核心蛋白聚糖组合物及其用途
【专利摘要】本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。在一个实施方案中，公开了通过下述来产生非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的方法：提供表达非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主细胞；培养所述宿主细胞使得产生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及纯化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。
【专利说明】核心蛋白聚糖组合物及其用途
发明领域
[0001]本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。
[0002]发明背景
[0003]携带一条或多条糖胺聚糖(GAG)链的蛋白聚糖形成一个大的基因家族，该家族根据核心蛋白的结构性质可被分成五组。其中一组是小的富亮氨酸的蛋白聚糖家族，该家族由核心蛋白聚糖(DCN)、双糖链蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和光蛋白聚糖组成。它们的特征在于40kDa的核心蛋白，该核心蛋白含有约12个氨基酸的富亮氨酸重复。DCN是该组的原型，并且也称为PG-S2、PG40、硫酸蛋白皮肤素(proteodermatan sulphate)和DS-PGII。它含有一条共价连接到成熟核心蛋白的丝氨酸的皮肤素硫酸软骨素GAG链，并被视为多功能的蛋白聚糖。
[0004]所提出的DCN功能包括但不限于调控胶原原纤维形成、通过与纤连蛋白和血小板反应蛋白结合而维持组织完整性以及作为转化生长因子β (TGF-β)的贮存器(reservoir)。DCN的后一功能通过其核心蛋白将细胞外环境中的生长因子与细胞表面上表达的受体相隔离而实现。
[0005]将核心蛋白聚糖输注到实验性啮齿动物脊髓损伤处已表明可抑制疤痕形成并促进轴突生长。核心蛋白聚糖也已在实验性鼠肿瘤模型中证实了具有抗肿瘤发生的特性并且能够抑制多种肿瘤细胞系的生长。对于核心蛋白聚糖基因，存在多种已知的选择性剪切转录变体。核心蛋白聚糖基因中的突变与先天性基质层角膜营养不良相关。
[0006]本领域需要的是改进的产生核心蛋白聚糖的方法，尤其是针对治疗性用途。
发明概要
[0007]本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。
[0008]因此，在一些实施方案中，本发明提供包含可操作地连接到编码核心蛋白聚糖的序列的异源信号肽的融合蛋白。在一些实施方案中，信号序列为α -乳白蛋白信号序列。在一些实施方案中，α乳白蛋白序列为牛α-乳白蛋白信号序列。在一些实施方案中，编码核心蛋白聚糖的序列编码核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变。在一些实施方案中，突变为丝氨酸到丙氨酸突变。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位不含糖胺聚糖分子的实质性修饰。
[0009]在一些实施方案中,本发明提供编码上述融合蛋白的载体。在一些实施方案中，载体包含编码α-乳白蛋白信号序列的核酸序列，所述α-乳白蛋白信号序列可操作地连接到编码核心蛋白聚糖核心蛋白的序列。
[0010]在一些实施方案中，本发明提供包含上述载体的宿主细胞。
[0011] 在一些实施方案中，本发明提供产生非糖胺聚糖化(non-gagylated)核心蛋白聚糖核心蛋白的方法，包括:提供表达非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主细胞；培养所述宿主细胞使得产生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及纯化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白分泌到用于培养所述宿主细胞的培养基中。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与离子交换介质接触。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与羟基磷灰石介质接触。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与至少一种离子交换介质和至少一种羟基磷灰石介质按任何顺序接触。在一些实施方案中，纯化包括:将所述培养基与阳离子交换介质接触；洗涤所述阳离子交换介质；从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液；将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触；洗涤所述羟基磷灰石介质；从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些实施方案中，阳离子交换介质为SP-琼脂糖FF。在一些实施方案中，羟基磷灰石介质为陶瓷羟基磷灰石I型。在一些实施方案中，方法还包括用离子交换膜或柱进一步纯化所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些实施方案中，离子交换膜为Q离子交换膜。在一些实施方案中，方法还包括病毒灭活步骤。在一些实施方案中，病毒灭活步骤包括用表面活性剂处理。在一些实施方案中，表面活性剂为Triton X-1OO0在一些实施方案中，方法还包括病毒过滤步骤。在一些实施方案中，方法还包括浓缩所述核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白通过所述宿主细胞以约大于1、5或IOpg/细胞/天的速率产生。
[0012]在一些实施方案中，本发明提供从含核心蛋白聚糖的培养基中纯化核心蛋白聚糖的方法，包括:将所述含核心蛋白聚糖的培养基与阳离子交换介质接触；洗涤所述阳离子交换介质；从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液；将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触；洗涤所述羟基磷灰石介质；从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液；用离子交换膜过滤所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液以提供含核心蛋白聚糖的滤液；处理所述滤液以除去病毒；以及从所述滤液中浓缩核心蛋白聚糖。
[0013]在一些实施方案中，本发明提供包含纯化的核心蛋白聚糖核心蛋白的组合物，所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变,使得所述核心蛋白聚糖蛋白基本上非糖胺聚糖化，所述组合物在所述组合物中包含少于约IOOng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约20pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，组合物在所述组合物中包含少于约5ng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约5pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，将核心蛋白聚糖配制成水溶液。在一些实施方案中，水溶液包含PH为约6.5至约7.5的磷酸盐缓冲溶液。
[0014]附图简述
[0015]图1:核心蛋白聚糖表达基因序列(SEQ ID NO:8)。
[0016]图2:核心蛋白聚糖表达蛋白质序列(SEQ ID NO:4)。
[0017]图3:将活细胞浓度的积分相对于在整个15天的生物反应器运行中的核心蛋白聚糖产生作图。各运行的回归曲线的斜率对应于以皮克/细胞/天(p/c/d)表示的细胞产量。这两次运行的平均值为24.4p/c/d。一次运行的最大产量达到了约1.8g/L，而另一次运行达到了 1.7g/L。
[0018]定义
[0019]为了有利于 理解本发明，下文将定义多个术语。[0020]如本文所用，术语“核心蛋白聚糖”是指具有与SEQ ID NO:4具有至少80%同一性的成熟蛋白质序列的蛋白质分子。
[0021 ] 如本文所用，术语“核心蛋白聚糖核心蛋白”是指在成熟核心蛋白聚糖的第4位具有突变并且在第4位氨基酸基本上不含糖胺聚糖(GAG;即非糖胺聚糖化)修饰的核心蛋白聚糖蛋白分子。
[0022]如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何真核细胞(例如，哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，而不论是位于体外还是体内。
[0023]如本文所用，术语“细胞培养”是指细胞的任何体外培养。此术语包括传代细胞系(例如，具有永生化表型)、原代细胞培养、有限细胞系(例如，非转化细胞)以及任何其他体外维持的细胞群，包括卵母细胞和胚胎。
[0024]如本文所用，术语“载体”是指当与合适的控制元件相关时能够复制并且可在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。因此，该术语包括克隆和表达运载体以及病毒载体。
[0025]如本文所用，术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列"5' -A-G-T-3"'与序列"3' -T-C-A-5"'互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中具有尤其重要的意义。 [0026]术语“同源性”和“百分比同一性”当相对于核酸使用时是指互补性程度。可以存在部分同源性(即，部分同一性)或完全同源性(即，完全同一性)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的序列与靶核酸序列杂交的序列，并指使用功能术语“基本上同源的”。完全互补序列与祀序列的杂交抑制可通过在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、液相杂交等)进行研究。基本上同源的序列或探针(即，能够与另一所关注的寡核苷酸杂交的寡核苷酸)将在低严格性条件下竞争并抑制完全同源的序列与靶序列的结合(即，杂交)。这并非是说，低严格性条件使得允许非特异性结合；低严格性条件要求两种序列彼此之间的结合为特异性(即，选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用甚至没有部分互补程度(例如，低于约30%的同一性)的第二靶标进行测试；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补靶标杂交。
[0027]如本文所用的术语“可操作的组合”、“可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列的连接方式使得产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还指氨基酸序列的连接方式使得产生功能性蛋白。
[0028]如本文所用，术语“信号序列”是指当可操作地连接到重组DNA序列时编码能够导致重组多肽分泌的信号序列的任何DNA序列。一般来讲，信号肽包含一系列约15至30个疏水性氨基酸残基(参见例如，Zwizinski 等，J.Biol.Chem.255 (16) =7973-77 [1980]，Gray等，Gene39(2):247-54[1985]和 Martial 等，Science205:602-607 [1979])。此类分泌信号序列优选地衍生自编码以下多肽的基因:该多肽从靶向组织特异性表达的细胞类型分泌(例如，在乳腺分泌性细胞中表达和分泌的分泌乳蛋白)。然而，分泌性DNA序列不限于此类序列。也可以使用来自从许多细胞类型和生物分泌的蛋白质的分泌性DNA序列(例如，t-PA、血清白蛋白、乳铁蛋白和生长激素的分泌信号，以及编码诸如得自酵母、丝状真菌和细菌的分泌多肽的微生物基因中的分泌信号)。
[0029]如本文所用，术语“纯化的”是指从其正常环境中移除、分离或分开的核酸或氨基酸序列分子。“分离的核酸序列”因而是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60%不含、优选地至少75%不含并且更优选地至少90%不含与其通常相关的其他组分。
[0030]发明详述
[0031]本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法，以及涉及核心蛋白聚糖用于治疗患者的用途。
[0032]核心蛋白聚糖
[0033]天然核心蛋白聚糖是具有附接的糖胺聚糖和90_140kD的平均分子量的糖蛋白。本发明设想产生重组的核心蛋白聚糖。在一些优选的实施方案中，核心蛋白聚糖是核心蛋白聚糖核心蛋白，即，基本上非糖胺聚糖化的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。在一些实施方案中，突变为丝氨酸到丙氨酸突变。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白与SEQ ID NO:1(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。
[0034]核心蛋白聚糖通常表达为前蛋白。本发明提供核心蛋白聚糖融合分子，其包含与核心蛋白聚糖前肽和成熟的肽序列可操作相关的异源信号序列。在一些实施方案中，异源信号多肽为α-乳白蛋白信号多肽。在一些实施方案中，α-乳白蛋白信号多肽为牛α-乳白蛋白信号多肽。在一些实施方案中，异源信号多肽与SEQ ID NO:2具有至少80^^90%或100%同一性。在一些实施方案中，前肽序列与SEQ ID N0:3具有至少80%、90%或100%同一性。在一些实施方案中，融合多肽的核心蛋白聚糖核心蛋白部分与SEQ ID N0:1(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO:4(信号前肽核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少80%、90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。
[0035]本发明还提供编码融合蛋白的核酸序列，以及包含核酸序列的载体。在一些实施方案中，异源信号多肽与SEQ ID N0:5具有至少80%、90%或100%同一性。在一些实施方案中，前肽序列与SEQ ID N0:6具有至少80%、90%或100%同一性。在一些实施方案中，融合多肽的核心蛋白聚糖核心蛋白部分与SEQ ID NO:7(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO:8(信号前肽核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少80%、90%、95%、99%或100%同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。[0036]
【权利要求】
1.一种产生非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的方法，包括: 提供表达非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主细胞； 培养所述宿主细胞使得产生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及 纯化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白分泌到用于培养所述宿主细胞的培养基中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括将所述培养基与离子交换介质接触。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括将所述培养基与羟基磷灰石介质接触。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括将所述培养基与至少一种离子交换介质和至少一种羟基磷灰石介质按任何顺序接触。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括: 将所述培养基与阳离子交换介质接触； 洗涤所述阳离子交换介质； 从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液； 将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触； 洗涤所述羟基磷灰石介质； 从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述阳离子交换介质为SP-琼脂糖FF。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述羟基磷灰石介质为陶瓷羟基磷灰石I型。
9.根据权利要求6所述的方法，还包括用离子交换膜或柱进一步纯化所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述离子交换膜为Q离子交换膜。
11.根据权利要求6所述的方法，还包括病毒灭活步骤。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒灭活步骤包括用表面活性剂处理。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述表面活性剂为TritonX-100。
14.根据权利要求6所述的方法，还包括病毒过滤步骤。
15.根据权利要求6所述的方法，还包括浓缩所述核心蛋白聚糖。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白通过所述宿主细胞以约大于1、5或IOpg/细胞/天的速率产生。
17.一种从含核心蛋白聚糖的培养基中纯化核心蛋白聚糖的方法，包括: 将所述含核心蛋白聚糖的培养基与阳离子交换介质接触； 洗涤所述阳离子交换介质； 从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液； 将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触； 洗涤所述羟基磷灰石介质； 从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液；用离子交换膜过滤所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液以提供含核心蛋白聚糖的滤液； 处理所述滤液以除去病毒； 从所述滤液中浓缩核心蛋白聚糖。
18.—种包含纯化的核心蛋白聚糖核心蛋白的组合物，所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变，使得所述核心蛋白聚糖蛋白基本上非糖胺聚糖化，所述组合物在所述组合物中包含少于约IOOng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约20pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。
19.根据权利要求18所述的组合物，所述组合物在所述组合物中包含少于约5ng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约5pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中将所述核心蛋白聚糖配制成水溶液。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述水溶液包含pH为约6.5至约7.5的磷酸盐缓冲溶液。
22.一种融合蛋白，其包含可操作地连接到编码核心蛋白聚糖的序列的异源信号肽。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述信号序列为α-乳白蛋白信号序列。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述α乳白蛋白序列为牛α-乳白蛋白信号序列。
25.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述编码核心蛋白聚糖的序列编码核心蛋白聚糖核心蛋白。
26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变。
27.根据权利要求26所述的融合蛋白，其中所述突变为丝氨酸到丙氨酸突变。
28.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位不含糖胺聚糖分子的实质性修饰。
29.—种编码根据权利要求22所述的融合蛋白的载体。
30.根据权利要求29所述的载体，其中所述载体包含编码α-乳白蛋白信号序列的核酸序列，所述α -乳白蛋白信号序列可操作地连接到编码核心蛋白聚糖核心蛋白的序列。
31.一种包含根据权利要求29所述的载体的宿主细胞。
【文档编号】C07K14/47GK103917655SQ201280013702
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2012年3月13日 优先权日:2011年3月14日
【发明者】G·T·布莱克, I·J·科林斯, M·J·弗赖 申请人:康泰伦特药物解决方案有限责任公司