于:⑴Fab片段，一种由VL、VH、CL和CHl结构域组成的一价片段；(ii) F(ab)2和F(ab’)2片段，一种包含在铰链区通过二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CHl结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的scFv片段，(v) dAb片段(Ward等，(1989) Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然 Fv片段的2个结构域VL和VH由各自的基因编码，但是可采用重组 方法，通过合成接头将它们连接，这使得将其制备成为其中VL和VH区配对形成一价分子的单条蛋白质链(称为单链 Fv (scFv);参见例如 Bird 等(1988) Science 242:423-426 ;以及 Huston 等(1988) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。这类单链抗体也欲包括在术语“抗体”内。 单链抗体的其它形式，例如双链抗体(diabodies)也包括在术语“抗体”内。双链抗体为二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用太短以致于不允许同一链上的两个结构域配对的接头，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对，并产生两个抗原结合部位(参见例如Hol-liger, P.等(1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等(1994) Structure 2:1121-1123)。
[0030]了解的是，抗原可具有一个或多个抗原决定簇(表位)，其包含⑴肽抗原决定簇， 由单条肽链组成，(2)构象抗原决定簇，由一个以上空间上邻接的肽链组成，所述肽链各自的氨基酸序列沿着多肽序列不连贯地定位；和(3)翻译后抗原决定簇，其由翻译后与抗原共价连接的分子结构的全部或部分组成，例如碳水化合物基团等。
[0031]本文所用术语“人抗体”、“多种人抗体”意指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括例如在CDR中、特别是在CDR3中不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点专一诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
[0032]其中自来源于另一哺乳动物物种(例如小鼠)的抗体衍生的抗体的CDR序列被移植到人构架序列，且任选可能通过诱变进一步改造的本发明抗体被称为“人源化抗体”。
[0033]术语“嵌合抗体”或“多种嵌合抗体”是指其轻链和重链基因通常通过遗传工程自属于不同物种的免疫球蛋白可变区和恒定区基因构建的本发明抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体基因的可变区段可与人恒定区段连接。
[0034]表位
在“抗原结合性多肽”例如抗体(Ab)与其相应的抗原(Ag)之间的分子相互作用的情况下定义本文所用术语“表位”。“表位”一般是指Ab与之特异性结合的Ag上的区或区域， 即与Ab物理接触的区或区域。对于Ab和Ag分子中的原子，可通过各种标准来定义物理接触(例如2-6A、例如3A、例如4 A、例如5A的距离截止值(cut-off);或溶剂可及性)。蛋白质表位可包含Ag中直接参与与Ab结合的氨基酸残基(亦称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，例如被Ab有效封闭的Ag的氨基酸残基，即Ab的“溶剂排斥表面(solvent-excluded surface) ”和/或“足迹(footprint) ”内的氨基酸残基。
[0035]可采用各种实验和计算表位作图方法，以不同的细节层次描述和表征给定抗体 (Ab)/抗原(Ag)对的表位。实验方法包括诱变、X射线晶体学、核磁共振(NMR)波谱学、氢氣交换质谱法(Hydrogen deuterium eXchange Mass Spectrometry,HX-MS)和各种竞争结合方法、本领域已知的方法。由于每种方法依赖于独特的原理，因此表位的描述与测定表位的方法密切相关。因此，根据所采用的表位作图方法，可对给定Ab/Ag对的表位进行不同的描述。
[0036]可根据本发明抗体识别或特异性结合的IL-21蛋白的一个或多个表位或部分来描述或确定本发明的抗体。例如可通过N端和C端位置或连续氨基酸残基的大小,来确定一个或多个表位或多肽部分。还可根据其交叉反应性来描述或确定本发明的抗体。包括了不结合多肽的任何其它类似物、直向同源物(ortholog)或同源物的抗体。
[0037]可关于抗体与其共同抗原同时结合的能力，来表征与相同抗原结合的抗体，并且可对抗体进行“竞争结合”/ “分箱(binning)”。本文中，术语“分箱”是 指对与相同抗原结合的抗体归类的方法。抗体的“分箱”可以在基于标准技术例如表面等离振子共振(SPR)、 ELISA或流式细胞术的测定法中两种抗体与其共同抗原的竞争结合为基础。
[0038]使用参比抗体来定义“箱(bin)”。如果第二抗体不能在与参比抗体相同的时间与抗原结合，则第二抗体被称为属于与参比抗体相同的“箱”，在这种情况下，参比抗体和第二抗体对于与抗原结合是竞争性的，因此该抗体对被称为“竞争性抗体”。如果第二抗体能够在与参比抗体相同的时间与抗原结合，则第二抗体被称为属于各自的“箱”。在这种情况下参比抗体和第二抗体对于与抗原结合不是竞争性的，因此该抗体对被称为“非竞争性抗体”。
[0039]抗体“分箱”不提供有关表位的直接信息。竞争性抗体，即属于相同“箱”的抗体可具有相同的表位、重叠表位或甚至各自的表位。后者是这样的情况:如果与抗原上的表位结合的参比抗体占据第二抗体与其抗原上的表位接触所需要的空间(“位阻”)。非竞争性抗体一般具有各自的表位。
[0040]本文所用术语“亲和力”定义了抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力通过平衡解离常数KD测量，平衡解离常数定义为[Ab] X [Ag] / [Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是平衡时抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合抗原的摩尔浓度。还可根据通过例如SPR方法测定的复合物形成和解离的动力学来描述KD。一价复合物结合和解离相应的速率常数分别称为结合速率常数ka (或kj和解离速率常数kd (或 kf)。然后通过等式KD = kd / ka将KD与ka和kd相关联。亲和常数KA定义为I/ KD。 用于通过竞争抑制测定抗体特异性和亲和力的优选方法可参见Harlow等，Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Colligan 等， 主编，Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc, and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993);以及Muller, Meth.Enzymo1.92:589-601 (1983)。
[0041]可对抗体或其片段进行修饰以延长其血清半衰期，例如通过与分子(例如脂肪酸或脂肪酸衍生物、PEG (聚乙二醇)或其它水溶性聚合物，包括多糖聚合物和肽衍生的聚合物)缀合来延长半衰期。
[0042]配体的结构
如上所述，如本文提及的配体可以是抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgA、IgE)或包含彼此互补因此彼此缔合形成VH/VL对的至少一个重链可变结构域和轻链可变结构域的片段(例如Fab、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、双链抗体)。它可来源于天然产生抗体的任何物种,或通过重组DNA技术产生；或使用分子展示技术由序列文库分离，例如噬菌体展示，不论文库序列分离自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、酵母还是细菌。
[0043]在本发明的一个优选的实施方案中，配体包含抗体的至少一个单一重链可变结构域和抗体的一个单一轻链可变结构域，使得两个区能够缔合形成互补的VH/VL对。
[0044]如果使用V基因库，则多肽序列的变异优选位于可变结构域的结构环内。可通过 DNA改组或通过突变改变任一可变结构域的多肽序列，以提高各可变结构域与互补对的相互作用。在本发明的一个优选的实施方案中，配体是单链Fv片段。在本发明的一个备选实施方案中，配体由抗体的Fab区组成。
[0045]又一方面，本发明.提供编码至少本文定义的配体的核酸。因此，又一方面，本发明提供包含编码至少本文定义的配体的核酸的载体。
[0046]治疗应用
IL-21参与T细胞介导的免疫，并且已表明促进多种炎性细胞因子。因此，本发明的配体可用于治疗涉及不当或不需要的免疫应答(免疫病症)的疾病，例如炎症、自身免疫、涉及这类机制的病况以及移植物抗宿主病。在一个实施方案中，这类疾病或病症是自身免疫病和/或炎性疾病。这类自身免疫病和/或炎性疾病的实例为系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD))、多发性硬化(MS)、硬皮病和I型糖尿病(Tl D)及其它疾病和病症，例如PV (寻常性天疱疮)、银屑病、特应性皮炎、乳糜泻、kol、桥本氏甲状腺炎 (hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(graves’ disease)(甲状腺)、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、格-巴综合征(guillain-barre syndrome)、古德帕斯彻综合征(goodpasture，s syndrome)、艾迪生病(additon，s disease)、韦格纳肉芽肿病(Wegener，s granulomatosis)、原发性胆管硬化症、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、雷诺现象(paynaud’ s phenomenon)、颞动脉炎、巨细胞性动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎、贝切特病(behcet’s disease)、原发性胆汁性肝硬化、眼色素层炎(uveitis)、心肌炎、风湿热、关节强硬性脊椎炎、肾小球性肾炎(glomerulenephritis)、 结节病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、斑秃、I型糖尿病、结肠炎相关性肿瘤发生和白癜风 (Vitilgo)0其它实例可参见PCT申请WO 01/46420，其涉及使用IL-17治疗自身免疫病和 /或炎性疾病，其中给出若干这类疾病的实例，以及W02010/055366，所述文献的内容通过引用明确结合到本文中。
[0047]在一个实施方案中，这类疾病或病症是SLE、RA或IBD。在一个实施方案中，这类疾病或病症是MS。
[0048]本发明的IL-21配体可与本领域已知的其它药物组合给予。
[0049]药物组合物
本发明还包括包含药学上可接受的载体和本发明的多肽/配体/抗体的药物组合物/ 制剂以及包含这类组合物的药盒。本发明的药物组合物可呈含水制剂或无水制剂的形式， 所述无水制剂在给予前在水/水性缓冲液中复溶。
[0050]包含本发明的配体/抗体/多肽的药物组合物可以药盒供应，药盒包括装有本发明的化合物的容器。治疗性多肽可以单剂量或多剂量注射溶液剂的形式或作为将在注射前复溶的无菌散剂的形式提供。包含本发明的化合物的药物组合物可适于皮下和/或IV给药。
[0051]此外，提供用于治疗与免疫应答异常有关的病况的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效量配体，所述配体可采用上述测定方法鉴定。
[0052]氨基酸I37-Y52和 N92-P108界定人IL-21的新的表位。我们确认与IL-21结合的高亲和力配体更可能与落入所述氨基酸范围的IL-21接触。通过与该表位结合，配体对 IL-21具有稳定作用。具体地说，极易活动的螺旋C被稳定在结合状态，大大降低了存在于游离状态的IL-21分子中的能量。
[0053]此外，我们还确认，该表位被单克隆抗体NNC 0114-0005 (本文亦可称为例如 “‘0005”)特异性结合。轻链和重链可变结构域的序列分别如SEQ ID No 10和SEQ ID No 11所示。该抗体与公开于W02010/055366的抗体相同，该文中命名为杂交瘤克隆号 362.78.1.44。本文还可以若干方式提及该抗体0005，，、“NNC-0000-0005，，、“0006”和 “NNC-0000-0006”。然而，在W02010/055366中，被相同抗体靶向的表位被不正确地界定为包含残基Ile45-Leu56和Glul29_Leul44。我们目前已表明这是不正确的。
[0054]同样地，本文界定的表位还被单克隆抗体NNC 0114-0015 (本文亦可称为 “0015”)结合，其公开于W02010/055366，被命名为杂交瘤克隆号362.597.3.15。轻链和重链可变结构域的序列分别如SEQ ID IN No 12和SEQ ID No 13所示。与NNC 0114-0005 相比，NNC 0114-0015具有单个氨基酸改变，HC S31T (按照Kabat的编号——Kabat, EA, ffu, TT, Perry, HM 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH 公布号 91-3242，1991)。[0055]第一方面，提供与本文定义的表位特异性结合的配体，优选抗体，条件是配体不是天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14给出包括不是成熟IL-21Ra蛋白的部分的信号序列的完整IL-21Ra序列)或包含本文所述IL-21结合部位的任何前述IL-21R变体，或单克隆抗体NNC 0114-0005或NNC 0114-0015，其轻链和重链分别在本文SEQ ID N0.10和 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12 和 SEQ ID N0.13 中示出。
[0056]优选配体是免疫球蛋白，例如抗体或抗体片段或TCR (T细胞受体)或其片段。
[0057]我们表明，结合所述表位的配体通过使螺旋C和整个分子稳定而使IL-21稳定。认为IL-21分子的稳定作用提高结合配体的亲和力，因为与未结合分子相比，结合的IL-21达到极低能态。
[0058]本发明实施方案的另一方面，配体是抗体或抗体片段，其中重链包含SEQ ID N0.11所示的CDRl、CDR2或CDR3的至少一个，轻链包含SEQ ID N0.10所示的CDRl、CDR2或 CDR3的至少一个。所列出的SEQ ID N0.10和11的CDR按照Kabat方案定义(Kabat, EA, ffu, TT, Perry, HM 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版.US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, NIH 公布号 91-3242，1991)。
[0059]在一个实施方案中，轻链包含SEQ ID N0.10所示序列。
[0060]在一个实施方案中，重链包含SEQ ID N0.11所示序列。
[0061]配体还可另外包含Fe，其介导抗体效应子功能。
[0062]另一方面，提供配体，优选抗体，其与本文鉴定的在IL-21和IL-21R a之间形成的界面上的IL-21表位特异性结合。优选配体在包括下列残基的任一个或多个的表位上结合:R34、R38、Q41、K102 和 R105。优选配体与至少 R34 和 K102 ;或 R34 和 R105 ;或 R34、K102 和 R105 ;或 R38 和 K102 ;或 R38 和 R105 ;或 R38、K102 和 R105 ;或 Q41 和 K102 ;或 Q41 和 R105 ;或041、1(102 和 R105 ;或町05、1?34 和 R38 ;或 R105、R34、R38 和 Q41 ;或1(102、1?34 和 Q41 ;*R34、R38、Q41、K102 和 R105 ;或 R38、Q41、K102 和 R105 ;或 R34、Q41、K102 和 R105 ； 或 R34、R38、K102 和 R105 结合。
[0063]还包括在本文鉴定的IL-21:1L_21R结合界面上与IL_21Ra结合的的抗IL_21Ra 配体。
.[0064]另一方面，提供与本发明IL-21的不连续表位特异性结合的配体，优选抗体，条件是配体不是:(i)天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)单克隆抗体NNC 0114-0005， 其轻链和重链分别如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)单克隆抗体NNC 0114-0015，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。因此，本发明包含具有这类性质的任何配体，下列化合物除外:IL-21Ra、单克隆抗体NNC 0114-0005和单克隆抗体 NNC 0114-0015。
[0065]另一方面，提供与IL-21上的不连续表位结合的配体，优选抗体，其中所述表位包含如SEQ ID N0.1所示IL-21的氨基酸I37-Y52的至少一个和氨基酸N92-P108的至少一个，条件是配体不是:(i)天然存在的IL_21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)单克隆抗体NNC 0114-0005，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)单克隆抗体NNC 0114-0015，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。因此，本发明包含具有这类性质的任何配体，下列化合物除外:IL-21Ra、单克隆抗体NNC 0114-0005和单克隆抗体NNC 0114-0015。
[0066]在一个实施方案中，本发明的配体与包含如SEQ ID N0.1所示IL-21的氨基酸 I37-Y52和N92-P108的表位结合。
[0067]本发明的另一方面或实施方案，配体含有包含对应于SEQ ID N0.10的下列残基的⑶R1XDR2或⑶R3中至少一个的轻链和包含对应于SEQ ID N0.11的下列残基的⑶R1、 ⑶R2或⑶R3中至少一个的重链。
[0068]0114-0005 CDR_L1: SEQ ID N0.10 的 R24-A35。
[0069]0114-0005 CDR_L2: SEQ ID N0.10 的 G51-T57。
[0070]0114-0005 CDR_L3: SEQ ID N0.10 的 Q90-T96。
[0071]0114-0005 CDR_H1: SEQ ID N0.11 的 S31-H35。
[0072]0114-0005 CDR_H2: SEQ ID N0.11 的 F50-G66。
[0073]0114-0005 CDR_H3: SEQ ID N0.11 的 D99-V115。
[0074]在另一个实施方案中，本发明的配体含有包含SEQ ID N0.10所示⑶Rl和⑶R3 中至少一个的轻链和包含SEQ ID N0.11所示⑶R2和⑶R3中至少一个的重链。
[0075]另一方面，提供在IL-21和IL-21Ra之间的结合界面上与IL-21结合的配体， 优选抗体，其中所述配体与包括SEQ ID No I所示IL-21序列中的R34、R38、Q41、R105和 K102至少一个、优选至少两个、优选至少三个、优选至少四个的表位结合，条件是配体不是: (i)天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14) (ii)单克隆抗体NNC 0114-0005，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)单克隆抗体NNC 0114-0015，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。因此，本发明包含具有这类性质的任何配体，下列化合物除外:IL-21Ra、单克隆抗体NNC 0114-0005和单克隆抗体NNC 0114-0015。
[0076]在一个实施方案中，本发明的配体与包含R34、R38、Q41、R105和K102的IL-21上的表位结合。
[0077]在另一个实施方案中，本发明的配体干扰IL-21与IL_21Ra结合。
[0078]在另一个实施方案中，人IL-21与本发明的配体相互作用的KD为10_12 (M)或更小。在另一个实施方案中，本发明的配体优选为抗体，其中所述抗体与SEQ ID No I所示 IL-21序列中的R34、R38、Q41、R105和K102结合，且其中人IL-21与抗体相互作用的KD为 Kr12 (M)或更小。
[0079]在另一个实施方案中，本发明的配体是抗体，其中所述抗体包含如SEQ ID NO 10 所示的⑶R3氨基酸序列和如SEQ ID NO 11所示的⑶R3氨基酸序列。
[0080]在另一个实施方案中，本发明的配体是抗体，其中人IL-21与所述抗体相互作用的KDSKT12 (M)或更小，其中所述抗体与SEQ ID No I所示IL-21序列中的R34、R38、Q41、 R105和K102结合，且其中所述抗体与IL-21竞争结合IL-21R。
[0081]在另一个实施方案中，本发明的配体是抗体，例如抗体、单克隆抗体、一价抗体或二价抗体。
[0082]在本发明的另一方面或实施方案中，配体是作为单克隆抗体NNC 0114-0005的变体的抗体，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，其中所述配体包含 SEQ ID N0.10和/或SEQ ID N0.11的⑶R序列中的一个或多个突变，其中所述突变选自下列的一个或多个:CDR Hl S31A、CDR H2 Y53F、CDR H2 A61S、CDR H2 S63T、CDR H2S63A、 CDR H2 K65R、CDR LI R24K、CDR LI S26T、CDR LI S31T、CDR LI S31A、CDR L2 S53T、CDR L2 S52A、CDR L2 S54A、CDR L2 S54T和CDR L2 R55K。当然要了解，这类变体抗体可只在给
定位置上包含一个突变。
[0083]另一方面，提供包含本发明的配体、优选抗体和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂/载体的药物组合物。这类赋形剂/载体是本领域众所周知的。这类药物组合物优选欲用于IV给药和/或皮下给药。
[0084]另一方面，提供用于治疗免疫病症的本发明的配体、优选抗体的用途。所述免疫病症优选为自身免疫病。
[0085]最后一个方面，提供治疗免疫病症的方法，其中所述方法包括给予有需要的人适当剂量的本发明的配体、优选抗体。在一个实施方案中，本发明的配体可在自身免疫病的治疗中用于减少B细胞分化。
[0086]本发明的配体适用于治疗免疫应答异常、包括自身免疫病的病况。在多种T细胞特异性相互作用中需要IL-21，且IL-21是免疫调节性细胞因子。因此，提供本文所述IL-21 特异性配体用于治疗涉及免疫应答异常的病况。此外，提供治疗涉及免疫应答异常的病况的方法，所述方法包括给予有需要的受试者本发明的配体。
[0087]本文提供的IL-21:1L_21Ra和Fab NNC 0114-0009:1L-21复合物的详细三维结构知识，包括其结合界面，可构成合理设计具有所需性质的相互作用分子的变体的基础。对于抗体可能需要改进的性质可为化学或物理性质，例如溶解度、粘度和稳定性。可能需要调节 的其它性质是抗体的抗原性质及其被抗抗体结合并诱导效应子功能的能力。
[0088]要了解，本发明的不同方面和实施方案可以组合。
实施例
[0089]实施例1
hIL-21与抗IL-21 Fab的复合物的晶体结构
解析了 hIL-21与人抗IL-21单克隆抗体NNC 0114-0005的Fab片段NNC 0114-0009 (该Fab片段在本文亦可称为例如“Fab 0114-0005”)的复合物的三维结构，并采用X射线晶体学精修至1.75 A分辨率。结果表明，hIL-21上的表位与专用hIL-21受体链(IL21Ra ) 的结合部位广泛重叠。因此，凭借其高亲和力，抗IL-21 mAb有效地阻断hIL-21与IL21Ra 结合，并因此抑制由hIL-21通过其关联受体介导的生物作用。
[0090]将hIL-21 (SEQ ID NO:1 的残基 30-162)和抗 IL-21 Fab NNC 0114-0009 (包含对应于SEQ ID NO: 16的轻链和对应于SEQ ID NO: 17的残基1-234的重链片段)与摩尔浓度略微过量的hIL-21混合，复合物采用大小排阻层析法纯化。然后将复合物浓缩至约
10.3mg/ml。用悬滴技术使晶体在以1:2 (沉淀剂溶液体积:蛋白质溶液体积)比率混合的25% w/v PEG 3350、0.1M柠檬酸(pH 3.5)中生长。总的液滴大小为3.0 u 10通过将含有75%沉淀剂溶液和25%甘油的3 u I冷冻溶液(cryo-solution)转移到含晶体的液滴中，并允许浸泡约15秒钟,来制备晶体用于低温冷冻(cryo-freezing)。然后使晶体在液氮中速冻，并在数据收集期间通过低温N2气流保持在100 K温度下。在MAX-1ab，Lund， Sweden,收集晶体学数据，最初在Rigaku 007HF旋转阳极源至2.03 A的分辨率，之后使用相同晶体在束线BL911-2 [1]至1.75 A分辨率。通过XDS软件包[2]进行空间群测定、数据的积分和标定，并通过Pointless软件[3]进一步检查。测定用于同步加速器数据的晶胞参数分别为 40.7，133.3，53.4 A，90。,106.87° 和 90。，空间群为 P2lt) M 1.75 A 分辨率的R-sym为5.1%，完整性98.1%。应用CCP4套件[6]的Phaser软件程序[4; 5]的分子置换用于结构测定。来自蛋白质数据库(Protein Data Bank, PDB)保藏的[7]结构3KDM [8]的Fab分子和来自较早前测定的1L-21/IL-21Ra复合物结构X射线结晶学结构(实施例2)的hIL-21分子用于结构测定。
[0091]将Fab分子分成分别含有可变和恒定结构域的两个部分。两个部分在分子置换计算中分别各用作搜索模型。对于IL-21，除未确定的柔性环以外，使用完整分子作为搜索模型。随后如果模型建立，则应用软件ARP/wARP [9]用于起始回合，接着应用CCP4软件包的软件程序Refmac5 [10]和Phenix软件包[12]的Phenix.ref ine [11]进行晶体学精修， 接着应用Coot软件程序[13]进行电子密度图的计算机图形检查、模型校正和建立。使该步骤循环直到不可进一步显著改进该模型。所有数据最终的R和自由R (R-free)分别为 0.191和0.241，模型显示与理想键长的均方根差(RMSD)为0.023 A0来自最终精修循环的 PDB文档的标题见表I。
[0092]结果
抗IL-21 Fab有效地阻断IL-21Ra与hIL-21分子结合。
[0093]通过CCP4 程序套件[6]的软件程序 Areaimol (B.Lee 和 F.M.Richards, J.Mol.Biol.，55，379-400 (1971)，E.B.Saff 和 A.B.J.Kui jlaars，The Mathematical Intelligencer, 19,5-11 (1997)),针对晶体结构的 hIL-21/ 抗 IL-21 Fab 分子复合物计算成对相互作用中所排除的面积，分别得到hIL-21为1189 A2，抗IL-21为1084 A2。计算 IL-21分子和抗IL-21 Fab间的成对相互作用中所排除的平均面积为1136 A2。
[0094]使用抗IL-21 Fab和hIL-21分子间4.0 A的截止距离，通过运行CCP4程序套件
[6]的CONTACT软件，鉴定出hIL-21与抗IL-21 Fab之间的直接接触点。hIL-21/抗IL-21 Fab复合物晶体结构的结果见表2。发现所得抗IL-21的hIL-21表位包含hIL_21 (SEQ ID NO:1)的下列残基:Ile 37>Arg 38、Gln 41、Asp 44、Ile 45>Asp 47、Gln 48>Asn 51>Tyr 52、Asn 92、Arg 94、lie 95、Asn 97、 Val 98、Val 98、 Ser 99、 Lys IOK Lys 102、Arg 105、 Lys 106、Pro 107 和 Pro 108。
[0095]因此，抗IL-21 hIL-21表位包含螺旋A和C的残基。此外，在螺旋C之前 (proceeding)的环区段中鉴定出几个接触残基(Arg 105-Pro 108)。这些接触区域与 hIL-21上确定为IL-21Ra结合部位的区域(实施例2)极其一致。
[0096]hIL-21的抗IL-21抗原互补位包括轻(L)链(SEQ ID NO: 16，表2)的残基Glu U Gln 27、Ser 28、Val 29、Ser 30、Ser 32、Tyr 33、Gln 91、Tyr 92、Gly 93、Ser 94 和 Trp 95 以及重(H)链(SEQ ID NO: 17、表 2)的残基 Trp 47、Trp 52、Ser 56、Asp 57、Tyr 59> Tyr 60>Asp 99>Asp 101> Ser 102> Ser 103>Asp 104> Trp 105> Tyr 106> Gly 107>Asp 108、Tyr 109和Phe 111。表2的hIL_21的氨基酸序列还标示了 hIL_21表位和参与氢结合的残基。
[0097]表1.通过CCP4程序软件包[6]的软件程序Refmac5 [10]对IL-21/抗IL-21 Fab复合物的观察数据进行X射线模型精修的结果。
【权利要求】
1.一种与IL-21上的不连续表位结合的配体，其中所述表位包含SEQ ID N0.1所示 IL-21氨基酸I37-Y52的至少一个和氨基酸N92-P108的至少一个，条件是所述配体不是: ⑴天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)单克隆抗体NNCOl 14-0005，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)单克隆抗体NNCOl 14-0015，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。
2.权利要求1的配体，其中所述配体与包含如SEQID N0.1所示IL-21的氨基酸 I37-Y52和N92-P108的表位结合。
3.权利要求1-2中任一项的配体，其中所述配体是抗体。
4.权利要求3的抗体，其中所述抗体含有包含SEQID N0.10所示的⑶R1XDR2或⑶R3 的至少一个的轻链和包含SEQ ID N0.11所示的⑶R1、⑶R2或⑶R3的至少一个的重链。
5.权利要求4的抗体，其中所述抗体含有包含SEQID N0.10所示⑶Rl和⑶R3的至少一个的轻链和包含SEQ ID N0.11所示⑶R2和⑶R3的至少一个的重链。
6.一种在IL-21和IL-21Ra之间的结合界面上与IL-21结合的配体，其中所述配体与包括SEQ ID Nol所示IL-21的氨基酸序列中的R34、R38、Q41、R105和K102的至少一个的表位结合，条件是所述配体不是:(i)天然存在的IL-21Ra (SEQ ID N0.14)，(ii)单克隆抗体NNCOl 14-0005，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，和(iii)单克隆抗体NNC0114-0015，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.12和SEQ ID N0.13所示。
7.权利要求6的配体，其中所述配体与SEQID如1所示11-21序列中的1?34、1?38、041、 R105和K102结合。
8.权利要求1-7中任一项的配体，其中所述配体干扰IL-21与II_21Ra的结合。
9.权利要求1-8中任一项的配体，其中人IL-21与配体相互作用的KD为KT12(M)或更小。`
10.权利要求1-9中任一项的配体，其中所述配体是作为单克隆抗体NNC0114-0005的变体的抗体，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.11所示，其中所述配体包含 SEQ ID N0.10和/或SEQ ID N0.11的⑶R序列中的一个或多个突变，其中所述突变选自下列的一个或多个:CDR H1S31A、CDR H2Y53F、CDR H2A61S、CDR H2S63T、CDR H2S63A、CDR H2K65R、CDR L1R24K、CDR L1S26T、CDR L1S31T、CDR L1S31A、CDR L2S53T、CDR L2S52A、CDR L2S54A、CDR L2S54T 和 CDR L2R55K。10.权利要求1-9中任一项的配体，其中所述配体是抗体，且其中所述抗体包含SEQID NOlO所示的⑶R3氨基酸序列和SEQ ID NOll所示的⑶R3氨基酸序列。
11.权利要求1-10中任一项的配体，其中所述配体是抗体，其中人IL-21与所述抗体相互作用的KD为KT12(M)或更小，其中所述抗体与SEQ ID Nol所示IL-21序列中的R34、 R38、Q41、R105和K102结合，且其中所述抗体与IL-21竞争结合IL-21R。
12.一种药物组合物，其包含权利要求1-11中任一项的配体和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂。
13.用于治疗免疫病症的权利要求1-11中任一项的配体或权利要求12的药物组合物的用途。
14.一种治疗免疫病症的方法，其中所述方法包括给予有需要的人适当剂量的权利要求1-11的配体或权利要求12的药物组合物。
15.一种治疗免疫病症的方法，其中所述方法包括给予有需要的人适当剂量的权利要求1-11的配体或权利要求12的药物组合物，其中所述配体用于在 自身免疫病的治疗中减少B细胞分化。
【文档编号】C07K14/54GK103443124SQ201280013862
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年1月17日 优先权日:2011年1月17日
【发明者】L.A.斯文斯森, M.D.安德森, J.布雷恩霍特, C.维伯格, B.O.克罗格, D.伦德斯加尔德, H.B.拉斯穆森 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司