新型含岩藻糖的糖类衍生物的合成的制作方法
【专利摘要】本发明提供了式1的化合物或其盐的合成方法，其中，A是糖类连接物，所述糖类连接物是乳糖基部分或由乳糖基部分和至少一种单糖单元组成，所述单糖单元选自由葡萄糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、岩藻糖和N-乙酰神经氨酸组成的组；并且其中，R1是以下端基异构保护基之一：a)–OR2，其中，R2是能够通过催化氢解去除的保护基；b)–SR3，其中，R3是可选地具有取代基的烷基，可选地具有取代基的芳基或可选地具有取代基的苄基；c)–NH-C(R”)=C(R’)2，其中，各个R’独立地为以下吸电子基团中的一种：–CN、-COOH、-COO-烷基、-CO-烷基、-CONH2、-CONH-烷基或–CON(烷基)2，或其中，两个R’-基团连接在一起形成–CO-(CH2)2-4-CO-，并从而与它们所连接的碳原子共同形成5-7元环烷-1,3-二酮，在该二酮中任何亚甲基可选地取代有1或2个烷基，并且R”是H或烷基，其中式2的岩藻糖基供体与式H-A-R1的受体或其盐在能够转移岩藻糖的酶的催化下反应，式2中，X选自由鸟苷二磷酸部分、乳糖部分、叠氮基、氟、可选地具有取代基的苯氧基、可选地具有取代基的吡啶氧基、可选地具有取代基的式A的3-氧代-呋喃氧基、可选地具有取代基的式B的1,3,5-三嗪氧基、式C的4-甲基伞形酮氧基和式D的基团组成的组；其中，Ra独立地为H或烷基，或二个邻近的Ra表现为=C(Rb)2基团，其中，Rb独立地为H或烷基，Rc独立地选自由烷氧基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基组成的组，Rd选自由H、烷基和-C(=O)Re组成的组，其中，Re是OH、烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、肼基、烷基肼基、二烷基肼基或三烷基肼基，式H-A-R1中，A和R1定义同上。本发明还提供了式1的化合物或其盐在制备人乳寡糖中的应用，人乳寡糖的制造方法和岩藻糖基供体。
【专利说明】新型含岩藻糖的糖类衍生物的合成
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及岩藻寡糖糖苷的酶促合成。
【背景技术】
[0002]人乳寡糖(HMO)具有重大意义，其直接与独特的生物学活性相关，如抗菌性、抗病毒性、免疫系统和认知发展的增强活性等。发现HMO在人体肠道系统内起到益生元的作用，有助于发展和维持肠道菌群。此外，还证明它们是抗炎性物质，因此它们在用于生产例如婴儿配方奶粉、婴儿谷类食品、临床婴儿营养品、幼儿配方奶粉等的营养产业中，或是作为用于儿童、成人、老人或哺乳期妇女的膳食补充剂或健康功能食品均是富有吸引力的成分，无论是作为合成制造的还是天然存在的化合物及其盐均是如此。HMO在用于生产治疗剂的医药行业中也是令人感兴趣的。
[0003]在含岩藻糖的HMO中，岩藻糖残基可经由a -糖苷键连接到D-半乳糖的2_0_位、D-葡萄糖的3-0-位和N-乙酰葡萄糖胺的3-或4-0-位。最重要的岩藻糖基化的HMO是2，岩操糖基乳糖(Fuc a l_2Gal 3 l_4Glc) >3-0-岩操糖基乳糖(Gal 3 1-4[Fuc a 1-3]Glc)、3’ -0-唾液酸基-3-0-岩藻糖基乳糖(NeuAc a 2_3Gal β1-4[Fuc a 1-3]Glc)、二岩藻糖基乳糖(Fuc a l-2Gal 3 1-4 [Fuc a 1-3]Glc)、乳糖-N-岩藻五糖 I (Fuc a 1-2Gal P l-3GlcNAc β l_3Galβ l_4Glc)、乳糖 _N_ 岩藻五糖 II (Gal β1-3 [Fuc a 1-4]GlcNAc P l_3Gal P l_4Glc)、乳糖-N-岩藻五糖 III (Gal P 1-4 [Fuc a 1-3]GlcNAc P l-3Gal β l_4Glc)、乳糖 _N_ 岩藻五糖 V (Gal β l_3GlcNAc β l_3Gal 3 I-4 [Fuc a 1-3] Glc)、乳糖 _N_ 二岩操糖 _ 己糖 I (Fuc ct I—2Gal 1-3 [Fuc a 1-4]GlcNAc P l_3GaiP l_4Glc)、乳糖 _N_ 二岩藻糖-己糖 II (Gal P 1-3 [Fuc a 1-4]GlcNAc 1-3Gal 1-4 [Fuc a 1-3] Glc)、乳糖—N- 二岩操糖—己糖 III (Gal 1-4 [Fuc a 1-3]GlcNAc P l-3Gal P 1-4 [Fuc a l_3]Glc)、F-LST a(NeuAc a 2_3Gal P 1-3 [Fuc a 1-4]GlcNAc β l-3Gal β l_4Glc)、F-LST b (Fuc a l-2Gal β 1-3[NeuAc a 2-6]GlcNAc P l-3Gal β l_4Glc)、F-LST c (NeuAc a 2_6Gal P l_4GlcNAc P l_3Gal P 1-4 [Fuca l-3]Glc)、岩藻糖基-乳糖-N-(新)己糖，二岩藻糖基-乳糖-N-(新)己糖、唾液酸基-岩藻糖基-乳糖-N-(新)己糖、唾液酸基-二岩藻糖基-乳糖-N-(新)己糖和三岩藻糖基-乳糖-N-(新)己糖[C.Kunz 等.Annu.Rev.Nutr.20,699 (2000)，T.Urashima 等.:MilkOligosaccharide, Nova Science Publishers, New York(2011)及其中所引文献]。
[0004]天然存在的HMO的可获得性是有限的。成熟的人乳是含有最高浓度(12g/l-14g/I)的HMO的天然乳源，其它的乳源则是牛奶(0.01g/l)、山羊奶和来自其它哺乳动物的奶。由于存在大量的相似寡糖，因而即使是以毫克的量级来从人乳和其他哺乳动物乳中分离岩藻寡糖也相当困难。到目前为止，仅开发出分析式的HPLC方法以从天然来源HMO中离析出一些岩藻寡糖。其较低的天然可获得性和较难的分离方法是开发生产HMO的生物技术及化学方法的重要原因。
[0005]复杂的岩藻寡糖的化学合成需要采用了保护和脱保护策略的多步合成路径。立体选择性化学合成工艺可能会因广泛使用保护基而变得复杂。这些策略使用糖基卤化物、硫苷或三氯乙酰亚胺酯供体的活化经由对适当保护的糖基受体进行立体选择性O-岩藻糖基化而得到了岩藻糖基化的寡糖。用于岩藻糖基化的昂贵的或者有毒性的化学品(如氰化汞、溴化汞、碳酸银或溴)的使用是这些方法缺乏吸引力的原因之一。低效的立体控制和/或不高的收率同样使得这些策略不适合进行进一步的开发。另外，这些策略还存在操作繁琐和提纯极其困难的特点。
[0006]在岩藻寡糖的酶法生成中，岩藻糖基转移酶和岩藻糖苷酶已成为优选使用的酶。虽然酶促岩藻糖基化通常伴随有高度的区域和立体选择性，这些复杂的酶促系统需要昂贵的规模化生产的方法，和困难的提纯方案，这同样阻碍了进一步的技术发展。这些缺陷似乎通过酶工程的新成果逐渐得到克服[见综述:s.M.Hancock等.Curr.0pin.Chem.Biol.10,509(2006), R.Kittl 等.Carbohydr.Res.345,1272(2010)及其中引用的文献]。近期已经开发出了作为具有改善的岩藻糖基化活性的突变体岩藻糖苷酶的转岩藻糖苷酶(transfucosidase)和岩藻糖合酶[G.0sanjo 等.Biochemistry 46,1022 (2007), J.Wada等.FEBS Lett.582，3739(2008)，B.Cobucc1-Ponzano 等.Chem.Biol.16，1097(2009)]。
[0007]由于诸如人乳等天然来源库中存在多种寡糖，因此分离技术一直不能提供大量的岩藻寡糖。另外，以极度相似结构为特征的区域异构体(regioisomer)的存在使得分离技术不能成功。
[0008]近期，公开了可选地取代有岩藻糖的唾液酸寡糖衍生物(W0 2012/007588)。
[0009]在刚过去的几十年中，对岩藻糖基化的HMO的制备和商品化的兴趣逐步增加。因此，需要能够简化其制备并且克服或避免现有纯化问题的方法。
【发明内容】
[0010]在第一方面，本发明提供了一种式I的化合物或其盐的合成方法，
[0011]
【权利要求】
1.一种式I的化合物或其盐的合成方法，
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述酶是岩藻糖基转移酶或岩藻糖苷酶。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述岩藻糖苷酶是工程化的转岩藻糖苷酶或工程化的岩藻糖合酶。
4.如权利要求3所述的方法，其中，所述工程化的转岩藻糖苷酶或所述工程化的岩藻糖合酶源自两歧双歧杆菌、硫磺矿硫化叶菌或海栖热袍菌。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述岩藻糖苷酶是工程化的α-转岩藻糖苷酶，并且其中，式2的化合物是2’-0_岩藻糖基乳糖，或者式2中的X是氟、苯氧基、对硝基苯氧基、2，4- 二硝基苯氧基、2-氣-4-硝基苯氧基、4，6- 二甲氧基_1，3, 5- 二嚷_2_基氧基、4，6-二乙氧基-1，3，5-三嗪-2-基氧基、2-乙基-5-甲基_3_氧代-(2Η)-呋喃-4-基氧基、5-乙基-2-甲基-3-氧代-(2Η)-呋喃-4-基氧基或2，5- 二甲基-3-氧代-(2Η)-呋喃-4-基氧基基团。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述受体是端基异构保护形式的脱岩藻糖基化的人乳寡糖。
7.一种式I的化合物或其盐，
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于式I’
9.如权利要求8所述的化合物，其中，A连同末端的岩藻糖基部分是人乳寡糖糖基残基。
10.如权利要求9所述的化合物，其中，A包含乳糖胺基残基和/或异乳糖胺基残基。
11.如权利要求8至10中任一项所述的化合物，所述化合物选自由以下物质的3_Ri_糖苷组成的组:2’ -O-岩操糖基乳糖、3-0-岩操糖基乳糖、3’ -0-唾液酸基-3-0-岩藻糖基-乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖1、乳糖-N-岩藻五糖I1、乳糖-N-岩藻五糖II1、乳糖-N-岩藻五糖V、乳糖-N- 二岩藻糖-己糖1、乳糖-N- 二岩藻糖-己糖I1、乳糖-N-二岩藻糖-己糖 II1、F-LST a、F-LST b 和 F-LST C。
12.如权利要求11所述的化合物，所述化合物选自由以下物质的P-OR2-和P-SR3-糖苷组成的组:2’ -0-岩藻糖基乳糖、3-0-岩藻糖基乳糖、二岩藻糖基乳糖、乳糖-N-岩藻五糖1、乳糖-N-岩藻五糖I1、乳糖-N-岩藻五糖II1、乳糖-N-岩藻五糖V、F-LST a、F_LST b和 F-LST Co
13.如权利要求12所述的化合物，其中，R2是苄基或2-萘基甲基，所述苄基或2-萘基甲基中的每一个可选地取代有选自由苯基、烷基或卤素组成的组中的至少一个基团，或者其中，R3是苯基或苄基。
14.权利要求8至10中任一项所述的式I’的化合物或其盐在制备岩藻糖基化的人乳寡糖或其盐中的应用。
15.如权利要求14所述的应用，其中，所述人乳寡糖或其盐是岩藻糖基化的寡糖或其盐，所述制备包括从式I’的化合物或其盐去除端基异构保护基R1的步骤。
16.一种人乳寡糖或其盐的制造方法，所述方法包括从式I’的化合物或其盐去除端基异构保护基R1的步骤，
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述式I’的化合物或其盐通过权利要求1至6中任一项所述的方法形成。
18.一种岩藻糖基化的寡糖或其盐的制造方法，所述方法包括以下步骤: 根据权利要求1至6中任一项所述合成式I的化合物或其盐，和从所述式I的化合物或其盐去除所述端基异构保护基札。
19.一种式2A的化合物
【文档编号】C07H5/08GK103443113SQ201280013568
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2012年3月19日 优先权日:2011年3月18日
【发明者】E·查姆平, 吉拉·德卡尼, M·海德罗斯, 卡洛利·阿戈斯通 申请人:格力康公司