专利名称：抑制免疫应答或治疗增生性疾病的方法
技术领域：
本文公开了用于治疗增生性疾病和用于抑制免疫系统应答的方法和药用组合物，它们涉及对主体给药某些4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物。
背景技术：
磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)将磷酯酰肌醇(phosphinositide)的3-羟基磷酸化。这些酶产生第二信使(例如，PIP3)并且起到酪氨酸激酶受体和G蛋白偶联受体下游的转导物的作用。PI3K参予许多基本过程，包括细胞程序死亡、增殖、细胞运动性和粘着。(参见Walker等人，Molec.Cell，6909-919,2000)。因此，已经开发了几种PI3K抑制剂。
雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶标为289kDa的丝氨酸苏氨酸激酶，其亦称FKBP-12靶-1(RAFT-1)和FKBP-12雷帕霉素相关蛋白。有几个mTOR的保守结构域，包括丝氨酸-苏氨酸激酶域。T细胞模型表明，IL-2和其它因子促进mTOR活化并且随后通过诱导新的蛋白质合成促进细胞生长。已知mTOR促进P70S6激酶的活化，活化又催化S6的磷酸化，S6为用于活化多核糖体以驱动蛋白质合成和mRNA翻译所需的40S核糖体蛋白。另外，mTOR活化真核起始因子4E。因此，mTOR在调节蛋白质合成和细胞周期中起作用。认为mTOR通过感知细胞状态和通过G1-S期调节细胞进程而起到关卡的作用。mTOR上游和下游的多种已知的效应器途径用于调节mTOR活性。因此，通过结合于mTOR而使mTOR失活的化合物可用于调节细胞周期功能并从而调节细胞生长。随着mTOR特异性地在淋巴细胞中起作用，mTOR的抑制还可用于改变T细胞和B细胞中的信号(参见Kirken和Want，Transplantation Proc.，35227S-23OS，2003)。
已知的mTOR抑制剂包括LY294002(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮)和雷帕霉素(rapamycin)。雷帕霉素用于免疫抑制、化疗方案中，和用于血管成形术后冠脉再狭窄的预防。LY294002阻断蛋白激酶B的PI3K-依赖性磷酸化作用。雷帕霉素具有显著的副作用，包括高胆甾醇血、药物诱导性肺炎、肾毒性、高血压、和增加易患病体质的机会感染。
不希望有的细胞增殖是许多疾病治疗方法的构成部分。例如，不希望有的细胞生长可以引起良性肿瘤或恶性肿瘤的形成。根据theAmerican Cancer Society(美国癌症学会)，癌症为一组以异常细胞的非受控生长和散布为特征的疾病。如果散布未受到控制，其可引起死亡。虽然癌症经常被称为单一的一种病况，其实际上包括超过100种不同的疾病。这些疾病的特征在于异常细胞的非受控生长和散布。癌症可以在许多部位产生并且根据其起源器官的不同而有不同表现。还在继续寻找可用于治疗不同类型的癌症的药物。
不希望有的细胞生长还是再狭窄、狭窄的再发生或矫正术后动脉狭窄的构成部分。再狭窄在冠脉旁路术(CAB)、动脉内膜切除术、心脏移植之后，特别是在血管成形术、斑块切除术(atherectomy)、激光切除术或施加支架之后发生。再狭窄是由管腔开口操作过程中对血管壁造成损害所致。在一些患者中，这种损害引发在被血管成形术损伤区域中的以称作“增生”的平滑肌细胞增殖为特征的修复反应。这种平滑肌细胞增生在几周到几个月内使由血管成形术打开的管腔再狭窄，从而需要重复血管成形术或其它操作以缓解再狭窄。
在免疫应答中，T细胞和/或B细胞响应被免疫系统看作是“外源性物质”的刺激物而增殖。虽然免疫应答通常是有益的，但是存在其中期望减少免疫应答的情况。例如，在自身免疫疾病中，免疫系统的细胞错误地将自身组成部分识别为外源性的，并且响应自身组成部分进行增殖。炎症应答可以是有害的，因为其可以免疫应答对抗移植器官。
显而易见，需要开发可以减少不希望的细胞增殖的药物。这些药物包括诱导免疫抑制、化疗剂，和再狭窄治疗剂。
发明内容
本文公开了用于抑制主体中的免疫应答和用于治疗主体中的增生性疾病的方法。这些方法包括对主体给药治疗有效量的以下结构表示的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物，或其可药用盐， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、卤素、羟基、或氨基。
本文另外公开了选择免疫抑制剂或抗增生剂的方法。该方法包括选择试验剂，与抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-依赖性的底物磷酸化相比，所述试验剂优先抑制酪蛋白激酶2和/或P70S6激酶的磷酸化。
本发明另外公开了药用组合物，其包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可药用盐、和可药用载体。
图1A为LY294002和LY303511的化学结构。LY294002中的吗啉基中的氧在LY303511中被胺代替。图1B为数字图像，表示其中将A549细胞在有或没有100μm LY303511、200ng/ml的雷帕霉素、或200nM渥曼青霉素的存在下的培养结果(或如图1C中表示的数字图像和图1D中所示的柱状图和数字图像)。
将细胞与O-100μm的LY303511反应1小时，然后加入L/I，持续30分钟并且制备细胞溶胞产物。通过SDS-PAGE分离蛋白质样品(70μg)并且将其转移到硝化纤维素膜上，随后通过蛋白质印迹进行磷酸-p70S6激酶T389(pS6K)、磷酸-Akt S473(pAkt)、总p70 S6激酶(S6K)、总Akt(Akt)、磷酸-mTOR S2481(pmTOR)、或总mTOR(mTOR)的免疫检测。蛋白质标准(kDa)位于右侧。对于图1D中所示的柱状图和数字图像，还图解表示了谱带密度测量。将pmTOR的积分谱带密度对于总mTOR的积分谱带密度对归一化。将用抑制剂处理的细胞的归一化谱带密度表达为相对于用DMSO＝1处理的细胞的归一化谱带密度(pmTOR/DMSO)。数据为得自五个实验的平均值(±SEM)。*p＜0.05通过Student t检验。所有的板条表示得自相同实验的数据并且表示四个单独的实验。
图2A为表示LY303511阻断A549细胞中的细胞增殖、DNA合成、和细胞周期进展的柱状图。A.使A549细胞(每35-mm皿为80,000个细胞)在具有FBS的培养基中生长1天，随后加入0.1％DMSO、100μMLY303511、雷帕霉素200ng/ml、200nM渥曼青霉素、或100μMLY294002，维持24小时。然后将细胞与胰蛋白酶培养，收集并计数。数据为得自三次重复实验的细胞/孔×10-4±SEM的平均值。*p＜0.05通过Student t-检验。图2B为使96孔板中的A549细胞(每孔4,000)在具有FBS的培养基中生长24小时，然后加入10mM BrDU+0-200μmLY303511，有或者没有雷帕霉素200ng/ml、或有单独的雷帕霉素(0-200ng/ml)时得到的结果的线形图。根据生产商的说明书(BrDU检测试剂盒，Roche)的原地ELISA测量BrDU结合(在490/465的吸光度)。对于每个试验，用抑制剂培养的细胞中的BrDU表示为用0.2％DMSO对照处理的细胞中的BrDU的百分数(％对照)。在各个实验中相对于对照＝100％的平均吸光度测量值为0.9±0.3、0.8±0.3、和0.8±0.3。数据为得自三次重复实验的BrDU含量±SEM的平均值。*p＜0.05通过Student t-检验。图2C为柱状图，表示LY303511通过组合的G1和G2/M抑制而抑制细胞周期。A549细胞在具有FBS的培养基中生长48小时，然后加入没有或有雷帕霉素200ng/ml的0-100μM的LY303511，维持24小时。然后收获细胞并将其与碘化丙啶培养2小时，然后使用Becton-Dickson FACSCalibur计数。数据为处于细胞周期的G1、S、或G2/M期的细胞百分数的平均值±SEM。通过Student t检验，相对于DMSO对照的*p＜0.05，相对于10μM LY303511的p＝0.056。
图3A-3B为柱状图和数字图像，表示LY303511对细胞周期抑制剂和细胞周期蛋白的水平的作用。使A549细胞(每100-mm皿～1×106细胞)生长48小时，然后加入0.1％DMSO、100μM LY303511、或雷帕霉素200ng/ml，维持0、12、或24小时。在所示的时间，将细胞匀质化并储存在-80℃。对于蛋白质印迹分析，将通过SDS-PAGE分离的溶胞产物蛋白质样品(70μg)转移到硝化纤维素膜上并与以下抗体反应A.磷酸-S6K T389(pS6K)、p27Kipl、p21Cipl、磷酸-Rb S807/S811、或B.细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D、和细胞周期蛋白E。所有的印迹得自于一个实验。下面的数据(相对密度)为，在三个实验中，相对于DMSO对照＝1.0，得自用抑制剂处理24小时的一式两份的皿的密度测量值的平均值。通过Student t-检验，相对于DMSO对照的*p＜0.05。
图4A-4D为柱状图和数字图像，表示LY303511抑制血清刺激的S6K和Akt的磷酸化(图4A和4B)，以及PASM细胞的增殖(图4C和4D)。在无血清培养液中培养24小时之后，将PASM细胞与没有或有100μM LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或200nM渥曼青霉素(图4A)、或0-100μM LY303511(图4B)培养1小时，然后加入10％FBS，维持30分钟并制备细胞溶胞产物。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质(20μg/凝胶体)并将其转移到硝化纤维素膜上，然后通过蛋白质印迹免疫检测磷酸-p70 S6激酶T389(pS6K)或磷酸-Akt S473(pAkt)。数据得自于五个实验中有代表性的一个实验。
使PASM细胞(每孔4,000个)在90-孔板中生长24小时，然后在有(图4C)或没有(图4D)10％FBS的培养基中培养24小时。然后将细胞在没有或有雷帕霉素200或400ng/ml的包含10％FBS、10μM BrDU、和0-100μM LY303511的新鲜培养基中培养24小时。根据生产商的说明书(BrDU检测试剂盒，Roche)通过原地ELISA测量BrDU结合。对于每个试验，用抑制剂培养的细胞中的BrDU含量表示为相对于用0.1％DMSO对照培养的细胞中的BrDU含量的百分数(％对照)。使用得自不同供体的细胞的每个实验的平均对照(＝100％)吸光度分别为图4C和图4D的0.22±0.06和0.24±0.06(＝100％)。数据为得自一式六份试验中3个实验的BrDU的平均值±SEM。通过Student t检验，相对于DMSO对照的*p＜0.05，或相对于10μM LY303511的p＜0.05。
图5A-5B为柱状图，表示LY303511通过引起组合的G1和G2/M抑制而抑制细胞周期，并且LY303511抑制CK2活性。对于图5A中所示的数据，PASM细胞在具有FBS的培养基中培养48小时，然后加入没有或有雷帕霉素400ng/ml的O-100μM的LY303511，维持24小时。然后收获细胞并将其与碘化丙啶培养2小时，然后使用Becton-DicksonFACSCalibur计数。数据为一式两份试验的三个实验中细胞周期的G1、S、或G2/M期中细胞百分数的平均值(±SEM)。通过Student t检验，相对于DMSO对照的*p＜0.05，相对于10μM LY303511的p＜0.05。图5B为柱状图，表示LY303511或LY294002体外抑制CK2。根据生产商的指导(Upstate Biotechnologies)，将0或100ng的重组CK2与具有1％DMSO或所示抑制剂的CK2底物肽和32P-γ-ATP培养10分钟。数据是具有抑制剂的样品的值(以相对于对照的百分数表示)的平均值，对照为(平均±SEM)0.2±0.03pmol磷酸酯/100ng蛋白质/10分钟。数据得自于一式两份进行的三个实验。以DMSO作对照进行Student t检验时，*p＜0.05。
图6A-6B为柱状图，表示LY303511抑制裸鼠中前列腺腺癌细胞(PC-3)的生长。将LY303511以10mg/kg/d腹膜内给药，以减弱裸鼠中PC-3肿瘤生长。生长抑制程度与用LY303511治疗的持续时间成正比。LY303511(LY3)的20天疗程与10天疗程在抑制肿瘤生长方面同样有效。图6C表示Kaplan-Mieir存活分析图。该分析包括当肿瘤达到300mm3时发生事件的假定。Y轴描述肿瘤尺寸小于300mm3的概率。应该指出的是，第4组具有早期事件，其很可能表示异常值(例如，动物没有接受完全剂量的药物)。
图7A-F为柱状图，表示LY303511抑制初生小鼠腹膜巨噬细胞或A549细胞中脂多糖(LPS)诱导的细胞因子生成或STAT1活性。使用得自Jackson(Jac)和Taconic(Tac)的野生型小鼠。在用巯基乙醇酸酯注射三天之后收获腹膜巨噬细胞。将细胞在2％FCS RPMI中培养三天。在用有或者没有LY 303511(1～100μm)的LPS 1μg/ml或DMSO刺激24小时之后收集上清液。测量细胞上清液中的细胞因子(白细胞介素(IL)-12p70、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、MCP-1、IL-10、IL-6)。结果显示，LY303511引起所有六种细胞因子的剂量依赖性降低(参见图7A-F)。加入100μM的LY303511引起类似于背景水平的细胞因子分泌。因此，显而易见，LY303511可以减少细胞因子表达，并且具有抗炎作用。
图8A-B为一组柱状图，其表示LY303511对由LPS/IFN-γ诱导的STAT1舌性的抑制。将A549细胞用表达由STAT1(GAS-luc，Clontech)驱动的荧光虫荧光素酶的报道基因载体瞬时转染，并且在没有或有100μM的LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或两者的情况下培养1小时，然后加入LPS/IFN-γ，维持6小时。在细胞溶胞产物(RLU)中测量STAT1活性(荧光素酶活性)。给出的数据为一式三份样品±SEM，并且代表两个独立的实验。如图4A和4B所示，LY303511通过两种炎症递质LPS/IFN-γ抑制STAT1活化。
几个实施例的详细说明为了便于理解，以下更具体地描述用于本文中的以下术语化学术语“烷基”是指只包含碳和氢的环状的、支链的、或直链的烷基，并且除非另作说明，其通常包含一到十二个碳原子。这个术语另外由以下基团举例说明甲基、乙基、正丙基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊酰、庚基、金刚烷基、和环戊基。烷基可为未取代的或被一种或多种如下所述的取代基取代。
“取代的烷基”是指其中上述烷基中的一个或多个氢或碳原子被另一个基团如卤素、芳基、取代的芳基、环烷基、取代的环烷基、及其组合代替的烷基。示例性的取代的烷基包括苄基、三氯甲基等。
“杂烷基”是指其中上述烷基中的一个或多个氢或碳原子被杂原子如N、O、P、B或S代替的烷基。被杂环烷基、取代的杂环烷基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基或氨基取代的烷基也被包括在“杂烷基”内。示例性的杂烷基包括氰基、苯甲酰基、2-吡啶基、2-呋喃基等。
“环烷基”是指具有单环或多稠环的饱和或不饱和的非芳香环状烃基。示例性的环烷基包括环戊基、环己基、双环辛基等。
“取代的环烷基”是指其中上述环烷基中的一个或多个氢或碳原子被另一个基团如卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、芳氧基、氨基、及其组合代替的环烷基。
“杂环烷基”是指其中上述环状基团中的一个或多个碳原子被杂原子如N、O、P、B或S代替的环烷基。示例性的杂环烷基包括例如哌嗪基、吗啉基、四氢吡喃基、四氢呋喃基、哌啶基、吡咯烷基、唑啉基等。
“取代的杂环烷基”是指其中上述杂环烷基中的一个或多个氢或碳原子被另一个基团如卤素、芳基、取代的芳基、烷氧基、芳氧基、氨基、及其组合代替的杂环烷基。
“芳基”是指芳香族取代基，其可为单一芳香环或稠和在一起、共价连接的或连接于共用基团如亚甲基或乙烯部分的多芳香环。共用连接基团也可为羰基，如在二苯酮中；或为氧，如在二苯醚中；或为氮，如在二苯胺中。芳香环可包括苯基、萘基、联苯基、二苯醚、二苯胺和二苯酮，以及其它。在具体的例子中，芳基具有1到20个碳原子。
“取代的芳基”是指其中上述芳基中的一个或多个氢或碳原子被一个或多个官能团如烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、卤素、烷基卤代、羟基、氨基、烷氧基、和硫基代替的芳基。示例性的取代的芳基包括氯代苯基、3，5-二甲基苯基、2，6-二异丙基苯基等。
“杂芳基”是指其中芳香环中的一个或多个碳原子被杂原子如N、O、P、B或S代替的芳香环。杂芳基是指可为单一芳香环、多芳香环、或结合于一个或多个非芳香环的一个或多个芳香环。示例性的杂芳基包括例如噻吩、吡啶、异唑、phthalidimide、吡唑、吲哚、呋喃等。
“取代的杂芳基”是指其中上述杂芳基中的一个或多个氢或碳原子被一个或多个官能团如烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、卤素、烷基卤代、羟基、氨基、烷氧基、和硫基代替的杂芳基。
“烷氧基”是指-OZ基团，其中Z选自烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、及其组合。示例性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、苄氧基、和叔丁氧基。相关的术语为其中Z选自芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、及其组合的“芳氧基”。示例性的烷氧基包括苯氧基、取代的苯氧基、2-吡啶氧基、8-喹啉氧基等。
“氨基”是指基团-NZ1Z2，其中Z1和Z2各自独立地选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、及其组合。
“硫基”是指基团-SZ1Z2，其中Z1和Z2各自独立地选自氢、烷基、取代的烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、芳氧基、及其组合。
“卤素”是指氟、溴、氯、或碘取代基。
本发明公开的化合物的“可药用盐”包括从阳离子如钠、钾、铝、钙、锂、镁、锌形成的那些盐；和从碱如氨、乙二胺、N-甲基-谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N，N′-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、二乙醇胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟甲基)甲胺、和氢氧化四甲铵形成的那些盐。这些盐可通过标准方法制备，例如通过将游离酸与适当的有机碱或无机碱反应。本说明书中叙述的任何化合物都可以作为其可药用盐给药。“可药用盐”还包括游离酸、碱、两性离子的形式。对于适当的可药用盐的说明可以在Handbook ofPharmaceutical Salts，Properties，Selection and Use，Wiley VCH(2002)中找到。
“药剂”或“药物”是指能够在适当地对主体给药时诱导所需的治疗或预防效果的化合物或组合物。
其它术语“AKT”是指已经表现出响应生长因子、细胞因子、和致癌Ras调节细胞存活信号的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AKT经由磷酸肌醇-3-OH激酶(PI3K)途径被活化并且通过其它上游激酶活化。AKT通过直接使细胞程序死亡中涉及的蛋白质(包括Bad、procaspase 9、和叉头(forkhead)转录因子家族的成员)磷酸化和失活而抑制细胞死亡途径。AKT又称蛋白激酶B(PKB，GenBank登录号Nu 005154)。
“动物”为有生命的多细胞脊椎动物生物体，其包括例如哺乳动物和鸟类。“哺乳动物”包括人类和非人类哺乳动物。“主体”包括人类和动物主体。
“抗增生剂”是指减少增殖、或引起细胞死亡的药物。抗增生剂包括化疗剂。
“动脉粥样硬化”是指血管随时间而发生的进行性狭窄和硬化。动脉粥样硬化是在大动脉和中等尺寸动脉的内膜和内部介质中形成的包含胆固醇、类脂物质、和噬脂细胞的微黄色斑块(粉瘤)的动脉硬化的常见形式。
“自身免疫性疾病”为其中免疫系统产生对抗作为正常寄主的一部分的抗原(即，自身抗原)的免疫应答(如，B细胞或T细胞应答)并随后损害组织的疾病。自身抗原可来自于寄主细胞，或者可来自于通常位于粘膜表面上的共生生物体如微生物(已知为共生生物体)。
影响哺乳动物的示例性的自身免疫疾病包括类风湿性关节炎、幼年寡关节炎(juvenile oligoarthritis)、胶原诱发性关节炎、佐剂诱发性关节炎、合格伦综合征、多发性硬化、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis)、炎症性肠病(如，克隆病、溃疡性结肠炎)、自身免疫性胃萎缩、寻常天疱疮、银屑病、白癜风、I型糖尿病、非肥胖性糖尿病、重症肌无力、格雷夫斯病、桥本氏甲状腺炎、硬化性胆管炎、硬化性涎腺炎、系统性红斑狼疮、自身免疫性血小板减少性紫癜、古德帕斯丘综合征、艾迪生病、系统性硬化、多肌炎、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血等。
“化学治疗”是指给药称为“化疗剂”的一种化合物或多种化合物的组合，以杀死或减慢迅速繁殖细胞的繁殖。化疗剂包括本领域技术人员已知的那些，包括但不限于5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、环磷酰胺、抗代谢物(如氟达拉滨)、抗肿瘤药(如依托泊苷、多柔比星、甲氨蝶呤、和长春新碱)、卡铂、顺铂和紫杉烷如紫杉醇。雷帕霉素也被用作化疗剂。
“移植物抗宿主病”是指其中供体骨髓移植物中的T细胞攻击和进攻宿主组织的骨髓移植物的并发症。移植物抗宿主病(GVHD)在其中血液骨髓供体与患者无关或当供体与患者相关但不完全匹配的情况中最常见。有两种GVHD形式早期形式被称为急性GVHD，其在移植不久以后在白细胞升高时出现；和晚期形式，被称为慢性GVHD。
急性GVHD通常在移植后的前三个月内出现并且可以影响到皮肤、肝、胃、和/或肠。早期征候通常为手、脚和脸上的看似晒伤一样散布的皮疹。急性GVHD伴有的严重问题可包括皮肤上的水疱、伴有腹部绞痛的水性或便血性腹泻、和反映肝脏受到牵连的黄疸(皮肤和眼睛变黄)。
慢性GVHD通常在移植后的2-3个月出现并且引起类似于自身免疫疾病如狼疮和硬皮病的症状。患者发展出现干燥发痒的皮疹并且看似鳄鱼皮一样。还可发生毛发丧失、皮肤出汗减少、和毛发过早灰白。口干为常见症状。其可发展为食物性过敏，并且辛辣和酸性食物可引起刺痛。眼睛也可受到牵连而变得干燥和感觉受刺激并变红。几乎任何器官都可以受到慢性GVHD的影响。
“免疫应答”是指免疫系统的细胞如B细胞、T细胞、巨噬细胞或多形核细胞对刺激的响应。免疫应答可以包括宿主防御反应中所牵涉的身体的任何细胞，如分泌细胞因子的上皮细胞。细胞因子包括但不限于白细胞介素(如IL-12(参见Quesniaux，Research Immunology，143385-400，1992)、肿瘤坏死因子(TNF)-α(参见Aggarwal和Vilcek(eds)，“Tumor necrosis factorstructure，function，and mechanism of action”，Marcel Dekker Inc.1992)，干扰素(IFN)-y(参见Farrar和Schreiber，Ann.Rev.of Immunol.，11571-611，1993)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1(参见Yoshimura和Leonard，Cytokines，4131-52，1992)、IL-10(参见Zlotnik和Moore，Cytokines，3366-71，1991)、和IL-6(参见Van Snick，Ann.Rev.Immunol.，8253-78，1990)。需要指出的是，对细胞因子的描述包括它们的蛋白质序列、核酸序列和对它们功能性描述可在国际互联网上得到例如在COPECytokines Online Pathfinder Encyclopaedia网址上。免疫应答(例如先天性的、获得性的)包括但不限于对病毒感染或细菌感染的应答、先天性免疫应答、对自体抗原或炎症的应答。
“免疫抑制”是指细胞和/或体液免疫的非特异性的无反应性。免疫抑制是指当T和/或B细胞数目耗竭或其反应性、胀大或分化受到抑制时出现的免疫应答的阻止或减少。免疫抑制可起因于特异性或非特异性T细胞如Treg细胞的由响应辐射的细胞因子信号所活化、或由对T和B细胞具有通用免疫抑制作用的药物所活化。
“免疫抑制剂”是指可以减少免疫应答如炎性反应的分子如化合物、小分子、类固醇、核酸分子、或其它生物剂。免疫抑制剂包括但不限于关节炎治疗剂(抗关节炎剂)。免疫抑制剂的具体的非限制性例子为非甾体抗炎药、环孢素A、FK506和抗-CD4。在另外的例子中，免疫抑制剂为生物应答改变剂，如Kineret(阿那白滞素)、Enbrel(依那西普)、或Remicade(英利昔单抗)；缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)如Arava(来氟米特)；非甾体抗炎药(NSAID)；具体地为环氧化酶-2(COX-2)抑制剂，如Celebrex(塞来昔布)和Vioxx(罗非昔布)；或其它制品如Hyalgan(玻尿糖苷)和Synvisc(hylan G-F20)。雷帕霉素为免疫抑制剂的另一个例子。
“炎症”或“炎症过程”是指一系列的复杂事件，包括小动脉、毛细血管和小静脉扩张，伴随有渗透性和血流量增加、流体渗出，包括血浆蛋白质和白细胞移动到炎性病灶中。炎症可通过本领域中公知的多种方法测量，如白细胞数、多形核白细胞嗜中性粒细胞(PMN)数、PMN活化程度如腔内(luminal)增强的化学发光的测量、或细胞因子存在量的测量。
“抑制”或“治疗”疾病是指抑制例如处于某种疾病(如自身免疫性疾病、移植物抗宿主病、或移植组织或器官排斥)危险下的主体中疾病或状况的全面发展。“治疗”是指改善疾病的征候或症状或开始发展之后的病理学状况的治疗性干预。如本文中使用的，关关疾病或病理学状况的术语“改善”是指治疗的任何可观察到的有益效果。有益效果可以通过例如以下方面得以证实易感主体中疾病的临床症状的延迟发病、疾病的一些或所有临床症状的严重程度减轻、疾病的进展减慢、疾病的复发次数减少、主体的总体健康或良好状态的改善、或通过本领域中公知的针对具体疾病具有特异性的其它参数。
“激酶”是指催化磷酸基从一个分子转移到另一个分子的酶。“丝氨酸苏氨酸激酶”将磷酸基转移到多肽中的丝氨酸和/或苏氨酸的羟基。“P70 S6激酶”为将核糖体的40S亚单位(小亚基)的S6蛋白磷酸化的激酶。GenBank登录号JE0377表示人P70S6激酶的示例性氨基酸序列。“磷脂酰肌醇3-激酶”是指将肌醇脂质在肌醇环的D-3位磷酸化以产生3-磷酸肌醇、磷脂酰肌醇3-磷酸[PtdIns(3)P]、磷脂酰肌醇3，4-二磷酸[PtdIns(3，4)P2]和磷脂酰肌醇3，4，5-三[PtdIns(3，4，5)P3]的酶。GenBank登录号AAB53966表示人磷脂酰肌醇3-激酶的催化性亚单位的示例性氨基酸序列。“酪蛋白激酶2”(genbank登录号NP 001887)是指优先磷酸化酸性蛋白质如酪蛋白的酶。GenBank登录号NP001887表示酪蛋白激酶2的示例性氨基酸序列。酪蛋白激酶2底物的例子包括p53(GenBank登录号CAA25652)、BH3相互作用结构域死亡激动剂(Bid；选择性转录本的登录号为NP_001187.1、NP_932070.1、NP_932071.1)、DNA拓扑异构酶II(NP 001058)。激酶的“优先”抑制是指与抑制第二种激酶如PI3K的活性相比，更大程度地降低一种激酶如P70S6激酶的活性。
“白细胞”是指血液中的细胞，也称为“白血球”，其参予防护身体免受感染性生物体和外来物质的威胁。白细胞在骨髓中产生。有五种主要类型的白细胞，其再分成两个主要的组多形核白细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)和单核白细胞(单核细胞和淋巴细胞)。
“巨噬细胞”是指负责多种内环境稳定过程、免疫过程和炎症过程的无处不在的单核吞噬细胞群。它们的广泛的组织分布使得这些细胞非常适合于在白细胞侵入之前提供对抗外来物质的立即性防御。炎性巨噬细胞存在于多种渗出物中，并且可通过多种特异性的标识物表征，如过氧化物酶活性和细胞因子表达，并且得自共享类似性质的单核细胞。“活化的巨噬细胞”是指具有特异性地增加的功能活性的巨噬细胞。分化过程与巨嗜细胞“活化”不同，其为分化的巨噬细胞获得增加的执行特异性功能的能力的过程。通常，未活化的巨噬细胞为相对免疫静止的，具有低的耗氧量、低的主要组织相容性复合体(MHC)II类基因表达水平，并且有很少的或几乎没有细胞因子分泌。一旦被活化，巨噬细胞不能增殖并且具有高的耗氧量。另外，活化的巨噬细胞能够杀死寄生物质和/或细胞溶解肿瘤细胞，并且分泌细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6。
“雷帕霉素哺乳动物靶标标(mTOR)”是指与啤酒糖酵母(S.cerevisae)ToR1和ToR2蛋白质共有约45％同一性的约289kDa的多肽。人、大鼠、和小鼠的mTOR蛋白共有约95％的氨基酸同一性。mTOR蛋白质为丝氨酸-苏氨酸蛋白质激酶(参见Hunter等人，Cell，831-4，1995；Hoekstra，Curr.Opina.Genet.Dev.，7170-175，1997)。mTOR(参见GenBank登录号L30475)在苏氨酸389处磷酸化P70S6激酶并且使真核翻译起始因子的结合蛋白磷酸化和活化。
“瘤形成”是指细胞异常和非受控生长的过程。瘤形成的产物为瘤(肿瘤)，其为由过度细胞分裂导致的组织的异常生长。不发生转移的瘤称为“良性肿瘤”。侵犯周围组织和/或可以转移的瘤称为“恶性肿瘤”。肿瘤形成为增生性疾病的一个例子。
血液瘤的例子包括白血病，包括急性白血病(如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病、和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、成髓单细胞性白血病、单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病、和慢性淋巴细胞性自血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(无痛形式和高级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病、脊髓发育异常综合征、和脊髓发育不良。
实体瘤如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、恶性淋巴瘤、胰腺癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、皮肤基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管肺癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维耳姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、膀胱癌、和CNS癌(如神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、黑素瘤、成神经细胞瘤、和视网膜母细胞瘤)。
“非肠道”给药是指在肠外如不通过消化道的给药。通常，非肠道制剂为通过除摄取之外的任何可能的方式给药的那些。这个术语具体地是指注射，无论是以静脉内、鞘内、肌内、腹膜内、动脉内、或皮下给药；和各种表面施用形式，包括例如鼻内、皮内、和局部施用。
“磷酸化”是指生成有机分子(如蛋白质或脂质)的磷酸酯衍生物。在细胞中，这可以通过从三磷酸腺苷(ATP)转移磷酸基而实现。
“增生性疾病”包括肿瘤和再狭窄。
“再狭窄”是指心脏瓣膜矫正术后狭窄的再发生、或除去或减少先前狭窄后的血管结构(如冠状动脉)的狭窄再发生。在多种例子中，再狭窄出现在放置支架之后或血管成形术之后。
“序列同一性”是指氨基酸序列之间的相似性，并且以序列之间的相似性表示，也称为序列同一性。序列同一性通常以百分同一性(或相似性或同源性)测量得到；百分数越高，则两个序列越相似。在使用标准方法对比时，多肽的同系物或变体具有较高程度的序列同一性。
用于比较的序列对比方法为本领域中公知的。多种程序和对比算法在Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2482，1981；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443，1970；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988；Higgins和Sharp，Gene，73237，1988；Higgins和Sharp，CABIOS，5151，1989；Corpet等人，Nucleic AcidsResearch 1610881，1988；和Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，852444，1988中描述。Altschul等人，Nature Genet.，6119，1994提供了序列对比方法和同源性计算的详细讨论。
NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215403，1990)可得自多种来源，包括the National Centerfor Biotechnology Information(NCBI，Bethesda，MD)、和国际互联网上，用于连接序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx。关于如何使用这个程序测定序列同一性的描述可在国际互联网上的NCBI网址上得到。
多肽的“同系物”和“变体”是指使用NCBI Blast 2.0、gapped blastp设置为缺省参数，与多肽的氨基酸序列进行全长对比时计算的以具有至少75％，例如至少80％、或至少90％序列同一性为特征的多肽。对于大于约30个氨基酸的氨基酸序列的比较，采用Blast 2序列函数，使用设置为缺省参数的default BLOSUM62 matrix(gap existence cost为11，和per residue gap cost为1)。在对比短的肽(少于约30个氨基酸)时，使用Blast 2序列函数进行对比，采用设置为缺省参数的PAM30matrix(open gap为9，extension gap为1 penalties)。在通过这种方法评价时，具有与参考序列更大相似性的蛋白质表现出增加的百分同一性，如至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、或至少99％的序列同一性。当比较不足整个序列的序列同一性时，同系物和变体通常在10-20个氨基酸的短窗中具有至少80％序列同一性，并且可具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性，根据它们与参考序列的相似性而定。在这种短窗中测定序列同一性的方法可在国际互联网上的NCBI网址得到。本领域技术人员应该理解，提供的这些序列同一性范围只是指导性的；完全有可能得到提供超出所述范围的非常显著的同系物。
“移植”是指组织、细胞、或器官、或其一部分从一名主体到另一名主体、从一名主体到相同主体的另一个部分、或从一名主体到相同主体的相同部分的转移。供体和接受者可为相同的或不是为相同的基因型。“同种异体移植”或“异种移植”是指从一个个体到另一个个体的移植，其中个体在两个个体的序列中的一个或多个基因座上具有不同的基因。同种异体移植可以在遗传学不同的相同种类的两个个体之间发生、或在两个不同种类的个体之间发生。“自体移植”是指组织、细胞、或其一部分从相同个体的一个位置到另一个位置的移植，或组织或其一部分从一个个体到另一个个体的移植，其中两个个体为遗传学相同的。
提供以上术语描述只是用于帮助读者，不应将其解释为是小于本领域技术人员所理解的范围，或因此将其看作是对权利要求范围的限制。
单数术语“a”、“an”和“the”包括复数，除非上下文关系清楚地表明不是这样。类似地，单词“或”是指包括“和”，除非上下文清楚地指明不是这样。单词“包括”表示“包含”。另外，应该理解，对于化合物的所有的分子量或分子质量值为近似值，提供目的在于说明。虽然与本文中所述方法和材料相似或等价的那些可用于本公开的实践或试验，适当的方法和材料描述如下。另外，材料、方法、和实施例只是示例性的而不是限制性的。所有的化合物都包括(+)和(-)立体异构体(以及(+)或(-)立体异构体)、及其任何互变异构体。缩写“mc”表示“微”，因此，“mcM”表示微摩尔，“mcL”表示微升。
使用的化合物可用于本文公开的方法和组合物中的一类4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物的一个例子为2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物，其具有下式表示的代表性结构
式A其中R1和R2各自的存在为非必要的，并且R1和R2各个独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、卤素、羟基、氨基、或硫基。如果R1和/或R2存在，则在每个各自的环状结构上可能有一个或多个R1和/或R2取代基。
可用于本文公开的方法和组合物中的一类4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物的另一个例子为2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物，其具有下式表示的代表性结构 式B其中R1和R2各自的存在为非必要的，并且R1和R2各自独立地选自烷基、芳基、烷氧基、卤素、羟基或氨基。如果R1和/或R2存在，则在每个各自的环状结构上可能有一个或多个R1和/或R2取代基。
具体的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物的示例性例子为2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮，其具有下式表示的结构
式C2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮二盐酸盐可购自Sigma-Aldrich Corporationis，名称为“LY 303511”。本文中所述的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物可根据Vlahos等人，J.Biol.Chem.，2695241-5248，1994中所述的方法合成。2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮的其它盐的形式可容易地根据已知技术合成，如在Handbook of Phazmaceutical Salts，Properties，Selection and Use，WileyVCH(2002)中描述的那些。
本发明公开的方法包括对主体给药在药学相容性载体中的一种或多种本发明所述的一种或多种化合物、或一种或多种化合物与一种或多种其它药物的组合。给药以有效抑制增生性疾病如肿瘤或再狭窄形成、或有效提供免疫抑制的量进行。虽然可以在处于显著的这种疾病的危险下人口统计群体中的任何患者中进行预防性治疗，也可以使用更具体的标准选择主体，如病况的明确诊断。
在其中药物进行递送的介质可以包括药物的可药用组合物，使用本领域技术人员公知的方法。可将任何普通的载体如无菌盐水或葡萄糖溶液与本文公开的药物一起使用。给药途径包括但不限于口服和非肠道途径，如静脉内(iv)、腹膜内(ip)、直肠、局部、眼、鼻、和透皮。
药物可以现在已知的或以后开发的适当方式在任何常规的介质(参见以下)中给药，如口服或静脉内。例如，静脉内注射可通过盐水介质进行。介质也可包含常规的药用辅剂，诸如例如，可药用盐用于调节渗透压力，脂质载体如环糊精、蛋白质如血清白蛋白、亲水性试剂如甲基纤维素、洗涤剂、缓冲液、防腐剂、表面活性剂、抗氧化剂(如，抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)和维生素E)、螯合剂、粘度调节剂、口味剂(tonicifiers)、香料、着色剂、调味剂等。对于非肠道药用载体的更完全说明可以在RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy(第19版，1995)的第95章中找到。
其它药用组合物的例子可以使用本领域技术人员已知的常规的可药用载体、助剂和平衡离子制备。优选组合物为固体、半固体和液体剂型的单位剂量的形式，如片剂、丸剂、粉末剂、液体溶液或悬浮液。半固体制剂可为任何半固体制剂，包括例如凝胶剂、糊剂、霜剂、和膏剂。液体剂型可包括溶液、悬浮液、脂质体制剂、或在有机或含水介质中的乳剂。
抑制免疫应答或治疗增生性疾病的方法本文提供了抑制主体中的免疫应答的方法，其包括对主体给药治疗有效量的本文公开的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物或其可药用盐。在一个具体的非限制性例子中，免疫应答可包括细胞因子的分泌，所述细胞因子例如但不限于白细胞介素(IL)-12、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6。在另一个具体的非限制性例子中，免疫应答包括巨噬细胞活化。
可以将治疗有效量的本文公开的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物或其可药用盐与另外的免疫抑制剂联合给药。这种给药可以任何顺序同时或连续进行。免疫抑制剂包括但不限于环孢素A、FK506、或其类似物；或抗体如特异性地结合CD3(如OKT3)、CD4、或CD8的单克隆抗体。
在一个例子中，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物和免疫抑制剂可以在溶液中或在促进这些药物的递送和吸收的递送介质如脂质体中共同给药。
在一个实施方案中，本文公开的方法可用于治疗移植排斥。移植涉及组织或器官或其一部分从一个身体或身体的一部分到另一个身体或身体的一部分的转移。“同种异体移植”或“异种移植”为从供体到接受者主体的移植，其中供体和接受者具有在两个个体的序列中的一个或多个基因座上的不同基因。接受者可能产生对抗供体抗原(包括供体MHC)的免疫应答；因此免疫抑制疗法经常用于治疗移植接受者(如心、肺、或肾移植接受者)。本文公开了用于治疗移植排斥的新方法，该方法包括给药治疗有效量的本文公开的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物或其可药用盐。在一个实施方案中，治疗延长了供体组织的存活或改善了其功能。本文公开的方法还可以用于治疗移植物抗宿主病。
本文提供治疗增生性疾病的方法，该方法包括对主体给药治疗有效量的本文公开的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物。本文证明了2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物可用于抑制肿瘤细胞的增殖。因此，可对主体给药治疗有效量的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物以治疗瘤。肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤。肿瘤另外包括血液瘤和实体瘤。示例性的肿瘤为皮肤、神经系统、肺、乳房、生殖器官、胰腺、淋巴样细胞(包括白血病和淋巴瘤)、血液或淋巴管、和结肠的肿瘤。肿瘤包括癌、肉瘤、乳头状瘤、腺瘤、血癌、淋巴瘤、黑素瘤、和腺癌，以及其它。
可以将治疗有效量的本文公开的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物或其可药用盐与另外的化疗剂联合给药。这种给药可以任何顺序同时或连续进行。化疗剂包括但不限于化药、抗代谢物和抗体。示例性的化疗剂为多柔比星、紫杉醇、雷帕霉素和甲氨蝶呤。
本文另外证明了2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物可用于抑制平滑肌细胞的增殖。因此，可对主体给药治疗有效量的2-(4-哌嗪基)-取代的4H--1-苯并吡喃-4-酮化合物以治疗血管再狭窄。
本文公开的治疗用化合物可用于治疗再狭窄，通过在冠脉或外周动脉血管成形术或斑块切除术、冠脉架桥术移植体或支架手术、或外周血管手术(如，颈动脉或其它外周血管动脉内膜切除术、血管搭桥、支架或假体移植操作)之前、过程中和/或之后将本发明的化合物对患者给药。除了本说明书中在别处描述的给药技术之外，苯并吡喃-4-酮可通过腔内装置如血管支架或移植体递送。例如，可对支架或移植体涂布或结合苯并吡喃-4-酮化合物，用于在感兴趣的血管位置控制释放苯并吡喃-4-酮化合物。这种控制释放可包括在所需时段内持续地递送化合物。
对于在本文公开的治疗方法中的应用，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物(和任选的另外的药物)的给药可为系统或局部给药。2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物的局部给药通过本领域技术人员公知的方法进行。例如，对个体如患有关节炎的个体的膝、臀部、和/或肩给药的一个方法为通过关节内注射给药。为了对膝给药，例如，将要注射的关节用聚维酮碘溶液或其它防腐剂洗涤。将约1％盐酸利多卡因溶液注射到皮肤和皮下组织中。使用3通旋塞阀/针头组件，通过18-30号针头给药化合物。使用本领域技术人员公知的标准旁侧方法(lateral approach)将2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物局部注射到关节间隙中。随着将针头抽出，通过3通旋塞阀组件用1％盐酸利多卡因清洗净化针头和针管道。然后使膝移动通过弯曲-伸展弧，然后以完全伸展方式被固定。然后患者卧床约24小时，使移动最小化和活性剂从关节的渗漏最小化。
在其它实施方案中，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物的给药为系统给药。考虑了口服、静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内、和甚至直肠的给药。
使用的药理学组合物可以常规方式使用一种或多种药理学(如，生理学或药学)可接受的载体进行配制，包括可药用的赋形剂以及促进将活性化合物加工为制剂的非必要助剂。适当的制剂根据选择的给药途径而定。另外，本领域技术人员可以容易地选择适当的给药途径，包括但不限于静脉内、肌内、腹膜内、经粘膜、皮下、透皮、经鼻、吸入、和口服给药。
因此，对于注射剂，可将活性组分配制为水溶液，优选在生理学相容性缓冲液中。对于经粘膜给药，在制剂中使用适合于渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂通常为本领域技术人员所公知。对于口服给药，可将活性组分与适合包括在片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶剂、糖浆剂、淤浆剂、悬浮液等中的载体组合。2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物也可被配制为用于吸入疗法，例如治疗患有肺炎症的主体。对于通过吸入给药，使用适当的推进剂，可将存在于加压包装或雾化器中的活性组分方便地以气雾剂喷射的形式递送。
2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物可被配制为用于通过注射进行非肠道给药，如通过弹丸注射或连续输注。类似地，2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物可被配制为用于气管内给药或用于吸入。这种组合物可为如悬浮液、溶液、或在油性或水性介质中的乳剂形式，并且可以包含制剂用助剂如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。其它药理学赋形剂为本领域中所公知。
本发明所述化合物的治疗有效剂量可由本领域技术人员测定，目的是实现抗再狭窄、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤或抗免疫抑制所需的水平。化合物的相对毒性使得其可能以多种剂量范围进行给药。在一个例子中，化合物以单独的或分开的剂量进行口服给药。
对于任何特定主体的特定剂量水平和剂量频率可能不同，并且根据多种因素而定，所述的多种因素包括特定化合物的活性、所患疾病的活性程度、年龄、体重、一般健康状态、性别、膳食、给药方式和时间、排泄速率、药物组合、和经历治疗的主体的病况的严重程度。
筛选本文提供用于选择免疫抑制剂或抗增生剂的方法。该方法包括选择试验剂，与抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依赖性的底物磷酸化相比，该试验剂优先抑制MTOR-依赖性的P70S6激酶磷酸化，从而鉴定药学有用的免疫抑制剂或抗增生剂。在一个实施方案中，药物还抑制一种或多种另外的激酶。例如，药物可以抑制酪蛋白激酶2，酪蛋白激酶2为细胞增殖的调节剂。因此，该方法包括选择试验剂，与抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依赖性的底物磷酸化相比，该试验剂优先抑制mTOR-依赖性的P70S6激酶、酪蛋白激酶2、或两者的磷酸化，从而鉴定药学有用的免疫抑制剂或抗增生剂。该试验可以在细胞或细胞提取物中进行。
试验化合物可为感兴趣的任何化合物，包括化合物、小分子、多肽、或其它生物制剂(例如抗体或细胞因子)。在几个例子中，筛选一组可能的化疗剂、或一组可能的免疫抑制剂。在其它实施方案中，筛选一组多肽变体。
在使用细胞的试验中，使细胞接触试验化合物。在一些实施方案中，将细胞与试验化合物培养足够的时间，从而通过PI3K实现底物磷酸化和抑制细胞中P70S6激酶磷酸化。将细胞胞溶并测量磷酸化P70S6激酶的量和被PI3K磷酸化的底物的量。将存在于细胞中的磷酸化P70S6激酶的量和磷酸化底物的量与没有暴露于试验化合物下的相同细胞进行比较。
在一些实施方案中，将蛋白质印迹技术用于通过电泳分离的细胞蛋白质并且使用结合于P70S6激酶、磷酸化p70S6激酶的抗体，和/或特异性地结合底物(如磷酸化S6)的抗体。或者，可将细胞在包含放射性同位素标记的磷的正磷酸盐的存在下培养，并检测磷酸化或未磷酸化的底物(如P70S6激酶)。
在一些实施方案中，在体外在37℃下在5％CO2的湿润气氛中将细胞用试验化合物处理。在用试验化合物处理之后，细胞用不含Ca2+和Mg2+的PBS洗，并且如(Haldar等人，Cell Death Diff.，1109-115，1994；Haldar等人，Nature，342195-198，1989；Haldar等人，Cancer Res.，542095-2097，1994)中所述提取总蛋白质。在另外的实施方案中，使用一系列稀释的试验化合物。
在一些实施方案中，使用蛋白质印迹法和免疫检测分析磷酸化作用，所述蛋白质印迹法和免疫检测使用Amersham ECL进行，AmershamECL是增强的化学发光检测系统和公知方法。在一个例子中，在试验化合物的存在下使用1mCi/ml的[p32]正磷酸(NEN)在无磷酸盐的培养基(GIBCO)中进行淋巴样细胞磷酸化6小时。p32标记的细胞提取物的免疫沉淀反应可以如例如Haldar等人，Nature，342195-198，1998中所述进行。该免疫沉淀反应采用结合感兴趣的底物如P70S6激酶、酪蛋白激酶2底物(如p53、Bid、DNA拓扑异构酶II)、或PI3K底物(如磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇4-磷酸、磷脂酰肌醇4，5-磷酸)的抗体。将免疫复合物在0.75mm厚的10％SDS-PAGE上运行。随后，将凝胶干燥并暴露以进行自动射线照相。
如本领域中已知的方式进行磷酸-氨基酸分析。例如，分析可以基本上以Hunter薄层电泳系统，HTLE700，(CBS Scientific Company Inc.，USA)操作手册中所述方式进行。简而言之，将p32标记的免疫沉淀物在10％SDS-PAGE凝胶上运行。从凝胶中切取所感兴趣的免疫活性谱带并用50μM的碳酸氢铵洗脱。在洗脱之后，在15％-20％TCA+载体蛋白的存在下使蛋白质沉淀，并用乙醇洗。然后在过甲酸中将沉淀的蛋白质氧化，并冻干。将干燥的小球再次悬浮在恒沸的HCl中，在110℃加热，并冻干。将残余物再次悬浮在包含磷酸-氨基酸标准的pH为1.9的缓冲液(50mcl的甲酸、156mcl的乙酸、1794mcl的H2O)中，并点样在PEI纤维素板上。进行二维薄层色谱法，使用pH为1.9的缓冲液进行第一维色谱法，使用pH为3.5的缓冲液(100ml的乙酸、10ml的吡啶、1890ml的H2O)用于第二维色谱法。将板在65℃烘烤10分钟，并通过对冷却的板喷射0.25％茚三酮并将板送回到65℃烘箱中15分钟使标准显像。然后使板暴露于胶片下两到四周，使用Kodak X-omat AR胶片。
在一些实施方案中，使用细胞提取物作为起始原料分析磷酸化的调节。将试验化合物与细胞提取物合并，并检查化合物对P70S6激酶磷酸化和对磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-依赖性磷酸化的作用。在一个例子中，将细胞提取物接触试验化合物，以鉴定在32P-γ-ATP的存在下试验化合物对P70 S6激酶磷酸化的作用，或鉴定试验化合物对bcl-2磷酸化的作用。
在示例性的方案中，使用100μg的总细胞提取物与特定浓度的试验化合物在体外在37℃下处理细胞提取物。对于磷酸酶反应，将50μl的细胞溶胞产物接触试验化合物并将反应混合物在37℃培养30-60分钟。
对于细胞提取物的磷酸化，将100μg的细胞提取物如上所述进行处理，只是向各个反应中中加入40μci的[32P]ATP(3000Ci/mmol)。通过将试管浸渍在冰中使反应终止。通过使用交联剂二甲基庚二酸亚胺酯(dimethylpimelimidate)二盐酸化物(50mM)将纯抗体共价结合于蛋白质-A琼脂糖凝胶上，而将[32P]ATP标记的反应混合物吸收在由对抗P70S6激酶或PI3K底物的单克隆抗体制成的免疫亲和柱上。用包含0.5％去氧胆酸钠的0.05M二乙胺(pH 11.5)洗脱特异性结合的[32P]-标记蛋白质。
在示例性的方法中，使用Amersham ECL检测系统和本领域技术人员已知的方法进行蛋白质印迹法的免疫检测。可以如例如Haldar等人，Nature，342195-198，1989中所述进行p32标记的细胞提取物的免疫沉淀反应。将免疫复合物在0.75mm厚的10％SDS-PAGE上运行。随后，将凝胶干燥并暴露以进行自动射线照相，使用胶片如Kodak XAR胶片的胶片。
例如，磷酸-氨基酸分析可以基本上如Hunter薄层电泳系统，HTLE700，(CBS Scientific Company Inc.，USA)操作手册中所述方式进行。在示例性的方法中，将p32标记的免疫沉淀物在10％SDS-PAGE凝胶上运行。从凝胶上切取P70S6激酶免疫活性谱带并用50μM的碳酸氢铵洗脱。在洗脱之后，在15％-20％TCA+载体蛋白的存在下使蛋白质沉淀，并用乙醇洗。然后在过甲酸中将沉淀的蛋白质氧化，并冻干。将干燥的小球再次悬浮在恒沸的HCl中，在110℃加热并冻干。将残余物再次悬浮在包含磷酸-氨基酸标准的pH为1.9的缓冲液(50mcl的甲酸、156mcl的乙酸、1794mcl的H2O)中，并点样在PEI纤维素板上。进行二维薄层色谱法，使用pH为1.9的缓冲液进行第一维色谱法，使用pH为3.5的缓冲液(100ml的乙酸、10ml的吡啶、1890ml的H2O)用于第二维色谱法。将板在65℃烘烤10分钟，通过对冷却的板喷射0.25％茚三酮并将板送回到65℃的烘箱中15分钟而使标准显像。然后将板暴露于胶片下。
酪蛋白激酶2活性的一个特异性试验是购自UpstateBiotechnology(New York)的试剂盒。该试验基于在30℃培养10分钟的过程中由酪蛋白激酶2转移32P-ATP的γ-磷酸的特异性底物(CK-2底物肽)的磷酸化。然后使用P81磷酸纤维素纸将磷酸化的底物与残留的32P-ATP分离，并通过闪烁计数定量。
实施例雷帕霉素通过阻断P70S6激酶的mTOR-依赖性调节而抑制癌症和平滑肌细胞增殖。雷帕霉素由FDA批准用于治疗移植排斥(免疫抑制作用和抗炎)、癌症、和冠脉血管成形术后的血管再狭窄。然而，雷帕霉素的应用具有几个缺点和副作用，并且期望鉴定mTOR依赖性信号的其它药理学抑制剂。
与LY294002一样，LY303511抑制mTOR和酪蛋白激酶2。与LY294002不同，LY303511不能显著地抑制PI3K，PI3K为控制细胞死亡、胞质分裂、和葡萄糖/脂类代谢中重要的信号酶。渥曼青霉素对PI3K有选择性。本文公开的实施例使用LY303511作为示例性的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物。结果证明，LY303511可用于抑制免疫应答和用于抑制细胞(包括平滑肌细胞和肿瘤细胞)的增殖。LY303511有可能在不同于雷帕霉素结合中所牵涉的位置上选择性地抑制mTOR，而对PI3K的作用较小。LY303511可单独使用、或与雷帕霉素或其它药物组合，用于控制细胞增殖和免疫应答。
实施例1LY303511抑制细胞增殖这个实施例证明，LY303511阻断P70S6激酶磷酸化和人肺上皮腺癌(A549)细胞的细胞增殖。LY303511与LY294002的不同之处在于用胺代替吗啉基中的氧(图1A)。
将A549细胞在没有或有100mcM LY303511、200ng/ml雷帕霉素、或50nM渥曼青霉素的无血清培养基中处理1小时，然后加入大肠杆菌脂多糖(LPS)(1000mcg/ml)和干扰素(IFN)-γ(100U/ml)(LPS/IFN-y或“L/I”)。将细胞匀质化并通过蛋白质印迹检测所示的蛋白质(参见表1)。蛋白质印迹得自相同的实验，为三个实验的代表。
表1抗体的描述
结果证明，LY303511阻断P70S6激酶磷酸化(图1B)。渥曼青霉素和雷帕霉素也阻断磷酸化。结果证明，LY303511和雷帕霉素增加AKT的磷酸化(图1B)。渥曼青霉素阻断PI3K并且抑制pAKT磷酸化。因此，LY303511抑制S6的mTOR敏感性磷酸化，而不是AKT的(图1C)。这些结果表明，LY303511为mTOR抑制剂。结果还证明，LY303511以浓度依赖性方式抑制mTOR的自磷酸化(图1D)。与雷帕霉素不同，LY303511对S6K或mTOR的基础磷酸化有极小的作用(图1B、1D)。因此，LY303511在低至1μM的浓度下以独立于PI3K的方式抑制LPS/IFN-γ刺激的mTOR活化和S6K的mTOR-依赖性磷酸化。
在另一个实验中，将A549细胞以每孔4,000个细胞铺板在96孔板上并用没有或有所示药理学抑制剂的溴脱氧尿苷处理24小时。通过原地ELISA(BrdU检测试剂盒，Roche)测量溴脱氧尿苷(BrdU)吸收，作为DNA合成和细胞增殖的指示剂。
另外，使A549细胞(每孔80,000个细胞)生长24小时，然后加入抑制剂(图2A)。在24小时之后，使用血细胞计数器计数用锥虫蓝染色的细胞。在所有条件下细胞存活率＞99％(数据未表示)。在暴露于单独介质下的细胞中，在24小时内，细胞数增加～50％。雷帕霉素轻微地减弱细胞增殖，而LY303511具有显著的抑制作用，几乎等于LY294002的抑制作用。与LY303511和LY294002的独立于PI3K的作用一致，渥曼青霉素未显著减少A549细胞增殖。通过碘化丙啶染色细胞的流式细胞计分析测定，LY303511没有诱导细胞程序死亡或坏死。
根据溴脱氧尿苷(BrDu)吸收所确定的，LY303511以及LY303511与雷帕霉素的组合抑制A549细胞的增殖(图2B)。尽管雷帕霉素对DNA合成具有弱的但是统计学显著的作用，LY303511的给药引起浓度依赖性的减少(图2B)。当LY303511与雷帕霉素组合时，没有另外的作用。单独的DMSO对于A549细胞增殖没有作用。
在另一个实验中，使A549细胞在含血清的培养基中生长到亚汇合和并与培养基、100mcM的LY303511、或雷帕霉素200ng/ml培养0、12、或24小时。将细胞胞溶并通过SDS-PAGE分离蛋白质，然后转移到硝化纤维素膜上。将膜与对抗p27Kipl、p21 Cipl、或磷酸-P70S6激酶T389培养。
在处理之后的12和24小时，LY303511和雷帕霉素在T389阻断P70 S6激酶磷酸化，与mTOR激酶活性的抑制一致(图3A)。LY303511而不是雷帕霉素引起细胞周期停滞标识物p27Kipl、和p21 Cipl的积聚。p27 Kipl(p27)水平的LY303511依赖性增加表明类似于雷帕霉素的G1/S过渡抑制剂的作用(图3A)。然而，与雷帕霉素相比，LY303511引起S期晚期进展的抑制剂p21 Cipl(p21)的显著增加。LY303511而不是雷帕霉素降低细胞周期蛋白A和B的水平，它们也是S和G2/M期进展的调节剂(图3B)。LY303511还降低Rb磷酸化，这表明细胞周期抑制的机理部分是由于E2F-依赖性基因的抑制所致。这些结果支持了LY303511-敏感性激酶在除了在G1/S过渡中之外，还在S晚期和G2/M进展中的作用。
为了证实LY303511引起G1抑制，将A549细胞用0、10、或100mcM的LY303511处理24小时，固定，并与对抗KI-67的抗体培养。将载波片装在包含DAPI以染色细胞核的溶液中。使用相等的激光强度抓拍照片并放大。用LY303511而不是雷帕霉素的处理在全部细胞中引起KI-67水平的显著降低，其也与在细胞增殖中的阻断一致。
结果证明，LY303511在作为mTOR依赖性P70S6激酶活化的标识物的苏氨酸(T)389(T389)处抑制P70S6激酶的基础磷酸化和刺激磷酸化。另外，LY303511没有在473位丝氨酸(S)(S473)抑制AKT的PI3K依赖性磷酸化。与雷帕霉素相似，LY303511增加AKT磷酸化。另外，LY303511在作为mTOR激酶活性标识物的2481位丝氨酸(S2481)抑制mTOR的基础磷酸化和刺激磷酸化。LY303511还抑制A549细胞的增殖。该作用在使用雷帕霉素与10到100mcM剂量的LY303511时是相加的。因此，LY303511、或LY303511与雷帕霉素的组合可用于抑制腺癌细胞的生长。结果进一步证明诱导了细胞周期停滞。
实施例2LY303511抑制炎症过程的活化这个实施例证明，LY303511抑制A549细胞中的P70S6激酶磷酸化和STAT1响应LPS和IFN-γ的活化。
将A549细胞用表达由STAT1(GAS-1uc，Clontech)驱动的荧光虫荧光素酶的报道基因载体瞬时转染并在没有或有100mcM的LY303511、雷帕霉素200ng/ml、或两者的情况下培养1小时，然后加入LPS/IFN-γ，维持6小时。在细胞溶胞产物(RLU)中测量STAT1舌性(荧光素酶活性)。图8中的数据为一式三份样品±SEM，并且为两个独立实验的代表。LY303511通过两种炎症递质LPS/IFN-γ抑制STAT1舌化。
与转录因子STAT1的抑制一致，LY303511通过用LPS刺激的巨噬细胞降低由LPS诱导的细胞因子产生(参见实施例8)。
实施例3LY303511抑制平滑肌细胞中P70S6激酶磷酸化这个实施例证明，LY303511抑制初级人肺动脉平滑肌(HPASM)细胞中P70S6激酶磷酸化。
HPASM细胞购自Clonetics并且根据生产商的说明书传代。将细胞在100mm皿中铺板，并使其生长到接近汇合，然后血清饥饿24小时。向介质中加入抑制剂，在1小时之后加入10％FBS，维持30分钟。将细胞匀质化并通过蛋白质印迹检测所示的蛋白质。
LY303511抑制人肺动脉平滑肌(PASM)细胞中P70S6激酶的基础磷酸化和血清刺激的磷酸化(图4A和4B)。LY303511还抑制AKT的磷酸化，虽然比p70S6激酶的磷酸化程度更低(图4B)。LY303511还抑制在作为mTOR激酶活性的标识物的S2481处的血清刺激的mTOR磷酸化。
在与血清培养并且之后加入抑制剂的PASM细胞中，雷帕霉素对增殖有很小的作用，而LY303511以浓度依赖性方式抑制(图4C)。在没有或有LY303511的情况下，雷帕霉素对增殖(BrDu结合)的作用当将PASM细胞在无血清培养液中培养24小时然后加入FBS时得到增强(图4D)。在没有血清存在下，LY303511对PASM细胞增殖的作用得到增强，如同雷帕霉素一样。10μM LY303511和雷帕霉素200ng/ml对增殖的作用相对于单独的10μM LY303511是相加的(p＜0.05，图4C、D)。虽然Akt磷酸化作用被LY303511抑制(图4B)，渥曼青霉素没有抑制细胞增殖，表明LY303511的这种作用与PI3K无关。
雷帕霉素和LY303511在PASM中对细胞周期的作用不如在A549细胞中的显著(图5A)。与雷帕霉素或无血清的培养基培养引起G1抑制。相比之下，LY303511通过增加G1和G2/M期的分数而降低处于S期的细胞比例。雷帕霉素+LY303511对S期细胞减少的作用是相加的。然而，响应LY303511的G1平滑肌细胞的增加是微不足道的，表明LY303511在癌细胞中比在初级细胞中作用更大。
因此，LY303511、或LY303511与雷帕霉素的组合可用于抑制初级平滑肌细胞的生长。结果进一步表明LY303511可用于诱导这些细胞的细胞周期停滞。
实施例4LY303511通过引起组合的G1和G2抑制而抑制细胞周期为了研究LY303511对细胞周期的作用，使A549细胞或肺动脉平滑肌细胞在含血清的培养基中生长到亚汇合，并在没有或有雷帕霉素(200ng/ml)的情况下与介质、10、或100mcM LY303511培养24小时。然后收获细胞并用碘化丙啶染色，然后通过流式细胞计分析细胞周期。测定在每种试验条件下处于细胞周期的G1、S、或G2/M期的细胞比例。通过碘化丙啶染色的强度门控细胞，以测定处于细胞周期的G1、S、或G2/M期中的细胞比例。与对DNA合成的作用一致，100μM的LY303511显著地降低S期的细胞分数(图2C)。处于G2/M期中的细胞的比例保持不变，表明细胞在G1和G2/M都受到抑制。相比之下，雷帕霉素通过降低处于S和G2/M期中的细胞比例而增加G1群。10μMLY303511和雷帕霉素对减少S期细胞的作用相对于单独的10μMLY303511是相加的(P＝0.056，图2C)。通过向雷帕霉素中加入LY303511产生的S期细胞的更大减少而G2/M没有进一步的减少表明LY303511通过另外的不同于雷帕霉素的机制阻断细胞周期。
结果证明，LY303511在转化细胞和肺动脉平滑肌细胞中都引起细胞周期停滞。因为，与雷帕霉素不同，LY303511引起G2/M期中的细胞增加，该结果还暗示出，将有用于LY303511的另外的mTOR非依赖性细胞靶(如，酪蛋白激酶2)。
实施例5LY303511抑制酪蛋白激酶2(CK2)活性已经进行了微阵列基因表达分析，其中将A549细胞在没有或有LY294002、或渥曼青霉素的情况下培养1小时，然后加入L/I，维持6小时。通过细胞反馈机制，在该药物的存在下，被药理学药物直接抑制的mRNA编码蛋白质的水平可能增加。为了鉴定用于LY294002的另外的PI3K非依赖性激酶靶，通过过滤和统计学分析，从数据集鉴定被LY294002而不是被渥曼青霉素增加的mRNA。不出所料，在LY294002的存在下，mTOR mRNA的水平增加(1.7倍)，，而不是被渥曼青霉素增加。被LY294002增加的其它激酶的mRNAs包括编码CK2α′的那些(1.8倍；GenBank登录号55268)。因为CK2可以调节G1和G2/M细胞周期过渡，评价了LY294002和LY303511对CK2活性的作用。
使用酪蛋白激酶2活性试剂盒(Upstate Biotechnology，产品编号17-132)测量酪蛋白激酶2(CK2)活性(每分钟计数)，通过将在50mcl试验缓冲液中的重组100ng CK2、镁/ATP鸡尾酒(10mcCi32P-γ-ATP、0.675微摩尔的MgCl2、4.5nmoles的ATP)和10微摩尔的肽底物(氨基酸序列RRRDDDSDDD(SEQ ID NO1)在没有或有所示浓度的DMSO(1％)、LY294002、LY303511、或雷帕霉素存在下在30℃培养10分钟。用20mcl的40％三氯乙酸终止试验，并将25mcl点样在P81磷酸纤维素方格纸上，然后用0.75％磷酸洗涤3次，并且用丙酮洗涤一次。通过使用Packard 100Tri-Carb液体闪烁计数器在5ml闪烁流体中计数磷酸纤维素方格而检测底物肽上的32P结合。
重组CK2与LY303511或LY294002的培养引起浓度依赖性抑制CK2活性(图5B)。LY294002的近似IC50(10μM)为LY303511的十分之一。渥曼青霉素和雷帕霉素都不影响CK2活性。因为已知CK2调节完整细胞中的G1和G2进展，CK2代表了用于LY303511的另外的激酶靶。因此，LY303511以10到100mcM的IC50抑制酪蛋白激酶2。与抑制PI3K相比，LY303511优先抑制P70S6激酶和酪蛋白激酶2。
LY303511和LY294002在体内抑制CK2的能力提出了第二种mTOR非依赖性和PI3K非依赖性机制，这些抑制剂可通过这种机制阻断细胞增殖。这些结果确立了可用于治疗肿瘤疾病的新的一族化合物。
LY303511和LY294002阻断CK2活性的发现提出了用于这类药物的新的替代靶，并且与用于抑制细胞增殖和细胞周期调节的mTOR非依赖性机制一致。CK2为普遍存在的并且是细胞生存需要的高度保守性丝氨酸-苏氨酸激酶。通常，肿瘤细胞表现出高水平的CK2活性，CK2过量产生能够在缺乏p53的小鼠中诱导肿瘤发生。CK2通过直接磷酸化蛋白质如p53、只含BH3的促凋亡蛋白(BID)、β-连环蛋白、或Fas相关因子(FAF1)而保护细胞免于细胞程序死亡。另外，CK2通过G0/G1、G1/S、和G2/M关卡调节进展。LY303511诱导的细胞周期蛋白A和B水平降低、以及p21和p27水平增加(图3)与CK2依赖性的细胞周期阻断一致。LY303511对增殖和细胞周期的相加作用表明，除了抑制S6K的mTOR磷酸化之外，LY303511可以通过抑制不同于S6K的途径如CK2而克服对雷帕霉素的耐受性。
mTOR和PI3K属于蛋白质的磷脂酰肌醇3-和4-激酶家族(interpro家族PI3 PI4激酶，编号IPR000403，参见可得自国际互联网的InterPro数据库)。这个家族包括具有用于PI3K结构域的特异性特征序列的247个蛋白质。LY294002抑制PI3K和mTOR，而其它类似物(如LY303511)可以优先抑制这个家族中的亚型激酶。已知mTOR中PI3K催化域与PI3K之间的结构同源性，LY303511还可以抑制具有PI3K样结构域的其它激酶，这些包括以下
实施例6磷酸化抑制的IC50的测定在A549细胞中，通过pS6K荧光印记(phosphoblots)的光密度分析，LY303511介导的在受刺激细胞中S6K磷酸化抑制的IC50为约10mcM。当A549细胞接触药物时，LY303511不抑制Akt的磷酸化，即使在100mcM下。在肺动脉平滑肌细胞中，通过光密度测定法，LY303511介导的S6K磷酸化抑制的IC50为约1mcM。通过光密度测定法，LY303511介导的Akt磷酸化抑制的IC50为10到100mcM(参见图8A-D)。
实施例7LY303511单独、或LY303511与多柔比星的组合在体内模型系统中对前列腺癌的作用对雄性成年裸鼠喂养标准饮食并圈养在普通笼子中。每个试验组包括五只小鼠，总共100只小鼠。为每只小鼠皮下接种在包含20％matrigel的PBS中的1×106细胞PC-3(前列腺癌)细胞。在肿瘤达到～200mm3大小之后，每天给药介质(0.2％DMSO或盐水)或药物一次，持续5天，并且每2天测量肿瘤体积，持续33天，然后处死或通过二氧化碳吸入无痛处死小鼠。
如下为每个试验组分配五只小鼠
多柔比星或介质只在第一天给药。雷帕霉素或LY303511每天给药，如前所述在第1-5天腹膜内给药(参见Grunwald等人，Cancer Res 626141，2002)。给药方案在药物治疗开始之后的33天结束。在无痛处死或处死小鼠之后，切除肿瘤用于组织学分析、免疫组织化学、和蛋白质印迹法。
体内评价LY303511对肿瘤生长的作用。将人前列腺腺癌细胞(PC-3细胞，ATCC No.CTL-1435)体外培养，然后收获并植入。对于每只小鼠，通过皮下注射到侧腹中植入在MatrigelTM(基质)中的1×106细胞。将小鼠再分成六个组，每组十只。在肿瘤达到约150mm3时开始治疗方案(第1天)，在所示时间点测量肿瘤体积(＝卡尺长度×宽度2/2)，维持三十天。对于每个试验组和时间点，数据表示为平均肿瘤体积+/-SEM。数据表示在图6A和6B中。(在每个时间点进行组间比较，通过单向ANOVA，*p＜0.05)。图6C为Kaplan-meier分析，表示在任何给定时间点肿瘤体积小于300mm3的概率(组间比较，通过对数-秩检验，p＜0.001)。
为每个组指派以下处理
LY303511抑制裸鼠中前列腺腺癌细胞(PC-3)细胞的生长。腹膜内给药10mg/kg的LY303511用于减弱裸鼠中PC-3肿瘤生长。生长抑制程度与治疗持续时间成正比。LY303511(LY3)的20天疗程与十天疗程同样有效抑制肿瘤生长(参见图6C)。在21天之后，超过15％的小鼠因为过度肿瘤生长需要无痛处死，并且平均肿瘤体积测量变得太易变。
结果证明，LY303511、或LY303511与多柔比星的组合降低肿瘤负荷(图6A和6B)。因此，LY303511和/或与另外的化疗剂组合的LY303511可用于治疗增生性疾病，如癌症。LY303511也可以与雷帕霉素组合用于肿瘤治疗。
实施例8LY303511用于抑制免疫应答的应用包括多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎、糖尿病、自身免疫葡萄膜炎、移植排斥、慢性铍尘病和移植物抗宿主病的多种人类疾病的发病机理看起来是由T细胞介导的免疫应答。本文公开的化合物可用于治疗这些疾病。
表2人类自身免疫疾病的例子
有几个基于动物的自身免疫模型可用于试验本文公开的化合物用于治疗自身免疫疾病的应用。表2列举了可使用肽/MHC络合物治疗的几种示例性的免疫介导疾病。例如，非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠模型为其中动物随年龄增加而发生糖尿病的动物模型系统。为了试验具体化合物的效力，将糖尿病前期的动物组(最大为4周)用例如LY303511、或LY303511与另外的免疫抑制剂的组合处理。然后分析发生糖尿病的动物数、和动物发生糖尿病的速率。类似地，在Hashimoto小鼠模型系统中，为了试验疫苗的效力，将发生症状之前的动物组用例如LY303511、或LY303511与另外的免疫抑制剂的组合处理。然后分析发生该疾病的动物数、和动物发生该疾病的速率。
在NOD模型或在Hashimoto模型、或在任何其它模型系统中，与未经处理的动物相比，LY303511、或LY303511与另外的免疫抑制剂的组合延迟疾病的进展，或提供免于发生该疾病的保护。
为了证明LY303511对免疫应答的作用，使用得自Jackson(Jac)和Taconic(Tac)的野生型小鼠。在巯基乙醇酸酯注射三天之后收获腹膜巨噬细胞。将细胞在2％FCS RPMI中培养三天。在用有或者没有LY303511(1～100μM)或DMSO的LPS 1μg/ml刺激24小时之后收集上清液。测量细胞上清液中的细胞因子(白细胞介素(IL)-12p70、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)γ、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6)。结果证明，LY303511在所有六种细胞因子中引起剂量依赖性降低(参见图7A-F)。加入100μM的LY303511引起与背景水平相似的细胞因子分泌。因此，显而易见，LY303511可以减少细胞因子表达，并且具有抗炎作用。
实施例9材料和方法以下提供用于上述实施例的材料和方法的概要；提供这个部分用于与单个章节中的信息合并。
细胞培养物A549细胞(CCL 185，American Type CultureCollection(ATCC)；Manassas，VA)，为人类肺泡II型上皮细胞样肺腺癌细胞系，在37℃下在5％CO2下在补充有10％胎牛血清(FBS)、2mM谷氨酰胺、青霉素(100单位/ml)、和链霉素(100μg/ml)的Ham′s F-12K培养基中生长，上述都得自Biofluids(Rockville，MD)。根据生产商的指导说明使人肺动脉平滑肌(PASM)细胞(Cambrex；Rockland，ME)在37℃下在5％CO2下在补充有5％FBS、胰岛素、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、和庆大霉素/两性霉素B的SMG2培养基中生长。
药理学抑制剂和抗体LY303511、雷帕霉素、LY294002、和渥曼青霉素购自Biomol(Plymouth，PA)或Calbiochem(San Diego，CA)并溶解于DMSO中。对抗磷酸-S6K T389、磷酸-Akt S473、磷酸-mTOR S2481、磷酸-Rb S807/S811、S6K、和Akt的抗体购自Cell SignalingTechnologies(Beverly，MA)。对抗mTOR(RAFT1)、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、p27 Kip1、和p21Cip1的单克隆抗体购自BD Transduction Laboratories(San Diego，CA)。
蛋白质磷酸化的测量将A549细胞在没有或有抑制剂的无血清培养液中培养1小时，如所示的，然后与LPS，100μg/ml(Sigma；St.Louis，MO)和IFN-γ，100U/ml(Roche；Nutley，NJ)的混合物培养30分钟。将PASM细胞在没有或有抑制剂的无血清培养液中培养24小时，如所示的，然后与10％FBS培养30分钟。将A549或PASM细胞用冷的PBS洗涤一次并在溶胞缓冲液(20mM的Tris，pH 8.0、1％的Nonidet P-40、1mM的EDTA、5mM的苄脒、抑肽酶10μg/ml、亮肽素10μg/ml、胰蛋白酶大豆抑制剂、1mM的PMSF、50mM的氟化钠、100μM的原钒酸钠、和1∶100的Sigma磷酸酶抑制剂组合I，包含斑蝥素、微囊藻素LR和bromotetramizole)中在冰上培养15分钟。在冻融之后，将溶胞产物在16,000xg离心30分钟，然后测量蛋白质并储存在-80℃。通过SDS-PAGE分离总蛋白质的等份并将其转移到硝化纤维素膜上，然后如所示进行初级抗体的免疫印迹法。将膜用连接于辣根过氧化酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗体(Promega；Madison，WI)处理，使用增强的化学发光检测试剂盒(SuperSignal West Pico，Pierce；Rockford，IL)展开，并暴露于X线胶片下，胶片使用Epson Expression 636扫描器扫描。使用Scion Imageβ 3b软件定量积分谱带密度。
细胞增殖的测量使用原地5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷(BrDU)检测试剂盒，根据生产商的指导说明(Roche Diagnostics；Nutley，NJ)评价细胞增殖或DNA合成。简而言之，将A549或PASM细胞(4,000/孔)接种在96孔板中并在血清的存在下生长24小时。在没有或有所示抑制剂的存在下加入10mM BrDU，维持24小时。在一些实验中，将PASM细胞在无血清培养液中培养另外的24小时，然后加入BrDU和抑制剂。将细胞固定并使用过氧化物酶结合的抗BrDU抗体检测BrDU。将在用抑制剂处理的细胞中测量的吸光度数据相对于用DMSO对照处理的那些数据归一化(％对照)。
细胞周期的测量将A549或PASM细胞生长到80％汇合，然后加入所示的抑制剂，维持24小时。通过温和的胰蛋白酶处理收获细胞并用PBS洗涤三次，然后加入0.5ml的Vindalov′s碘化丙啶(10mM的Trizma碱、10mM的NaCl、0.05mg/ml的碘化丙啶、0.7U/ml的核糖核酸酶、0.1％的Nonidet P40)，维持至少2小时。在FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences；San Diego，CA)上进行细胞周期分析。得自氩气激光器的488-nm线用于碘化丙啶的激发，并且使用585-nm谱带通滤波器(FL2)收集发射的荧光。使用Cell Quest Software在线性刻度上收集Listmode数据。通过流式细胞计计数碘化丙啶染色的细胞，并测定处于G1、S、或G2/M期中的细胞百分数。
酪蛋白激酶2(CK2)活性的测量使用CK2活性试剂盒(Upstate，Charlottesville，VA)测量CK2活性(每分钟计数)，通过将没有或有所示浓度的在1％DMSO中的LY294002、LY303511、渥曼青霉素或雷帕霉素的存在下的50μl试验缓冲液(20mM的MOPS，pH 7.2、5mM的EGTA、25mM的β-磷酸甘油、1mM的原钒酸钠、1mM的二硫苏糖醇)中的100ng的重组CK2、镁/ATP鸡尾酒(10μCi32P-γ-ATP、0.675μmol的MgCl2、4.5nmol的ATP)、和10摩尔肽底物(氨基酸序列RRRDDDSDDD)在30℃下培养10分钟。使用20μl的40％三氯乙酸终止试验，并将上清液的样品(25μl)应用于P81磷酸纤维素纸方格上，然后将其用0.75％磷酸洗涤三次，用丙酮洗涤一次。使用Packard 100Tri-Carb液体闪烁计数器在5ml的闪烁流体中定量磷酸纤维素方格上的底物肽中的32P。活性表示为每10分钟结合的pmol磷酸酯。在抑制剂的存在下测量的CK2活性除以在DMSO对照存在下测量的CK2活性(＝100％对照)。
已经说明和描述了公开的组合物和方法的原则，显而易见，这些组合物和方法可在构建和细节上进行改进而不脱离这种原则。
权利要求
1.抑制主体中的免疫应答的方法，包括对主体给药治疗有效量的具有式A所示结构的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物或其可药用盐， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、卤素、羟基、或氨基。
2.权利要求1的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物包括具有式B所示结构的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物， 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自独立地选自烷基、芳基、烷氧基、卤素、羟基或氨基。
3.权利要求1的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
4.权利要求1的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物抑制雷帕霉素或酪蛋白激酶2的哺乳动物靶标，但是不显著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
5.权利要求1的方法，其中主体患有自身免疫疾病。
6.权利要求1的方法，其中主体具有炎症应答。
7.权利要求1的方法，其中主体患有移植物抗宿主疾病。
8.权利要求1的方法，其中主体是移植接受者，并且其中免疫应答是移植体的排斥。
9.权利要求1的方法，进一步包括对主体给药治疗有效量的另一种免疫抑制剂。
10.抑制细胞增殖的方法，包括使细胞接触有效量的具有式A所示结构的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物或其可药用盐， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、卤素、羟基、或氨基。
11.权利要求10的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物包括具有式B所示结构的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物， 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自独立地选自烷基、芳基、烷氧基、卤素、羟基或氨基。
12.权利要求10的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
13.权利要求10的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物抑制雷帕霉素或酪蛋白激酶2的哺乳动物靶标，但是不显著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
14.权利要求10的方法，进一步包括使细胞接触有效量的化疗剂。
15.权利要求10的方法，其中细胞在体内。
16.权利要求10的方法，其中细胞在体外。
17.抑制主体中的增生性疾病的方法，包括对主体给药治疗有效量的具有式A结构所示的2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物或其可药用盐， 式A其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自独立地选自烷基、取代的烷基、杂烷基、环烷基、取代的环烷基、杂环烷基、取代的杂环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、烷氧基、卤素、羟基、或氨基。
18.权利要求17的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物包括具有式B所示结构的2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮化合物 式B其中R1和R2各自的存在是非必要的并且R1和R2各自独立地选自烷基、芳基、烷氧基、卤素、羟基或氨基。
19.权利要求17的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮。
20.权利要求17的方法，其中2-(4-哌嗪基)-取代的4H-1-苯并吡喃-4-酮类化合物抑制P70 S6激酶的磷酸化，但是不显著抑制磷脂酰肌醇3-激酶。
21.权利要求17的方法，其中增生性疾病包括再狭窄。
22.权利要求17的方法，其中增生性疾病是肿瘤。
23.权利要求22的方法，其中肿瘤是肺癌或前列腺癌。
24.选择免疫抑制剂或抗增生剂的方法，包括选择试验剂，与抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)依赖性的底物磷酸化相比，该试验剂优先抑制酪蛋白激酶2和P70 S6激酶的磷酸化，从而鉴定药学有用的免疫抑制剂或抗增生剂。
25.权利要求24的方法，其中底物为蛋白激酶B(PKB)。
26.权利要求24的方法，其中试验剂在389位丝氨酸抑制P70 S6激酶的磷酸化。
27.权利要求24的方法，其中选择免疫抑制剂。
28.权利要求23的方法，其中选择抗增生剂。
29.药用组合物，包括2-(4-哌嗪基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮或其可药用盐、和可药用载体。
30.权利要求1的方法，其中免疫应答包括巨噬细胞活化。
31.权利要求1的方法，其中免疫应答包括一种或多种细胞因子的分泌。
32.权利要求31的方法，其中细胞因子为白细胞介素(IL)-12、肿瘤坏死因子(TNF)-α、干扰素(IFN)-γ、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、IL-10、IL-6。
33.权利要求22的方法，进一步包括对主体给药另外的化疗剂。
34.权利要求33的方法，其中化疗剂为5-氟尿嘧啶(5-FU)、硫唑嘌呤、环磷酰胺、氟达拉滨、依托泊苷、多柔比星、甲氨蝶呤、长春新碱、卡铂、顺铂、紫杉醇、雷帕霉素、或其组合。
全文摘要
本文公开了用于抑制主体中的免疫应答、治疗主体中的肿瘤、或治疗主体中纤维增生性血管病的方法，包括对主体给药治疗有效量的具有式(A)所示结构的2－(4－哌嗪基)－取代的4H－1－苯并吡喃－4－酮类化合物或其可药用盐，其中R
文档编号A61P37/06GK1889958SQ200480036665
公开日2007年1月3日 申请日期2004年12月9日 优先权日2003年12月9日
发明者约埃尔·莫斯, 阿诺尔德·克里斯托夫 申请人:美国政府健康及人类服务部