含有与聚阴离子多肽偶联的、衍生自cd4受体的肽的用于治疗艾滋病的新共轭分子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及共轭分子及其制备方法，所述共轭分子含有衍生自CD4受体的肽，所述肽通过接头与有机分子偶联。所述有机分子包括5至21个氨基酸阴离子多肽。所述共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病的治疗。
【专利说明】含有与聚阴离子多肽偶联的、衍生自CD4受体的肽的用于治疗艾滋病的新共轭分子
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有衍生自CD4受体的肽和有机分子的共轭分子，有机分子例如聚阴离子多肽。该共轭分子可以用于抗病毒治疗，也就是用于艾滋病的治疗。本发明进一步涉及制备所述共轭分子的方法。
【背景技术】
[0002]在大量血清反应阳性的HIV患者中，结合核苷(NRTI)、非-核苷(NNRTI)和/或蛋白酶抑制剂(PI)的三联疗法导致病毒载量(viral charge)降低至检测水平以下。这些治疗同时靶向逆转录和蛋白质水解。这种功效已经导致由HIV感染导致的死亡数目的本质的减少。但不幸地，约80%的患者显示了抗病毒抗性的基因型，更忧虑地，45.5%的病毒群对NRTI/PI联合治疗具有抗性，而26%对三种抗-HIV类的联合治疗具有抗性(Tamalet等人，AIDS.2003Nov7;17(16):2383 - 8)。这种观察特别令人不安，是因为在70%接受治疗的患者中发现长期三联疗法治疗的副作用(皮下脂肪萎缩、脂肪营养不良、高三酸甘油酯血症、高胆固醇血症、神经病等)导致顺应性差以及通常导致抗性的治疗“突然”停止。因此，优先考虑开发具有较少副作用和没有交叉抗性的较低严重形式的治疗，尽管市场上目前可以得到大量的药物。鉴于此，有必要以HIV复制步骤为靶向，而非逆转录和蛋白质水解。
[0003]在病毒性感染循环中，病毒进入细胞是重要步骤。该过程被分成两个阶段:第一，病毒在细胞表面与特定宿主受体相互作用，接着病毒遗传物质渗透入靶细胞。关于HIV，参与粘附和进入机制的分子伴侣已很好地确定。gpl20病毒包膜糖蛋白，通过结合宿主细胞的跨膜糖蛋白CD4，本质上决定病毒/细胞相互作用的复合物。这种相互作用导致gpl20中构象的改变，gpl20暴露出特 定的表位，称为CD4-诱导(CD4i)，因此建立趋化因子受体(基本上为CCR5和CXCR4)的结合位点。因此，CCR5和CXCR4在细胞表面充当gpl20共受体。第二种相互作用导致gpl20/gp41蛋白质复合物的重新组织和细胞/病毒膜融合的开始。
[0004]通过所用共受体的类型定义HIV病毒的细胞趋向性。更具体地说，所谓的X4或“T向性(T - tropic)”病毒倾向于感染在它们的表面表达CXCR4的细胞株，例如T淋巴细胞。所谓的R5或“M向性(M - tropic)”病毒使用共受体CCR5且主要感染巨噬细胞和单核细胞。R5或X4病毒的存在通常与完全不同的艾滋病发展阶段相关(对R5无症状阶段，X4病毒的出现通常与不利的疾病发展结果相联系，表明共受体CXCR4的用途是艾滋病发病机理的重要因素)。由于gpl20带有对CCR5和CXCR4识别的结构决定簇，所以R5和X4病毒代表两种分开的靶标。
[0005]国际专利申请W02008/015273中显示，衍生自⑶4受体的特定活化的肽可以和有机分子选择性反应，提供化学定义地共价共轭物。这种活化需要在衍生自CD4受体的肽序列中的特定位置上插入一个且只有一个氨基酸残基赖氨酸。这种插入允许在mini⑶4合成和纯化之后，通过接头将有机化合物和化学物(chemistries)偶联。
[0006]W02009/098147中公开了多种潜在抗病毒衍生物，抗病毒衍生物由包含⑶4肽的共轭分子组成，其中CD4肽通过接头特异性地偶联至聚阴离子硫酸类肝素(HS)。这些共轭物表现出强大的抗病毒活性。通过gpl20中存在至少两种不同的HS识别位点激发HS的作用，即V3可变环和⑶4 (⑶4i)诱导的位点:mCD4-HS的⑶4部分(moiety)被认为是通过直接相互作用触发gpl20的构象变化，因此导致CD4i表位的暴露，然后共价结合的HS可以与⑶4i表位相互作用，从而削弱X4和R5细胞系的HIV病毒感染。
[0007]由抑制病毒附着至细胞组成的这种方法是治疗有利的，因为它直接靶向病毒而非细胞本身。因此，其没有用结合至共受体的疗法所观察到的细胞作用。另外，考虑到保留作为各种病毒向性功能而参与其中的位点，根据本发明的化合物应当与不同的病毒分尚株的gpl20相互作用。尽管可能误导认为绝不会产生抗性，无论如何可以预期和其它治疗相比它将以低得多的比例发生。事实上，gpl20的⑶4位点需保持完整以便继续结合⑶4，如参与和聚阴离子多糖的结合以便与共受体相互作用的碱性残基。这两个位点中任何一个突变的确都将导致病毒传染性降低。
[0008]本发明人现在已经鉴定了一种新共轭分子，其能够阻断HIV病毒进入到细胞中。它们表明，mCD4共轭分子中存在硫酸类肝素低聚糖，对于抑制病毒进入X4或R5细胞系而言不是绝对必需的，并且通过由5至21，有利地5至17、特别是5、9、13、17或21，优选13个氨基酸组成的阴离子多肽代替以前所用的HS分子，也可以得到非常有效的抗病毒活性。在一个优选的实施方式中，一些氨基酸带负电荷，特别是至少I个，有利地至少2个，优选至少3个。在更优选的实施方式中，3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个氨基酸带负电荷(取决于阴离子多肽的长度)。在最优选的实施方式中，当阴离子多肽由13个氨基酸组成时，9个氨基酸带负电荷。更重要的是，它们还表明，令人惊讶的是，这些新mCD4共轭分子(包括所述阴离子多肽)，相较于现有技术中所公开的共轭分子，对R5或X4病毒都具有更好的抗病毒活性。
【发明内容】
[0009]根据第一方面，本 发明涵盖含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头被偶联至有机分子，其中
[0010].所述衍生自⑶4受体的肽含有下列通用序列(I):
【权利要求】
1.含有衍生自CD4受体的肽的共轭分子，所述肽通过接头偶联至有机分子，其中: ?所述衍生自CD4受体的肽含有下列通用序列(I):
Xaaf _ Pl _ Lys _ Cys _ P2 _ Cys _ P3 _ Cys _ Xaas _ Xaah _ Xaa1 _ Xaaj _ Cys _ Xaak _Cys - Xaa1 - Xaam, (I) 其中: -Pl代表3至6个氨基酸残基， -P2代表2至4个氨基酸残基， -P3代表6至10个氨基酸残基， -Xaaf代表N -乙酰半胱氨酸(Ac - Cys)或3_巯基丙酸(TPA)，
-Xaag 代表 Ala 或 Gln, -Xaah 代表 Gly 或(D)Asp 或 Ser,
-Xaa1 代表 Ser 或 His 或 Asn, -XaaMf表联苯基丙氨酸(Bip)、苯丙氨酸或[β] _萘基丙氨酸，
-Xaak 代表 Thr 或 Ala， -Xaa1 代表 Gly、Val 或 Leu,且 -Xaa1 代表_順2或-OH， P1、P2和P3中的氨基酸残基是天然或非天然的，相同或不同的，P1、P2和P3中的所述残基都与Lys残基不同，且Pl、P2和P3具有共同或非共同的序列，且?所述有机分子包括: -阴离子多肽，其由5至21个天然或非天然的、相同或不同的氨基酸残基组成，其中至少3个氨基酸带负电荷， -分子基团A-Z，其中: 〇 A 包括选自如下的式-CO (CH2)3NH-CO (CH2) 2_、- CO (CH2)p-NH-CO-(CH上-、-CO (CH2-CH2) - (O-CH2-CH2) p-NH_C0- (CH2) q-, - CO (CH2) p-NH_C0- (CH2-CH2-O) q- (CH2-CH2) _和_CO(CH2-CH2) - (O-CH2-CH2) P-NH-CO-(CH2-CH2-O)q-(CH2-CH2)-,其中 p 代表包括在 I 和 10 之间的整数，q代表包括在I和10之间的整数，其中第一个羰基偶联至N-端丝氨酸的a NH2,有利地A代表式-CO (CH2) 3NH-C0 (CH2) 2-的基团，以及O Z表示卤原子、巯基或马来酰亚胺基， 所述阴离子多肽通过式A-Z的所述分子基团被连接至接头，以及所述接头在其末端之一共价结合至所述衍生自CD4受体的肽的通用序列(I)中存在的氨基酸残基Lys的游离氨基(-NH2),并且所述接头在其另一末端共价结合至所述有机分子的Z基团。
2.根据权利要求1所述的共轭分子，其中所述通用序列⑴的衍生自CD4受体的肽的序列选自序列SEQ ID N0.1或SEQ ID N0.2。
3.根据权利要求1或2所述的共轭分子，其中所述接头选自:
CO- (CH2O) 2CH2NHC0 (CH2) 2 吡咯烷基-2，5- 二酮
4.根据权利要求1-3任一项所述的共轭分子，其中阴离子多肽的带负电荷的氨基酸选自天冬氨酸、酪氨酸、磺基酪氨酸、酪氨酸磺酸酯、氨基辛二酸、对-羧甲基苯丙氨酸和谷氨酸， 〇其中所述磺基酪氨酸具有式:
5.根据权利要求1-4任一项所述的共轭分子，其中所述阴离子多肽由13个氨基酸组成。
6.根据权利要求1-5任一项所述的共轭分子，其中所述阴离子多肽由相同的氨基酸组成。
7.根据权利要求6所述的共轭分子，其中所述相同的氨基酸是谷氨酸(E)。
8.根据权利要求1-5任一项所述的共轭分子，其中所述阴离子多肽由至少两个不同的氨基酸组成。
9.根据权利要求8所述的共轭分子，其中所述阴离子多肽至少包括天冬氨酸(D)和丝氨酸(S)。
10.根据权利要求8和9所述的共轭分子，其中所述阴离子多肽具有序列S-(X-D-X-S)n，比如 S-X-D-X-S-X-D-X-S-X-D-X-S (SEQ ID NO: 19)，其中 η 代表包括在 I 和 5 之间的整数，S代表丝氨酸和D代表天冬氨酸，以及其中X选自:酪氨酸、磺基酪氨酸、酪氨酸磺酸酯、氨基辛二酸和对-羧甲基苯丙氨酸，以及优选磺基酪氨酸。
11.根据权利要求10所述的共轭分子，其中所述阴离子多肽具有选自如下的序列:S- (Y-D-Y-S) n、S- (YSo3_D-Ys03_S) n、S- (Ysn-D-Ysn-S) n、S- (pF-D-pF-S) n 和 S- (Asu-D-Asu-S) n,其中n代表包括在I和5之间的整数，S代表丝氨酸和D代表天冬氨酸，Y代表酪氨酸，Ys03代表磺基酪氨酸，Ysn代表酪氨酸磺酸酯，PF代表对-羧甲基苯丙氨酸以及Asu代表氨基辛二酸。
12.根据权利要求11所述的共轭分子，其中所述阴离子多肽具有选自如下的序列:S-Y-D-Y-S-Y-D-Y-S-Y-D-Y-S(SEQ ID NO:8),S-Ys03-D-Ys03-S-Ys03-D-Ys03-S-Ys03-D-Ys03-S(SEQ ID NO:4)、S-Ysn-D-Ysn-S-Ysn-D-Ysn-S-Ysn-D-Ysn-S (SEQ ID NO: 5)、S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S-pF-D-pF-S(SEQ ID NO:6)、S-Asu-D-Asu-S-Asu-D-Asu-F-Asu-F-D-Asu-S(SEQ ID NO:7)、S-Ys03-D-Ys03-S-Ys03-D-Y-S-Y-D-Y-S (SEQ ID NO:20)和 S-Y-D-Y-S-Y-D-Ys03-S-Ys03-D-Ys03-S(SEQ ID NO: 21)，其中S代表丝氨酸，D代表天冬氨酸，Y代表酪氨酸，Ysra代表磺基酪氨酸，Ysn代表酪氨酸磺酸酯，PF代表对-羧甲基苯丙氨酸以及Asu代表氨基辛二酸。
13.根据权利要求1-12任一项所述的共轭分子，其中: -衍生自CD4受体的肽选自序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2， -接头是 CO- (CH2O) 2CH2NHC0 (CH2) 2-吡咯烷基-2，5- 二酮， -有机分子包括具有如下序列的阴离子多肽:如权利要求12中所定义的S-Ym3-d-yS03-s-yS03-d-yS03-s-yS03-d-yS03-s,其通过式A-Z的分子基团连接至接头，其中A是-NHCO (CH2) 3NH-C0 (CH2) 2_ 以及 Z 是巯基。
14.根据权利要求1-13任一项所述的共轭分子，其用作药物。
15.根据权利要求1-13任一项所述的共轭分子，其用于艾滋病的治疗。
16.药物组合物，其含有根据权利要求1-13任一项所述的共轭分子以及药学上可接受的载体。
17.制备根据权利要求1-13任一项所述的共轭分子的方法，其特征在于所述方法包括下列步骤: a.用带有两个活性基团的双官能化合物接触如权利要求1所定义的通用序列(I)的衍生自CD4受体的肽，从而两个活性基团中的一个与存在于通用序列(I)中的氨基酸Lys残基的游离氨基(-NH2)形成共价键，以获得带有双官能团的第二活性基团的活化肽，以及 b.用如权利要求 1所定义的带有官能团的有机分子，或用相当于如权利要求1所定义的带有巯基的有机分子的有机分子，接触步骤(a)中获得的活化肽，其中巯基(SH)已被保护性巯基保护，从而所述活化肽的活性基团与有机分子的受保护或不受保护的官能团形成共价键，以获得所述共轭分子。
【文档编号】C07K14/705GK103429269SQ201280013736
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2012年3月16日 优先权日:2011年3月18日
【发明者】F·巴勒斯克, H·洛尔塔雅各布, D·博纳夫 申请人:巴斯德研究所, 国家科学研究中心, 巴黎第十一大学