Il-21表位和il-21配体的制作方法
【专利摘要】本发明涉及IL-21配体(例如抗体)及其用途。
【专利说明】IL-21表位和IL-21配体
[0001]本发明涉及存在于IL-21上的不连续表位和与该表位结合的配体。
[0002]IL-21是对先天性免疫应答和获得性免疫应答两者都发挥多效作用的I型细胞因子。它主要由活化⑶4+T细胞、滤泡T细胞和天然杀伤细胞(NKT)产生。另外，最新证据表明Thl7细胞可产生大量的IL-21。
[0003]IL-21提高⑶8+T细胞的细胞毒性，在抗原存在下可促进⑶8+细胞增殖。IL-21受IL-6(—种已知促进Thl7细胞发育的细胞因子)的诱导。IL-21以促进其自身产生和支持T辅助细胞分化成为Thl7细胞的自分泌方式作用于T辅助细胞。与此一致，IL-21缺陷型小鼠显示Thl7反应受损。IL-21还作用于B细胞，并增加抗体产生；然而，IL-21不是功能性抗体产生所必需的，而IL-21Ra阴性小鼠显示增殖降低以及CD8+细胞的细胞毒性受损两者。最新的系列研究表明，由CD4+细胞产生的IL-21对CD8+T细胞控制病毒感染的能力至关重要。[0004]成熟IL-21为133个氨基酸的多肽(SEQ ID N0.1的残基30-162，图2)，其特征在于4个螺旋区段，以上-上-下-下的拓扑结构排列。IL-21通过由专用的IL-21受体a链(IL-21Ra)和共同的Y链(YC) (SEQ ID N0.8的残基23-369)组成的异二聚体受体复合物发出信号。IL-21包含两个结合部位，结合部位I(BSl)和2(BS2)，IL-21经由其分别与IL-21Ra和YC相互作用。IL-21经由BSl以高亲和力结合IL-21R a，但受体激活与信号转导也需要IL-21和YC之间经由BS2的结构性相互作用，从而形成三元复合物。以高亲和力结合IL-21Ra但缺乏与Y C结构性相互作用的能力的IL-21变体将占据IL21受体而不诱导信号转导，并因此用作IL-21受体拮抗剂。
[0005]IL-21提高免疫力的能力在IL-21的治疗应用中激起了极大关注。最近在针对转移性黑素瘤类型和肾癌的临床试验中对其进行了评价。动物研究证实IL-21和肿瘤特异性抗体之间的协同效应，这可能表明IL-21作为抗肿瘤抗体的增效剂的未来治疗应用。此外，IL-21在自身免疫病中起复杂作用。IL-21减量调节IgE产生的能力表明，它可治疗性地用于对抗哮喘和变态反应。动物研究结果支持这个观点。另一方面，IL-21促进Thl7发育的能力使之成为促炎细胞因子，而且目前针对在治疗一系列不同的自身免疫病中的可能应用，对多种不同的IL-21和IL-21Ra拮抗剂/抑制剂进行了研究。
[0006]对IL-21有特异性的单克隆抗体是本领域已知的，例如W02007111714和W02010055366 (Zymo-Genetics, Inc.)的单克隆抗体。具体地说，W02010055366 描述了以克隆号366.328.10.63 (本文称为“mAbl4”)命名的IL-21抗体，其对其关联抗原具有高亲和力并具有其它所需性质，对人和食蟹猴(cynomolgus monkey) IL-21显示特异性。使用同二聚体IL-21R a -Fe构建体或异二聚体IL-21R a /y C-Fc构建体，该抗体显示不与IL-21R a也不与￥(:竞争结合11-21。
[0007]发明概述
[0008]我们在本文定义了 IL-21上的新表位。IL-21配体例如抗体与该表位的结合竞争或干扰Y C经由BS2与IL-21的结合，但不干扰IL-21Ra经由BSl与IL-21的结合。
[0009]我们还描述了 IL-21配体(例如抗体)(其与本发明的表位特异性结合，条件是所述配体不是mAbl4和YC)以及制备和使用这类配体的方法。我们还描述了 mAb 14与IL-21的结合如何干扰YC与IL-21的结合。
[0010]本发明IL-21配体的独特特征是其竞争或干扰YC与IL-21结合的能力，同时与配体复合的IL-21将保持有能力结合IL-21Ra的BS1。因此，本发明配体将在IL-21存在下形成配体:IL_21复合物，其具有以高亲和力和特异性地结合存在于细胞表面的IL-21Ra的能力。
[0011]保持以高亲和力经由BSl结合IL-21Ra的能力但具有缺乏与YC相互作用的能力的BS2的IL-21变体将占据IL-21Ra受体并用作IL_21Ra受体拮抗剂。损害BS2结合的一种方式是引入一个或多个关键涉及与YC相互作用的IL-21残基的点突变。另一种方式是通过使BS2配体与IL-21结合而阻断BS2。因此，有效阻断BS2但保持BSl不受影响的IL-21配体，基本上如对于本发明的配体所述，在IL-21存在时预期充当体内IL-21Ra受体拮抗剂。
[0012]通常，在治疗上使用单克隆抗体以“中和”可溶的靶，例如自身免疫和慢性炎性疾病中的促炎分子。干扰溶液中IL-21分子上BS2的IL21配体的结合将导致该特定IL-21分子的“中和”。然而，由于所形成的配体:IL_21复合物获得拮抗性质，其将额外能够阻断和“中和”含IL-21Ra的细胞上一个IL_21Ra分子的功能。该双重作用模式，即可溶IL-21的中和以及膜结合IL-21Ra的阻断，与干扰IL-21BS1的配体(其中所形成的配体:IL_21复合物将不会获得IL-21Ra拮抗性质)相比，将潜在地改进这样的BS2阻断/干扰性IL-21配体的效能。
[0013]本发明的配体由于组合的中和以及受体阻断性质因而可具有改进的效能。
[0014]一般地，本发明的配体将结合IL-21并形成配体:IL_21复合物，其保持有能力的BSl并从而保持以高亲和力结合IL-21Ra的能力。因此，配体:IL_21复合物能够结合IL-21Ra的可溶片段(例如其胞外域)或细胞表面上存在的膜结合IL-21Ra。换言之，本发明的配体可在IL-21存在时具有特异性结合含IL-21Ra的细胞的能力。
[0015]在配体是包含能够诱导ADCC和/或⑶C的Fe结构域的抗体的情况下，这样的配体可由于其与含IL-21Ra的细胞的高亲和力和特异性结合而具有杀伤所述含IL-21Ra的细胞的能力。
[0016]因此，在另一方面，本发明的配体，例如包含具有内置效应子功能的Fe结构域的抗体，可介导其表面上携带IL-21Ra的细胞的特异性消耗。
[0017]已显示，克罗恩病(⑶)患者肠道中特异性细胞亚组例如T细胞和巨噬细胞的消耗是⑶的目前抗TNF a疗法中作用模式的重要组分(MacDonald, NatureMedicine, 16(2010),第1194-1195页和其中的参考文献)。因此，特异性炎性细胞的消耗在一些炎性疾病的治疗中可为有利的。
[0018]抗体的效应子功能依赖于同种型并且可通过本领域已知的若干方法调节，包括在Fe结构域中引入突变，这将改变抗体与Fe受体的结合。本发明的配体包括具有改进的效应子功能的此类配体。
[0019]结合本发明表位的IL-21配体竞争或干扰Y C与IL-21的结合。使用实验性和同源性建模方法，我们预测了 IL-21和Y C之间结合界面的位置和IL-21中参与相互作用并且因此是IL-21配体的靶的特定氨基酸残基，所述IL-21配体经设计以通过破坏IL-21和Y C之间相互作用而抑制IL-21活性。
[0020]以下IL-21氨基酸或其亚组(参考SEQ ID N01)被具有与mAbl4 (W02010055366中称为抗体366.328.10.63)的那些类似的CDR序列的抗体结合:Glu65、Asp66、Val67、Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73、Lysll7、Hisll8、Argll9、Leul43、Lysl46、Metl47、Hisl49、Gln150和Hi s 151，如本文通过X-射线晶体学数据所示。
[0021]发明详述
[0022]除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。除非另有说明，否则本发明的实践采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。
[0023]附图简述 [0024]图1:本文提及的氨基酸序列。
[0025]图2:显示成熟IL-21氨基酸序列(SEQ ID NOl的残基30-162)，其中螺旋A、B、C和D (分别对应于 SEQ ID NOl 的氨基酸 34-50 (SEQ ID N02)、SEQ ID NOl 的氨基酸 72-82 (SEQID N03)、SEQ ID NOl 的氨基酸 93-103 (SEQ ID N04)和 SEQ ID NOl 的氨基酸 133-152 (SEQID N05))以粗体和加下划线显示。属于BS1、BS2和mAbl4及mAb5的表位(分别为表位14和表位5)的残基在氨基酸序列下面通过“X”标记。在图中Mab5表位指示为“表位5”。在图中Mab 14表位指示为“表位14”。
[0026]图3:通过质谱法监测的HX鉴定出参与mAb结合的hIL-21的区域。对于所有的图，上面的波谱显示非氘化对照，下面的图显示氘化对照，即在不存在mAb下在D2O中孵育30秒后的hIL-21。中间的图显示如所示在存在mAb下交换30秒后的肽。
[0027](A)对应于位于螺旋A的肽片段29-44即MQGQDRHMIRMRQLID的质/荷谱(Mass/charge spectra) (m/z=676.68, z=3)。mAb5 导致在该区域的交换保护。
[0028](B)对应于位于环和螺旋B的肽片段67-76即VETNCEWSAF的质/荷谱(m/z=l 185.49, z=l)。mAbl4导致在该区域的交换保护。
[0029](C)对应于位于螺旋C的肽片段93-98即ERIINV的质/荷谱(m/z=743.47，z=l)。mAb5导致在该区域的交换保护。
[0030](D)对应于位于螺旋 D 的肽片段 138-162 即 ERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS 的质 /荷谱(m/z=738.63，z=4)。mAbl4导致在该区域的交换保护。
[0031]图4:在mAb5或mAbl4不存在或存在时hIL-21的代表性肽的氢交换时间曲线。在不存在(黑色菱形，?)或存在mAb5(白色三角，A)或mAbl4(白色圆圈，〇)时，hIL-21肽的氘掺入(Da)以对数标度针对时间作图。
[0032]图5:在mAbl4存在和不存在时hIL-21的HX分析的肽的序列覆盖(sequencecoverage)。在HX分析的肽(表示为水平棒)上方显示原始序列。在mAbl4存在和不存在两种情况下显示类似交换模式的肽以白色显示，而在mAbl4结合时显示氘掺入减少的肽着黑色。用框标出的序列区界定表位。
[0033]图6:不同hIL-21/Fab复合物的X射线结构中建模的hIL-21残基。加入Fab35(来自实施例1)用于比较。
[0034]图7:通过运行CCP4程序套件的CONTACT软件(Bailey, 1994)鉴定的hIL_21上Fab56、Fab57、Fab59和Fab60hIL_21表位的概述。‘=’表示Fab片段与hIL_21分子之间的4.0 A的截断距离。表示Fab片段与hIL-21分子之间4.0和5.0人之间的距离。[0035]定义
[0036]除非另外明确说明，否则IL-21是指人IL-21。IL-21氨基酸序列，包括其信号序列，示于图1 (SEQ ID N01)。成熟IL-21多肽对应于SEQ ID NOl的残基30-162。IL-21的特征在于4个螺旋区段，以对I类细胞因子具有代表性的上-上-下-下的拓扑结构排列。IL-21通过由专用链IL-21Ra和YC(后者为IL-2、IL-4、IL-7、IL-9和IL-15共有)组成的异二聚体受体复合物发出信号。IL-21Ra经由IL-21上的结合部位I(BSl)以高亲和力结合IL-21。另一方面，IL-21和Y C之间的相互作用具有相对低的亲和力。IL-21经由其结合部位2(BS2)结合Y C。需要IL-21与IL-21Ra和Y C两者结合用于信号转导。因此，对IL-21Ra具有高亲和力并且对YC没有或具有强烈降低的亲和力的IL-21变体预期结合表达IL-21R的细胞表面上的IL-21Ra，从而阻断胞内IL21诱导的信号转导。
[0037]先前已通过NMR波谱法测定了人IL-21的结构(Bondensgaard等J.Biol.Chem.(2007)，282，23326-23336)。游离或与受体链复合的IL-21的晶体结构尚未公布但通过x射线晶体学测定的与其3个受体链复合的结构相关IL-2分子(IL-2:1L2Ra:1L-2R^: y C)已经公布，并且其坐标已储存在公众可获得的数据库中(蛋白质数据库(Protein DataBank))。
[0038]干扰Y C与IL-21结合的配体:具有干扰YC与IL-21结合的能力的本发明配体在本文中是指结合IL-21的配体，并且在这种情况下，或直接与Y C竞争结合IL-21或降低其结合IL-21的能力/其对IL-21的亲和力。另外所述配体将不会干扰IL-21Ra与IL-21的结合。这意味着本发明的配体可结合与BS2重叠的表位或位于与BS2足够近，以提供YC结合的位阻，从而降低其结合IL-21的能力至少25%、优选至少50%、优选至少60%、优选至少70%、优选至少75%、优选至少80%、优选至少90%和最优选至少95%。继而可得出，本发明配体的IL-21上的表位与BSl良好分离，因为本发明配体的结合不显著干扰IL-21R a与IL-21的结合。干扰Y C结合可通过例如实施例所示的表面等离振子共振(SPR)检测。
[0039]本文所用术语“治疗”是指对有需要的任何人或其它动物受试者的医学治疗。预期所述受试者已由医学或兽医从业人员进行了身体检查，医学或兽医从业人员已做出了可表明采用所述具体治疗有益于所述人或其它动物受试者健康的试验性或确定性诊断。根据受试者的健康现状，所述治疗的时机和目的可在个体与个体间不同。因此，所述治疗可为预防性、治标性的、针对症状的和/或治愈性的。
[0040]就本发明而言，预防性、治标性、针对症状的和/或治愈性治疗可代表本发明的各个方面。
[0041]本发明涉及已在人IL-21上发现的表位。因此具有该表位的多肽是共有人IL-21的三维结构的至少部分的多肽。多肽的丑段是这样的多肽，其在C或N端截短，或其具有一个或多个氨基酸从其序列除去。在本发明的背景下，片段应保持足够的三维结构以限定本发明表位或互补位。
[0042]根据本领域熟知的方法针对结合活性(或任何其它所需活性)进行_，所述方法例如SPR(表面等离振子共振)、FACS、ELISA等。筛选允许根据所需特性选择库(repertoire)成员。[0043]本文所用“分离的”化合物是从其天然环境移出的化合物。
[0044]IL-21变体:本发明的IL-21模拟物/变体包含不连续表位，所述不连续表位包含来自以下IL-21肽区段的至少2个的至少一个氨基酸残基:SEQ ID Nol中所示的Glu65至Phe73、Lysll7至Argll9和Leul43至Hisl51。所述模拟物/变体可以多种方式产生，其中一种方式是通过氨基酸插入、取代或缺失对天然IL-21的突变。插入、取代或缺失可在大小和程度上变化，主要随着其在分子中的位置而变化。例如，可容忍大的N或C端插入而不改变本发明的表位，C端缺失亦是如此。在别处，可更好地容忍较小的插入、缺失或取代。
[0045]抗体:本文所称的术语“抗体”，指源自种系免疫球蛋白序列的多肽。该术语包括全长抗体和其任何抗原结合片段例如Fab片段和其它单价抗体。本文所用术语“抗体”、“单克隆抗体”和“mAb”意指有能力与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子和其片段。药学上特别感兴趣的免疫球蛋白亚类是属于IgG家族的那些，其可再细分成同种型IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgG分子由通过两个或若干个二硫键互连的两个重链与两个轻链(每个通过二硫键与每个重链连接)组成。IgG重链由四个Ig-结构域组成，包括可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可再细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着更加保守的被称为架构区(FR)的区。每个VH和VL由三个⑶R和四个FR组成，按下列顺序从氨基-端至羧基-端排列:FRl、OTRl、FR2、raR2、FR3、CDR3、FR4。
[0046]抗原-结合片段的实例包括Fab、Fab’、F (ab) 2、F (ab’)2、F (ab) S、Fv (典型地抗体单臂的VL和VH结构域)、单链Fv(scFv ;参见例如Bird等，Sciencel988 ;242:42S_426 ;和Huston 等 PNAS1988 ；85:5879-5883)、dsFv、Fd(典型地 VH 和 CHI 结构域)和 dAb(典型地 VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单个VH和单个VL链的单价分子；小抗体(minibodies)、二抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和 k 体(kappa body)(参见例如 Ill 等，Protein Engl997 ；10:949-57);胳马它 IgG ；IgNAR ;以及一种或多种分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起以形成功能性抗体片段。各种类型的抗体片段已经描述或综述于，例如Holliger和 Hudson，Nat Biotechnol2005 ；2S, 1126-1136 ;TO2005040219，以及公布的美国专利申请20050238646 和 20020161201 中。
[0047]本发明抗体的Fe结构域可经修饰以调节某些效应子功能例如补体结合和/或与某些Fe Y受体结合。Fe结构域可另外经调节以增加对新生儿Fe受体(FcRn)的亲和力。IgGlFc结构域中位置234、235和237 (根据EU索引的残基编号)的突变将通常导致与Fe y RI受体的结合降低并且可能还导致与Fe Y RIIa和Fe Y RIII受体的结合降低。这些突变不改变与FcRn受体的结合，其通过胞吞再循环途径促进长的循环半衰期。优选本发明抗体的修饰的IgGlFc结构域包含一个或多个以下突变，其将分别导致与某些Fe Y受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和导致Clq-介导的补体结合降低(A330S和P331S)(根据EU索引的残基编号)。或者，Fe结构域可为任选包含S241P/S228P突变的IgG4Fc结构域(S241P表示根据Kabat的残基编号，S228P表示根据EU编号系统的残基编号(EdelmanG.M.等，Proc.Natl.Acad.USA63, 78-85 (1969)。
[0048]本文所用术语“ 人抗体”意指具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可包括例如在CDR中、特别是在CDR3中不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，本文所用术语“人抗体”，并不意指包括这样的抗体:其中，源自另外的哺乳动物物种(例如鼠)的种系的CDR序列已被移植到人构架序列上，例如所谓的“人源化抗体”或人/小鼠嵌合抗体。
[0049]术语“嵌合抗体”或“多个嵌合抗体”，指这样的抗体:它的轻链和重链基因已通常通过基因工程，由属于不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因而构建。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段与人恒定区段连接。
[0050]延长半衰期的部分:本发明的配体可经修饰以增加其血清半衰期，例如通过添加分子-例如脂肪酸或脂肪酸衍生物、PEG(聚乙二醇)或其它水溶性聚合物(包括多糖聚合物)以增加循环半衰期。本文中“延长基团”/ “延长半衰期的部分”应理解为连接到一个或多个氨基酸侧链官能团例如-SH、-0H、-C00H、-C0NH2、-NH2的一个或多个化学基团，或者一个或多个N-和/或0-聚糖结构，并且当其缀合到这些蛋白质/肽时可增加多种治疗性蛋白质/肽的体内循环半衰期。延长基团/延长半衰期的部分的实例包括但不限于:生物相容性脂肪酸及其衍生物、羟基烷基淀粉(HAS)例如羟基乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery) n (HAP)、透明质酸(HA)、Heparosan聚合物(HEP)、基于磷酸胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximer、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽及其任何组合。
[0051]分箱/竞争结合:关于抗体与其共同抗原同时结合的能力，可表征与相同抗原结合的抗体。可对抗体进行“分箱(binning)”，本文中该术语是指对与相同抗原结合的抗体归类的方法。抗体的“分箱”可基于在根据标准技术例如表面等离振子共振(SPR)、ELISA或流式细胞术的测定法中两种抗体与其共同抗原的竞争结合。
[0052]通过参比抗体来定义“箱(bin) ”。如果第二抗体不能在与参比抗体相同的时间与抗原结合，则第二抗体被称为属于与参比抗体相同的“箱”。在这种情况下，参比抗体和第二抗体对于与抗原结合是竞争性的，因此该对抗体被称为“竞争性抗体”。如果第二抗体能够在与参比抗体相同的时间与抗原结合，则第二抗体被称为属于单独的“箱”。在这种情况下参比抗体和第二抗体对于与抗原结合不是竞争性的，因此该对抗体被称为“非竞争性抗体”。
[0053]抗体“分箱”不提供有关表位的直接信息。竞争性抗体，即属于相同“箱”的抗体，可具有相同的表位、重叠表位或甚至各自的表位。后者是这样的情况:如果与抗原上的其表位结合的参比抗体占据第二抗体与其抗原上的表位接触所需要的空间(“位阻”)。非竞争性抗体具有单独的表位。
[0054]表位、互补位和抗原:本文所用术语“表位”，在“抗原结合分子”，例如抗体(Ab)，与其对应的“抗原”(Ag)之间的分子相互作用的背景下定义。术语抗原(Ag)可指用于免疫接种具有免疫能力的脊椎动物以生产识别该Ag的抗体(Ab)的分子实体。本文中，Ag被更广泛地定义，且通常意指包括被Ab特异性识别的靶分子，因此包括在免疫接种过程中用于引发Ab的分子的片段或模拟物。通常，“表位”指在Ag上的与Ab特异性结合的区域或区，即与Ab物理接触的区域或区。物理接触可通过Ab和Ag分子中原子的距离标准(例如4
A的距离截止值)来定义。[0055]“不连续表位”是由多肽的两个或更多个区形成的表位，所述区在线性肽序列中彼此不相邻，但在多肽的三维结构中排列形成结构表位。其它形式的表位包括:线性肽表位、构象表位(其由两个或更多个在抗原的三维结构中彼此临近定位的非相邻氨基酸组成)和翻译后表位(其整体或部分由与抗原共价连接的分子结构，例如碳水化合物基团组成)。
[0056]对于给定的抗体(Ab) /抗原(Ag)对的表位，可使用多种实验性和计算性的表位作图法在不同级别的细节上进行定义和表征。实验性方法包括:诱变、X射线晶体分析法、核磁共振(NMR)波谱法、氢氘交换质谱(HX-MS)和本领域已知的方法。因为每种方法依赖于独特的原理，表位的描述最终与测定其的方法紧密相关。因此，取决于采用的表位作图方法，对于给定的Ab/Ag对的表位将进行不同描述。
[0057]在其最详细的级别上，用于Ab和Ag间相互作用的表位，可通过定义存在于Ag-Ab相互作用中的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息，进行描述。在不太详细的级别上，表位可通过定义Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标进行描述。在更不详细的级别上，表位可通过其包含的氨基酸残基(如通过特定标准，例如Ab和Ag中的原子间的距离定义)进行描述。在更加不详细的级别上，Ag-Ab相互作用可通过功能，例如通过与其它Ab的竞争结合和“分箱”，进行表征，尽管竞争结合不提供有关表位的任何结构信息。
[0058]在通过Ab (例如Fab片段)和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X射线衍生的晶体结构的背景下，本文的术语表位，除非另外指定或上下文矛盾，明确地定义为IL-21残基，其特征为具有与Ab中的重原子(即非氢原子)的距离在约3.5至约5.0 A例如
4 A之内的重原子。
[0059]从在不同级别的细节上获得表位的描述和定义(依赖于使用的表位作图法)这样的事实，可得出结论，即在相同Ag上对于不同Ab的表位的比较，可类似地在不同级别的细节上进行。
[0060]在氨基酸级别上描述的表位，例如由X射线结构测定的，如果它们包含同一组的氨基酸残基，则认为它们是相同的。如果表位共有至少一个氨基酸，则认为表位是重叠的。如果表位没有共有氨基酸残基，则认为表位是单独的(唯一的)。
[0061]术语“互补位”的定义以反向的角度衍生自上文“表位”的定义。因此，术语“互补位”指在Ab上的与Ag特异性结合的区域或区，即抗体通过其与Ag物理接触。
[0062]在通过Ab (例如Fab片段)和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X射线衍生的晶体结构的背景下，本文的术语互补位，除非另外指定或上下文矛盾，明确定义为Ab残基，其特征为具有与IL-21中的重原子(即非氢原子)距离在约4人(3.5-5.0 A)之内的重原子。
[0063]对于给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和互补位可通过常规方法描述。例如，可通过评价抗体结合IL-21不同片段或变体的能力测定表位的总体位置。使用常规的方法，还可测定IL-21内与抗体接触的特异性氨基酸(表位)，和抗体中与IL-21接触的特异性氨基酸(互补位)。例如，可使Ab和Ag分子组合，并使Ab/Ag复合物结晶。可测定复合物的晶体结构，并用于鉴定Ab和Ag之间相互作用的特异性位点。
[0064]经由单价相互作用的两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间的结合亲和ii，可通过测定平衡解离常数(kd)来定量测定。反过来，可通过对复合物形成和解离动力学的测量，例如通过SPR方法，来测定Kd。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数，被分别称为缔合速率常数ka (或km)和解离速率常数kd (或kf)。Kd通过等式KD=kd/ka与ka和kd相联系。根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的Kd值进行比较。
[0065]非抗体配体:特异性针对本发明表位的配体还可包括抗体模拟物，其包含在分子骨架(例如蛋白质或碳水化合物骨架)上构建的特异性针对本文所述表位的一个或多个IL-21结合部分。具有相对限定的三维结构的蛋白质(通常称为蛋白质骨架)可用作设计抗体模拟物的模板。这些骨架通常含有一个或多个适于特异性或随机序列变化的区，并且常常进行这样的序列随机化以产生蛋白质文库，从中可选择所需产物。例如，抗体模拟物可包含嵌合非-免疫球蛋白结合多肽，其具有包含免疫球蛋白-样结构域的骨架并且对于被母体抗体结合的配体展示选择性结合活性，所述骨架含有具有两个或更多个溶剂暴露的环，所述环含有插入每一个环中的与母体抗体不同的CDR。已提出非-免疫球蛋白蛋白质骨架用于获得具有新的结合性质的蛋白质。
[0066]配体的结构:如上所述，本文提及的配体可以是抗体(例如IgG、IgM、IgA、IgE)或其片段(例如Fab、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、二抗体)，所述片段包含彼此互补并因此可彼此缔合形成VH/VL对的至少一个重链可变结构域和轻链可变结构域。它可来源于天然产生抗体的任何物种，或通过重组DNA技术产生；不论分离自血清、B细胞、杂交瘤、转染瘤、哺乳动物细胞、酵母还是细菌。
[0067]治疗应用:IL_21参与T细胞介导的免疫，并且已表明促进多种炎性细胞因子。因此，本发明的配体可用于治疗涉及不当或不需要的免疫应答的疾病(免疫病症)，例如炎症、自身免疫、涉及这类机制的病况以及移植物抗宿主病。在一个实施方案中，所述疾病或病症是自身免疫病和/或炎性疾病。所述自身免疫病和/或炎性疾病的实例为系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和炎性肠病(IBD)(包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(Crohn’s disease，CD))、多发性硬化(MS)、硬皮病和I型糖尿病(TlD)及其它疾病和病症，例如PV(寻常性天疱疮)、银屑病、特应性皮炎、乳糜泻、kol、桥本氏甲状腺炎(hashimoto's thyroiditis)、格雷`夫斯病(graves’ disease)(甲状腺)、斯耶格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、格-巴综合征(guillain-barre syndrome)、古德帕斯彻综合征(goodpasture，s syndrome)、艾迪生病(additon，s disease)、韦格纳肉芽肿病(Wegener，sgranulomatosis)、原发性胆管硬化症、硬化性胆管炎、自身免疫性肝炎、风湿性多肌痛、雷诺现象(paynaud’ s phenomenon)、颞动脉炎、巨细胞性动脉炎、自身免疫性溶血性贫血、恶性贫血、结节性多动脉炎、贝切特病(behcet’s disease)、原发性胆汁性肝硬化、眼色素层炎(uveitis)、心肌炎、风湿热、关节强硬性脊椎炎、肾小球性肾炎(glomerulenephritis)、结节病、皮肌炎、重症肌无力、多肌炎、斑秃、I型糖尿病、结肠炎相关性肿瘤发生和白癜风(vitilgo)。
[0068]在一个实施方案中，所述疾病或病症是SLE、RA或IBD。在一个实施方案中，所述疾病或病症是MS。
[0069]本发明的IL-21配体可与本领域已知的其它药物组合给予。
[0070]本发明还包括包含药学上可接受的载体和本发明的多肽/配体/抗体的药物组合物/制剂以及包含所述组合物的药盒。本发明的药物组合物可呈含水制剂或无水制剂的形式，所述无水制剂在给予前在水/水性缓冲液中复溶。
[0071]包含本发明的配体/抗体/多肽的药物组合物可以藍盒供应，药盒包括装有本发明的化合物的容器。治疗性多肽可以单剂量或多剂量注射溶液剂的形式或作为将在注射前复溶的无菌散剂的形式提供。包含本发明的化合物的药物组合物可适于皮下和/或IV给药。
[0072]组合治疗:本发明杭体可与一种或多种其它治疗剂或制剂共同给予。所述其它剂可意在治疗患者的其它症状或病况。例如，所述其它剂可为止痛剂、免疫抑制剂或抗炎剂。
[0073]组合给予两种或更多种药剂可用多种不同方式实现。在一个实施方案，抗体和其它药剂可在单一组合物中一起给予。在另一个实施方案，抗体和其它药剂可在作为组合疗法的一部分的各自的组合物中给予。例如，调节剂可在其它药剂给予之前、之后给予或与其它药剂同时给予。
[0074]本发明的抗体/蛋白质可连同其它药物(例如甲氨蝶呤、地塞米松和泼尼松)和/或其它生物药物一起给予。已经在自身免疫中使用的药剂包括免疫调节剂，例如IFNP、Orencia(CTLA4_Ig)、Humira(抗-TNF)、Cimzia(抗-TNF, PEGFab)、Tysabri(A4-整合蛋白 mAb)、Simpon1、Rituxan/MabThera、Actemra/RoActemra、Kineret ;非留体抗炎药(NSAIDS)，像阿司匹林、布洛芬等；糖皮质激素；缓解疾病的抗风湿性药物(DMARD)，像Plaquenil、柳氮磺胺吡唳、甲氨蝶呤等，Copaxone (醋酸glatirimer) ；Gilneya(芬戈莫德(fingolimod));抗 生素,像灭滴灵(Flagyl)、环丙沙星(Cipro);局部用(皮肤施用)药物包括局部用皮质类固醇激素、维生素D类似物霜剂(Dovonex)、局部用类视色素(Tazorac)、保湿剂、局部用免疫调节剂(他克莫司和吡美莫司)、煤焦油、地蒽酚等等；Raptiva;Ustekimumab ;光疗法，像PUVA、UVB ;CellC印(麦考酚酸吗乙酯)。
[0075]实施方案
[0076]以下实施方案列表代表本发明实施方案的实例，因此不应理解为限制本发明。
[0077]1.1L-21模拟物，包含含有SEQ ID N0.1中所示的以下氨基酸的表位:Glu65、Asp66、Val67 和 Hisl49。
[0078]2.实施方案I的模拟物，其中所述模拟物的表位还包含SEQ ID NOl中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Arg40、Lys50、Glul29、Glul35、Glul38、Argl39、Lysl41、Serl42和 Glnl45。
[0079]3.实施方案I的模拟物，其中所述模拟物的表位还包含以下氨基酸中的一个或多个:Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73、Lysll7、Hisll8、Argll9、Leul43、Lysl46、Metl47、Glnl50 和 Hisl51。
[0080]4.实施方案1-3中任一个的模拟物，其中所述模拟物的表位还包含以下氨基酸:Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73、Lysll7、Hisll8、Argll9、Leul43、Lysl46、Metl47、Glnl50 和 Hisl51。
[0081]5.用于选择结合IL-21的配体的方法，包括用实施方案1-4中任一个的IL-21模拟物筛选一个或多个配体文库，和分离一种或多种结合所述表位的配体。
[0082]6.实施方案1-4中任一个的IL-21模拟物在选择与IL-21选择性结合的配体中的用途。[0083]7.一种配体，其中所述配体优选为抗体，该配体特异性结合实施方案1-4中任一个的IL-21模拟物的表位，条件是所述配体不是:(i)天然存在的共有YC(SEQ ID N0.8)，和不是(ii)单克隆抗体mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。如果所述配体为抗体，则抗体不是单克隆mAbl4抗体。
[0084]8.一种配体，其中所述配体优选为抗体，该配体结合IL-21上的表位，其中所述表位包含SEQ ID N0.1中所示的Arg40-Val67氨基酸中的一个或多个以及Glul29-Hisl49氨基酸中的一个或多个，条件是所述配体不是:(i)天然存在的共有Y链(SEQ ID N0.8)，和不是(ii)mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。所述配体优选包含Glu65-Val67氨基酸中的一个或多个和Glul29_Hisl49氨基酸中的一个或多个。如果配体是抗体，则抗体不是单克隆mAbl4抗体。
[0085]9.结合IL-21的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体与SEQ ID NOl中所示以下氨基酸中的至少一个结合:Arg40、Lys50、Glu65、Asp66、Val67、Glul29、Glul35、Glul38、Argl39、Lysl41、Serl42、Glnl45和Hisl49，条件是所述配体不是:(i)天然存在的共有Y C(SEQ ID N0.8)，和不是(ii)mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ IDN0.7所示。
[0086]10.实施方案9的配体，其中所述配体与SEQ ID NOl中所示的Arg40、Lys50、Glu65、Asp66、Val67、Glul29、Glul35、Glul38、Argl39、Lysl41、Serl42、Glnl45 和 Hisl49
氨基酸结合。
[0087]11.结合IL-21的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体结合IL_21(SEQID N01)中氨基酸Glu7 2-Ala82的至少一个，条件是所述配体不是mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。优选所述配体结合氨基酸Glu65_Trp73中的至少一个，条件是所述配体不是天然存在的共有YC(SEQ ID N0.8)并且不是mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。如果后者配体是抗体，则抗体不是单克隆mAbl4抗体。
[0088]12.实施方案7-11中任一个的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体结合 IL-21(SEQ ID N01)中的氨基酸 Asn70、Glu72 和 Trp73。
[0089]13.实施方案7-12中任一个配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体另外结合SEQ ID NOl中所示的氨基酸Glu65、Asp66和Val67中的一个或多个。
[0090]14.实施方案7-13中任一个的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体进一步结合SEQ ID NOl中所示的氨基酸Hisl49。
[0091]15.实施方案7-14中任一个的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体结合 SEQ ID NOl 中所示的氨基酸 Glu65、Asp66、Val67 和 Hisl49。
[0092]16.结合IL-21的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体结合包含SEQ IDNOl中所示的以下氨基酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个的表位:Arg40、Lys50、Glu65、Asp66、Val67、Glul29、Glul35、Glul38、Argl39、Lysl41、Serl42、Glnl45 和 Hisl49，条件是所述配体不是:⑴天然存在的共有Y链(SEQ ID N0.8)?，并且不是(ii)mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。优选配体结合SEQ ID NOl中所示的以下氨基酸:Arg40、Lys50、Glu65、Asp66、Val67、Glul29、Glul35、Glul38、Argl39、Lysl41、Serl42、Glnl45 和 Hisl49。[0093]17.实施方案16的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体结合包含SEQID NOl 中所示的以下氨基酸的表位:Arg40、Lys50、Glu65、Asp66、Val67、Glul29、Glul35、Glul38、Argl39、Lysl41、Serl42、Glnl45 和 Hisl49。
[0094]18.实施方案7-15中任一个的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体结合包含以下氨基酸中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个的表位:Glu65、Asp66、Val67、Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73、Lysll7、Hisll8、Argll9、leul43、Lysl46、Metl47、Hisl49、Glnl50 和 Hisl51。
[0095]19.结合IL-21的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体结合包含以下氨基酸的表位:Glu65、Asp66、Val67、Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73、Lysll7、Hisll8、Argll9、leul43、Lysl46、Metl47、Hisl49、Glnl50 和 Hisl51，条件是所述配体不是:(i)天然存在的共有Y C(SEQ ID N0.8)，并且不是(ii)mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和 SEQ ID N0.7 所示。
[0096]20.实施方案7-19中任一个的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体包含SEQ ID N0.6中所示CDR1、CDR2和CDR3中的一个、两个或三个和SEQ ID N0.7中所示⑶R1、⑶R2和⑶R3中的一个、两个或三个，条件是所述配体不是mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。mAbl4抗体是与W02010/055366中公开的抗体相同的抗体，其中通过杂交瘤克隆号366.328.10.63命名。
[0097]21.实施方案7-20中任一个的配体，其中所述配体优选为抗体，其中所述配体干扰IL-21与共有Y C的结合。
[0098]22.实施方案7 -21中任一个的配体，其中所述配体为抗体。所述抗体可为抗体、单克隆抗体、抗体的抗原结合片段、单价抗体、二价抗体。所述抗体可为这些中任一个的人或人源化形式。
[0099]23.实施方案22的配体，其中所述抗体为IgGl抗体。所述配体可备选地为IgG4抗体。
[0100]24.实施方案22-23中任一个的配体，其中所述抗体包含Fe结构域，其介导抗体效应子功能。
[0101]25.实施方案24的配体，其中所述配体包含具有降低的效应子功能的Fe结构域。
[0102]26.实施方案25的配体，其中所述配体包含IgGlFc结构域，其包含以下突变中的一个、两个、三个或四个，所述突变将分别导致与某些Fe受体的亲和力降低(L234A、L235E和G237A)和导致Clq-介导的补体结合降低(A330S和P331S)(根据EU索引的残基编号)。所述配体将保持相对长的体内半衰期和显著降低的效应子功能。
[0103]27.实施方案20的配体，其中所述配体为抗体，其为mAbl4的变体，mAbl4的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示，其中所述配体包含⑶R序列中的一个或多个突变，其中所述突变选自由以下组成的列表中的一个或多个:A61S(SEQ ID N07)、D62E(SEQ ID N07)、V64I(SEQ ID N07)和K65R(SEQ ID N07)、R24K(SEQ ID N06)、S26T(SEQID N06)、Q27N(SEQ ID N06)、D30E(SEQ ID N06)、S53T(SEQ ID N06)和S56T(SEQ ID N06)。因此这些突变中的每一个代表单独的实施方案。其任何组合也代表单独的实施方案。
[0104]28.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQ ID N0.1中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Glu65、Asp66、Val67、Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73 ；以下氨基酸中的一个或多个:Lysll7、Hisll8、Argl 19 ;和以下氨基酸中的一个或多个:Leul43、Lysl46、Metl47、Hisl49、Glnl50和Hisl51，条件是所述抗体不是单克隆抗体mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。所述抗体可备选地结合IL-21上的表位，其中所述表位包含SEQ ID N0.1中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Glu65、Asp66、Val67、Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73、Lysll7、Hisll8 和 Argl 19 和以下氨基酸中的一个或多个:Leul43、Lysl46、Metl47、Hisl49、Glnl50 和 Hisl51。所述抗体可备选地结合IL-21上的表位，其中所述表位包含SEQ ID N0.1所示的以下氨基酸中的一个或多个:Glu65、Asp66、Val67、Glu68、Thr69、Asn70、Glu72 和 Trp73 和以下氨基酸中的一个或多个:Lysll7、Hisll8 和 Argll9、Leul43、Lysl46、Metl47、Hisl49、Glnl50 和 Hisl51。
[0105]29.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQ ID N0.1中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Glu65-Trp73 ;以下氨基酸中的一个或多个:Lysll7-Argll9和以下氨基酸中的一个或多个:Leul43-Hisl51,条件是所述抗体不是单克隆抗体mAbl4,其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。所述抗体可备选地结合IL-21上的表位，其中所述表位包含SEQ ID N0.1中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Glu65-Trp73和以下氨基酸中的一个或多个:Leul43-Hisl51。
[0106]30.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQ ID N0.1中所示的Arg40-Val67氨基酸中的一个或多个和Glul29_Hisl49氨基酸中的一个或多个，条件是所述抗体不是mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
[0107]31.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含IL-21(SEQ ID N0.1)的Glu65-Trp73氨基酸中的一个或多个，条件是所述抗体不是mAbl4，其轻链和重链分别如SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7 所示。
[0108]32.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQ ID N0.1中所示的Glu65、Asp66、Val67和Hisl49氨基酸中的一个或多个，条件是所述抗体不是mAbl4，其轻链和重链分别如 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7 所示。
`[0109]33.包含实施方案7-32中任一个的配体/抗体和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。所述赋形剂/载体为本领域熟知。所述药物组合物优选意在用于IV给药和/或皮下给药。
[0110]34.包含实施方案7-32中任一个的配体/抗体的药盒。
[0111]35.实施方案7-32中任一个的配体/抗体在用作药物中的用途。
[0112]36.实施方案7-32中任一个的配体/抗体在治疗免疫病症中的用途。
[0113]37.实施方案7-32中任一个的配体/抗体在治疗自身免疫疾病中的用途。
[0114]38.实施方案7-32中任一个的配体/抗体在治疗SLE中的用途。
[0115]39.实施方案7-32中任一个的配体/抗体在治疗RA中的用途。
[0116]40.实施方案7-32中任一个的配体/抗体在治疗IBD中的用途。
[0117]41.实施方案7-32中任一个的配体/抗体在治疗⑶中的用途。
[0118]42.一种治疗免疫病症的方法，其中所述方法包括给予有其需要的人合适剂量的实施方案7-32中任一个的配体/抗体。
[0119]本文提供的mAbl4的Fab片段(Fab35)和IL-21之间的复合物的详细3-维结构知识，包括其结合界面，可构成合理设计具有所需性质的相互作用分子的变体的基础。对于抗体可期需改进的性质可为化学性质或物理性质，例如溶解度、粘度和稳定性。可期需调节的其它性质为抗体的抗原性质及其被抗-抗体结合的能力。
实施例
[0120]实施例1
[0121]IL-21与mAbl4的Fab片段(Fab35)的复合物的晶体结构 [0122]解析了 IL-21与人抗IL-21单克隆抗体mAbl4的Fab片段(Fab35)的复合物的三维结构，并采用X射线晶体学精修至1.64 A分辨率。结果表明，与mAb5的相比，IL-21上的Fab35(代表mAbl4)表位位于IL-21分子的完全不同部分，并且以不同的结合模式结合。“mAb5”对应于W02010055366中公开的克隆362.78.1.44抗体的IgGl形式，mAb5的Fe区携带L234A、L235E和G237A(降低的Fe受体结合)和A330S和P331S突变(降低的Clq-介导的补体结合)。尽管mAb5结合IL-21上螺旋A和C的表面暴露的面，但Fab35 (mAb14)更多地向四-螺旋束的一端结合，与暴露的环相互作用，并且还通过将色氨酸残基(重链的W102)侧链插入螺旋B和D之间而穿透到IL-21分子中，从而使螺旋D的C端部分稍微变形。与mAb5竞争IL-21Ra与IL-21的结合不同，Fab35 (代表mAb 14)将竞争YC与IL-21的结合，并且由于其高结合亲和力，将阻断YC与IL-21的结合。因此mAbl4将抑制通过YC由IL-21介导的生物学作用。
[0123]所述表位采用Fab35和IL-21之间的复合物结构来表征。然而，关于IL-21上Fab35表位的结论也适用于IL-21和相应完全抗体mAbl4 (由其得到Fab35)之间的相互作用。
[0124]将在IOmM组氨酸缓冲液，pH5.3中的hIL_21(在大肠杆菌(E.coli)中表达为成熟肽；SEQ ID NO:1的残基30-162，具有添加的N端甲硫氨酸残基)和在PBS缓冲液,pH7.4(4 片在 2 升水中，GIBCO 目录号 18912-014Invitrogen Corporation)中配制的抗-1L-21Fab35(包含对应于SEQ ID N0.9的轻链和对应于SEQ ID N0.10的重链片段)以1:1的摩尔比混合。复合物的终浓度为10.3mg/ml。用坐滴(sitting drop)技术在以1:1 (沉淀剂溶液体积:蛋白质溶液体积)比率混合的30%w/vPEG1000和200mM甲酸镁中使晶体生长。总的液滴大小为0.2 ill。通过将3 ill含有75%沉淀剂溶液和25%甘油的冷冻溶液(cryo-溶液)转移到含晶体的液滴中，并允许浸泡约半分钟，来制备晶体用于低温冷冻(cryo-freezing)。然后使晶体在液氮中速冻,并在数据收集期间通过低温N2气流保持
在100K温度下。在MAX-lab，Lund，SWeden在束线BL911-2(1)，收集晶体学数据至1.64 A分辨率。通过XDS软件包(2)进行数据的空间群测定、积分和标定。测定数据的晶胞参数分别为89.4,65.2, 106.7 A，90。，IlL 57°和90。，空间群为C2。至1.64 A分辨率的R-sym为6.4%，完整性98.2%。应用CCP4套件(5)的Phaser软件程序(3; 4)的分子置换技术用于结构测定。抗-1L-21Fab9(对应于mAb5)与IL-21的复合物的X-射线结构(未公布的结果)用作PHASER软件的输入模型。亦独立于Fab使用来自Fab9:1L-21复合物结构的IL-21分子，作为PHASER软件的输入。软件ARP/wARP(6)随后用于起始回合的模型建立，接着应用CCP4软件包的软件程序REFMAC5 (7)和PHENIX软件包(9)的PHENIX.refine (8)进行晶体学精修，接着应用Coot软件程序(10)进行电子密度图的计算机图形检查、模型校正和建立。使该步骤循环直到不可进一步显著改进该模型。所有数据最终的R和R-free分别为0.179和0.211，模型显示与理想键长的均方根偏差(RMSD)为0.()22 Ae
[0125]结果
[0126]Fab35的结合部位将竞争YC与IL-21的结合，并且由于其高结合亲和力，将阻断YC与IL-21的结合。因此其将抑制通过YC由IL-21介导的生物学作用。
[0127]通过CCP4程序套件(5)的软件程序Areaimol (11; 12)，针对晶体结构的IL-21/
Fab35分子复合物计算成对相互作用中所排除的面积，分别得到IL-21为1082 A2，抗IL-21为UMl A211计算IL-21分子和Fab35间的成对相互作用中所排除的平均面积为
1061 A 气
[0128]使用抗Fab35和IL-21分子间4,0 A的距离截止值，通过运行CCP4程序套件(5)
的contacts软件，鉴定出IL-21与Fab35之间的直接接触。IL_21/Fab35复合物晶体结构的结果见表1。发现所得对Fab35(代表mAbl4)的IL-21表位包含IL-21 (SEQ ID NO:1)的下列残基:Glu65、Asp66、Val67、Glu68、Thr69、Asn70、Glu72、Trp73、Lysll7、Hisll8、Argll9、Leul43、Lysl46、Metl47、Hisl49、Glnl50 和 Hisl51。
[0129]因此，Fab35 (mAbl4)表位包含螺旋B的N端部分中的残基(残基72_73)和螺旋D的C端部分中的残基(残基143-151)。此外,在螺旋C之前(proceeding)的环区段(残基65-70)中和在螺旋C和螺旋D之间的环(残基117-119)中鉴定出几个接触残基。该表位与预测的YC与IL-21结合部位具有部分重叠。
[0130]对IL-21的Fab35(代表mAbl4)互补位包括轻(L)链(SEQ ID N0.9，表2)的残基 Ser31、Asp50、Phe91、Asn92 和 Tyr94 和重(H)链(SEQ ID N0.10，表 2)的残基 Ile28、Ser30、Ser31、Tyr32、Ser33、Thr52、Ser53、Gly54、Ser55、Tyr56、Tyr57、His59、Glu99、ArglOO、GlylOU Trpl02、Glyl03、Tyrl04 和 Tyrl05。对 Fab35 片段 /mAbl4 抗体的表位见图2。
[0131]表1.通过CCP4程序软件包(5)的软件程序Refmac5 (7)对IL_21/Fab35复合物
的观测数据进行X射线模型精修的结果。
[0132]
【权利要求】
1.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQID N0.1中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Glu 65、Asp 66、Val 67、Glu 68、Thr 69、Asn 70、Glu 72、Trp 73 ;以下氨基酸中的一个或多个:Lys 117,His 118, Arg 119和以下氨基酸中的一个或多个:Leu143、Lys 146, Met 147、His 149、Gln 150和His 151，条件是所述抗体不是单克隆抗体mAbl4，所述mAbl4的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
2.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQID N0.1中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Glu 65-Trp 73;以下氨基酸中的一个或多个:Lys 117-Arg 119和以下氨基酸中的一个或多个:Leu 143-His 151,条件是所述抗体不是单克隆抗体mAbl4,所述mAb 14的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
3.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQID N0.1中所示的Arg 40-Val67氨基酸中的一个或多个以及Glu 129-His 149氨基酸中的一个或多个，条件是所述抗体不是mAbl4，所述mAbl4的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
4.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含IL-21(SEQ ID N0.1)中Glu65-Trp 73氨基酸中的一个或多个,条件是所述抗体不是mAbl4,所述mAbl4的轻链和重链分别如 SEQ ID N0.6 和 SEQ ID N0.7 所示。
5.前述权利要求中任一项的抗体，其中所述抗体结合SEQID N0.1中所示Glu 65、Asp 66和Val 67中的一个或多个。
6.前述权利要求中任一项的抗体,其中所述抗体结合SEQID N0.1中所示的His149。
7.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQID N0.1中所示Glu 65、Asp66、Val 67和His 149氨基酸中的一个或多个，条件是所述抗体不是mAbl4，所述mAbl4的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
8.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含SEQID N0.1中所示的以下氨基酸中的一个或多个:Arg 40,Lys 50,Glu 65、Asp 66,Val 67,Glu 129,Glu 135,Glu 138、Arg 139、Lys 141、Ser 142、Gln 145 和 His 149,条件是所述抗体不是 mAb 14,所述 mAb14的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
9.结合IL-21上的表位的抗体，其中所述表位包含以下氨基酸中的一个或多个:Glu65、Asp 66,Val 67,Glu 68,Thr 69、Asn 70,Glu 72,Trp 73、Lys 117,His 118,Arg 119、leu 143、Lys 146、Met 147、His 149、Gln 150 和 His 151，条件是所述抗体不是 mAbl4，所述mAbl4的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示。
10.权利要求9的抗体，其中所述抗体包含轻链和重链，所述轻链包含SEQID N0.6中所示⑶R1、⑶R2和⑶R3的至少一个，并且所述重链包含SEQ ID N0.7中所示⑶R1、⑶R2和⑶R3的至少一个。
11.权利要求1-10中任一项的抗体，其中所述抗体干扰共有YC链与IL-21的结合。
12.权利要求10的抗体，其中所述抗体是mAbl4的变体，所述mAbl4的轻链和重链分别如SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.7所示，其中所述抗体包含⑶R序列中的一个或多个突变，其中所述突变选自由以下组成的列表中的一个或多个:A61S (SEQ ID NO 7)、D62E (SEQ IDNO 7)、V64I (SEQ ID NO 7)和 K65R (SEQ ID NO 7)、R24K (SEQ ID NO 6)、S26T (SEQ IDNO 6)、Q27N (SEQ ID NO 6)、D30E (SEQ ID NO 6)、S53T (SEQ ID NO 6)和 S56T (SEQ IDNO 6)。
13.药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的抗体和任选一种或多种药学上可接受的赋形剂。
14.权利要求1-12中任一项的抗体在治疗免疫病症中的用途。
15.用于选择结合IL-21的配体的方法，其中所述方法包括:用IL-21模拟物筛选一个或多个配体文库，其中所述IL-21模拟物包含含有SEQ ID N0.1中所示的以下氨基酸的表位:Glu 65、Asp 66、Val 67和His 149 ;和分离一种或多种结合所述不连续表位的配体。
【文档编号】C07K16/28GK103702721SQ201280037924
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年5月31日 优先权日:2011年5月31日
【发明者】A.斯文斯森, M.D.安德森, J.布雷恩霍特, C.维伯格, H.B.拉斯穆森, B.奧森克罗格 申请人:诺沃—诺迪斯克有限公司