增强保护性免疫应答的方法

专利名称：增强保护性免疫应答的方法
本申请为美国专利申请No.08/607,509的部分继续申请，后者递交于1996年2月23号，为递交于1995年6月6号的美国专利申请No.08/488,386的部分继续申请，申请No.08/488,386为递交于1994年4月22号的美国专利申请No.08/232,543的部分继续申请。
本发明大体涉及在病人体内、分离细胞和细胞培养中增强免疫应答的化合物和方法。本发明特别涉及包含作为真核启动因子4A(eIF4A)同源类似物的利什曼原虫抗原的全部或部分的化合物及其在刺激免疫应答的疫苗中的应用。
疫苗通常通过在病人体内产生对感染或疾病相关的特异性抗原的免疫应答来引发对感染或疾病的免疫。利用现代技术对适当抗原的识别和应用使试验和发展大量针对常见感染(包括细菌，病毒和原生动物感染)以及像癌等疾病的疫苗变得可能。
但是，在许多情况下，纯化的抗原免疫原性很低，即一个特异性抗原所产生的免疫应答尽管针对需要的靶位，但没有足够的强度提供免疫保护。在这种情况下，必须加入一种免疫调节剂，如一种佐剂或免疫刺激剂，来加强免疫应答。佐剂是那种与抗原同时注射或与抗原注射于同一部位时可加强抗原特异性免疫应答的物质。佐剂的作用机理很多，包括以下几种(1)捕捉并缓慢释放抗原，(2)促使细胞向注射部位移动，(3)刺激或捕捉淋巴细胞，或是刺激淋巴细胞增殖，(4)促进抗原在病人体内散布。例如，油类、聚合物、矿物盐和脂质体由于具有这方面的特点而被用作佐剂。与佐剂相此，免疫刺激物是那种引发病人免疫应答普遍性、阶段性提高的物质，这种提高与其是否于与抗原同时注射无关。细菌是典型的免疫刺激物，如BCG(结核分枝杆菌的一种减毒株)或小棒状杆菌的失活株。无论哪一种机制，佐剂和免疫刺激物都是通过非特异的方式来增强目的特异性免疫应答。
目前可得到的许多佐剂的一个严重缺陷是其毒性。一般说来，最合适的佐剂(即能够最大限度地增强目的免疫应答的那些)同时毒性也最大。因此，实施者必须不断权衡佐剂的刺激水平和毒性。
因此，有必要发现既可以提供想要的对特异性免疫应答的增强作用，而毒性又低的化合物。本发明不仅满足了这方面的需要，而且进一步具有其他相关优点。
简而言之，本发明提供了有关与真核核糖体蛋白eIF4A同源的利什曼原虫抗原LbeIF4A或LmeIF4A的化合物和方法。一方面，本发明提供了在病人体内增强或引发对一种抗原和/或DNA疫苗编码抗原免疫应答的方法，包括给予病人一种抗原和/或DNA疫苗以及一种LbeIF4A多肽，该LbeIF4A多肽包括选自下组的一个DNA序列编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下可以同SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸互补链杂交的DNA序列，其中的DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。另一方面，本发明提供了在病人体内增强或引发对一种抗原和/或DNA疫苗编码抗原免疫应答的方法，包括给予病人一种抗原和/或DNA疫苗以及一种LmeIF4A多肽，该LbeIF4A多肽包括选自下组的一个DNA序列编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO.3 117-1325位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下可以同SEQ ID NO.3 117-1325位核苷酸互补链杂交的DNA序列，其中的DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
在其他相关方面，本发明提供了在病人体内增强或引发对一种抗原和/或DNA疫苗编码抗原免疫应答的方法，包括给予病人一种抗原和/或DNA疫苗以及一种LbeIF4A多肽，该LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO.2 49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体，或给予一种抗原和/或DNA疫苗以及一种LmeIF4A多肽，该LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO.4 49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
在另外的相关方面，本发明提供了在生物样本中增强免疫应答的方法，包括将生物样本与一种抗原和/或DNA疫苗编码的抗原以及上面提到的一种LbeIF4A多肽接触，其中生物样本包括选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞以及其组合的细胞。
在另一相关方面，本发明提供了在生物样本中增强或引发免疫应答的方法，包括将生物样本与如上所述的LmeIF 4A多肽接触，其中生物样本含有选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞及其组合的细胞。
在另一相关方面，本发明提供了在病人体内增强对一种肿瘤免疫应答的方法，包括给予病人一种肿瘤抗原和/或DNA疫苗以及上面提到的一种LbeIF4A多肽或LmeIF4A多肽。
在另一相关方面，本发明提供了治疗病人体内一种肿瘤的方法，包括给予病人上面提到的一种LbeIF4A多肽或LmeIF4A多肽。
在上面所提到的每个方面中，可以用病毒载体或核酸分子(总称为“核酸组份”)替代LbeIF4A或LmeIF4A多肽，这种核酸组份指采用感染或转染了核酸组份的病人细胞表达这些多肽。核酸组份的给药步骤可以体内或离体方式进行，后者包括随后给予感染/转染细胞。另外，当给予一抗原或肿瘤抗原时，显然也可以设计核酸组份以指导这种抗原的表达(应用相同或不同的载体或核酸分子)。
参照下面的详细说明及附图可对本发明上述的各个方面和其他方面有更清楚的了解。本文所引用的参考文献以其整体引入本文作为参考，相当于每篇逐一引入。


图1给出的是利什曼原虫DNA Southern印迹分析的结果，表明利什曼原虫中保持了eIF4A同源性，并且L.braziliensis基因组DNA至少含有LbeIF4A的两个拷贝。
图2为一免疫印迹分析结果，它证明了LbeIF4A免疫免血清可以同不同种利什曼原虫的一个约45KDa的优势蛋白反应。
图3说明了纯化的重组LbeIF4A可以刺激L.braziliensis感染个体外周血单核细胞的增殖。
图4A和4B给出的是确认为有L.braziliensis感染的病人外周血单核细胞中细胞因子mRNA表达模式的分析结果。
图5表明经LbeIF4A或虫体裂解物刺激后，感染了L.braziliensis的病人外周血单核细胞分泌的IFN-γ上清水平。
图6表明经LbeIF4A或虫体裂解物刺激后，感染了L.braziliensis的病人外周血单核细胞分泌的IFN-α上清水平。
图7A-D表明，用LbeIF4A刺激病人外周血单核细胞分泌到培养上清中的IL-12要比用虫体裂解物刺激的IL-12水平明显高，并且IL-10抑制IL-12的产生。
图8A和B证明，在所有被检测病人外周血单核细胞中IFN-γ的产生依赖于IL-12，但被IL-10抑制。
图9A和9B表明LbeIF4A可刺激培养的人巨噬细胞及粘附性外周血单核细胞中IL-12的产生。
图10表明LbeIF4A可刺激人骨髓白血病细胞系THP-1中IL-12p40的产生，并与IFN-γ协同作用刺激THP-1细胞分泌IL-12。
图11是表明LbeIF4A致敏的小鼠淋巴结细胞增殖并分泌几乎单一的Th1细胞因子的结果。
图12说明LbeIF4A对一个与人类疾病相关的动物模型的L.major感染可提供显著的保护。
图13说明用代表性LmeIF4A多肽引发了抗-卵清蛋白CTL。
图14说明代表性LmeIF4A多肽用作佐剂引发三硝基苯酚特异抗体。
图15表明代表性LmeIF4A多肽可提高抗-MUC-1抗体的产生。
图16表明代表性LmeIF4A多肽在培养细胞中可增强特异性的CTL活性。
图17表明IL-2自身或同LmeIF4A多肽一起对CTL活性的体外刺激作用。
图18表明LmeIF4A多肽对鼠同种异体性CTL的诱导作用。
图19显示了包含于微球体的肿瘤抗原和LmeIF4A多肽给药后的肿瘤抑制。
图20显示了包含于微球体的肿瘤抗原和LmeIF4A多肽给药后的肿瘤抑制。
图21显示了包含于微球体的肿瘤抗原和可溶性LmeIF4A多肽给药后的肿瘤抑制。
上文已提到，一般本发明涉及在病人或细胞培养中增强体液和/或细胞介导的免疫应答。在本发明的情形内，如文中所述对一抗原包括一免疫激活抗原(即可以引起病人免疫应答的抗原)的免疫应答可通过同时给予病人该抗原和一种或多种来源于LbeIF4A或LmeIF4A的多肽来引发或加强。抗原和免疫激活抗原通常为蛋白分子，包括来源于病毒如HIV、HBV、流感病毒、呼吸道合胞病毒，细菌如流感嗜血杆菌、肺炎链球菌，寄生虫如利什曼原虫和锥虫的分子。另外，可以通过给予病人肿瘤抗原(即刺激产生对肿瘤的免疫应答如CTL)来引发或增强对肿瘤的免疫应答。在本发明的情形中，肿瘤抗原包括病毒编码的分子、MAGE-1、Her-2、PSA以及其他分子。因此本发明的方法包括特异抗原或免疫激活抗原和本文所公开的LeIF4A来源的多肽共同给药。对肿瘤的治疗可以只给予病人LbeIF4A或LmeIF4A多肽而无需外源性肿瘤抗原。
本发明的LbeIF4A和LmeIF4A多肽也可用于引发或增强对DNA疫苗编码抗原的免疫应答。DNA疫苗编码一个或几个免疫激活抗原，使这些抗原就地产生。例如，DNA疫苗可编码一肿瘤抗原并有选择地编码本文所提到的LbIF4A来源的多肽。在这种疫苗中，DNA可以存在于本领域普通技术人员已知的许多转移系统的任一种中，包括核酸表达系统，细菌和病毒表达系统。适当的核酸表达系统含有在病人体内表达所必需的DNA序列(如合适的启动子)。细菌转移系统包括使用可在细胞表面表达前列腺细胞抗原一抗原决定簇的细菌(如卡介苗)。DNA可以通过病毒表达系统(如痘苗或其他痘病毒，逆转录病毒或腺病毒)引入，其中应用的为非致病性(缺陷)但可复制的病毒。合适的系统在文献中已有提及，如Fisher-Hich等，美国国家科学院研究进展(PNAS)86317-321，1989；Flexner等，纽约科学院年鉴(Ann N.Y.Acad.Sci.)56986-103，1989；Flexner等，疫苗(Vaccine)817-21，1990；美国专利号4,603,112，4,796,330和5,017,487；WO89/01973；美国专利号No.4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner，生物技术(Biotechniques)6616-627，1988；Rosenfeld等，科学(Science)252431-434，1991；Kolls等，美国国家科学院研究进展91215-219，1994；Kass-Eisler等，美国国家科学院研究进展，9011498-11502，1993；Guzman等，循环(Circulation)882838-2848，1993；Guzman等，循环研究(Cir.Res.)731202-1207，1993。本领域的技术人员对于DNA掺入表达系统的技术都很了解。DNA可以为“裸露”的，如出版的PCT申请WO90/11092和Ulmer等，科学2591745-1749，1993以及Cohen，科学2591691-1692，1993综述中所述。将DNA包被于可生物降解的小珠中，借助后者有效地转入细胞可提高裸露DNA的吸收。本发明的化合物通常包括可刺激外周血单核细胞(PBMC)中Th1或CTL(细胞毒T淋巴细胞)免疫应答的多肽。特别是公开了包括L.braziliensis或L.major真核核糖体蛋白eIF4A同源类似物的全部或其刺激活性部分(本文称之为LbeIF4A和LmeIF4A)的多肽。本文中“外周血单核细胞”是指外周血中核细胞的制备物。“多肽”在本发明中指包括全长蛋白及其部分蛋白在内的各种长度的氨基酸链，其中氨基酸分子之间以共价肽链相连。因此，“多肽LbeIF4A”包括LbeIF4A，或其保留刺激活性的部分蛋白或其变体。同样，“多肽LmeIF4A”包括LmeIF4A或其保留刺激活性的部分蛋白或其变体。本文“LeIF4A”指LbeIF4A或LmeIF4A。尽管LbeIF4A在本文中作为实例，在本发明中同样可用LmeIF4A或其部分蛋白，或其变体(或其变体的部分蛋白)。多肽LeIF4A可全部由一个或多个LeIF4A刺激活性部分组成，这些刺激活性部分包含在包括另外LeIF4A序列和/或LeIF4A同源氨基酸序列的较大蛋白中。优选多肽基本不含有外源物质的污染。
本发明的多肽包括对外周血单核细胞中Th1或细胞毒T淋巴细胞免疫应答具有刺激活性的LeIF4A变体。这些变体包括主蛋白的各种结构形式。例如，由于可离子化氨基和羧基的存在，LeIF4A多肽可以为酸性盐或碱性盐或中性形式。单个氨基酸残基可通过氧化或还原来修饰。
本发明范围内的变体还包括LeIF4A一级结构或其片段经修饰同其他多肽或者象糖基、脂类、磷酸、乙酰基及类似的化学基团组成共价或聚集性偶联物。共价衍生物可通过在氨基酸侧链或氨基或羧基末端连接上特殊的功能基来制备。或者，对于另一多肽连接到LeIF4A多肽上形成的衍生物，可以象下面所讲的那样通过重组DNA技术来制备融合蛋白。在一种这样的实施方案中，LeIF4A多肽可在其氨基端区域连接上一段信号(或前导)多肽序列，后者在共翻译时或翻译后可指导LeIF4A多肽由合成部位转移到细胞膜或细胞壁内侧或外侧的功能部位(如酵母α-因子前导序列)。
本发明中的蛋白融合体也可以包括连接上可方便LeIF4A多肽纯化和识别的肽链(如多聚组氨酸)。例如Hopp等在《生物技术》(Bio/Technology)61204(1988)中描述了一种可用于帮助鉴别的高免疫原性肽。此肽含有一个抗原决定簇，它与一特异的单克隆抗体可逆地结合，这使得表达的重组蛋白易于检测和纯化。Hopp等所提到的序列还可被牛粘膜肠激酶特异性切割，如此可以从纯化的蛋白中去除该肽。带有此类肽链的融合蛋白还可耐受大肠杆菌的细胞内降解。
本发明中的蛋白融合体也包括例如连有一免疫球蛋白Fc区的LeIF4A多肽。假如LeIF4A融合蛋白包含一抗体的重链和轻链，就有可能形成多到4个LeIF4A蛋白区的蛋白寡聚体。LeIF4A多肽连接上亮氨酸拉链区也在本发明范围之内。亮氨酸拉链区在例如PCT申请WO94/10308中有述。包含亮氨酸拉链的LeIF4A多肽可以是例如寡聚体、二聚体或三聚体。所有上面的蛋白融合体可如下所述通过化学连接或以融合蛋白的形式制备。
优选的蛋白融合体包括含有有益于刺激对感染性病原体(如抗原)免疫的序列。这种序列可能来自于例如病毒、肿瘤细胞、寄生虫或细菌。
本发明也包括带有或不带有自身模式糖基化的LeIF4A多肽。表达于酵母或哺乳动物细胞表达系统的多肽在分子量和糖基化模式上同原分子类似或稍有不同，这取决于表达系统。如，编码LeIF4A多肽的DNA在象大肠杆菌这样的细菌中表达时不会有糖基化分子的产生。真核蛋白氨基N-糖基化位点的特征是氨基酸三连体Asn-A1-Z，其中A1为脯氨酸之外的所有氨基酸，Z为丝氨酸或苏氨酸。本发明范围内也包括氨基糖基化位点失活的LeIF4A多肽变体，通过本领域普通技术人员所知技术如寡核苷酸的合成和连接，或点突变技术即可得到。或者，在LeIF4A多肽中增加N-连接的糖基化位点。
本发明也包括如下LeIF4A多肽变体，此变体的氨基酸序列由于一个或几个缺失、插入、替代或其他修饰而有别于原LeIF4A蛋白。这类变体应与原LeIF4A充分同源并且保持对外周血单核细胞中Th1或细胞毒T淋巴细胞免疫应答的刺激活性。这里的“充分同源”的变体指可由能够在中等严紧的条件下同编码如LbeIF4A的原DNA序列杂交的DNA序列编码的氨基酸序列。适当的中等严紧条件包括用5×SSC，0.5％SDS，1.0mM EDTA(pH 8.0)预洗；5×SSC 50℃-65℃杂交过夜；然后分别用2×，0.5×，0.2×SSC(含0.1％SDS)65℃洗两次，每次20分钟。这类杂交的DNA序列也在本发明的范围之内。变异对LbeIF4A多肽活性的影响可通过用本文所描述的任何方法分析变异LbeIF4A多肽引发Th1或细胞毒T淋巴细胞免疫应答的能力而加以确定。优选的LbeIF4A多肽变体是L.major中LbeIF4A的同源类似物(LmeIF4A)。
一般说来，氨基酸的替代应该是保守性的，即替代氨基酸应与被替代氨基酸性质类似，这样，蛋白质化学领域的熟练技术人员可预料多肽的二级结构和疏水性不会有显著改变。通常，下面各组内的氨基酸的替代表现出保守性(1)丙氨酸，脯氨酸，甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，丝氨酸，苏氨酸；(2)半胱氨酸，丝氨酸；酪氨酸，苏氨酸；(3)缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，甲硫氨酸，丙氨酸，苯丙氨酸；(4)赖氨酸，精氨酸，组氨酸；和(5)苯丙氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸。本发明范围内的变体也可同时包括或代之以其他对多肽刺激活性、二级结构和疏水性仅有微弱影响的修饰，包括氨基酸的删除或增加。一般说来，LbeIF4A片段可通过删除末端或中间的残基或序列来构建。通过比较LbeIF4A和eIF4A家族其他成员的序列和结构可以为适当修饰提供另外的指导。例如，生物活性非必需的LbeIF4A末端或中间的残基或序列可以被删除。半胱氨酸可被删除或代之以其他氨基酸以防止复性时形成非正确的分子内二硫桥。其他诱变方法包括修饰相邻三元氨基酸残基以提高在带有KEX2蛋白酶活性的酵母系统中的表达。
一个LeIF4A全长蛋白一般可用编码此蛋白的基因组或cDNA来获得。SEQ ID NO1显示的是编码全长LbeIF4A的基因序列，SEQID NO2给出的是其推定的氨基酸序列。SEQ ID NO3显示的是编码全长LmeIF4A的基因序列，SEQ ID NO4给出的是其推定的氨基酸序列。通过在适当的L.braziliensis或L.major表达文库中筛选能够表达对粘膜利什曼病患者血液应答的抗原的克隆，然后分析反应性抗原在病人T细胞检测中刺激增殖应答和产生优势Th1细胞因子的能力以及在病人T细胞中刺激CTL反应的能力，如此即可分离出上述克隆。文库的制备及筛选可通过本领域普通技术人员所熟知的方法进行，如Sambrook等，分子克隆实验室操作手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989中所述的方法，此书作为参考而在本文中引用。简而言之，可将一噬菌体表达文库涂板并转移到滤膜上，然后同血清和检测试剂一起孵育。在本发明中，“检测试剂”包括所有能够同抗原-抗体复合物结合，然后用本领域普通技术人员所熟知的任何技术能够检测的化合物。典型的检测试剂含有偶连有一报告基团的“结合剂”，如蛋白A、蛋白G、IgG或凝集素。优选的报告基团包括酶、底物、辅助因子、抑制因子、染料、放射性核素、发光基团、荧光基团和生物素。更为优选的报告基团为辣根过氧化物酶，同其底物如2，2’-连氮基-二-3-乙基苯并噻唑啉磺酸一起孵育即可检测此酶。表达与血清中抗体结合之蛋白的基因序列或cDNA序列包含于某一噬菌斑中，通过本领域普通技术人员所掌握的技术可以分离并纯化此噬菌斑。例如，适用方法可在Sambrook等，分子克隆实验室操作手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989中找到。
病人T细胞检测的一般做法是用应答抗原处理病人PBMC，然后分析细胞的适当反应。例如，PBMC上清可用于检测所分泌细胞因子的水平。检测的细胞因子优选为干扰素-γ、白介素-2、白介素-12(p40亚单位或具生物活性的p70)、白介素-1或肿瘤坏死因子-α同样可检测细胞因子白介素-4和白介素-10，因为这些典型的Th-2型细胞因子的表达水平通常会因本文所述多肽的作用而降低。例如，对细胞因子的检测可以是把商业途径可获得的目标细胞因子的特异抗体用于ELISA法，根据生产商的说明确定阳性结果。适用抗体可购自例如Chemicon、Temucula，CA和PharMingen、San Diego，CA。或者，经处理的PBMC可用来检测编码干扰素-γ、白介素2、白介素12p40亚单位、白介素1或肿瘤坏死因子-α中一种或几种细胞因子的mRNA，或用来按本文所述检测增殖应答。或者通过检查PBMC上清中细胞因子特异性生物活性来测定细胞因子。
保持在PBMC中对Th1免疫应答刺激能力的LbeIF4A变体一般可通过从上文所述的一个或几个方面对序列加以修饰，并检测所形成的多肽对Th1应答的激活能力来识别。这类检测的做法一般为如上文所述，用修饰过的多肽处理病人PBMC并测定反应。天然存在的LbeIF4A变体也可从其他种的利什曼原虫中分离到，如应用LbeIF4A或其变体的编码DNA序列对一合适的基因或cDNA文库进行筛选。
上面所述的序列修饰可用标准的重组技术或人工合成修饰多肽来引入。如通过合成含有一种两侧带有限制性酶切位点(使之可连入原序列片段)的变异序列的寡核苷酸可在特定位点引入变异。连接后产生的改造序列所编码的类似物即带有需要的氨基酸插入、替代或缺失。
或者，寡核苷酸指导下的点突变方法可用于提供一带有所需替代、缺失或插入而使特定密码子改变的基因。上文提出的突变方法的例子见于Walder等，基因42133，1986；Bauer等，基因3773，1985；Craik，生物技术，一月，1985，12-19；Smith等，基因工程原理和方法(Genetic Engineering Principles and Methods)，Plenum Press，1981；美国专利No.4,518,584和4,737,462。
所构建的用来表达这类LbeIF4A多肽的核酸序列的变异当然必须保持编码序列的读码框架，并且最好不产生能够与之互补产生影响受体mRNA翻译的mRNA二级结构，如环或发夹结构。尽管变异位点可预先确定，变异自身的性质却无须预先确定。例如，为了挑出一定点变异的最佳特性，可以对靶密码子进行随机诱异，然后在表达的LbeIF4A蛋白中筛选带有所需活性的蛋白变体。
并非所有LbeIF4A蛋白编码核酸序列的变异都会表达在终产物中。例如，核酸替代可用来提高表达，主要用来避免转录mRNA中二级结构环的生成(例如可参阅欧洲专利申请75,444A)，或是提供更易于被所选宿主翻译的密码子，如众所周知的大肠杆菌表达的大肠杆菌优选密码子。
本发明的多肽，包括天然存在的和修饰过的，优选用重组DNA技术得到，这种方法包括将一段编码LbeIF4A多肽的DNA序列插入一重组表达载体，在促进表达的条件下将此DNA序列于一个重组的微生物、哺乳动物或昆虫细胞表达系统中表达。编码本发明所提供多肽的DNA序列可以由cDNA片段和短的寡核苷酸连接子或由一系列寡核苷酸组装起来，以提供一能够插入重组表达载体并在一个重组转录单位中表达的合成基因。
重组表达载体包括编码LeIF4A多肽的DNA序列，此序列可操作地连接上来自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的适当转录或翻译调节元件。这些调节元件包括后面将会提到的一个转录启动子，一个控制转录的可选择的操纵子序列，一段适当的编码mRNA核糖体结合位点的序列，以及控制转录和翻译终止的序列。另外可加入一复制起点和一个有助于识别转化子的选择性标记。
功能相关的DNA区被可操作性地连接起来。例如，假如一信号肽(分泌性前导肽)的编码DNA参与了一个多肽的分泌，可将其同多肽的编码DNA可操作性地连接。如一启动子控制一个编码序列的转录，可将二者可操作性地连接，或假如一核糖体结合区可使一个编码序列定位以便翻译，可将二者可操作性地连接。一般说来，可操作性连接意味着连续性，对分泌型前导序列来说，意味着在同一读码框架中。用于微生物表达的LeIF4A多肽的编码序列优选不包括可过早终止DNA转录为mRNA的内含子。
用于细菌的表达载体可包含来自可通过商业途径获得带有众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)基因元件的质粒的一个选择性标记和细菌复制起点。如，这些商业载体包括pKK223-3(Pharmacia FineChemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分同一个适当的启动子和要表达的结构基因序列相连。大肠杆菌通常用大肠杆菌质粒pBR322(Bolivar等，基因295，1977)的衍生质粒转化。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，因此为鉴定转化细胞提供了简单的方法。
重组微生物表达载体中常用的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖启动子系统(Chang等，自然(Nature)275615，1978；Goeddel等，自然281544，1979)，色氨酸(Trp)启动子系统(Goeddel等，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)84057，1980；欧洲专利申请36,776)和tac启动子(Maniatis；分子克隆实验室操作手册，冷泉港实验室，p412，1982)。一个特别有用的细菌表达系统使用了λ噬菌体PL启动子和热敏感抑制子cI85ts。可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)得到的带有PL启动子变体的质粒载体，包括质粒pHUB2(宿主菌为大肠杆菌JMB9株)(ATCC37092)和质粒pPLc28(宿主菌为大肠杆菌RR1株)(ATCC53082)。
酵母载体中适当的启动子序列包括以下蛋白的启动子金属硫蛋白，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)2552073，1980)或其他糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；Holland等，生物化学(Biochem.)174900，1978)，如烯醇酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸变构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，丙糖磷酸变构酶，磷酸葡萄糖变构酶以及葡萄糖激酶。用于酵母表达的适用载体和启动子在R.Hitzeman等的欧洲专利中请73,657中有进一步描述。
优选的酵母载体可以用用于在大肠杆菌中筛选和复制的pBR322的DNA序列(氨苄抗性基因和复制起点)和含有葡萄糖可抑制的ADH2启动子和α-因子分泌前导序列的酵母DNA序列组装。ADH2启动子曾被Russell等(生物化学期刊，2582674，1982)和Beier等(自然，300724，1982)所描述。指导异源蛋白分泌的酵母α-因子前导序列可以插入到启动子和要表达的结构基因中间(例如可参阅Kurjan等，细胞30933，1982和Bitter等，美国国家科学院研究进展815330，1984)。前导序列的近3’端经修饰可带上一个或几个有用的限制性酶切位点以方便其同外源基因的融合。用于转化脊椎动物细胞的表达载体，其转录和翻译调控序列可以来源于病毒。如常用的启动子和增强子来源于多瘤病毒、猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒。来源于SV40病毒基因组的基因序列，如SV40复制起点、早期和晚期启动子、增强子、剪切和多聚腺嘌呤位点，可用于提供外源基因表达所需的其他基因元件。由于早期和晚期启动子易于以同时带有SV40复制起点的片段形式得到(Fiers等，自然273113，1978)因而特别有用。也可使用包括病毒复制起点中HindIII酶切位点到BglII酶切位点长约250bp的序列在内的或短或长的SV40片段。另外，病毒基因组启动子，调控和/或信号序列也可使用，前提是这些调控序列与所选择的宿主细胞相容。例如，载体可依据Okayama和Berg，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)3280，1983所述而构建。
用于C127鼠乳房上皮细胞中哺乳动物受体cDNA高效稳定表达的一个有用系统大致可如Cosman等(分子免疫(Mol.Immunol.)23935，1986)所述而构建。一优选用于LbeIF4A蛋白DNA表达的真核载体是pDC406(McMahan等，欧洲分子生物学协会期刊(EMBOJ.)102821，1991)并包括来自SV40，人免疫缺陷病毒(HIV)和Epstein-Barr病毒(EBV)的调节序列。其他优选载体有来自pDC406的pDC409和pDC410。通过用SV40大T抗原编码序列替代pDC406中的EBV复制起点而得到p410。pDC409与pDC406的区别在于前者中多克隆位点外的一个BglII位点已被删除，因而使多克隆位点内的BglII位点成为单一位点。
用于象带有EBV复制起点的pDC406和pDC409这样的表达载体以附加体形式复制的一个有用细胞系为CV-1/EBNA(ATCC CRL10478)。CV-1/EBNA细胞系通过Epstein-Barr病毒核抗原-I(EBNA-1)编码基因转染CV-1细胞系而得到，在人CMV立即早期增强子/启动子的作用下它可持续表达EBNA-1。
转化的宿主细胞是指用应用DNA重组技术构建并带有本发明的LbeIF4A多肽编码序列的表达载体转化或转染而得到的细胞。转化的宿主细胞可表达需要的LbeIF4A蛋白，但是用于LbeIF4A DNA克隆或扩增的转化宿主细胞并不需要表达LbeIF4A蛋白。表达的LbeIF4A优选分泌到培养液上清中(这一点取决于选择的DNA)，但也可积累在细胞膜内。
适用于重组蛋白表达的宿主细胞包括在适当启动子调控下的原核细胞，酵母或较高级的真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，如大肠杆菌或杆菌。较高级的真核细胞包括下面所述的来自昆虫或哺乳动物的成型细胞系。无细胞翻译体系也可用于用源自本文公开的DNA结构的RNA产生LbeIF4A蛋白。例如，适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达的载体在Pouwels等，克隆载体实验室手册(Cloning VectorsA Laboratory Manual)，Elsevier，纽约，1985中有所描述。
原核表达宿主也可用于表达LbeIF4A多肽，表达过程不需要大量的蛋白裂解和二硫键形成。原核表达载体一般包括一个或多个表型筛选标记，如一个编码提供抗生素抗性或自营需要的蛋白的基因，和能够被宿主菌识别的以保证在宿主菌中扩增的复制起点。适用于转化的原核宿主包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、放线菌属和肺炎球菌属的不同菌种，也可使用其他宿主。
重组LbeIF4A多肽也可于酵母宿主中表达，优选酵母宿主来自糖酵母属，如啤酒糖酵母。其他如毕赤氏属酵母和克鲁维氏属酵母也可使用。酵母载体一般包括来自酵母质粒2μ的复制起点或一自主复制序列(ARS)，一个启动子，编码LbeIF4A多肽的DNA，多聚腺嘌呤和转录终止序列和一选择基因序列。优选酵母载体包括可使其同时转化酵母和大肠杆菌的复制起点和选择标记，如大肠杆菌氨苄青霉素抗性基因，啤酒糖酵母trp1基因(可为失去在色氨酸中生长能力的酵母变异株提供筛选标记)和引导下游结构基因转录的高表达酵母基因启动子。酵母宿主细胞中trp1的缺损通过转化子在无色氨酸下生长为检测转化子提供了一个有效的环境。
适用的酵母转化步骤为本领域技术人员所知。如Hind等(美国国家科学院研究进展751929，1978)所述技术包括在一含有0.67％酵母氮源培养基、0.5％酪蛋白氨基酸、2％葡萄糖、10mg/ml腺嘌呤以及20mg/ml尿嘧啶的选择培养基中筛选Trp阳性转化子。带有ADH2启动子的载体转化的宿主菌株可在一含有1％酵母抽提物、2％蛋白胨，1％葡萄糖并补充80mg/ml腺嘌呤和80mg/ml尿嘧啶的富集培养基中培养以表达相应蛋白。ADH2启动子的去抑制有赖于葡萄糖的耗尽。酵母粗上清可通过过滤而收获，进一步纯化以前4℃存放。
不同的哺乳动物或昆虫(如草地夜蛾或粉蚊夜蛾)细胞培养系统也可用来表达重组蛋白。如用于在昆虫细胞中产生外源蛋白的杆状病毒系统综述于Luckow和Summers，生物技术647，1988。适用的哺乳动物细胞系的例子包括猴肾COS-7细胞系(Gluzman，细胞23175，1981)和其他一些能够表达适当载体的细胞系，如CV-1/EBNA(ATCCCRL 10478)、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、COS、NS-1、Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包含非转录元件，如一个复制起点、连接到要表达基因上的一适当的启动子和增强子、其他5’或3’端非转录旁侧序列以及5’或3’端非翻译序列，如必需的核糖体结合位点、一多聚腺嘌呤位点、剪切供体和受体位点以及转录终止序列。
纯化的LbeIF4A多肽可以通过培养适当的宿主/载体系统来表达本发明的DNA的重组翻译产物，然后从培养液或细胞抽提物中纯化产物来制备。例如，重组蛋白分泌到培养液中的系统，其上清首先可以用商业途径获得的蛋白浓缩膜(如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)进行浓缩。浓缩之后，将浓缩物施加于一适当的纯化基质上。例如，一适当的亲和基质可包含结合于一适当支持物上的一个相反结构的蛋白(即通过基于结构的特异反应与LbeIF4A结合的蛋白)、或凝集素或抗体分子。或者应用一离子交换树脂，如带有二乙氨基乙基(DEAE)侧团的基质或底物。该基质可以为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或常用于蛋白纯化的其他类型物质。或者，应用阳离子交换方法。适用阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基基团的不同种类的不溶性基质。优选磺丙基基团。凝胶过滤层析也是LeIF4A的一种纯化方法。
亲合层析是纯化LbeIF4A多肽的一种特别优选的方法。例如，以包含免疫球蛋白Fc区的融合蛋白形式表达的LbeIF4A多肽可以用蛋白A或蛋白G亲和层析来纯化。同时，包含一亮氨酸拉链区的LbeIF4A蛋白可用含有亮氨酸拉链区特异抗体的树脂来纯化。LbeIF4A蛋白的单克隆抗体也可用于亲和层析纯化，使用方法为本领域所熟知。
最后，一种或多种应用疏水RP-HPLC介质(如含有甲基侧基或其他脂肪族基团的硅胶)的反相高效液相层析(RP-HPLC)方法可用来进一步纯化LbeIF4A蛋白组分。部分或全部前面的纯化方法的不同组合也可用于提供一外源重组蛋白。
产生于细菌培养中的重组LbeIF4A多肽的优选分离方法是首先抽提细胞沉淀，然后是一次或多次浓缩，盐析，水中离子交换，或排阻层析。高放液相层析(HPLC)可用作最后的纯化步骤。用于重组LbeIF4A蛋白表达的微生物细胞可使用许多方便的方法加以裂解，包括冻融循环、超声、物理裂解或是应用细胞裂解剂。
以分泌蛋白形式表达LbeIF4A多肽的酵母的发酵大大简化了纯化过程。来自大规模发酵的分泌重组蛋白可用类似于Urdal等(色谱杂志(J.Chromatog.)296171，1984)中所述的方法加以纯化。这篇参考文献描述了在一制备型HPLC柱上用两个连续的反相HPLC步骤来纯化重组的GM-CSF。
合成于重组子培养液的LbeIF4A多肽的制备物中可能含有包括蛋白在内的非LbeIF4A细胞成分，其数量和性质取决于用于从培养液中回收LbeIF4A蛋白的纯化方法。这些成分通常来源于酵母，原核或人以外的真核细胞。这种制备物不含有在天然来源物种中一般与LbeIF4A蛋白相结合的其他蛋白。
自动合成提供了制备小于约100个氨基酸(典型地小于50个氨基酸)的本发明多肽的另一方法。例如，可应用商业途径获得的各种固相技术，如Merrifield固相合成法，其中将氨基酸顺序地连到延伸的氨基酸链上(参阅Merrifield，美国化学协会期刊(J.Am.Chem.Soc.)852149-12146，1963)。用于多肽自动合成的设备可通过商业途径购自供应商，如Foster City，CA的Applied Biosystems，Inc.，设备的操作依据生产商说明。
作为另外一个LbeIF4A多肽的存在形式，本发明包括能转移编码LeIF4A多肽或其部分多肽的核酸分子的组合物。这些组合物包括重组病毒载体(如逆转录病毒(参阅WO90/07936，WO91/02805，WO93/25234，WO93/25698，WO94/03622)，腺病毒(参阅Berker，生物技术6616-627，1988；Li等，人类基因治疗(Hum.GeneTher.)4403-409，1993；Vincent等，Nat.Genet 5130-134，1993；Kolls等，美国国家科学院研究进展91215-219，1994)，痘病毒(参阅美国专利No.4,769,330；美国专利No.5,017,487，WO89/01973)，裸露DNA(参阅WO90/11092)，复合于一多聚阳离子分子的核酸分子(参阅WO93/03709)，和与脂质体结合的核酸(参阅Wang等，美国国家科学院研究进展84；7851，1987)。在某些实施方案中，DNA上可连上被杀死或失活的腺病毒(Curiel等，人类基因治疗3147-154，1992；Cotton等，美国国家科学院研究进展896094，1992)。其他适用的组合物包括DNA-配基(参阅Wu等，生物化学期刊26416985-16987，1989)和脂类-DNA复合物(参阅Felgner等，美国国家科学院研究进展，847413-7417，1989)。另外，将裸露DNA包被于可生物降解的胶质小珠中可提高其进入细胞的效率。
除了直接的体内程序，也可使用离体程序，其中来自动物的细胞改造后移入同一或另一动物。显而易见，在离体法中，上面的所有组合物都可用于介导LeIF4A核酸分子进入组织细胞。用于吸收的病毒、物理和化学方法的程序为本领域所熟知。
如上文所述，本发明提供了应用本文中的多肽或相关核酸组分增强或引发免疫应答的方法。本发明中已发现LbeIF4A包含刺激来自利什曼原虫感染个体的PBMC增殖的抗原决定簇。LbeIF4A也刺激来自感染个体的PBMC产生单一的Th1细胞因子应答。Th1应答的特点是产生细胞因子白介素-1(IL-1)、白介素-2(IL-2)、白介素-12(IL-12)或干扰素-γ(IFN-γ)，以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。IL-12为一异源双体分子，包括p40和p35两个亚单位，此两个亚单位共表达才能产生具生物活性的IL-12p70。p40亚单位仅在IL-12产生细胞中产生，由细菌和寄生虫刺激于体外或体内诱导，p35亚单位则可持续表达于各种细胞。因此，产生IL-12的细胞中无生物学活性的游离p40链大量过剩(10到100倍)。IL-12的产生所带来的刺激作用非常重要，因为IL-12能够影响T细胞产生Th1应答(产生IFN-γ和IL-2)。因此蛋白刺激产生IL-12的能力是其一个重要的佐剂性质。
LbeIF4A在来自利仁曼原虫感染病人的PBMC中也可刺激产生编码IFN-γ、IL-2、白介素-12p40亚单位和TNF-α的mRNA。在刺激过的PBMC中检测不到IL-4或IL-10(代表着Th2应答)mRNA。实际上，LbeIF4A一般下调一些利什曼病患者的新鲜PBMC中IL-10mRNA的表达以及LPS诱导的病人和正常PBMC中IL-10的产生。LbeIF4A的这些性质暗示其可以用于在利什曼病患者中产生保护性或治疗性免疫应答。
另外，在来自未感染对照个体的PBMC以及培养的人巨细胞病毒、骨髓白血病细胞系THP-1和小鼠中，LbeIF4A刺激产生IL-12和IL-2。LbeIF4A还协同IFN-α刺激THP-1细胞分泌IL-12，并且抗-IL-12抗体的存在会抑制其对病人PBMC产生IFN-γ的引导作用。LbeIF4A刺激产生IL-12和IL-2的能力表明它可以用来引发一免疫应答，并且本文所述多肽可广泛用于提高一非特异性的免疫应答。
因此，本发明包括在病人或细胞培养中增强或引发一细胞免疫应答(如抗原特异性细胞裂解性T细胞的产生)的方法。本发明同时包括应用上面所述LbeIF4A或LmeIF4A多肽增强或引发针对某一抗原的体液免疫应答(如抗原应答性抗体的产生)的方法。本文所用“病人”一词指的是任何温血动物，优选为人。病人可患有一种疾病，如利什曼病(或其他感染性疾病)或癌症，如黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、结肠癌或其他癌症，也可为正常(即无可检测到的疾病和感染)。“细胞培养”指的是对PBMC的任何制备物或分离的组分细胞(包括但并不限于巨噬细胞、单核细胞、B细胞和树突细胞)。这些细胞可用本领域普通技术人员所熟悉的各种技术(如Ficoll-hypaque密度离心)加以分离。细胞可以(但非必须)从患有利什曼病或其他疾病的病人中分离，并在处理后可重新移入病人体内。
在这些方法中，LeIF4A多肽(或核酸组分)同抗原一道给予病人或细胞培养物，以使其发挥增强或引发针对抗原的免疫应答的免疫调节剂的作用。LeIF4A多肽可以同抗原以同一制剂的形式(如疫苗)给药，也可单独给药。在一种实施方案中，抗原和LeIF4A多肽在同一时间给予病人的同一部位。在这种方法中，如LeIF4A多肽可以作为佐剂用于外源物质疫苗制剂。另外一种实施方案中，抗原和LeIF4A多肽给予病人的不同部位，如LeIF4A多肽可在一条手臂上给药(如注射)，而抗原于另一条手臂给药。这种给药可以但不必须在同一时间进行。另外，LeIF4A多肽可在抗原之前或之后给药。例如，LeIF4A多肽可在抗原给药之前24小时给药。后面给出了给药的适用剂量和方法。
对于接受了LeIF4A多肽的病人，其产生的免疫应答随着自身条件的不同而有所不同。对于利什曼病患者来说，其产生的免疫应答包括优势的Th1免疫应答(包括对产生IL-12的刺激作用)以及对IL-10表达的下调作用。对未感染个体来说，免疫应答可为IL-12的产生、IL-2的产生、对γT细胞的刺激作用、干扰素的产生、抗原应答性CTL的产生、抗原特异性抗体的产生，或其任何组合。以上免疫应答的任意一种都可增强病人针对同LeIF4A多肽一起给药的抗原的免疫应答。另外，对于经诊断患有癌症(如黑色素瘤，乳腺癌，前列腺癌，淋巴瘤，结肠癌或其他癌症)的病人来说，免疫应答包括优势的CTL反应。对于肿瘤的治疗来说，免疫应答应减小肿瘤的体积。
用于上述方法中的LeIF4A多肽(或核酸组分)优选配制成药物组合物或疫苗。药物组合物通常含有结合有生理学可接受的载体、赋形剂或稀释剂的一种或多种LeIF4A多肽。这种载体的用量和浓度对受者没有毒性。疫苗包括一种或多种LeIF4A多肽以及一种或多种另外适于该适应症的抗原。LeIF4A蛋白与可溶性细胞因子受体、细胞因子和化疗试剂的联合应用也在本发明的考虑之内。
多肽的剂量以及给药途径和频率随个体的不同而不同，并与其他感染的现行免疫和治疗所用条件平行。一般来说，药物组合物和疫苗可通过注射(例如肌肉注射，静脉注射，或皮下注射)，鼻腔途径(如吸入)或口服来给药。给药的剂量和频率当然取决于待治疗临床表现的性质和严重性、目的反应、病人的身体条件及其他因素。典型的是2-6周内给药1-4个剂量。优选给予2个剂量，第一次给药后2-4周进行第2次给药。适当的LbeIF4A多肽剂量应该是刺激病人体内IL-12的产生，使从病人分离的PBMC的上清中IL-12的浓度在10ng/ml到10μg/ml之间。通常，可用本领域普通技术人员所知的适当检测方法包括本文所述方法来对IL-12定量。典型的剂量为每公斤宿主约1pg到100mg LbeIF4A多肽。典型为10pg到约1mg，优选为约100pg到约1μg。适当的给药体积随动物的大小而变，但对于10-60公斤的动物，典型范围是从约0.01mL到约5mL。用于具体适应症的特定适当剂量易于决定。
或者，细胞(优选外周血单核细胞)从病人中分离，体外用一种LeIF4A多肽和抗原(包括肿瘤抗原)刺激。抗原特异性免疫应答如CTL应答产生后，可扩增细胞并回输给病人。
尽管为本领域技术人员所知道的适当的载体可用于本发明的药物组合物，载体的类型则取决于给药方式以及是否需要持续释放。对于象皮下注射这样的非肠道给药方式来说，载体优选包括水、盐水、酒精、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服给药方式来说，上面的所有载体或固体载体如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖以及碳酸镁均可使用。可生物降解的微球体(如多聚乳糖半乳糖苷)也可用作本发明药物组合物的载体。例如适用的微球体公开在美国专利No.4,897,268和5,075,109和美国专利申请No.08/116,484和08/116,802(列入本文作为参考)中。多肽或多肽/抗原复合物可以包埋于微球体内或附于微球体表面。从这个意义上，优选的微球体应大于约25微米。
药物组合物和疫苗也可包含稀释剂(如缓冲液)、抗氧化剂(如抗坏血酸)、低分子量多肽(约小于10残基)、蛋白，氨基酸、糖类(包括葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、螯合剂(如EDTA)、谷胱甘肽和其他的稳定剂和赋形剂。例如，中性缓冲液平衡的盐水或者与非特异的血清蛋白混合的盐水是适当的稀释剂。优选用适当的赋形剂溶液(如蔗糖)作为稀释剂将产品配制成冻干品。
除LbeIF4A外，另外一些不同的试剂可任选用于本发明的疫苗或药物组合物，以进一步非特异地增强免疫应答。这些试剂通常包括旨在保护抗原免受迅速降解的物质(如氢氧化铝或矿物油)和免疫应答的非特异刺激物(如脂A，Bortadella pertussis或结核分枝杆菌)。这类试剂可通过商业途径得到，如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLoboratories，Detroit，MI)以及Merck佐剂65(Merck andCompany，Inc.，Rahway，NJ)。
现提供下列实施例用于说明目的，而无任何限制意义。本领域技术人员会发现对实施例中所包含的本发明可以进行变动，特别是在本文列出的各种参考文献的教导下。
实施例1LbeIF4A编码DNA的制备此实施例举例说明了编码L.braziliensis核糖体抗原LbeIF4A的DNA序列的分子克隆。
在噬菌体λZAPII(Stratagene，La Jolla，CA)中用来自L.braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)的切割DNA构建一基因组表达文库。来自患有粘膜利什曼病的L.braziliensis感染个体的大肠杆菌预吸附血清用于表达文库的筛选。纯化带有免疫活性重组抗原的噬菌斑，按照制造商的方法切割噬菌粒pBSK(-)。用核酸内切酶III处理嵌套缺失，所得到的重叠缺失可用于单链模板的制备和测序。用制造商(Stratagene，La Jolla，CA)推荐方法感染VCSM13辅助噬菌体后分离单链模板，采用双脱氧末端终止法或Tap染料终止系统(使用应用生物学系统自动测序仪Model 373A)进行测序。
免疫活性重组抗原然后用在病人T细胞检测中分析其对增殖性免疫应答(如后面实施例5所述)和主要Th1细胞因子的刺激能力(如后面实施例7所述)。
通过比较重组克隆预测的氨基酸序列和其他蛋白序列，重组在上面的检测中被鉴定出来的克隆被鉴定为真核启动因子4A(eIF4A)的L.braziliensis同源类似物。分离的克隆(pLeF.1)缺少全长蛋白序列的前48个氨基酸残基(144核苷酸)。然后pLeF.1的插入片段用于分离全长基因组序列。
SEQ ID NO1为全长LbeIF4A多肽的完整核苷酸序列。开放读码框架(115到1323位核苷酸)编码-预计分子量为45.3kD的403个氨基酸的蛋白。序列比较表明预测的LbeIF4A蛋白序列同来自烟草(TeIF4)、小鼠(MeIF4)和酵母(YeIF4)的同源蛋白有广泛的序列同源性，其中前20-30位氨基酸变异最大。LbeIF4A、TeIF4、MeIF4和YeIF4的长度(403，413，407，395个氨基酸)、分子量(45.3，46.8，46.4，44.7kD)和等电点(5.9，5.4，5.5，4.9)都分别类似。LbeIF4A同TeIF4，MeIF4和YeIF4的总体同源性分别为75.5％(57％相同，18.5％为保守性替代)、68.6％(50％相同，18.6％为保守性替代)和67.2％(47.6％相同，19.6％为保守性替代)。
实施例2LbeIF4A基因的定性此实施例举例说明了利什曼原虫中LbeIF4A DNA的Southernblot分析。所用的L.braziliensis(MHOM/BR/75/M2903)、L.guyanensis(MHOM/BR/75/M4147)、L.amazonensis(IFLA/BR/67/PH8)、L.chagasi(MHOM/BR/82/BA-2，Cl和MHOM/BR/84/Jonas)、L.donovani(MHOM/Et/67/HU3)、L.infantum(IPT-1)，L.major(LTM p-2)、L.tropica(1063C)、Trypanosoma cruzi(MHOM/CH/00/Tulahuen C2)和T.brucei(TREU 667)以前曾有描述(参阅Burns等，美国国家科学院研究进展90775-779，1993)。在无菌培养基中培养原鞭毛虫和短膜型鞭毛虫。L.chagasi和L.amazonensis无鞭毛体分别从Syrian仓鼠肾和BALB/c ByJ鼠足垫中得到，纯化方法如Burns等，免疫学期刊(J.Immunol.)146742-748，1991中所述。
基因组DNA的制备、酶切(酶切位点包括LbeIF4A内的PstI和NotI及LbeIF4A外的BamHI，EcoRI，EcoRV，HindIII，PvuII和SstI)、分离(0.7％的琼脂糖凝胶)和印迹(Nytran(尼龙)膜)如Sambrook等，分子克隆实验室操作手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989中所述。用随机引物法放射性标记LbeIF4A编码区中一个长约0.94kb的酶切片段(143-1083位核苷酸)(见Feinberg和Vogelstein，生化年鉴，137266-268，1984)，与印迹膜65℃杂交过夜。分别用2×，0.5×和0.2×含0.1％SDS的SSC 65℃洗膜两次，每次20分钟。L.brazliensis基因组DNA中至少含有两个拷贝的LbeIF4A，BamHI和PvuII条带中两条杂交带的存在即是例证(图.1)图1还表明L.braziliensis和利什曼原虫其他种中的eIF4A同源类似物具有种间保守性。在所有其他利什曼原虫种中都检测到了两个主要Ps+I杂交片段，测定了L.donovani群的成员(L.chagasi，L.donovani和L.infantum)，显示相同的杂交带型。在严紧杂交条件下，LbeIF4A可以同关系相隔较远的寄生虫T.cruzi杂交，但同T.brucei不杂交。这些数据表明利什曼原虫eIF4A同源类似物具有广泛的种间保守性。
实施例3LbeIF4A的制备此实施例举例说明了长约45kD的LbeIF4A抗原基因产物的表达和纯化。从500毫升IPTG诱导的培养物中纯化来自基因组克隆pLeIF.1的45kDa重组抗原(即缺少氨基端48个残基的抗原)。分离内含体，然后用含2、4和8M尿素的10ml TNE(50mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl和10mM EDTA)依次洗涤。含有溶解的重组抗原的部分(通常为4和8M尿素上清)经收集后，用Tris缓冲的盐溶液(TBS)透析，然后用硫酸铵沉淀浓缩。经制备型的SDS-PAGE胶电泳，切割和电洗脱将重组抗原纯化至均一。在Limulus阿米巴样细胞检测(方法由Immunex Corp.，Seattle，WA提供)中，本研究所用的所有抗原均含有少于10pg/ml或1ng/ml的内毒素蛋白。此剂量的内毒素对细胞因子诱导和/或佐剂活性都不重要。
重组抗原用于免疫小鼠以产生多克隆抗体。用包含100μg纯化LbeIF4A的不完全弗氏佐剂(IFA，GIBCO，Grand Island，NY)连同100μg胞壁酰二肽(佐剂肽，Calbiochem-Novabiochem Corp.，La Jolla，CA)静脉免疫一成年兔(New Zealand White；R&R Rabbitry，Stanwood，WA)。四周后用含100μg重组抗原的IFA增强免疫。三周后，用含25μg LbeIF4A的生理盐水增强免疫，一周后收集血清。
随后，用多克隆兔抗血清作探针，对来自原鞭毛虫的L.braziliensis裂解物进行免疫印迹分析(图2)，其中的原鞭毛虫收集于对数期的早、中、晚期或是在培养温度由22℃变为35℃之后。图2的A组展示了分子量标记(带M)、未诱导(带1)及诱导培养的(带2)的大肠杆菌裂解物和纯化的重组抗原(带3)的免疫印迹分析结果。图2的B组展示了L.braziliensis原鞭毛虫裂解物(带1)、L.chagasi原鞭毛虫裂解物(带2)和L.amazonensis原鞭毛虫裂解物(带3)或无鞭毛体裂解物(带4)的免疫印迹分析结果。
通过对细胞沉淀的在不含甘油和β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中冻融裂解制备寄生虫和哺乳动物细胞裂解物。在一微显离心机中10Krpm离心除去上清中的不溶物质。用Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。5到10μg的寄生虫或细胞提取物或0.5到1.0μg的重组抗原用12.5％的SDS-PAGE分离，电泳转移至硝基纤维素膜上。如前人(Skeiky等，实验医学期刊(J.Exp.Med.)176201-211，1992)所述，应用I125标记的蛋白A放射自显影测定抗血清活性，兔抗血清检测到一个大小约为45kD的优势蛋白。对所有分析的裂解物来说其45kD eIF4A同源类似物具有相似的相对强度，这表明在寄生虫生长对数期的早、中和晚期或是在培养温度由22℃变为35℃之后(模仿细胞内无鞭毛体阶段)此抗原仍持续表达。这一点与利什曼原虫热休克蛋白家族的成员不同，后者在培养温度由22℃变为35℃之后可提高表达。免疫前兔血清不与寄生虫裂解物反应。
实施例4制备与LbeIF4A结合的单克隆抗体此实施例举例说明了抗LbeIF4A的单克隆抗体的制备。纯化的LbeIF4A制备物或高水平表达LbeIF4A的转染细胞可依常规方法(如美国专利No.4,411,993所述)用于产生LbeIF4A单克隆抗体。此抗体可用来干扰LbeIF4A对PBMC的活化，也可用于LbeIF4A的诊断或研究检测，或是用于LbeIF4A的亲和纯化。
为免疫啮齿类动物，LbeIF4A免疫原乳化至一佐剂(如完全或不完全弗氏佐剂，明矾，或另一个佐剂如Ribi佐剂R700(Ribi，Hamilton，MT))中，用10到100μg的量静脉注射给选择的啮齿类动物，如BALB/c小鼠或Lewis大鼠。十天到三个星期之后，注射免疫原增强免疫，之后每一周、两周或三周阶段性增强免疫。采用后眼球取血或尾端切断的方法阶段性取血，用于点杂交检测(抗体夹心法)或ELISA(酶联免疫吸附法)。其他方法也可使用，如Th1应答引发的抑制。
测定适当的抗体浓度后，将盐水中的抗体静脉注射给阳性动物。三到四天后，杀死动物，收获脾细胞，融合于骨髓瘤细胞系(如NS1或优选的Ag8.653[ATCC CRL 1580])。将此步产生的杂交瘤细胞系铺于含选择性培养基(如，一包括次黄嘌呤核苷酸，氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷，或HAT的培养基)的多孔微滴定板上，以抑制非融合细胞、骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞和脾细胞-脾细胞杂交细胞的增殖。
如此得到的杂交瘤细胞系可用于ELISA筛选以确定与LbeIF4A的反应活性，例如，可采用Engvall等(免疫化学[Immunochem.]8871，1971)和美国专利No4,703,004中所述技术。优选的筛选技术为抗体捕捉技术(如Berkman等，免疫学期刊1444212，1990所述)。例如，杂交瘤细胞系可通过有限稀释或于软琼脂中克隆来克隆以产生单克隆细胞系。阳性克隆然后注射到同系啮齿类动物的腹腔中以产生带有高浓度(＞1mg/ml)的抗LbeIF4A单克隆抗体的腹水。产生的单克隆抗体可用硫酸铵沉淀然后用凝胶排阻层析的方法加以纯化。或者使用基于抗体同蛋白G或蛋白A结合的亲和层析，如同基于与LbeIF4A结合的亲和层析。
实施例5LbeIF4A对PBMCs增殖的刺激作用此实施例举例说明了纯化LbeIF4A对来自L.braziliensis感染个体的PBMC增殖的刺激能力。外周血来自生活于一有地方性L.braziliensis传播地区中的个体，其中本地区的流行病学、临床及免疫学调查已做了十多年。对病人的诊断用下面三项中至少一项临床调查结果进行从损伤处分离寄生虫、应用利什曼原虫裂解物的阳性皮肤试验，或阳性血清试验。
收集外周血，用FicollTM(Winthrop实验室，纽约)密度离心分离PBMC。对于体外增殖检测，以2-4×105个细胞/孔于96孔板培养5天，采用带有或不带有10μg/ml指定抗原或5μg/ml PHA(SigmaImmunochemicals，St.Louis，MO)的完全培养基(RPMI1640，补加有庆大霉素、2-ME、L-谷氨酰胺和10％过筛收集的A+人血清；Trimar，Hdlywood，CA)。培养到最后18小时时，用1μCi的[3H]胸腺嘧啶辐射细胞。
数据以三份培养液的平均cpm的形式给出，刺激指数(SI)定义为带抗原培养液与不带抗原培养液平均cpm之比。如表I和图3所示，来自大多数(＞70％)的粘膜和活动的或痊愈的皮肤型病人的PBMC对LbeIF4A的应答表现出不同的增殖方式，其刺激指数的变化范围分别为12到233和2到64。
表I对寄生虫裂解物和LbeIF4A抗原应答，来自L.braziliensis感染个体的PBMC的体外增殖[3H]Tdr掺入(平均cpm(SD)×10-3)患者介质 裂解物 LbeIF4ASISI黏膜组JV 0.15(0.0)41.30(1.3)29411.90(4.8) 81SZ 0.45(0.1)140.60(7.6) 308105.90(5.6)233AB 0.42(0.3)44.20(0.5)1045.00(1.3) 12NO 0.38(0.1)52.70(3.3)13812.80(1.6) 33TE 0.18(0.0)27.40(1.5)1508.80(0.3) 48MB 0.18(0.0)300.10(9.4) 1634 41.50(4.5) 226OM 0.28(0.0)35.40(3.2)1246.90(2.5) 24皮肤组AS 0.22(0.0)19.14(1.3)87 14.30(2.3) 64JP 0.25(0.0)55.63(8.6)2184.40(0.3) 17VS 0.17(0.0)0.26(0.0) 1.50.3(0.0) 2RJ 0.10(0.0)0.32(0.2) 3.01.5(0.6) 15JA 0.16(0.0)0.77(0.1) 4.72.5(0.2) 16AD 4.20(1.0)4.01(1.0) 0.014.1(2.2) 3.5HN 0.36(0.0)4.73(1.7) 13 4.69(1.7) 13弥散皮肤组VAL 0.22(0.0)0.51(0.3) 2.02.12(0.2) 9.0自愈皮肤组GS 0.21(0.0)19.70(4.4)94 41.50(2.8) 198MS 0.09(0.0)0.60(0.1) 6.55.10(2.1) 57AH 0.11(0.0)59.60(7.1)5199.60(4.7) 83DJ 0.12(0.0)0.20(0.1) 1.619.00(6.7) 151HS 0.12(0.0)27.10(2.0)22512.40(2.7) 103MCT 0.38(0.0)130.30(14)3406.20(1.5) 16正常组LV 0.14(0.0)0.19(0.0) 1.40.71(0.1) 4.0VV 0.18(0.0)0.31(0.1) 1.70.28(0.1) 1.5N3 0.14(0.0)0.36(0.1) 2.60.27(0.1) 1.9N4 0.59(0.1)2.00(0.3) 3.80.56(0.0) 1.0
一般说来，粘膜型个体的PBMC的刺激指数要高一些。一些粘膜型个体的PBMC对LbeIF4A应答的刺激指数可同对寄生虫裂解物应答的刺激指数相比。有趣的是，在一些皮肤型利什曼病患者中，对LbeIF4A的增殖应答要高于对寄生虫裂解物的应答。同粘膜型和皮肤型病人相比，6个自愈皮肤型个体的PBMC对LbeIF4A应答的增殖刺激指数(16-198)可同粘膜型个体相比。两个自愈皮肤型个体(MS和DJ)的PBMC的应答要明显高于从寄生虫裂解物获得的应答。LbeIF4A对来自未感染个体的细胞只有轻微的刺激作用。
实施例6LbeIF4A对PBMCs中细胞因子mRNA表达的刺激作用此实施例给出的是PBMC中细胞因子mRNA表达模式的分析，其中PBMC来自确定有L.braziliensis感染的病人。为分析细胞因子mRNA，0.5到1ml的PBMC(1-2×106细胞/毫升)在含有或不含有10μg/ml的缺少SEQ ID NO2氨基末端48个残基的LbeIF4A抗原(如实施例3中所述)的条件下培养48到72个小时。收获上清和细胞，用聚合酶链反应(PCR)分析细胞因子mRNA。为PCR分析细胞因子mRNA，用酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提法(如Chomczynski和Sacchi，分析生化(Anal.Biochem.)162156-159，1987所述)分离PBNC中总RNA。用poly(dT)(Pharmacia)和AMV逆转录酶(Bethesda研究实验室，Gaithersburg，MD)合成cDNA，cDNA的终体积为20μl。cDNA样品用水稀释到200μl。
β-肌动蛋白标准化后，用Taq聚合酶(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)PCR扩增12到20μl稀释的cDNA，50ml反应体系中还包括0.2μM相应的5’和3’引物。反应条件为94℃变性(β-肌动蛋白、IL-2和IL-41分钟；IFN-γ45秒；IL-10 30秒)，55℃退火(β-肌动蛋白、IL-2和IL-41分钟；IL-10 30秒)或60℃45秒(IFN-γ)，72℃延伸。通过一开始将cDNA梯度稀释并变化PCR循环次数证实我们的PCR条件在半定量范围内。在下面所有实验中，β-肌动蛋白、IL-2、IL-4和IFN-γ扩增反应用30个循环；IL-10 PCR为25个循环。
所用引物对和PCR条件来自发表的文献β-肌动蛋白、IL-2、IL-4和IFN-γ(Ehlers等，实验医学期刊17323-36，1991)和IL-10(Viera等，美国国家科学院研究进展881172-1176，1991)。5’和3’寡聚核苷酸引物的核苷酸序列分别列于下面(1)β-肌动蛋白，TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA 和CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG；(2)IL-2，ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT和GTCAGTGTTGAGATGATGCTTTGAC；(3)IL-4，ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT 和CGAACACTTTGAATATTTCTCTCTCAT； (4)IFN-γ，ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTT和GATGCTCTTCGACCTCGAAACAGCAT； (5)IL-10，TCTCAAGGGGCTGGGTCAGCTATCCCA 和ATGCCCCAAGCTGAGAACCAAGACCCA。
探针来自含有人IL-2、IFN-γ、IL-4序列(Lewis等，美国国家科学院研究进展859743-9747，1988)和β-肌动蛋白序列的质粒(no.65128；美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)，分别用HindIII/EcoRI，EcoRI，SacI/HindIII和EcoRI酶切。从来自正常供体的经有丝分裂原刺激的PBMC中进行PCR克隆出人IL-10 cDNA，其中应用设计的引物扩增出一包括人IL-10全部编码区的535碱基对片段(Lewis等，美国国家科学院研究进展859743-9747，1988)。cDNA亚克隆于pBluescript，然后用BamHI/EcoRI切割。1％琼脂糖凝胶分离后，切下插入的DNA片段，电洗脱，并纯化。随机引物法制备放射性标记的32P-探针。
PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，转到尼龙膜上，用带放射性标记的32P-DNA插入段探测。55℃杂交过夜，然后55℃分别用包含0.2％SDS的2×和1×SSC洗两次，每次20分钟。
图4A和4B给出了分析结果。细胞因子PCR分析所用细胞包括培养前的细胞(带0)，不带抗原条件下培养的细胞(带-)，带有10μg/ml利什曼原虫裂解物培养的细胞(带Lb)，带有10μg/ml LbeIF4A培养的细胞(带IF)。图4A显示的是PBMCs分析中六个粘膜型病人中的三个(JV，SZ，TE)和一个患有L.amazonesis感染病人(VA)(表现为弥散皮型利什曼病(DCL))的细胞因子mRNA的PCR结果。对于六个粘膜型病人的三个(图4A中的TE；未显示的NO和EO)，其中未在体外培养的PBMC中可检测到IFN-γ、IL-2和IL-4(病人TE和EO)。在所有的粘膜型病人的“待测”PBMC中未能检测到IL-10mRNA。但是，经过在缺少抗原刺激的条件下的体外培养，大多数分析的粘膜型PBMC中IL-10mRNA的合成有所增加，另外，在病人TE，NO和EO的“待测”PBMC中所检测到的细胞因子mRNA的水平则降低到背景水平。
寄生虫裂解物刺激Th1细胞因子IFN-γ和IL-2以及Th2细胞因子IL-4(六个病人中的三个)的mRNA的表达。一个病人的PBMC(SZ)与寄生虫裂解物共培养后可检测到IL-10mRNA增加。LbeIF4A抗原和寄生虫裂解物在所有粘膜型病人的PBMCs中均引发产生IFN-γ，和IL-2mRNA，其中LbeIF4A只引发Th1细胞因子。实际上，LbeIF4A在大多数未经抗原刺激的粘膜型病人的培养PBMC中调节减少IL-10mRNA的合成。有趣的是，同粘膜型病人PBMC类似，DCL病人VA中的IL-10mRNA的合成也受LbeIF4A下调节。
一般来说，抗原刺激前IFN-γ和IL-2mRNA在溴化乙锭染色的胶中目测不到，经抗原刺激后，可提高到易于检测的水平。但是，细胞因子IL-4和IL-10mRNA只有在分辨的PCR产物放射探测后才能检测到，表明这些细胞因子mRNA为低丰度的mRNA。
皮肤型病人的PBMC用于类似的PCR分析(图4B)。来自被分析的四个病人的三个(VS，JP和CA(未显示))中的新制备的PBMC表明被检测的Th1细胞因子(IFN-γ和IL-2)和Th2细胞因子(IL-4和IL-10)的mRNA的水平都很高。在从第四个皮肤型病人(AS)中新制备的PBMC中可检测到IFN-γ和IL-2mRNA，但检测不到IL-4和IL-10mRNA。因此，与粘膜型病人相比，在新制备的皮肤型利什曼氏病患者PBMC中，除IL-4、IL-2和IFN-γ外也可检测到IL-10mRNA。有趣的是，在无抗原存在的情况下体外培养PBMC后，IL-2和IFN-γmRNA的水平降低到几乎检测不出来，而IL-10则没有受影响或升高。因此，在皮肤型病人中，IL-10mRNA的自发水平或是稳定的或是其中PBMC在无抗原刺激的情况下持续合成IL-10mRNA。对皮肤型利什曼病人来说，观察这样的应答可用来区分预计发展为慢性皮肤型利什曼病的个体和能够自愈的个体。
所有检查的皮肤型病人对LbeIF4A抗原和寄生虫裂解物的应答可以增加IFN-γ和IL-2mRNA的合成，对四个病人中两人(VS和AS)来说，用寄生虫裂解物刺激后，IL-4的水平也有提高。在可检测到IL-10自发水平的三个病人中，LbeIF4A和寄生虫裂解物可调节降低IL-10mRNA的表达。
能自愈的CL病人的PBMC中的细胞因子特征同ML病人的相似之处在于(a)除一个病人IL-10mRNA可检测到之外，从四个病人中其他三个新制备的PBMC可检测到IL-4、IL-2和IFN-γ，但是IL-10mRNA的水平很低或没有；(b)在无抗原存在的情况下培养PBMC后，IL-10mRNA受调节提高表达，而IL-2、IFN-γ和IL-4mRNA的水平降低到背景水平；(c)利什曼原虫裂解物刺激混合的Th1/Th2细胞因子表达，而LbeIF4A只引发提高Th1-型细胞因子mRNA的表达，并下调大多数自愈个体(未显示)的培养PBMC中IL-10mRNA的表达。
实施例7LbeIF4A对PBMC中细胞因子分泌的刺激作用此实施例给出的是，用缺少SEQ ID NO2氨基端48个残基(如实施例3中所述)的LbeIF4A抗原或寄生虫裂解物刺激后，L.braziliensis感染个体的PBMC培养上清中分泌细胞因子的水平。等分的PBMC上清用于检测IL-4、IL-2、IFN-γ和IL-10。IFN-γ的定量采用双夹心ELISA法，其中用鼠抗-人IFN-γ单抗(Chemicon，Temucula，CA)和多克隆兔抗-人IFN-γ血清(Genentech Inc.，San Francisco，CA)。人重组IFN-γ(rIFN-γ)(Genentech Inc.，San Francisco，CA)用于产生标准曲线。上清中IL-4的定量采用双夹心ELISA法，其中用鼠抗-人IL-4单抗(M1)和多克隆兔抗-人IL-4血清(P3)。人IL-4(Immunex Corp.，Seattle，WA)用于产生标准曲线，范围在50pg/ml到1ng/ml。IL-10定量采用鼠抗-人IL-10单抗(PharMingen，San Diego，CA，Cat.#18551D)以“捕捉”分泌的IL-10，和生物素化的鼠抗-人IL-10单抗(PharMingen，San Diego，CA，Cat.#18562D)，用结合有亲和素的辣根过氧化物酶和ABTS作为底物来检测结合的IL-10。标准曲线用重组人IL-10(rIL-10)(由DNAX Reseach研究所惠赠，Palo Alto，CA)来得到，范围从30pg到2ng/ml。
来自三组病人(即，粘膜型、皮肤型和自愈皮肤型)的细胞经10μg/ml LbeIF4A或10μg/ml寄生虫裂解物刺激分泌IFN-γ和TNF-α(图5和6)。同其类似，LbeIF4A刺激感染L.tropica的病人(DesertStorm病人)的PBMC增殖并分泌IFN-γ(未显示)。在病人PBMC上清中检测到的IFN-γ和TNF-α的水平明显高于未感染对照。在缺少抗原刺激的情况下，只有粘膜型病人(六人中的五位)的PBMC上清中产生可检测到的TNF-α(60-190pg/ml)。所有被分析的上清中检测不到或只有微量的TNF-α(未显示)，这表明其表达水平低于所用ELISA的检测限。通过比较，利什曼原虫裂解物同样刺激PBMC分泌IFN-γ和TNF-α，并且在一些病人中，IL-10也能被检测到(未显示)。总之，结果表明，LbeIF4A在L.braziliensis感染者PBMC中刺激优势Th1细胞因子，而寄生虫裂解物则刺激混合的Th1/Th2细胞因子。
经抗原刺激的粘膜型和自愈型个体的病人PBMC培养上清中TNF-α的检测水平要高于皮肤型病人(图6)。五位粘膜型病人中四位(JV，SZ，AB和MB)的PBMC培养上清中的TNF-α水平(0.8到2.20ng/ml)高于经寄生虫裂解物刺激的未感染对照。与其类似，同样的PBMC经LbeIF4A刺激后上清中TNF-α的浓度在0.66到3.14ng/ml之间。同未感染对照相比，被分析的六个自愈型病人中的三个(GS，HS和MCT)PBMC对寄生虫裂解物的免疫应答产生较高水平的TNF-α，被分析的六个自愈型病人(GS，MS，AH，DJ，HS和MCT)全部对LbeIF4A的免疫应答产生较高水平的TNF-α。对寄生虫裂解物免疫应答的皮肤型利什曼病患者PBMC所产生的TNF-α与未感染对照接近。但是，LbeIF4A刺激的三个病人(RJ，AD和JS)的PBMC产生TNF-α。这些病人可能处在急性皮肤型利什曼病的发展过程中。
实施例8LbeIF4A对产生IL-12的刺激作用此实施例表明了LbeIF4A刺激L.braziliensis感染个体的PBMC，以及来自正常供体血液的PBMC或培养的人巨噬细胞或粘附性PBMC和人骨髓瘤细胞系THP-1分泌IL-12。已表明IL-12在细胞介导的免疫的发展过程中以及对在细胞内细菌性或寄生虫感染中Th1应答的产生和IFN-γ的产生起着重要的调节作用。用作LbeIF4A抗原的LbeIF4A多肽缺少SEQ ID NO2的氨基端48个残基(如实施例3中所述)。
用RIA(检测限为10pg/ml)对细胞上清中IL-12p40定量，所用mAb对为C11.79/C8.6(如D’Andrea等，实验医学期刊1791387-1398，1992所述)。具生物活性的IL-12 70异源二聚体的定量(检测限为1pg/ml)如Kubin等所述(血液(Blood)831874-1855，1994)。
图7A表明，10μg LbeIF4A(LeIF)刺激粘膜型病人PBMC所分泌的IL-12p40要比10μg寄生虫裂解物作为抗原(Lb)时的量明显高。无裂解物或抗原存在时，IL-12p40的分泌量也已给出(Med)。此图还表明，用LbeIF4A(LeIF+IL-10)或裂解物(Lb+IL-10)刺激病人的PBMC后，10μg IL-10可调节降低IL-12p40的产生。
未感染个体的PBMC同LbeIF4A一起培养后也可产生IL-12p40(LeIF，图7B)，而对寄生虫裂解物(Lb)的免疫应答则检测不到IL-12p40。这说明IFN-γ对于在病人PBMC中观察到的裂解物诱导产生的p40有一定的作用，抗原刺激后病人PBMC中产生的IFN-γ要比正常PBMC的高出5到100倍(见图5)。
为判定在抗原刺激的PBMC培养中观察到的IL-12p40是否反映生物活性细胞因子，在这些培养中也检测了IL-12p70(图7C和7D)。p70的产生一般平行于p40的产生，这说明病人和正常PBMC对LbeIF4A的免疫应答可产生具有生物活性的IL-12。
在培养的人巨噬细胞(图9A)和粘附性PBMC(图9B)中也刺激产生IL-12。通过对正常供体血液的PBMC的Ficoll-hypaque密度梯度离心来分离制备粘附细胞。2×106PBMC在500μlRPMI(含2％人AB血清)中培养2小时。用PBS洗板三次纯化粘附细胞。接着加入500μl含相应刺激物(IFN-1000U/ml，LbeIF4A(Lf)10μg/ml)的检测液(RPMI，2％人AB血清)。18小时后收获上清。
使用五天龄的PHA胚细胞用一种俘获生物检测法对粘附性PBMC中产生的IL-12进行定量。简单说，将IL-12俘获抗体C11.5.14(由Wistar研究所惠赠)包被于96孔板上。将诱导反应上清以及作为对照的重组IL-12孵育4小时。洗几遍后，加入五天龄的PHA胚细胞，胚细胞的增殖用于判定粘附细胞上清中IL-12的浓度。
将粘附细胞(2×106PBMC)在检测液中培养五天产生巨噬细胞。然后用PBS洗，加入500μl RPMI，2％人AB血清和1000U/mLIFN-γ。巨噬细胞用LbeIF4A(10μg/ml)刺激或单独培养于培养液(M)中。在另一组中，LbeIF4A对照巨噬细胞在500μl RPMI，2％人AB血清(无IFN-γ)中同LbeIF4A一起培养。18小时后收获上清，用于诱导IL-12依赖性增殖。简单说，用巨噬细胞上清培养五天龄胚细胞两天。最后18小时时加入3H胸腺嘧啶。如前所述加入中和性抗-IL-12多克隆羊血清(5μg/ml)。
另外，LbeIF4A刺激人骨髓瘤细胞系THP-1中IL-12p40的产生(图10)。细胞以106个细胞/毫升的密度在含5％胎牛血清的无内毒素的RPMI培养基中培养24-48小时。IFN-γ协同10μg/ml LbeIF4A刺激THP-1细胞分泌IL-12p40。这些结果表明LbeIF4A可用作疫苗佐剂。
实施例9IL-12和IL-10对LbeIF4A诱导产生IFN-γ的影响此实施例研究了LbeIF4A多肽免疫应答中IL-12、IL-10和IFN-γ的相互作用，其中LbeIF4A多肽缺少SEQ ID NO2的氨基端48个残基(如实施例3中所述)。如图8A所示，用10μg/ml LbeIF4A(LeIF)或加上10ng/ml的抗-IL-12(LeIF+抗-IL-12)或加上10ng/ml IL-10(LeIF+IL-10)刺激粘膜型利什曼病患者的PBMC，培养上清用于检测IFN-γ的分泌。抗-IL-12单抗和IL-10均阻止LbeIF4A诱导的IFN-γ的分泌。但是，抗-IL-12单抗仅部分减少利什曼体裂解物刺激后的IFN-γ的产生(图8B)。这些结果表明IFN-γ的产生依赖于IL-12，并被IL-10抑制，而IL-12的产生可以由IFN-γ依赖的和不依赖的两种途径来调节。
实施例10LbeIF4A对小鼠Th1的刺激作用此实施例举例说明了缺少SEQ ID NO2氨基端48个残基的LbeIF4A(如实施例3中所述)在BALB/c小鼠中刺激优势Th1细胞因子。以quilA或CFA作为佐剂用LbeIF4A或8E(L.braziliensis线粒体hspP70的羧基端部分，能够刺激病人PBMC产生高水平的IL-10)接种动物。接种十天后，用重组抗原体外再次刺激淋巴结(LN)细胞，培养上清用于分泌细胞因子的分析。结果(图11)表明，用LbeIF4A接种的小鼠的LN细胞在用LbeIF4A和两种类型佐剂激发后可增殖并分泌几乎单一的Th1细胞因子(IFN-γ)。比较而言，用8E接种的小鼠的LN细胞对8E激发的特异应答产生Th0应答或Th1/Th2型细胞因子(用quilA作为佐剂)，其中极其偏向于产生Th2细胞因子IL-4和IL-10。与此相似，用寄生虫裂解物接种小鼠产生一混合的细胞因子，此结果可反驳把寄生虫裂解物单独用作疫苗候选物的做法(图11)。
这些结果表明LbeIF4A可用作免疫佐剂，也可用作特异性T细胞疫苗。因为LbeIF4A可诱导一强烈的Th1应答，其中包括与实验利什曼病肯定相关的两种细胞因子IFN-γ和IL-12，我们研究了此抗原对小鼠利什曼病的保护能力。用无佐剂LbeIF4A免疫BALB/c小鼠一次，七天后静脉注射L.major。同对照组相比，LbeIF4A对L.major提供明显的保护(图12)。因此来自L.braziliensis的异源蛋白能够对L.major感染产生保护，这表明在这两种寄生虫之间至少有一些保守的“保护性”抗原决定簇。
实施例11LmeIF4A的制备此实施例举例说明了来自L.major的LbeIF4A新变体的制备。
用ZAP-cDNA单向克隆试剂盒(Stratagee，La Jolla，CA)构建一包括L.major polyA+RNA的cDNA文库。用放射标记的含有SEQ IDNO1中258到1188位核甘酸的DNA探针筛选大约500,000pfu。杂交后用含0.1％SDS的0.5×SSC55℃洗膜。这样鉴定出一含有约2.5kb插入的克隆(LmeIF4A)。pBSK(-)噬菌粒序列参照制造商给出的程序切割。核酸内切酶III处理插入的cDNA得到重叠的克隆，然后用Taq染料终止子测序。
发现LmeIF4A大约2.7kb cDNA插入片段包括全部编码序列，以及5’剪切的前导序列和3’旁侧序列。使用5’和3’特异的寡聚核苷酸PCR扩增包含LmeIF4A全部编码序列的片段。5’寡聚核苷酸在ATG起点之前含有一NdeI位点。克隆到pET载体(Novagen，Madison，WI)的NdeI位点后，蛋白的第一个氨基酸为非融合的重组LmeIF4A的起始密码子(Met)。应用胞浆载体pET和T7聚合酶表达系统(Novagen，Madison，WI)在大肠杆菌中表达非融合的全长重组LmeIF4A(rLmeIF4A)。分离包涵体，然后用含有2、4和8M尿素的10ml TNE(50mM Tris，pH8.0，100mM NaCl，10mM EDTA)洗涤两次。含重组抗原的8M尿素部分上样于制备型SDS-PAGE胶。通过制备胶的电洗脱或HPLC纯化重组LmeIF4A。终产物中细菌内毒素可忽略(内毒素含量用Limulus法测定)。
LmeIF4A cDNA的部分序列分析(SEQ ID NOS3和4)表明LmeIF4A和分离自L.braziliensis的抗原(在核酸和氨基酸水平上)具有相当的同源性(即氨基酸序列等同性大于90％)。
实施例12抗原特异性CTL应答的引发此实施例举例说明了用如上所制备的LmeIF4A引发一针对卵清蛋白的特异性CTL应答。
用30μg可溶性卵清蛋白(Sigma，St.Louis，MO)单独(ova)或同包埋于聚乳酸乙醇酸苷小珠(Southern Research Institute，Birmingham，AL)的50μg LmeIF4A一起(Lmeif/PLG)免疫C57BL/6小鼠(H-2b)一次。其他组小鼠还用包埋于PLG小珠的LmeIF4A免疫(ova+Lmeif/PLG)或PLG单独免疫。用于实验的小珠的大小范围在1到10μm之间。
免疫三周后，杀死小鼠，取脾。为得到效应细胞，脾细胞经5天辐射(20,000拉德)后，用表达ova的EG7.ova细胞体外刺激。EG7.ova细胞系通过用包含ova cDNA的β-肌动蛋白控制下的质粒转染EL4胸腺瘤细胞系(H-2b)(传染病研究所，Seattle，WA)而得到，(如Moore等，细胞54777-785，1988所述)
通过能够裂解51Cr标记EG7.ova但不裂解51Cr标记未转染的亲本EG7.ova的效应细胞的存在估价接种。结果显示于图13，以百分毒性和效应细胞与靶细胞比的函数表示。这些结果证明了用可溶性卵清蛋白和LmeIF4A一起免疫的小鼠表现出良好的可特异地杀死靶细胞的CTL免疫应答。在用LmeIF4A，PLG或可溶性卵清蛋白自身免疫小鼠均检测不到特异的CTL引发。
实施例13对三硝基苯酚特异抗体的刺激作用此实施例举例说明了LmeIF4A对抗-三硝基苯酚(TNP)抗体的增强作用。
3μg TNP-KLH加明矾、或LmeIF4A(75μg)或生理盐水0天腹腔免疫C57BL/6小鼠。第十天取血，第21天增强免疫(同原始免疫)，第26天取血。用酶连免疫吸附检测法(ELISA)检测TNF特异的同型特异抗体应答。数据以每个ELISA中产生最大OD值(用线性回归分析计算)的50％时每个抗血清稀释度对数值的形式显示于图14。
这些结果表明LmeIF4A同单独使用抗原相比可显著增强抗体的应答。特别有趣的是，与Th2应答关系最为密切的抗体类型IgE观察不到明显增加。另外，如上所述注射TNP-KLH(3μg)加LmeIF4A(75μg)一次即可增强基础IgM和IgG抗体应答。
实施例14对MUC-1特异抗体产生的增强作用此实施例举例说明了用LmeIF4A来增强MUC-1特异抗体的产生。
用人肿瘤抗原MUC-1同LmeIF4A的不同组合免疫C57BL/6小鼠。小鼠的分组包括用可溶性MUC-1(带有或不带有可溶性LmeIF4A)以及固定于PLG小珠上的MUC-1(带有或不带有可溶性LmeIF4A)免疫的小鼠。两种不同大小的小珠用于MUC-1/PLG实验中。其中所用的一批小珠的大小为1-10μm，另一批为40-100μm。免疫后10、20和30天取血，血清用于检测MUC-1特异抗体(IgM和IgG)的存在。血清还可用来检测同型抗体μ，γ2a，γ2b，γ1的存在。
结果(图15所示)证明用MUC-1或MUC-1加上LmeIF4A一次免疫不足以产生抗-MUC-1抗体应答，当MUC-1包埋于PLG珠中时LmeIF4A可显著增强抗体应答。包埋于小PLG珠中的MUC-1据推断早在第一次免疫后10天即可诱导强烈的抗-MUC-1应答，LmeIF4A的加入进一步增强了抗体应答。用包埋于大PLG珠的MUC-1一次免疫在10天之内检测不到抗-MUC-1抗体，但是结合LmeIF4A后大PLG珠中MUC-1免疫小鼠则可观察到增强的应答。抗-MUC-1抗体的同型抗体分布包括IgM、IgGγ2a、IgGγ2b和IgGγ1，但没有检测到IgE应答。
实施例15对培养细胞中CTL活性的增强作用此实施例举例说明了在培养细胞中LmeIF4A对特异CTL活性的增强作用。
用30μg可溶性卵清蛋白或包埋于PLG珠的同浓度的卵清蛋白免疫小鼠。两周后取脾细胞，用无抗原LmeIF4自身(10μg/ml)、辐射过的EG7.ova或辐射过的EG7.ova加上LmeIF4A(10μg/ml)体外刺激。结果见图16。
结果表明卵清蛋白/PLG免疫小鼠体内可敏化卵清蛋白特异的CTL，这可用刺激性应答脾细胞和EG7.ova刺激细胞来检测。更进一步，卵清蛋白酶化的肾细胞中产生的CTL在加入LmeIF4A(10μg/ml)到含EG7.ova的培养液中后可显著提高。应注意的是将EG7.ova或EG7.ova加上LmeIF4A用于第一次体外培养时，总单核细胞的数量没有改变(见下面表2和3)。
表IILmeIF4A增强离体CTL活性免疫物离体刺激物裂解单位(LU)/106个单核细胞无无抗原 0LmeIF4A自身 0EG7.ova 0LmeIF4A+EG7.ova 0小珠 无抗原 0LmeIF4A自身 0EG7.ova 0LmeIF4A+EG7.ova 0卵清蛋白/小珠 无抗原 0LmeIF4A自身 0EG7.ova 2.5LmeIF4A+EG7.ova 16.6表III来自含LmeIF4A培养物的单核细胞的回收免疫物 体外刺激物 回收的细胞数目(LU)(106)/107个加入的单核细胞卵清蛋白/PLGA 无抗原 1.8LmeIF4A自身 2.4EG7.ova 2.52LmeIF4A+EG7.ova 2.88可溶性卵清蛋白 3.2可溶性卵清蛋白+LmeIF4A 2.6
我们也评价了LmeIF4A能否用于体外增强和扩大抗原特异的CTL。来自上面提到的卵清蛋白/PLG免疫小鼠的CTL体外用辐射过的EG7.ova加上IL-2或EG7.ova加上IL-12和LmeIF4A再次刺激。培养五天后，用51Cr标记的EL4或EG7.ova细胞检测效应细胞。
结果(如图17所示)表明用EG7.ova加上IL-12和LmeIF4A再刺激的卵清蛋白特异CTL杀死EG7.ova要优于用EG7.ova加上IL-2所产生的效应细胞，但区别不明显。但是，考虑细胞计量后，用LmeIF4A培养产生的效应细胞要比不用LmeIF4A时高出2.5倍。这些结果(见表4)以每培养物中的裂解单位来表示，证明了LmeIF4A体外增加CTL数量的整体强度。
表IV来自含LmeIF4A培养物的单核细胞的回收回收细胞数目(LU)(106)/ 裂解单位免疫物 体外刺激物 106个加入的单核细胞 (LU)/培养物卵清蛋白/PLGA EG7.ova+IL-26.475.2NrEG7.ova+IL-2+LmeIF4A16 388.8实施例16LmeIF4A对同种反应性CTL诱导的增强作用此实施例举例说明了LmeIF4A对鼠同种反应性CTL的诱导作用。
在2ml RPMIFCS(包括或不包括10μg/ml胶纯化的LmeIF4A)中共培养2.5×106BALB/c脾细胞和5×106辐射(3500R)过的C57BL/6脾细胞。五天后收获培养物，洗后检测不同浓度效应细胞(培养物部分)对培养于200μl培养液中的51Cr标记的EL4细胞(2000/孔)的细胞裂解活性(4小时释放测定)。图18中的数据以此释放的百分数来表示，计算公式为
这些结果表明LmeIF4A能够明显增强同种反应性CTL。同上述结果一起表明，利什曼原虫eIF4A同源类似物在一系列检测系统中具有强佐剂活性。进一步讲，利什曼原虫eIF4A同源类似物的IL-12诱导能力和无毒性使之成为独特的佐剂。
实施例17给予LmeIF4A和抗原后的肿瘤抑制用皮下注射的方式免疫6-8周龄的C57BL/6(H-2b)母鼠一次，所用免疫物包括50μg LmeIF4A或30μg包埋于聚乳酸乙醇酸苷(PLG)小珠的LmeIF4A(LbeIF/PLG)，VSV肽或包埋于PLG珠中的VSV肽，包埋于PLG珠中的GM-CSF，或载体(PBS)。用VSV(带状疱疹病毒)核壳蛋白基因转染EL4细胞得到N1细胞。因为指导VSV核壳蛋白表达的质粒含有一筛选性标记新霉素抗性基因，因此细胞可在含G418的选择性培养基中生长。从大肠杆菌转化物中产生重组LmeIF4A，用HPLC分级分离的方法纯化。化学合成并用HPLC纯化N1特异的肽抗原。蛋白用PLG微球体(Southern Research Institute，Birmingham，AL)包埋。
约2×105N1细胞腹腔接种到C57BL/6小鼠的右侧。可触摸到肿瘤后，小鼠被随机分组，每组5只，将上述各肽皮下注射到小鼠的另一侧。每2到3天测量肿瘤直径并换算成体积(按照公式V＝4/3πr3)，以此检测肿瘤的生长。
检测了LmeIF4A引发针对肿瘤特异性抗原的免疫应答的效力。在鼠肿瘤N1中，H-2Kb分子持续表达八聚体抗原肽抗原决定簇RGYVYQGL。如图19所示，注射VSV/PLG加LmeIF4A/PLG越明显抑制肿瘤的生长。在对照组小鼠和接受其他抗原组合的小鼠中观察不到抑制作用。另一项研究(图20)证实这个结果并且证实LmeIF4A作为佐剂比GM-CSF要好很多。在这个实验中，用肿瘤特异性VSV/PLG加LmeIF4A/PLG对小鼠实施免疫注射后一周肿瘤开始消退。实际上，在这个实验中五只小鼠中的三个的肿瘤完全消失。另外，结合PLG包埋的VSV肽的可溶性LeIF也具有强抗肿瘤活性(图21)。
另外，通过LmeIF4A和肿瘤抗原共免疫所产生的免疫应答非常特异。通过外科手术从未完全消除N1肿瘤的小鼠中取出残留的肿瘤。将残留的肿瘤细胞培养于含有0.2mg/ml G418的培养液中，两天后死亡。与其相比，用于肿瘤接种的原始N1细胞则可以抗G418。因此，残留的肿瘤来自已丢失了包含抗原性VSV序列和新霉素抗性基因的质粒的N1变体。所以，LeIF能够增强针对一预定抗原的特异性免疫应答，此免疫应答对肿瘤具有治疗效果。
实施例18LmeIF对已建立肿瘤的治疗对C57BL/6母鼠皮下注射2×105个Lewis肺癌细胞，8天后检查所有鼠中的肿瘤。然后将鼠分为两组，每组5只。在肿瘤接种后的第8，10，13和16天，在远离肿瘤的部位皮下注射0.2ml生理盐水或50μg LmeIF(溶于0.2ml生理盐水)。在第8、10、13和16天检查肿瘤的生长。如下表所示，16天时接种LmeIF的小鼠的肿瘤生长显著降低。
表VLmeIF对肿瘤生长的抑制作用肿瘤的平均体积(立方毫米)组别8天 10天 13天 16天注射盐水组 5.2112.6141.06283.53注射Lmeif组 6.7910.8326.7569.48从上文中可以认识到，尽管为说明的目的描述了本发明的具体实施方案，在不偏离本发明精神和范围的前提下可进行各种修改。
序列表(1)一般资料(i)申请人Reed，Steven G.
(ii)发明题目增强保护性免疫应答的方法(iii)序列数目4(iv)通信地址(A)收信人SEED and BERRY(B)街道6300 Columbia Center，701 Fifth Avenue(C)城市西雅图(D)州华盛顿(F)邮政编码98104-7092(v)计算机阅读模式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)目前申请材料(A)申请号(B)递交日期16-FEB-1996(C)类别(viii)律师/代理人资料(A)姓名Nottenburg Ph.D.，Carol(B)登记号39，317(C)卷号/备案号210121.404C3(ix)电信资料(A)电话(206)622-4900(B)传真(206)682-6031(2)SEQ ID NO1资料(i)序列特点(A)长度1618碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置115..1326(xi)序列详述SEQ ID NO1CCACTCTCTC GGTCGTCTGT CTCCCACGCG CGCACGCAGT TGATTTCCGC CTTCTTAAAC 60GCTCTCTTTT TTTTTATTTT TCACCTGACC AACCGCACCA CGTCGGCCTC CATC ATG117Met1 1TCG CAG CAA GAC CGA GTT GCC CCA CAG GAC CAG GAC TCG TTC CTC GAC 165Ser Gln Gln Asp Arg Val Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu Asp5 10 15GAC CAG CCC GGC GTC CGC CCG ATC CCG TCC TTC GAT GAC ATG CCG TTG 213Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro Leu20 25 30CAC CAG AAC CTT CTG CGC GGC ATC TAC TCG TAC GGC TTC GAG AAA CCG 261His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr 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Ser Asp Val150 155 160ATC AAG CGC GGC GCG CTG CGC ACC GAG TCC CTG CGC GTG CTG GTG CTC 645Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val Leu165 170 175GAC GAG GCT GAT GAG ATG CTG TCT CAG GGC TTC GCG GAT CAG ATT TAC 693Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile Tyr180 185 190GAG ATC TTC CGC TTC CTG CCG AAG GAC ATC CAG GTC GCG CTC TTC TCC 741Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe Ser195 200 205GCC ACG ATG CCG GAG GAG GTG CTG GAG CTG ACA AAG AAG TTC ATG CGC 789Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met Arg210 215 220 225GAC CCC GTA CGC ATT CTC GTG AAG CGC GAG AGC CTG ACG CTG GAG GGC 837Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu Gly230 235 240ATC AAG CAG TTC TTC ATC GCC GTC GAG GAG GAG CAC AAG CTG GAC ACG 885Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp Thr245 250 255CTG ATG GAC CTG TAC GAG ACC GTG TCC ATC GCG CAG TCC GTC ATC TTC933Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile 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Phe Arg His Asn Leu Ile Gln85 90 95Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu100 105 110Val Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ala Lys Phe Cys115 120 125Glu Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu130 135 140Gln Ala Gly Val Val Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Val Lys Gly Val Ala Ile355 360 365Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Gly370 375 380His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385 390 395 400Leu Gly Glu(2)SEQ ID NO3资料(i)序列特点(A)长度1678碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ix)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置117..1325(xi)序列详述SEQ ID NO3CTTTATTGTT GATTTCCGCC TTCTGAACAG CCCTCATTTT TTTTTGGTTT ACCTCTCGTT60GCTTGTGACG CCCCTCCCCC TCTTCACCCA TCAAGCACCC CCTGTCGTCC TCCATC 116ATG GCG CAG AAT GAT AAG ATC GCC CCC CAG GAC CAG GAC TCC TTC CTC 164Met Ala Gln Asn Asp Lys Ile Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu1 5 10 15GAT GAC CAG CCC GGC GTT CGC CCG ATC CCG TCC TTC GAC GAC ATG CCG 212Asp Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro20 25 30CTG CAC CAG 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ACG CCG GGC CGC GTG TCC GAC596Gln Ala Gly Val Ile Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160GTG ATC AAG CGT GGC GCG CTG CGC ACA GAG TCG CTG CGC GTG CTG GTG644Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175CTC GAC GAG GCT GAT GAG ATG CTG TCT CAG GGC TTC GCG GAC CAG ATT692Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190TAC GAG ATC TTC CGC TTC CTG CCG AAG GAC ATC CAG GTC GCG CTC TTC740Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205TCC GCC ACG ATG CCG GAG GAG GTA CTG GAG CTG ACG AAG AAG TTC ATG788Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220CGC GAC CCC GTG CGT ATT CTC GTG AAG CGC GAG AGC CTG ACG CTG GAG836Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240GGC ATC AAG CAG TTC TTC ATC GCC GTC GAA GAG GAG CAC AAG CTG GAC884Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255ACG CTG ATG GAC CTG TAC GAG ACC GTG TCC ATC GCG CAG TCC GTC ATC932Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270TTC GCC AAC ACG CGC CGC AAG GTG GAC TGG ATC GCC GAG AAG CTG AAC980Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285CAG AGC AAC CAC ACC GTC AGC AGC ATG CAC GCC GAG ATG CCC AAG AGC 1028Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300GAC CGC GAG CGC GTC ATG AAC ACC TTC CGC AGC GGC AGC TCC CGC GTG 1076Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320CTC GTC ACG ACC GAC CTC GTG GCG CGC GGT ATC GAT GTG CAC CAC GTG 1124Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335AAC ATC GTC ATC AAC TTC GAC CTG CCA ACG AAC AAG GAG AAC TAC CTG 1172Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350CAT CGC ATT GGT CGC GGC GGC CGC TAC GGC CGT AAG GGT GTT GCC ATC 1220His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile355 360 365AAC TTC GTG ACG GAG AAG GAC GTG GAG CTA CTG CAC GAG ATC GAG GCG 1268Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Ala370 375 380CAC TAC CAC ACG CAG ATC GAC GAG CTC CCG GTC GAC TTC GCT GCC TAC 1316His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385 390 395 400CTT GGC GAG TAA GCGGGTCCTT GCCTCCCCCC CCCTCCTCCT CCATCCCCAT 1368Leu Gly GluCCCCCACCAC CCCACACACC CCCCCCCCGT TCCTCGTCGG AAGAAGAAAG GACGCACATC 1428GCCACGCGAA GGATGACGAG GGCTGAGGAG GAGCTCAGGG AACGGACTCG TCCCCGGTGA 1488GCGGGGGGAG GAGGAGGTGA GGCCATCGCG CGAGCGCACC GCCGGAAGGT CGACCAGGGC 1548GCTCAACACC CACCCAGCAC CCCGGTAGTT CCCTGCCCTC TCGTGCGCCT CCTCTCCCAC 1608CCCGTAAATC TCCTGACGAC TTTGTGTGGA CCACACACGC GCGCTCTCGC TCCGTATCGG 1668ACGCGCCCTA TACAACACAA CGAACCCGCC AACGTGCCGG TCGNCTTGTG GATGTGTGTC 1728TGGCGTAGAA CGTGCGTCTG CCCCCGTCCC ATCCCCATCC CACCTCCTCG NGTGTGTGTG 1788TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG TGTGTGTGTG AGTGTGTGTG TTTAAAAACT ATNATNTAGA 1848ATATATATCT ATATAGGTN 1867(2)SEQ ID NO4资料(i)序列特点(A)长度403个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列详述SEQ ID NO4Met Ala Gln Asn Asp Lys Ile Ala Pro Gln Asp Gln Asp Ser Phe Leu1 5 10 15Asp Asp Gln Pro Gly Val Arg Pro Ile Pro Ser Phe Asp Asp Met Pro20 25 30Leu His Gln Asn Leu Leu Arg Gly Ile Tyr Ser Tyr Gly Phe Glu Lys35 40 45Pro Ser Ser Ile Gln Gln Arg Ala Ile Ala Pro Phe Thr Arg Gly Gly50 55 60Asp Ile Ile Ala Gln Ala Gln Ser Gly Thr Gly Lys Thr Gly Ala Phe65 70 75 80Ser Ile Gly Leu Leu Gln Arg Leu Asp Phe Arg His Asn Leu Ile Gln85 90 95Gly Leu Val Leu Ser Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln Thr Ala Glu100 105 110Val Ile Ser Arg Ile Gly Glu Phe Leu Ser Asn Ser Ser Lys Phe Cys115 120 125Glu Thr Phe Val Gly Gly Thr Arg Val Gln Asp Asp Leu Arg Lys Leu130 135 140Gln Ala Gly Val Ile Val Ala Val Gly Thr Pro Gly Arg Val Ser Asp145 150 155 160Val Ile Lys Arg Gly Ala Leu Arg Thr Glu Ser Leu Arg Val Leu Val165 170 175Leu Asp Glu Ala Asp Glu Met Leu Ser Gln Gly Phe Ala Asp Gln Ile180 185 190Tyr Glu Ile Phe Arg Phe Leu Pro Lys Asp Ile Gln Val Ala Leu Phe195 200 205Ser Ala Thr Met Pro Glu Glu Val Leu Glu Leu Thr Lys Lys Phe Met210 215 220Arg Asp Pro Val Arg Ile Leu Val Lys Arg Glu Ser Leu Thr Leu Glu225 230 235 240Gly Ile Lys Gln Phe Phe Ile Ala Val Glu Glu Glu His Lys Leu Asp245 250 255Thr Leu Met Asp Leu Tyr Glu Thr Val Ser Ile Ala Gln Ser Val Ile260 265 270Phe Ala Asn Thr Arg Arg Lys Val Asp Trp Ile Ala Glu Lys Leu Asn275 280 285Gln Ser Asn His Thr Val Ser Ser Met His Ala Glu Met Pro Lys Ser290 295 300Asp Arg Glu Arg Val Met Asn Thr Phe Arg Ser Gly Ser Ser Arg Val305 310 315 320Leu Val Thr Thr Asp Leu Val Ala Arg Gly Ile Asp Val His His Val325 330 335Asn Ile Val Ile Asn Phe Asp Leu Pro Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Leu340 345 350His Arg Ile Gly Arg Gly Gly Arg Tyr Gly Arg Lys Gly Val Ala Ile355 360 365Asn Phe Val Thr Glu Lys Asp Val Glu Leu Leu His Glu Ile Glu Ala370 375 380His Tyr His Thr Gln Ile Asp Glu Leu Pro Val Asp Phe Ala Ala Tyr385 390 395 400Leu Gly Glu
权利要求
1.用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的、包括一种抗原和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
2.根据权利要求1的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
3.根据权利要求1的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的1-403位氨基酸或其部分。
4.根据权利要求1的组合物，其中LbeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc区。
5.用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的、包括一种抗原和一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
6.根据权利要求5的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的49-403位氨基酸。
7.根据权利要求5的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸或其部分。
8.根据权利要求5的组合物，其中LmeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc区。
9.用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的、包括一种抗原和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
10.用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的、包括一种抗原和一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
11.根据权利要求1-10的组合物，其中抗原和LbeIF4A或LmeIF4A多肽存在于同一组合物中。
12.根据权利要求1-10的组合物，其中抗原包埋于可生物降解的微球体中。
13.根据权利要求书1-10的组合物，其中LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球体中或结合于其表面。
14.根据权利要求1-10的组合物，其中抗原和LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球体中。
15.用于制备在病人体内增强或引发针对某DNA疫苗的免疫应答的药物的、包括一种DNA疫苗和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
16.根据权利要求15的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO2的49-403位氨基酸。
17.根据权利要求15的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO2的1-403位氨基酸序列或其部分。
18.根据权利要求15的组合物，其中LbeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc区。
19.用于制备在病人体内增强或引发针对某DNA疫苗的免疫应答的药物的、包括一种DNA疫苗和一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
20.根据权利要求19的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的49-403位氨基酸。
21.根据权利要求19的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸或其部分。
22.根据权利要求19的组合物，其中LmeIF4A多肽另外包括一免疫球蛋白Fc区。
23.用于制备在病人体内增强或引发针对某DNA疫苗的免疫应答的药物的、包括一种DNA疫苗和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
24.用于制备在病人体内增强或引发针对某DNA疫苗的免疫应答的药物的、包括一种DNA疫苗和一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的1-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
25.根据权利要求15-24中任一项的组合物，其中DNA疫苗和LbeIF4A或LmeIF4A多肽存在于同一组合物中。
26.根据权利要求15-24中任一项的组合物，其中DNA疫苗包埋于可生物降解的微球体中。
27.根据权利要求15-24中任一项的组合物，其中LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球体中或结合于其表面上。
28.根据权利要求15-24中任一项的组合物，其中DNA疫苗和LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球体中。
29.用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的、包括一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
30.用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的、包括一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
31.一种在生物学样本中增强或引发免疫应答的方法，包括将生物学样本与一种抗原和一种LbeIF4A多肽接触，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽；并且其中生物学样本包括选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞以及其组合的细胞。
32.一种在生物学样本中增强或引发免疫应答的方法，包括将生物学样本与一种抗原和一种LmeIF4A多肽接触，其中LmeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽；并且其中生物学样本包括选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞以及其组合的细胞。
33.一种在生物学样本中增强或引发免疫应答的方法，包括将生物学样本与一种DNA疫苗和一种LbeIF4A多肽接触，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽；并且其中生物学样本包括选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞及其组合的细胞。
34.一种在生物学样本中增强或引发免疫应答的方法，包括将生物学样本与一种DNA疫苗和一种LmeIF4A多肽接触，其中LmeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽；并且其中生物学样本包括选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞及其组合的细胞。
35.一种在生物学样本中增强或引发免疫应答的方法，包括将生物学样本与一种LbeIF4A多肽接触，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO.1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽；并且其中生物学样本包括选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞及其组合的细胞。
36.一种在生物学样本中增强或引发免疫应答的方法，包括将生物学样本与一种LmeIF4A多肽接触，其中LmeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽；并且其中生物学样本包括选自外周血单核细胞、单核细胞、B细胞、树突细胞及其组合的细胞。
37.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种肿瘤抗原和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的CTL应答的多肽。
38.根据权利要求37的方法，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
39.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种肿瘤抗原和一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的CTL应答的多肽。
40.根据权利要求39的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4 49-403的位氨基酸。
41.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种肿瘤抗原和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
42.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种肿瘤抗原和一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
43.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种编码肿瘤抗原的DNA疫苗和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的CTL应答的多肽。
44.根据权利要求44的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
45.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种编码肿瘤抗原的DNA疫苗和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血中单核细胞的CTL应答的多肽。
46.根据权利要求45的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的49-403位氨基酸。
47.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种编码肿瘤抗原的DNA疫苗和一种LbeIF4A多肽的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸；或是其保守性替代和/或修饰变体。
48.用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的、包括一种编码肿瘤抗原的DNA疫苗和一种LmeIF4A多肽的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ ID NO4的49-403位氨基酸，或其保守性替代和/或修饰变体。
49.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的LbeIF4A多肽，包括(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得的外周血单核细胞的CTL应答的多肽。
50.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的LmeIF4A多肽，包括(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得的外周血单核细胞的CTL反应的多肽。
51.根据权利要求39-50中任一项的组合物，其中LbeIF4A或LmeIF4A多肽包埋于可生物降解的微球体中或结合于其表面上。
52.根据权利要求49或50中任一项的组合物，另外包含一种选自细胞因子和化疗试剂的治疗试剂。
53.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的组合物，其包含一种抗原和一种病毒载体，其中在用该病毒载体感染的病人细胞中病毒载体指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
54.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的组合物，其包含一种抗原和一种核酸分子，其中在用该核酸分子转染的病人细胞中核酸分子指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
55.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某DNA疫苗的免疫应答的药物的组合物，其包含一种DNA疫苗和一种病毒载体，其中在用该病毒载体感染的病人细胞中病毒载体指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
56.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某DNA疫苗的免疫应答的药物的组合物，其包含一种DNA疫苗和一种核酸分子，其中在用该核酸分子转染的病人细胞中核酸分子指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
57.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的组合物，其包含一种病毒载体，其中在用该病毒载体感染的病人细胞中病毒载体指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
58.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某抗原的免疫应答的药物的组合物，其包含一种核酸分子，其中在用核酸分子转染的病人细胞中核酸分子指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
59.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的组合物，其包含一种肿瘤抗原和一种病毒载体，其中在用该病毒载体感染的病人细胞中病毒载体指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
60.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的组合物，其包含一种肿瘤抗原和一种核酸分子，其中在用该核酸分子转染的病人细胞中核酸分子指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
61. 一种用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的组合物，其包含一种编码肿瘤抗原的DNA疫苗和一种病毒载体，其中在用该病毒载体感染的病人细胞中病毒载体指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
62.一种用于制备在病人体内增强或引发针对某肿瘤的免疫应答的药物的组合物，其包含一种编码肿瘤抗原的DNA疫苗和一种核酸分子，其中在用该核酸分子转染的病人细胞中核酸分子指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
63.一种用于制备治疗病人肿瘤的组合物，其包含一种病毒载体，在用该病毒载体感染的病人细胞中该病毒载体指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
64.一种用于制备治疗病人肿瘤的组合物，其包含一种核酸分子，在用该核酸分子转染的病人细胞中核酸分子指导LbeIF4A或LmeIF4A多肽的表达。
65.根据权利要求53-64中任一项的组合物，其中多肽是LbeIF4A多肽，后者包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO1的115-1323位核苷酸；(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO1 115-1323位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
66.根据权利要求65的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ ID NO2的49-403位氨基酸。
67.根据权利要求65的组合物，其中LbeIF4A多肽包括SEQ IDNO2的1-403位氨基酸或其部分。
68.根据权利要求53-64中任一项的组合物，其中多肽是LmeIF4A多肽，后者包括选自下组的DNA序列所编码的氨基酸序列(a)SEQ ID NO3的117-1325位核苷酸；和(b)在中等严紧的条件下与SEQ ID NO3 117-1325位核苷酸的互补链杂交的DNA序列，其中该DNA序列编码可以刺激从利什曼原虫感染个体所得外周血单核细胞的Th1免疫应答的多肽。
69.根据权利要求68的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的49-403位氨基酸。
70.根据权利要求68的组合物，其中LmeIF4A多肽包括SEQ IDNO4的1-403位氨基酸或其部分。
71.根据权利要求53或59的组合物，其中病毒载体也指导抗原的表达。
72.根据权利要求54或60的组合物，其中核酸分子也指导抗原的表达。
全文摘要
本文提供了引发或增强对抗原包括肿瘤抗原和/或DNA疫苗的免疫应答的方法。该方法中使用包括利什曼原虫L.braziliensis或L.major中真核启动因子4A同源类似物中的至少一个生物活性部分或其变化的多肽或核酸组分。这种多肽和核酸组分可有效地增强或引发病人的细胞和/或体液免疫应答,如用于肿瘤的治疗。
文档编号A61K38/00GK1194000SQ96195382
公开日1998年9月23日 申请日期1996年6月5日 优先权日1995年6月6日
发明者S·G·芮德 申请人:科里克萨有限公司