双特异性和单特异性、不对称抗体和其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种抗体。该抗体包括Fc区和Fab区，其中：（i）Fc区包括两个不相同的重链，其中两个不相同的重链的至少一个包含氨基酸修饰使得在两个不相同的重链之间形成互补，从而提高形成不相同的重链的异源二聚体的可能性并且降低形成相同重链的同源二聚体的可能性；和（ii）Fab区包含在Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在所述Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键，其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。还提供了产生上述抗体的方法和上述抗体的用途。
【专利说明】双特异性和单特异性、不对称抗体和其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明，在其一些实施方式中，涉及双特异性抗体，单特异性、不对称抗体和它们的制备方法。
【背景技术】
[0002]双特异性抗体(BsAb)是具有两个结合位点的抗体，各自针对不同靶抗原，对其它们可以同时结合(Baeuerle and Reinhardt, 2009)。这种性能使得能够开发使用常规的单克隆抗体所不可能的治疗策略。双特异性抗体的主要应用包括:a)同时抑制两种靶(例如，可溶性配体的受体，受体和配体，或两种不同的配体)，b)再导向，其中一种结合特异性针对靶细胞(通常为肿瘤细胞)，而另一个结合位点则用来募集对于靶细胞的毒性活性或部分(T或NK细胞；用于前药活性的酶；细胞因子、放射性核素、病毒、毒素)，c)提高的特异性，由两个抗体臂的同时接合而介导的强结合仅可以发生在表达两种抗原的细胞上(Fischer andLeger, 2007;Amann et al., 2009;Lutterbuese et al.，2010)。由于双特异性抗体被视为有前途的治疗剂，因此已开发了若干双特异性模式，但由于与稳定性和制造复杂性有关的问题，它们的效用受到限制。在过去的20年中，已提出用于产生双特异性抗体的若干种策略，但尽管多次尝试和提出了多种抗体形式，BsAb仍然苦于缺乏产物均一性和具有挑战性的生产问题(Fischer and Leger, 2007; Chames and Baty, 2009)。
[0003]起初，尝试通过融合两种各自产生不同的抗体的杂交瘤来产生双特异性抗体，从而得到所谓的“四体杂交瘤(四源杂交瘤，quadromas)”或混合杂交瘤。然而，四体杂交瘤遭受遗传学不稳定性并产生重链和轻链的异质混合物。研究发现，平均而言，发现L链与H链的随机缔合具有两种抗体，.并且仅有很小的部分是所期望的双特异性抗体(De Lau etal., 1991;Massino et al.，1997)。如果考虑由两种单特异性抗体A和B来产生双特异性抗体，则以IgG形式有效装配双特异性抗体具有两个基本要求，第一个要求是每个重链与第二个抗体的重链缔合(重链A与重链B缔合)并且不出现同源缔合(A+A或B+B)。第二个要求是每个轻链与它的同源重链缔合(轻链A与重链A，而不是轻链B与重链A，或轻链A与重链B)。在四体杂交瘤中抗体链的随机缔合不能满足这些要求。
[0004]抗体工程的进步使得可以有效生成双特异性抗体。先进的抗体工程使得能够产生新的重组抗体形式如串联单链可变片段(scFv) (Robinson et al.，2008)、双抗体(Hudsonand Kortt, 1999)、串联双抗体(Kipriyanov, 2009)、二合一抗体(Bostrom et al.，2009)、和双可变区抗体(Wu et al.，2007)。这些新的抗体形式解决了一些制造问题，并提供均匀的制备品。然而，由于它们的较小尺寸，大多数的这些骨架遭受较差的药物代谢动力学并需要频繁给予或结合至较大的载体分子以提高半衰期(Constantinou et al.，2009)。
[0005]Ridgway等，1996年提供了对于用于制备双特异性抗体的两个标准之一的解决方案，使得能够重新考虑基于IgG的双特异性抗体在技术上是可行的。他们描述了一种称作“球形突出物进入孔中(knobs into holes)”的工程方式，其仅允许形成“抗体A和B”的重链之间的异源二聚体，而不允许形成同源二聚体。当研究重链缔合的规则时，作者推测，它主要依赖于在两个重链的Ch3结构域之间的界面相互作用。当蛋白质结构域或亚结构域相互作用时，球形突出物是庞大的侧链，其突入相反结构域，此处它与小的侧链对齐其使得这样的侵袭成为可能。在他们的方法中，通过球形突出物插入到伴侣CH3结构域上的适当设计的孔中而预期了球形突出物和孔变异体的异源二聚体化。通过以最大的侧链，酪氨酸或色氨酸，替代小侧链来构建球形突出物。通过以较小侧链(在这种情况下为丙氨酸或苏氨酸)替代较大侧链来产生与球形突出物相同或相似尺寸的孔。以这种方式，由于侧链冲突，同为球形突出物变异体的两个重链不能同源缔合，并且由于缺乏稳定的侧链相互作用，两个孔变异体的同源缔合不太有利。随后，此基团工程化产生在G3结构域的C端附近的二硫键以进一步稳定所装配的双特异性抗体(Merchant et al.，1998)。
[0006]美国专利号US 7，183，076教导了使用球形突出物和孔的方式产生双功能抗体的方法。
[0007]然而，球形突出物进入孔中的方式仅为重链的异质缔合提供解决方案，而并没有为每个重链与它的同源轻链的正确配对提供解决方案。因此，在这项研究中，通过共表达共同轻链和相应的改造重链接着进行蛋白A层析制备了能够同时结合至人类受体HER3和cMpI的双特异性IgG。工程化重链保留了它们的支持抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的能力，如用抗-HER2抗体所证明的(Merchant et al.，1998)。
[0008]国际专利申请2010/115589教导了三价双特异性抗体，其中对于携带球形突出物进入孔中突变的单特异性IgG，具有第二特异性的V1^P '在两个CH3结构域的C端处融合。
[0009]在美国专利申请US 2010/0256340中描述了类似的分子。
[0010]首先由Andreas Pliickthun 小组(Glockshuber et al., 1990)并随后由 Ira Pastan 小组(Brinkmann et al., 1993;Reiter et al., 1994a;Reiter etal., 1994b;Reiter et al..，1995)描述了二硫键稳定的 Fv。Pastan 小组进行了关于 dsFv的大量工作，并使用分子建模来确定抗体Fv片段(Fv)在保守骨架区中的位置，其远离CDR，并潜在地可以用来制备重组Fv片段，其中通过插入到结构保守框架位置之间的工程链间二硫键稳定了不稳定的Vh和'异源二聚体。在这些位置之一处引入二硫键，结果表明Vh44-Vl105或Vh111-'48可以稳定各种Fv，其保留充分结合和特异性。
[0011]美国专利号us 5，747，654、US 6，147，203 和 US 6，558，672 教导了二硫键稳定的Fv，其中Fv被改造以在轻链和重链之间引入另外的二硫键。
[0012]其它【背景技术】包括Jackman et al., Journal of Biological Chemistry Vol 285，N0.27，pp.20850-20859，July2, 2010和 Schaefer et al., Proc Natl Acad Sci U S A.2011July5;108(27):11187 - 11192。
【发明内容】
[0013]根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了包含Fe区和Fab区的抗体，其中:
[0014](i)Fc区包括两个不相同的重链，其中两个不相同的至少一个重链包含氨基酸修饰以形成在两个不相同的重链之间的互补，从而增加形成不同重链的异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的同源二聚体的可能性；和
[0015](ii)Fab区包含在Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键，其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。
[0016]根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于制备抗体的方法，包括:
[0017](a)提供编码第一重链的第一核酸分子；
[0018](b)提供编码第二重链的第二核酸分子；
[0019](c)提供编码第一轻链的第三核酸分子；
[0020](d)提供编码第二轻链的第四核酸分子；
[0021](e)在允许 表达核酸分子的条件下培养包含第一、第二、第三和第四核酸分子的宿主细胞；和
[0022](f)回收抗体。
[0023]根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了药物组合物，该药物组合物包含本文披露的抗体作为活性剂和药用载体。
[0024]根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于治疗感染或炎性疾病或病症的抗体。
[0025]根据本发明的一些实施方式的一个方面，提供了用于在需要其的受试者中治疗感染或炎性疾病或病症的方法，该方法包括给予受试者治疗有效量的本文披露的抗体，从而治疗感染或炎性疾病或病症。
[0026]根据本发明的一些实施方式，抗体是双特异性抗体。
[0027]根据本发明的一些实施方式，抗体是不对称的、单特异性抗体。
[0028]根据本发明的一些实施方式，互补包括空间互补。
[0029]根据本发明的一些实施方式，互补包括电荷互补。
[0030]根据本发明的一些实施方式，Fe区包括Fe区的一个重链的突出部分和在Fe区的第二重链上的空间补偿空腔，其中突出部分突入补偿空腔。
[0031]根据本发明的一些实施方式，通过以具有比原始氨基酸更大侧链容积的另一个氨基酸取代在一个重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生突出部分。
[0032]根据本发明的一些实施方式，通过以具有比原始氨基酸更小侧链容积的另一个氨基酸取代在第二重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生补偿空腔。
[0033]根据本发明的一些实施方式，第一共价键是在一个重链的CHl结构域和一个轻链的CL结构域之间；并且第二共价键是在第二重链的Vh结构域和第二轻链的\结构域之间。
[0034]根据本发明的一些实施方式，第一和第二共价键是二硫键。
[0035]根据本发明的一些实施方式，具有比原始氨基酸更大侧链体积的氨基酸选自由酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和色氨酸组成的组中。
[0036]根据本发明的一些实施方式，具有比原始氨基酸更小侧链体积的氨基酸选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和苏氨酸组成的组中。
[0037]根据本发明的一些实施方式，抗体选自由嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体组成的组。
[0038]根据本发明的一些实施方式，第一重链的CH3结构域共价连接至第二重链的CH3结构域。
[0039]根据本发明的一些实施方式，抗体的第一抗原结合位点结合抗原的第一表位并且抗体的第二抗原结合位点结合抗原的第二表位。
[0040]根据本发明的一些实施方式，抗体的第一抗原结合位点结合第一抗原的表位并且抗体的第二抗原结合位点结合第二抗原的表位。
[0041 ] 根据本发明的一些实施方式，每个轻链使用单二硫键连接至它的同源重链。
[0042]根据本发明的一些实施方式，抗体是完整抗体。
[0043]根据本发明的一些实施方式，抗体选自由IgA、IgD、IgE和IgG组成的组。
[0044]根据本发明的一些实施方式，IgG包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。
[0045]根据本发明的一些实施方式，第一重链包含T366W突变；并且第二重链包含T366S、L368A、Y407V 突变。
[0046]根据本发明的一些实施方式，第一重链包含S354C突变并且第二重链包含Y349C突变。
[0047]根据本发明的一个实施方式，第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合erbB2。
[0048]根据本发明的一些实施方式，第一抗原结合位点结合⑶30并且第二抗原结合位点结合假单胞菌外毒素(PE )。
[0049]根据本发明的一 些实施方式，第一抗原结合位点结合⑶30并且第二抗原结合位点结合链霉亲和素。
[0050]根据本发明的 一些实施方式，将至少一个重链连接到治疗部分。
[0051]根据本发明的一些实施方式，将至少一个重链连接到可识别部分。
[0052]根据本发明的一些实施方式，抗体选自由灵长类动物抗体、猪抗体、鼠抗体、牛抗体、羊抗体和马抗体组成的组。
[0053]根据本发明的一些实施方式,宿主细胞包括细菌细胞。
[0054]根据本发明的一些实施方式，宿主细胞包括哺乳动物细胞。
[0055]根据本发明的一些实施方式，在细菌细胞的包涵体中发生表达。
[0056]根据本发明的一些实施方式，将每个核酸分子转染进入不同的宿主细胞。
[0057]根据本发明的一些实施方式，将每个核酸分子转染进入相同的宿主细胞。
[0058]根据本发明的一些实施方式，细菌细胞包括革兰氏阴性细菌细胞。
[0059]根据本发明的一些实施方式，上述方法进一步包括在步骤(f)之后用蛋白A/G/L纯化抗体。
[0060]根据本发明的一些实施方式,炎性疾病是癌症。
[0061]根据本发明的一些实施方式，炎性疾病或病症是癌症。
[0062]除另有限定外，在本文中所使用的所有技术和/或科学术语具有如与本发明所属【技术领域】的技术人员的通常理解相同的含义。虽然与本文描述的类似或等效的方法和材料可以用于实施或测试本发明的实施方式，但下文描述了示例性的方法和/或材料。在发生冲突的情况下，以本专利说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法、和实施例仅是说明性的而不意在是限制性的。
【专利附图】
【附图说明】
[0063]仅通过实例的方式并参照附图来描述本发明的一些实施方式。现详细地具体参照附图，强调的是，示出的细节是通过实例的方式并用于说明性讨论本发明的实施方式。在这方面，说明书连同附图一起使得本领域技术人员可以明了如何实施本发明的实施方式。
[0064]在附图中:
[0065]图1A-B是用于产生双特异性抗体的新策略的示意性结构。(A)通过球形突出物进入孔中的方式产生的IgG抗体的示意图，其中存在两个不同的重链和共同轻链。(B)根据本发明的实施方式制备的双特异性抗体的示意图。存在两个不同的重链，各自配对于它的同源轻链。“球形突出物”突变对应于T366W，“孔”突变对应于T366S、L368A、Y407V替换。在“球形突出物”或“孔”重链的CH3区处分别的半胱氨酸替换突变S354C和Y349C提供95%的异源二聚体化(Merchant et al.，1998)。
[0066]图2A-H是在大肠杆菌中用于表达单特异性抗体和双特异性抗体的基于PHAK-1gH和pHAK-1gL的质粒图谱的示意图:pHAK_IgL用于表达具有人κ或轻链的抗体、pHAK-LC-Cys用于表达包含dsFv样链内二硫键的轻链、pHAK-1gH用于表达具有人、I重链的抗体、PHAK-HC-球形突出物用于表达在恒定区中包含S354C和T366W “球形突出物”突变的重链、pHAK-HC-孔用于表达在恒定区中包含Y349C、T366S、L368A和Y407V “孔”突变的重链、pHAK-HC-孔-PE38用于表达包含融合至假单胞菌外毒素A的截短形式(PE38)的“孔”突变的重链、PHAK-HC-Cys用于表达包含dsFv样链内二硫键的重链、pHAK-HC-Cys-球形突出物用于表达在恒定区中包含“球形突出物”突变和dsFv样链内二硫键的重链。
[0067]图3是重链和轻链纯化的SDS-PAGE分析的照片。以包涵体收集表达的蛋白，通过连续离心步骤纯化并溶解在6M盐酸胍缓冲溶液。(l)T427IgL，(2)T427IgH，(3)T427-1gH-球形突出物，(4)T427-1gH-PE38，(5)T427-1gH-孔-PE38。"球形突出物"突变对应于 S354C:T366W。"孔"突变对应于 Y349C:T366S:L368A:Y407V。
[0068]图4A-B提供了双特异性IgG样蛋白的分析。(A) IgG重链和轻链以及理论上可以形成的可能的IgG分子的示意性结构。根据分子量的显著差异，可以容易地检测每种变异体。(B)蛋白A纯化产物 的SDS-PAGE (10%丙烯酰胺)分析:野生型T427抗体，其显示在重链上的PE38 (I), T427抗体的“球形突出物进入孔中”变体(S354C:T366W/Y349C:T366S:L368A:Y407V 突变)(2),野生型 FRP5 抗体(3)。
[0069]图5A-B提供了蛋白A纯化产物的SDS-PAGE (10%丙烯酰胺)分析。(I) T427 “球形突出物-球形突出物”变体(IgL+IgH-球形突出物S354C:T366W突变体)。(2) T427抗体的“球形突出物进入孔中”变体(S354C: T366W/Y349C: T366S: L368A: Y407V突变体)。(3 )T427 “孔-孔”变体(IgL+IgH-孔-PE38Y349C:T366S:L368A:Y407V 突变)。(4)野生型 T427抗体，其显示在重链上的PE38。(M)标记。
[0070]图6示出I gG和I gG样蛋白的凝胶过滤分析。用Sephadex200凝胶过滤柱在11.5分钟时洗脱T427IgG抗体(150kDa)。在10.3分钟时洗脱IgG样T427异二聚体(2IgL+IgH-球形突出物+IgH-孔-PE38) (190kDa)。在11.5分钟时洗脱小部分球形突出物-球形突出物同源二聚体(150kDa)。可以在空隙容积下洗脱孔-孔同源二聚体(230kDa)(6.5分钟(未不出))。
[0071 ] 图7A-C示出蛋白A纯化产物的SDS-PAGE(7.5%丙烯酰胺)和密度分析。(A)T427IgG野生型(1)、T427-球形突出物-孔-PE38 (2)和Τ427-ΡΕ38 (3)蛋白质的SDS-PAGE分析。(B)通过ImageMasterlD激光扫描密度测定法进行的SDS-PAGE的蛋白带密度分析。(C)根据在带位置处的像素强度，测量异源二聚体形成产率的饼图。T427-球形突出物-孔-PE38(2)由 2IgL+IgH-球形突出物+IgH-孔-PE38 构成。T427_PE38(3)由 2IgL+2IgH_PE38 构成。"球形突出物"突变对应于S354C:T366W。"孔"突变对应于Y349C:T366S:L368A:Y407V。
[0072]图8A-B示出IgG和IgG样蛋白的ELISA分析。FRP5IgG和双特异性FRP5-T437-PE38 (PE38融合于T427重链)的结合能力。(A)以erbB2 (FRP5抗体的抗原)涂覆ELISA板并使用抗人二抗来检测抗体。(B)以erbB2 (FRP5抗体的抗原)涂覆ELISA板并使用抗PE 二抗来检测抗体(检测双特异性抗体)。
[0073]FRP5-T427-PE38 抗体由 IgL-FRP5+IgL-T427+IgH_FRP5-球形突出物+IgH-T427-孔-PE38蛋白构成。“球形突出物进入孔中”突变:S354C:T366W/Y349C:T366S:L368A:Y407V。
[0074]图9A-B示出 蛋白A纯化IgG和IgG样蛋白的SDS-PAGE (12%和6%丙烯酰胺)分析。(l)FRP5IgG 野生型。(2)T427IgG 野生型。(3)T427IgG-Cys(IgH_Cys44:Cys222Ala+IgL-Cysl04:Cys218del)o (4)双特异性T427-FRP5IgG(IgH_FRP5-孔+IgL-FRP5+IgH_T427-球形突出物-Cys44:Cys222Ala+IgL-T427-Cysl04:Cys218del IgG。“球形突出物”突变对应于 S354C: T366W。“孔”突变对应于 Y349C: T366S: L368A: Y407V。
[0075]图10是蛋白A纯化IgG和IgG样蛋白的SDS-PAGE (10%丙烯酰胺)分析。(l)T427IgG 野生型。(2)抗 Tac IgG 野生型。(3) T427IgG_Cys 对照 A (IgH 野生型+IgL-Cysl04:Cys218del)o (4)T427IgG-Cys 对照 B (IgH_Cys44:Cys222Ala+IgL 野生型)。
[0076]图11是以包涵体纯化并重新悬浮在6M盐酸胍中的a PE (Bll)、Τ427和a SA抗体的重链和轻链的SDS-PAGE分析。在12%丙烯酰胺凝胶上在还原条件下分离样品。
[0077]图12Α-Β是a SA (抗链霉亲和素)抗体的ELISA分析。分析了 Τ427、a SA (单克隆)和Τ427- a SA (双特异性)蛋白A纯化抗体结合⑶30的能力(Α)。使用羊抗人HRP标记抗体来检测上述结合。以牛血清白蛋白(BSA)涂覆用作对照(B)。
[0078]图13A-C是a PE (抗假单胞菌外毒素38kDa片段)抗体的ELISA分析。分析了T427、aPE Bll克隆(单克隆)和Τ427-a PE (双特异性)蛋白A纯化抗体结合avitag_PE38(A)和dsFv-PE38 (B)抗原的能力。使用羊抗人HRP标记抗体来检测结合。以牛血清白蛋白(BSA)涂覆用作对照(C)。
[0079]图14是pDual载体系统的示意介绍。pDual载体是基于双顺反子、CMV启动子的质粒，用于在哺乳动物细胞中表达IgG。通过结合来自pMAZ载体的重链和轻链表达盒来构建它们(Mazor Y, J Immunol Methods.2007Apr 10; 321 (1-2): 41-59)。
[0080]图15A-B示出在CaCl2转染的293Trex细胞的培养基中分泌的IgG的分析。(A)用pDual野生型、pDual L(Cys)+H(野生型)野生型或pMAZ-1gL+pMAZ-1gH载体系统转染的细胞培养基的蛋白印迹分析。使用羊抗人HRP标记二抗来检测抗体。通过与受必妥(Erbitux)抗体的二次稀释相比来确定在培养基中的抗体浓度(B)。
[0081]图16示出以pDual单特异性和双特异性载体或载体的组合转染的293Trex细胞的蛋白印迹分析。使用羊抗人HRP标记抗体来检测抗体。
[0082]图17示出由抗体分泌克隆的点杂交分析的示例性结果。将细胞培养基吸收到硝酸纤维素膜上并使用羊抗人HRP标记抗体来检测抗体。相对于其它克隆确定分泌水平。将未处理细胞的细胞培养基用作对照。[0083]图18A-B示出双特异性克隆的结合活性的确认。以erbB2 (18A)或CD30 (18B)抗原温育细胞培养基。使用羊抗人HRP标记抗体来检测结合。带标记的克隆证明了对两种抗原的结合能力。
[0084]图19A-B示出在HEK293 T-REx?哺乳动物细胞中产生的IgG随后是蛋白A纯化的SDS-PAGE分析。在未还原条件下并在10%丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质以评价150kDa IgG(A)并且在还原条件下并在12%丙烯酰胺凝胶(B)上分离蛋白质以评价在T427和FRP5重链和轻链之间的最小差异并确定在双特异性T427-FRP5分子中的双带。
[0085]图20A-B示出蛋白A纯化的在哺乳动物细胞中生产的IgG的ELISA分析。A5是以四种质粒转染的对照细胞系，两种编码单特异性T427抗体并且两种编码单特异性FRP5抗体。双特异性T427-FRP5表示对每种抗原(erbB2和CD30)具有单价结合能力的双特异性抗体的稳定分泌克隆D3。使用羊抗人HRP标记二抗检测结合。
[0086]图2IA-B是示出蛋白A纯化在哺乳动物细胞中产生的I gG的ELI SA分析的曲线图。T427和FRP5表示具有二价结合活性的单特异性抗体。双特异性T427-FRP5表示对每种抗原(erbB2和⑶30)具有单价结合能力的双特异性抗体的稳定分泌克隆D3。将Erbitux用作阴性对照。使用羊抗人HRP标记二抗检测结合。
[0087]图22是示出分泌T427-FRP5双特异性抗体B3克隆(从稳定克隆的条件培养基进行蛋白A-纯化的)与A431/CD30和SKBR3 (erbB2+)细胞的结合能力的细胞-ELISA分析曲线图。使用羊抗人HRP标记二抗检测结合。
[0088]图23是本发明的实施方式的单特异性抗体的示意图。
[0089]图24是T427KIH的ELISA分析。相比于`T427抗体的球形突出物进入孔中(KIH)变体(2X IgL+IgH-球形突出物 +IgH-孔-PE38)，T427IgG 和 T427_PE38(融合于重链的 PE38)的结合能力。
【具体实施方式】
[0090]在其一些实施方式中，本发明涉及双特异性抗体、单特异性抗体、不对称抗体和它们的制备方法。
[0091]在详细解释本发明的至少一种实施方式以前，应当理解的是，本发明的应用不一定限于以下描述中陈述的或通过实施例举例说明的细节。本发明能够具有其它实施方式或以各种方式加以实施或进行。
[0092]在过去几年中，实验室和早期临床研究分均已证明在癌症治疗中双特异性抗体(BsAb)可能具有重要的潜在应用:亦或通过用细胞毒性剂(包括效应细胞、放射性核素、药物、和毒素)靶向肿瘤细胞，亦或通过同时阻断两种相关的肿瘤靶标，即，生长因子受体或它们的配体，从而中和多种受体活性和下游信号转导通路。在开发BsAb中的主要障碍是通过传统技术如混合杂交瘤和化学结合法难以生产足够质量和数量的材料。因此，相信开发IgG样BsAb作为治疗剂将在很大程度上取决于在设计重组BsAb构建体和生产效率方面所取得的进步。
[0093]为了确保形成抗体"A"和"B”的重链之间的异源二聚体，并且为了防止抗体"A"与抗体"A"以及抗体"B"与抗体"B"的同源二聚体化，如在美国专利号US7，183,076中所披露的，已提出了球形突出物和孔的方式。然而，球形突出物进入孔中的方式仅为重链的异质缔合提供了解决方案而没有为每个重链与它的同源轻链的正确配对提供解决方案。
[0094]本发明涉及以IgG形式来有效装配双特异性抗体的方式。该方式涉及通过应用球形突出物进入孔中的方式异源二聚体化两个重链，加之促进每个重链仅与它的同源轻链的配对。
[0095]本发明的发明人提出使用一个天然CHl-CL结合二硫键和一个非天然Vh-Vl结合dsFv样二硫键来使相同抗体的重链和轻链配对(如图1B所示)。以这种方式，一个抗体分支将在分子上保持未接触而其它抗体分支将获得在可变区中的新二硫共价键来代替野生型S-S键。错配的轻和重链将不会形成S-S稳定按合点并且将不会产生稳定的IgG分子。因此，这种策略意味着一个抗体分支转化成dsFv样分子而没有任何亲和力或稳定性损失。
[0096]虽然减少了本发明的实施，但本发明的发明人通过使抗⑶30 (T427)和抗erbB2(FRP5)抗体结合生产了双特异性抗体。在erbB2抗体中，通过共价连接重链的ChI结构域和轻链的CL结构域的天然二硫键促进了重-轻链缔合。在抗CD30抗体中，将C0I中的半胱氨酸突变成丙氨酸并且删除Q的C-端半胱氨酸，从而防止形成天然H-L 二硫键。代替消失的二硫键，根据二硫键稳定的Fv片段(dsFv)的规则，引入两个半胱氨酸，一个在重链的可变区中并且一个在轻链的可变区中。因此，经由通过这些两个半胱氨酸残基形成于Vh和\之间的二硫键，共价缔合了抗⑶30抗体的重链和轻链。因此，本发明预期在双功能抗体的一个臂上在重链和它的同源轻链之间产生新的二硫桥并以此进一步增强正确装配，删除在相同重链和它的同源轻链之间的天然存在的二硫桥。
[0097]如在图9A-B中所示，利用这种方式，在细菌细胞中产生了全长双功能抗体。当没有如上所述突变抗CD30抗体的重链和轻链时，不会产生全长双功能抗体(图10)。
[0098]另外，使用双特异.性载体，本发明的发明人表明，通过应用球形突出物进入孔中方式，并联合促进每个重链仅与它的同源轻链的配对，促进了在哺乳动物细胞中产生全长双功能抗体(如图17-22所示)。
[0099]因此，根据本发明的一个方面，提供了包括Fe区和Fab区的抗体，其中:
[0100](i)Fc区包括两个不相同的重链，其中两个不相同重链的至少一个包含氨基酸修饰以在两个不相同的重链之间形成互补，从而提高形成不相同的重链的异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的同源二聚体的可能性；和
[0101](ii)Fab区包含在Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键，其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。
[0102]抗体的特征在于，位于中央的二硫桥，其将一系列的反向平行的β链稳定成免疫球蛋白样折叠。抗体重链或轻链具有N端(NH2)可变区(V)，和C端(-C00H)恒定区(C)。重链可变区被称为Vh，并且轻链可变区被称为V1^P'片段一起被称为"Fv"。可变区是分子的一部分，其结合至抗体的同种抗原，而恒定区则确定抗体的效应物作用(例如，补体结合、调理作用)。由在N端的可变区基因(一般约110个氨基酸)和在COOH端的恒定区基因编码全长免疫球蛋白或抗体"轻链"(一般约25千道尔顿(Kd)，约214个氨基酸)。类似地，由可变区基因(通常编码约116个氨基酸)和多个恒定区基因(编码约330个氨基酸)之一来编码全长免疫球蛋白或抗体"重链"(一般约50Kd，约446个氨基酸)。抗体轻链或重链可变区包含三个超变区，还被称为互补决定区或CDR，两侧是四个相对保守的骨架区或FR。
[0103]根据本发明的此方面的一个实施方式，抗体是双特异性抗体。
[0104]如在本文中所使用的，术语"双特异性抗体"是指一种抗体，其包含两个抗原结合位点，各自结合至抗原的不同表位。本发明的此方面的双特异性抗体既不共享共同轻链也不共享共同重链。
[0105]根据一个实施方式，两个抗原结合位点各自结合至相同抗原的不同表位。根据另一个实施方式，两个抗原结合位点各自结合至不同抗原上的不同表位。
[0106]根据本 发明的此方面的另一个实施方式，抗体是单特异性、不对称抗体。
[0107]本发明的此方面的单特异性抗体在结合相同抗原的两个臂上具有相同互补位。然而，不同于其对称装配了两个相同重链和两个相同轻链的常规的单克隆抗体，本文描述的单特异性抗体是两个不相同重链和两个不相同轻链的不对称装配。两个重链之间和两个轻链之间的差异在于恒定区和可变区中的骨架区，其使得链能够异源二聚化。因此，可变区的CDR环和支持可变区残基(其可以包含互补位)在链配对中是相同的-参见图23。
[0108]根据一个特定的实施方式，单特异性抗体是IgG4。
[0109]优选地，对于相同的靶标，与其相应的单克隆抗体的一个臂相比，抗体的每个抗原结合位点对于它的靶标的亲和力并没有显著降低。根据一个【具体实施方式】，亲和力没有降低超过100倍，更优选没有降低超过50倍，更优选没有降低超过20倍，更优选没有降低超过10倍并且甚至更优选没有降低超过5倍。
[0110]双特异性抗体的实例包括那些具有针对第一生长因子配体的一个抗原结合位点和针对第二生长因子配体的第二抗原结合位点的；针对第一生长因子受体的一个抗原结合位点和针对第二生长因子受体的第二抗原结合位点的；针对第一细胞因子的一个抗原结合位点和针对第二细胞因子的第二抗原结合位点的；针对第一细胞因子受体的一个抗原结合位点和针对第二细胞因子受体的第二抗原结合位点的；针对生长因子受体的一个抗原结合位点和针对生长因子配体的第二抗原结合位点的；针对细胞因子受体的一个抗原结合位点和针对细胞因子配体的第二抗原结合位点。还预期了生长因子、生长因子受体、细胞因子和细胞因子受体的另外的组合。
[0111]根据另一个实施方式，双特异性抗体阻断血管生成的两种途径，一个抗原结合位点针对与第一途径相关的受体或配体而另一个抗原结合位点针对与第二途径相关的受体或配体。
[0112]根据具体的实施方式，双特异性抗体包含针对肿瘤细胞抗原的一个抗原结合位点和针对其它抗原的结合位点，其它抗原包括细胞毒性触发分子如抗Fe Y RI/抗CD15、抗pl85HEE2/Fc YRIII (CD16)、抗 CD3/ 抗恶性 B 细胞(1D10)、抗 CD3/ 抗 pl85HEK2、抗 CD3/ 抗p97、抗⑶3/抗肾细胞癌、抗⑶3/抗0VCAR-3、抗⑶3/L-D1 (抗结肠癌)、抗⑶3/抗促黑激素类似物、抗EGF受体/抗⑶3、抗⑶3/抗CAMAl、抗⑶3/抗⑶19、抗⑶3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM) /抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP) /抗CD3、抗泛癌相关抗原(AM0C-31) /抗 CD3。
[0113]具有特异性地结合至肿瘤抗原的一个抗原结合位点和结合至毒素的一个抗原结合位点的双特异性抗体包括例如抗皂素/抗Id-Ι、抗⑶22/抗皂素、抗⑶7/抗皂素、抗CD38/抗皂素、抗CEA/抗蓖麻毒素A链、抗干扰素-α (IFN-a )/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱。
[0114]其它设想的双特异性抗体包括用于转化酶激活的前体药物的那些，如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化将丝裂霉素磷酸前药转化为丝裂霉素醇)。
[0115]其它设想的双特异性抗体包括可以用作纤维蛋白溶解剂的那些如抗血纤蛋白/抗组织纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)。
[0116]另外设想的双特异性抗体包括那些双特异性抗体，其用于将免疫复合物靶向细胞表面受体如抗低密度脂蛋白(LDL) /抗Fe受体(例如Fe Y R1、Fe Y RII或Fe Y RIII)。
[0117]另外设想的双特异性抗体包括用于治疗传染病的那些，如抗⑶3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体:CD3复合物/抗流感、抗Fe Y R/抗HIV。用于体外或体内肿瘤检测的另外的双特异性抗体包括抗CEA/抗E0TUBE、抗CEA/抗DPTA、抗pl85HER2/抗半抗原。
[0118]双特异性抗体可以用作疫苗佐剂(参见Fanger et al., Critical Reviews in Immunologyl2(3，4):101-124(1992))。
[0119]双特异性抗体可以用作诊断工具如抗兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗生长抑素/抗P物质、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β -半乳糖苷酶。
[0120]另外设想的双特异性抗体包括以下的双特异性抗体:其中第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合erbB2的双特异性抗体；其中第一抗原结合位点结合CD30并且第二抗原结合位点结合假单胞菌外毒素(PE)的双特异性抗体；其中第一抗原结合位点结合CD30和第二抗原结合位点结合链霉亲和素的双特异性抗体。
[0121]三特异性抗体的实例包 括抗⑶3/抗⑶4/抗⑶37、抗⑶3/抗⑶5/抗⑶37和抗CD3/抗 CD8/抗 CD37。
[0122]可以由任何抗体,如IgG1' IgG2、IgG3、或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得本发明的抗体的Fe区。
[0123]根据一个实施方式，Fe区是IgG Fe区。
[0124]如所提及的，本文描述的抗体的Fe区包括两个不相同的重链(例如，其不同于可变区的序列)，其中两个不相同重链的至少一个包含氨基酸修饰以提高形成不相同的重链的稳定异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的稳定同源二聚体的可能性。
[0125]根据一个实施方式，至少一个重链被基因修饰以致产生了穿过界面的改变的电荷极性。因而，促进了在静电匹配的Fe链之间稳定的异源二聚体，并且由于不利的排斥电荷相互作用抑制了不需要的Fe同源二聚体形成。
[0126]Gunasekaran K，Pentony Mj Shen Mj Garrett Lj Forte Cj Woodward A, Ng SB, BornT，Retter M，Manchulenko K, Sweet H, Foltz IN, Wittekind M，Yan W.Enhancing antibodyFe heterodimer formation through electrostatic steering effects:applicationsto bispecific molecules and monovalent IgG.J Biol Chem.2010Jun 18;285
(25): 19637-46.Epub2010Apr 16中解释了确定修饰何种氨基酸和修饰到何种氨基酸，通过引用结合于此。
[0127]根据一个实施方式，在两个重链之间的界面的边缘处而不在界面的疏水核心处的结构上保守的隐蔽残基上进行氨基酸修饰(其影响电荷互补性)。
[0128]根据另一个实施方式，基因修饰至少一个重链以产生具有3D结构的重链，相对于相同重链(即同源二聚体)，其更有效地结合至不相同的重链(即异源二聚体)。由于空间互补促进生成异源二聚体并且由于空间位阻阻碍生成同源二聚体。
[0129]根据这个实施方式，基因修饰一个重链以产生突出部分，并且基因修饰第二重链以产生空间补偿空腔，突出部分突入补偿空腔。
[0130]通过以较大侧链(例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸)替代来自第一重链的界面的小氨基酸侧链来构建"突起物"。可选地，在第二重链的界面上通过以较小氨基酸侧链(例如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸、或苏氨酸)替代大氨基酸侧链，产生与突出部分具有相同或相似尺寸的补偿"空腔"。
[0131]可以通过合成方法将突出部分或空腔"引入"第一或第二重链的界面，例如通过重组技术、体外肽合成、先前描述的用于引入非天然存在的氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶学或化学连接或这些技术的一些组合。因此，"引入的"突出部分或空腔是"非天然存在的"或"非天然的"，其意味着它并不存在于自然界中或最初多肽(例如人源化单克隆抗体)中。
[0132]优选地，用于形成突出部分的导入氨基酸残基具有相对较少数目的“旋转异构体”(例如约36)。"旋转异构体"是氨基酸侧链的能量最优的构象。在Ponders andRichards, J.Mol.Biol.193:775791 (1987)中综述了各种氨基酸残基的旋转异构体的数目。
[0133]作为选择用于形成突出部分和/或空腔的初始残基的第一步骤，利用本领域中众所周知的技术如X射线晶体学或NMR来获得抗体的三维结构。基于三维结构，本领域技术人员将能够确定界面残基。
[0134]优选的界面是免疫球蛋白恒定区的Ch3结构域。优先选择待取代"隐蔽"残基。已经确定了 IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的CH3结构域的界面残基(参见，例如，PCT/US96/01598，其全部内容通过引用结合于此)，包`括最适用于以导入的残基替代的那些界面残基，如各种IgG亚型的界面残基和"隐蔽"残基。优选的C03结构域源自IgG抗体，如人IgGl。
[0135]人IgGl的CH3/CH3界面涉及位于4个反向平行β链上的在每个结构域上的16个残基，其隐蔽了来自每个表面的1090ANG2。优选突变靶向位于两个中央反向平行β链上的残基。目的是使产生的突出部分通过突入周围溶剂而不是通过在伴侣C03结构域中的补偿空腔来容纳产生的突出部分的风险最小化。
[0136]在美国专利号US 7，183,076中已经披露了在重链上选择特定位点的方法，通过引用结合于此。
[0137]根据一个【具体实施方式】，第一重链包含T366W突变(B卩，苏氨酸到色氨酸)，并且第二重链包含T366S、L368A、Y407V突变(即，苏氨酸到丝氨酸；亮氨酸到丙氨酸；和酪氨酸到缬氨酸)。
[0138]根据一个实施方式，在界面的疏水核心处在结构上保守的隐蔽残基进行氨基酸修饰，而不是在两个重链之间的界面有边缘处(其影响结构互补性)。
[0139]可以使用分子图形建模程序如InsightTM程序(Biosym Technologies)来研究替代残基对重链的影响。
[0140]一旦通过分子建模确定了优选的初始/导入残基以后，可以使用在本领域中众所周知的技术将氨基酸替换引入重链。
[0141]寡核苷酸介导的诱变是用于制备编码第一或第二重链的DNA的替代变体的优选方法。如由Adelman et al.，DNA, 2:183 (1983)所描述的，在本领域中这种技术是众所周知的。简要地，通过将编码所期望的突变的寡核苷酸杂交到DNA模板来改变第一或第二多肽编码DNA，其中模板是单链形式的质粒或噬菌体(包含异多聚体的未改变或天然的DNA序列)。在杂交以后，使用DNA聚合酶合成模板的整个第二互补链，其将因此结合寡核苷酸引物，并将在异多聚体DNA中编码所选改变。
[0142]可以如Wells et al.Gene34:315 (1985)所描述的通过以由使互补寡核苷酸退火所产生的合成突变片段替代感兴趣的DNA的区进行盒式诱变。PCR诱变也适用于制备第一或第二多肽DNA的变体。虽然以下讨论涉及DNA，但可以理解的是，上述技术也适用于RNA。PCR 技术通常是指以下步骤(参见 Erlich, Science, 252:1643 1650 (1991)，R.Higuchi 的章节，P.61 70)。
[0143]还设想另外的修饰以进一步增强在两个重链之间的相互作用的特异性。因此，本发明结合在两个重链之间的共价键(例如在CH3结构域上)。
[0144]本发明设想的共价键的实例包括酰胺键和二硫键。
[0145]因此，例如本发明设想引入自由巯基，其在抗体的两个重链之间形成分子间二硫键。在允许在重链之间形成二硫键的位置处，通过用例如半胱氨酸取代重链的天然存在残基，可以将自由巯基引入重链之一的界面。
[0146]如在本文中所使用的，短语"包含自由巯基的化合物"是指一种化合物，其可以被加入或与本发明的多肽界面的氨基酸反应，使得化合物的自由巯基部分被定位于在本发明的另外的多肽的界面处与该部分的自由巯基相互作用来形成二硫键。优选地，包含自由巯基的化合物是半胱氨酸。
[0147]根据一个【具体实施方式】，第一重链包含S354C突变(即，丝氨酸到半胱氨酸)；并且第二重链包含Y349C突变(酪氨酸到半胱氨酸)。
[0148]除在它们的重链中具有 修饰之外，也修饰了本文描述的抗体的至少一个轻链，使得在第一重链和第一轻链之间存在第一共价键并且在第二重链和第二轻链之间存在第二共价键，其中第一共价键相对于第一重链的位置不同于第二共价键相对于第二重链的位置。
[0149]选择第一和第二共价键的定位使得促进了重链与它的同源轻链之间的配对，同时相比于从其所产生的单个抗体，没有降低抗体的特异性和稳定性超过20%或者优选地超过10%或者甚至更优选地超过5%。
[0150]根据另一个实施方式，将第一重链和它的同源轻链之间的共价键定位在Chi和Q区之间，而将第二重链和它的同源轻链之间的共价键定位在Vh和\区之间。
[0151]本发明设想的共价键的实例包括例如酰胺键、二硫键和在位点特异性插入氨基酸残基(包括非天然氨基酸)之间发生的另外形式的共价键(参见Wu，X., Schultz, P.G." Synthesis at the Interface of Chemistry and Biology." J.Am.Chem.Soc., 131(35):12497-515, 2009;Hutchins BM, Kazane SA, Staflin K, Forsyth JS, Felding-HabermannB,Schultz PG, Smider VV.Site-specific coupling and stericalIy controlledformation of multimeric antibody fab fragments with unnatural amino acids J MolBiol.2011 Mar 4;406(4):595-603.Epub 2011 Jan 13;Liu CC,Schultz PG.Adding newchemistries to the genetic code.Annu Rev Biochem.2010; 79:413-44.Review,所有上述通过引用结合于此)。
[0152]因此，本发明设想突变重链和它的同源轻链的至少之一，使得不再能够产生连接两个分子的至少一个天然存在的(即天然的)二硫键。通常，这是通过删除(或取代)在上文所述位置处的半胱氨酸实现。
[0153]如在本文中所使用的，短语"天然二硫键"是指连接重链和它的同源轻链(通常在轻链的恒定区和重链的CHl区之间)的链间二硫键，其由天然存在的种系抗体基因所编码。
[0154]通常，通过以具有类似大小和电荷的氨基酸(即保守氨基酸，如半胱氨酸到丙氨酸)替代氨基酸来进行半胱氨酸的取代。
[0155]本发明设想，第一共价键是天然存在的二硫键而第二共价键是非天然存在的共价键(例如工程二硫键)，其中，已经将至少一个半胱氨酸氨基酸残基插入链-即工程半胱氨酸。
[0156]如在本文中所使用的，术语"工程半胱氨酸"是指在天然种系抗体序列中不存在半胱氨酸的位置处已被弓I入抗体片段序列的半胱氨酸。
[0157]可替代地，第一和第二共价键均可以是非天然存在的，并且可以由不能作为氨基酸残基来产生共价键的其它氨基酸来替代半胱氨酸(其在非修饰抗体中作为氨基酸残基来产生二硫键)。
[0158]需要关于感兴趣的抗体的信息以产生二硫键的适当位置。通过与在Kabat和Wu的众所周知的出版物中的.那些类似序列[Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest, " E.Kabat, et al., U.S.Government Printing Office, NIH PublicationN0.91-3242(1991)](通过引用结合于此)进行序列比对来比较感兴趣的可变区的氨基酸序列，以确定可以突变哪些序列以致在每个重链和轻链可变区的适当位置编码半胱氨酸，从而在所期望抗体的骨架区中提供二硫键。
[0159]比对序列以后，确定了在感兴趣的序列中的氨基酸位置，其与由Kabat和Wu使用的编号系统的以下位置对齐:重链可变区的位置43、44、45、46、和47 (第I组)和位置103、104、105、和106 (第2组);以及轻链可变区的位置42、43、44、45、和46 (第3组)和位置98、99、100、和101 (第4组)。在一些情况下，一些这些位置可以是缺失的，表示为在序列对比中的缺口。
[0160]随后，改变编码在这些确定位置中的两个位置处的氨基酸的核酸序列使得这两个氨基酸被突变成半胱氨酸残基。待选择的设想的氨基酸对是:Vh44-'100、Vh105-Vl43,Vh105-Vl42、Vh44-Vl101, Vh106_Vl43、Vh104_Vl43、Vh44_Vl99、Vh45_Vl98、Vh46_Vl98、Vh103-Vl43, Vh103-Vl44, Vh103_Vl45。
[0161]最优选地，在以下位置处进行半胱氨酸的取代:Vh44-'100、*Vh105-'43。(符号VH44-'100，例如，是指一种多肽，其具有在Vh中在位置44处的半胱氨酸和在\中在位置100处的半胱氨酸；上述位置是根据由Kabat和Wu给出的编号)。
[0162]注意，使用根据Kabat和Wu的位置的指定，位置的编号是指定义的保守残基而不是指在给定抗体中实际顺序编号的氨基酸位置。例如，(Kabat和Wu的)CysLlOO其用来产生如在以下实施例中描述的ds (Fv) B3，实际上对应于B3 (VJ的位置105。
[0163]根据一种实施方式，可以根据在美国专利号US 5, 747, 654 (其通过引用结合于此)中记载的规则来选择突变哪个氨基酸。可以通过检查亦或实际抗体亦或如下文举例说明的感兴趣的模型抗体来确定突变为半胱氨酸残基的位点。用来产生蛋白质如抗体的模型有计算机程序是通常可获得的并且是本领域技术人员众所周知的(参见Kabat andWu; Loew, et al., Int.J.Quant.Chem., Quant.Biol.Symp., 15: 55-66 (1988) ; Bruccoleri,et al., Nature, 335:564-568(1988);Chothia, et al.，Science, 233:755-758(1986))，均通过引用结合于此。可以将市售计算机程序用来在计算机监视器上显示这些模型、计算在原子之间的距离和估计不同的氨基酸相互作用的可能性(参见，Ferrin, et al.，J.Mol.Graphics, 6:13-27 (1988),通过引用结合于此)。例如，计算机模型可以预测易接近的带电荷氨基酸残基和关于结合，然后可以合成构象受限的有机分子。参见，例如，Saragovi, etal.,Science, 253:792(1991)，其通过引用结合于此。在其它情况下，可以获得实验确定的抗体的实际结构。
[0164]根据一个实施方式，一对适宜的氨基酸残基应该:(I)具有在两个残基之间小于或等于8ANG的Ca-Ca距 离、优选地小于或等于6.5ANG(由可获得的抗体的晶体结构如来自Brookhaven Protein Data Bank的那些晶体结构确定)和(2)尽可能远离⑶R区。一旦确定它们之后，可以以半胱氨酸取代它们。
[0165]为了，通过众所周知的技术可以容易地完成在靶标点处编码半胱氨酸的基因的修饰，如寡核苷酸定向诱变(如上文所述的)、位点定向诱变(参见，Gillman andSmith, Gene, 8:81-97(1979)和 Roberts, S.，et al, Nature, 328:731-734(1987),两者通过引用结合于此)、通过在 Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:488-492(1985)中描述的方法，其通过引用结合于此、通过全基因合成(Hughes, R.A.et al, , Methods inEnzymology, Volume498 p.277-309 (2011))或通过本领域中已知的任何其它方法。
[0166]本发明的一些实施方式的抗体可以是来自任何哺乳动物源，包括人、猪、鼠、牛、山羊、马、犬、猫、绵羊等。抗体可以是异源抗体。
[0167]如在本文中所使用的，"异源抗体"是相对于转基因宿主如表达抗体的植物加以定义。
[0168]根据本发明的一些实施方式，抗体是分离的完整抗体(即，基本上不含除抗体外具有不同的抗原特异性的细胞材料和/或其它化学品)。
[0169]如在本文中所使用的，"重组抗体"是指通过重组方法所制备、表达、产生或分离的完整抗体，如(a)分离自动物(例如，小鼠)的抗体，其相对于免疫球蛋白基因(例如，人免疫球蛋白基因)或从其制备的杂交瘤是转基因的；(b)分离自被转化以表达抗体的宿主细胞的抗体；(C)分离自重组抗体库的抗体；和((1)通过涉及将免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它方式所制备、表达、产生或分离的抗体。在某些实施方式中，本发明的免疫球蛋白可以具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。在其它实施方式中，可以将上述重组人抗体进行体外诱变并由此使得重组抗体的Vh和\区的氨基酸序列包含这样的序列:其虽然源自并且与人种系％和 '序列相关，但不能自然地体内存在于人抗体种系谱内。
[0170]由本发明的范围覆盖抗体的以下示例性实施方式。
[0171]如在本文中所使用的，"人抗体"是指具有可变区的完整抗体，其中骨架区和CDR区均源自人类种系免疫球蛋白序列，如，例如，由Kabat et al.(参见Kabatl991, Sequencesof proteins of immunological Interest, 5th Ed.NIH Publication N0.91-3242)所描述的。人抗体的恒定区还源自人类种系免疫球蛋白序列。人抗体可以包括不由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基残基(例如，通过体外随机诱变或位点定向诱变或体内体细胞突变所引入的突变)。然而，如在本文中所使用的，术语"人抗体"并不意在包括这样的抗体:其中将源自另一哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列移植到人骨架序列上。
[0172]如在本文中所使用的，"嵌合抗体"是指完整抗体，其中可变区源自第一物种而恒定区源自第二物种。可以通过基因工程从属于不同物种的免疫球蛋白基因片段来构建嵌合免疫球蛋白(例如，Vh和\区来自小鼠抗体并具有人起源的恒定区)。
[0173]如在本文中所使用的，"人源化免疫球蛋白"是指完整抗体，其中将来自非人(例如，鼠)抗体的最小小鼠部分移植到人抗体上；人源化抗体通常是5-10%小鼠抗体和90-95%人抗体。
[0174]通常，人源化抗体将包含几乎所有的至少一个、并且通常两个可变区，其中所有或几乎所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些CDR区并且所有或几乎所有的FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体最佳地将还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fe),通常是人免疫球蛋白的恒定区[Jones et al.，Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann et al., Nature, 332:323-329(1988);and Presta,Curr.0p.Struct.Biol.，2:593-596(1992)]。
[0175]在本领域中用于人源化非人抗体的方法是众所周知的。通常，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为导入残基，其通常获自导入可变区。基本上可以根据Winter和同事的方法[Jones et al.，Nature, 321:522-525(1986);Riechmann et al., Nature332:323-327 (1988);Verhoeyen etal.，Science, 239:1534-1536 (1988)]来进行人源化，其中通过以啮齿动物⑶R或⑶R序列取代人抗体的相应序列。因此，上述人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号US 4，816，567)，其中，由来自非人物种的相应序列取代比完整的人可变区显著更少的部分。在实际操作中，人源化抗体通常是其中一些⑶R残基并且可`能地一些FR残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基所取代的人抗体。
[0176]还可以使用本领域中已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库[Hoogenboom and Winter, J.Mol.Biol.,227:381 (1991);Marks et al., J.Mol.Biol., 222:581 (1991) ]。Cole等和Boerner等的技术也可用于制备人单克隆抗体[Cole etal., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, p.77(1985)和 Boerneret al.，J.1mmunol.，147(1):86-95(1991)]。类似地，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入其中内源性免疫球蛋白基因已被部分或完全灭活的转基因动物例如，小鼠，)中来制备人抗体。在攻击后，观测到人抗体生产，其在所有方面均非常类似于在人类中观测到的情况，包括基因重排、装配、和抗体谱。例如在于美国专利号US 5, 545,807, US 5，545，806、US 5, 569, 825,US 5, 625, 126,US 5, 633, 425,US 5，661，016，和以下科学出版物:Marks etal.,Bio/TechnologylO,:779-783 (1992);Lonberg et al., Nature368:856-859(1994);Morrison, Nature368812-13(1994);Fishwild et al., Nature Biotechnologyl4, 845-51 (I996);Neuberger, Nature Biotechnologyl4:826(1996);和 Lonberg and Huszar, Intern.Rev.Tmmunol.13, 65-93 (1995)中描述这种方式。[0177]可以将本发明的抗体连接至功能部分如可检测或治疗部分。
[0178]可以将各种类型的可检测部分或报告部分连接至本发明的抗体。它们包括但不限于放射性同位素(如[125]碘)、磷光化学品、化学发光化学品、荧光化学品(荧光团)、酶、荧光多肽、亲和标签、和通过正电子发射层析成像(PET)或磁共振成像(MRI)可检测的分子(造影剂)。
[0179]适合的荧光团的实例包括但不限于:藻红蛋白(PE)、异硫氰酸荧光素(FITC)、Cy-铬、罗丹明、绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、德克萨斯红、PE_Cy5等。对于关于荧光团选择、将荧光团连接于各种类型的分子的方法的另外指导，参见RichardP.Haugland, “Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicalsl992 - 1994，，，5th ed., Molecular Probes, Inc.(1994);属于Oncoimmunin Inc.的美国专利号 US 6, 037, 137 ；Hermanson, “Bioconjugate Techniques”，Academic PressNew York, N.Y.(1995) ；Kay M.et al., 1995.Biochemistry34:293 ；Stubbs et al., 1996.Biochemistry35:937 ；Gakamsky D.et al., “Evaluating Receptor Stoichiometry byFluorescence Resonance Energy Transfer,，’in“Receptors:A Practical Approach,，，2nded., Stanford C.and Horton R.(eds.), Oxford University Press, UK.(2001)；属于Targesome, Inc.的美国专利号US 6，350，466]。当连接至荧光可检测部分时，可以用来检测抗体的荧光检测方法包括，例如，荧光活性流式细胞计数(FACS)、免疫荧光共焦显微镜术、荧光原位杂交(FISH)和荧光共振能量转移(FRET)。
[0180]可以将许多类型的酶连接至本发明的抗体[例如，辣根过氧化物酶(HRP)、β -半乳糖苷酶、和碱性磷酸酶(ΑΡ)]，并且可以使用ELISA (例如，在溶液中)、酶联免疫组化测定(例如，在固定组织中)、酶联化学发光测定(例如，在电泳分离的蛋白混合物中)或本领域中已知的其它方法来检测酶-标记的抗体[参见例如，Khatkhatay M1.and Desai Μ., 1999.J Immunoassay20:151-83 ；ffisdom GB., 1994.Methods Mol Biol.32:433-40 ；IshikawaE.et al.,1983.J Immunoassay4:209-327 ;0ellerich M., 1980.J Cl in Chem ClinBiochem.18:197-208 ；Schuurs AH.and van Weemen BK., 1980.J Immunoassayl:229-49)。
[0181]亲和标签(或结合对的成员)可以是由相应抗体可识别的抗原[例如，异羟洋地黄毒甙元(DIG)，其通过抗DIG抗体确定)或对于标签具有高亲和力的分子[例如，链霉亲和素和生物素]。如上文所述可以荧光标记结合亲和标签的抗体或分子或将其连接至酶。
[0182]可以采用在本领域中广泛实行的各种方法将链霉亲和素或生物素分子连接至本发明的抗体。例如，如在随后的实施例部分和在Denkberg，G.et al.，2000.Eur.J.1mmunol.30:3522-3532中所描述的，可以经由生物素蛋白连接酶(例如，BirA)的识别序列将生物素分子连接至本发明的抗体。可替代地，可以将链霉亲和素分子连接于抗体片段如单链Fv,基本上如在Cloutier SM.et al., 2000.MolecularImmunology37:1067-1077;Dubel S.et al., 1995.J Tmmunol Methods178:201;HustonJS.et al., 1991.Methods in Enzymology 203:46;Kipriyanov SM.et al., 1995.Hum Antibodies Hybridomas 6:93;Kipriyanov SM.et al., 1996.ProteinEngineering9:203;Pearce LA.et al., 1997.Biochem Molec Biol Intl 42:1179-1188 中所描述的。
[0183]基本上从所有的免疫荧光流式细胞计数试剂的主要供应商(例如，Pharmingen或Becton-Dickinson)可商业上获得连接至链霉亲和素的功能部分,如突光团。
[0184]根据本发明的一些实施方式，将生物素标记的抗体结合至链霉亲和素分子以形成多价成分(例如，抗体的二聚体或四聚体形式)。
[0185]表I提供了可以被连接至本发明的抗体的可识别部分的非限制性实例。
[0186]表I
[0187]
【权利要求】
1.一种抗体,包括Fe区和Fab区，其中: (i)所述Fe区包括两个不相同的重链,其中，所述两个不相同的重链的至少一个包含氨基酸修饰使得所述两个不相同的重链之间形成互补，从而增加形成所述不相同的重链的异源二聚体的可能性并降低形成相同重链的同源二聚体的可能性；和 (ii)所述Fab区包含在所述Fab区的第一重链和第一轻链之间的第一共价键和在所述Fab区的第二重链和第二轻链之间的第二共价键，其中，所述第一共价键相对于所述第一重链的位置不同于所述第二共价键相对于所述第二重链的位置。
2.根据权利要求1所述的抗体，是双特异性抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体，是不对称的、单特异性抗体。
4.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述互补包括空间互补。
5.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述互补包括电荷互补。
6.根据权利要求4所述的抗体，其中，所述Fe区包含所述Fe区的一个重链的突出部分和在所述Fe区的第二重链上的空间补偿空腔，所述突出部分突入所述补偿空腔。
7.根据权利要求4所述的抗体，其中，通过用比初始氨基酸具有更大侧链体积的另一氨基酸取代在所述一个重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生所述突出部分。
8.根据权利要求7所述的抗体，其中，通过以比所述初始氨基酸具有更小侧链体积的另一氨基酸取代在所述第二重链的CH3结构域上的一个位置处的氨基酸来产生所述补偿空腔。
9.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述第一共价键是在所述一个重链的CHl结构域和所述一个轻链的CL结构域之间；而所述第二共价键是在所述第二重链的Vh结构域和所述第二轻链的'结构域之间。
10.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述第一和所述第二共价键是二硫键。
11.根据权利要求7所述的抗体，其中，比所述初始氨基酸具有更大侧链体积的所述氨基酸选自由酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和色氨酸组成的组中。
12.根据权利要求8所述的抗体，其中，比所述初始氨基酸具有更小侧链体积的所述氨基酸选自由丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和苏氨酸组成的组中。
13.根据权利要求1所述的抗体,选自由嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体组成的组中。
14.根据权利要求1所述的抗体，其中，将所述第一重链的所述CH3结构域共价地连接至所述第二重链的所述CH3结构域。
15.根据权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体的第一抗原结合位点结合抗原的第一表位而所述抗体的第二抗原结合位点结合所述抗原的第二表位。
16.根据权利要求2所述的抗体，其中，所述抗体的第一抗原结合位点结合第一抗原的表位而所述抗体的第二抗原结合位点结合第二抗原的表位。
17.根据权利要求1所述的抗体，其中，每个轻链经由单二硫键连接至它的同源重链。
18.根据权利要求1所述的抗体,是完整抗体。
19.根据权利要求1所述的抗体,其中，所述抗体选自由IgA、IgD、IgE和IgG组成的组中。
20.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述IgG包括IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。
21.根据权利要求1所述的抗体，其中，所述第一重链包含T366W突变；并且所述第二重链包含T366S、L368A、Y407V突变。
22.根据权利要求21所述的抗体，其中，所述第一重链包含S354C突变并且所述第二重链包含Y349C突变。
23.根据权利要求16所述的抗体，其中，所述第一抗原结合位点结合CD30而所述第二抗原结合位点结合erbB2。
24.根据权利要求16所述的抗体，其中，所述第一抗原结合位点结合CD30而所述第二抗原结合位点结合假单胞菌外毒素(PE )。
25.根据权利要求16所述的抗体，其中，所述第一抗原结合位点结合CD30而所述第二抗原结合位点结合链霉亲和素。
26.根据权利要求1所述的抗体，其中，至少一个所述重链连接至治疗性部分。
27.根据权利要求1所述的抗体，其中，至少一个所述重链连接至可识别部分。
28.根据权利要求1所述的抗体，选自由灵长类动物抗体、猪抗体、鼠抗体、牛抗体、羊抗体和马抗体组成的组中。
29.—种制备根据权利要求1所述的抗体的方法，包括: Ca)提供编码所述第一重链的第一核酸分子； (b)提供编码所述第二重链的第二核酸分子； (c)提供编码所述第一轻链的第三核酸分子； Cd)提供编码所述第二轻链的第四核酸分子； (e)在允许表达所述核酸分子的条件下培养包含所述第一、第二、第三和第四核酸分子的宿主细胞；和 Cf)回收根据权利要求1所述的抗体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述宿主细胞包括细菌细胞。
31.根据权利要求29所述的方法，其中，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述表达发生在所述细菌细胞的包涵体中。
33.根据权利要求29所述的方法，其中，将每种所述核酸分子转染进入不同的宿主细胞。
34.根据权利要求27所述的方法，其中，将每种所述核酸分子转染进入相同的宿主细胞。
35.根据权利要求30所述的方法，其中，所述细菌细胞包括革兰氏阴性细菌细胞。
36.根据权利要求29所述的方法，进一步包括，按照步骤(f)纯化在蛋白A/G/L上的抗体。
37.一种药物组合物，包含作为活性剂的根据权利要求1所述的抗体，和药用载体。
38.根据权利要求1所述的抗体，用于治疗感染或炎性疾病或病症。
39.根据权利要求38所述的抗体，其中，所述炎性疾病是癌症。
40.一种用于在需要其的受试者中治疗感染或炎性疾病或病症的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的根据权利要求1所述的抗体，从而治疗所述感染或炎性疾病或病症。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述炎性疾病或病症是癌症。
【文档编号】C07K16/32GK103429619SQ201280013666
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年3月15日 优先权日:2011年3月17日
【发明者】埃泰·本哈尔, 莱拉克·瓦克斯 申请人:雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司