专利名称：包含结合hiv包膜蛋白的配体的免疫原的制作方法
技术领域：
本发明总的来讲涉及免疫原，具体地说涉及用于诱导中和各种各样的HIV原代分离株的抗体的免疫原。本发明也涉及一种应用这种免疫原诱导抗HIV抗体的方法。
背景由于HIV持续在全世界流行，因此迫切需要有效的HIV疫苗。HIV疫苗开发的一个关键障碍是HIV的巨大变异性和HIV突变的速度和程度(Wain-Hobson，The Evolutionary biology of Retroviruses，SSBMorse Ed(编著).Raven Press，NY，第185-209页(1994))。
Myers、Korber及其同事分析了全球的HIV序列并将HIV分离株分成多个组别或分支，从而提供评价各个HIV分离株彼此的进化亲缘的基础(Myers等(编著)，Human Retroviruses and AIDS(1995)，由Theoretical Biology and Biophysics Group发表，T-10，Mail Stop K710，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，NM 87545)。最近，Korber等也分析了含有CTL和T辅助表位的HIV蛋白质区的变异程度，在HIV分离株中的许多CTL和T辅助表位记载有序列变异(Korber等(编著)，HIV Molecular Immunology Database(1995)，由TheoreticalBiology and Biophysics Group发表，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，NM 87545)。
最近，Hahn等通过证明HIV在分支中时常发生重组，报道新水平的HIV变异复杂性(Robinson等，J.Mol.Evol.40245-259(1995))。这些作者提出，达10％之多的HIV分离株是重组嵌合体，表明基于唯一一个HIV分支的疫苗将不保护免疫受治疗者被嵌合HIV分离株感染(Robinson等，J.Mol.Evol.40245-259(1995))。
本发明涉及适合用于HIV疫苗的免疫原。所述免疫原将会在人体内诱导广泛的交叉反应性中和抗体并且中和各种各样的HIV原代分离株。
发明概述本发明涉及一种用于诱导中和各种各样HIV原代分离株的抗体的免疫原。本发明也涉及一种应用这种免疫原诱导抗HIV抗体的方法。
根据下文的描述，本发明的目的和优势将是显而易见的。
附图简述
图1显示与gp160结合的CCR5或CXCR4辅受体蛋白(或其蛋白或肽片段)和可溶性CD4。
图2显示在小泡、脂质体或灭活病毒体中含有与gp160结合的CD4、CCR5(或CXCR4)的小泡或脂质体。
图3显示与gp160结合的可溶性CD4和反映CCR5或CXCR4gp120结合部位的肽。
图4显示HIV分离株DH12的可溶性gp120和可溶性CD4之间结合相互作用的BlAcore测定。
图5显示HIV 89.6、JRFL和DH12可溶性gp120蛋白和可溶性CD4之间的结合相互作用。
图6显示gp120和CD4之间相互作用的动力学和结合亲和力。
图7显示可溶性CD4与表达gp120、得自CHO-wt(表达HIV-IIIBgp160-)细胞的膜的结合。
图8显示在gp160和gp140中与对应于有能力诱导细胞融合的gp160结构相关的变化。
图9显示当加入作为卷曲螺旋区部分的DP-178或T649肽时以及当加入至CD4触发包膜时导致防止融合的融合表位的“冻结(freezing)”。
图10A-10D显示CD4和CCR5 N末端肽与HIV 89.6 gp140寡聚体的结合。
图10A.固定化CD4和HIV包膜蛋白(89.6 gp120和gp140)之间相互作用结合曲线的重叠。数据表明，sCD4与经切割的HIV 89.6gp140(c1)和HIV 89.6 gp120蛋白结合。阴性对照(negative ctrl)通过在CD8固定化表面注射89.6 gp120蛋白而产生。与HIV JRFL和DH12gp120env蛋白相比，HIV 89.6 gp120 env以相对较高的亲和力与CD4结合(Kd＝146nM、96nM和23nM，分别对于JRFL、DH12和89.6env而言)。Kd的这些差异主要是由于解离速率的差异所致(kd＝8.8×10-4s-1、4.7×10-4s-1、1.1×10-4s-1，分别对于JRFL、DH12和89.6 gp120包膜蛋白而言)。
图10B.未经切割的CM235 gp140(uncl)和IIIB-gp160(uncl)寡聚体与固定化CD4的结合。数据表明，尽管未经切割的IIIB-gp160(图10B)寡聚体与CD4弱结合，但是未经切割的HIV CM235 gp140(图10B)寡聚体的确结合sCD4。阴性对照是同样注射的、流过用IIIBgp160蛋白固定化的表面的IIIB-gp160。
图10C.通过在CD4固定化表面注射可溶性89.6 gp140寡聚体，首先形成CD4-gp140复合物(箭头所指)。然后注射CCR5 N末端肽(D1)，以监测其与CD4-gp140复合物的结合。
图10D.在有和无CD4的情况下CCR5 N末端肽D1与89.6 gp140寡聚体结合的结合曲线的重叠。在CD4-gp140复合物上，D1肽结合的表观Kd为280nM(ka＝9×103M-1s-1，kd＝2.56×10-3s-1)。在CD4不存在时，D1肽与经切割的gp140寡聚体组成型结合的缔合速率相似，但解离速率较快(kd＝0.01 S-1；Kd＝1μM)。在有和无CD4的情况下，CCR5-D1肽稳态结合方面的差异为一种定量效应。为了确保所有gp140分子与CD4结合，在CD4固定化传感器表面捕获经切割的gp140蛋白(RU＝530)，而将可溶性89.6 gp140蛋白直接固定(RU＝3300)在同一传感器芯片的邻近流式测定池上。
图11A-11D显示CD4和CCR5胞外结构域肽诱导HR-2肽与HIV89.6 gp140的结合。
图11A.在89.6 gp140寡聚体与CD4(实线)、CD4和CCR5-D1肽(虚线)、CCR5-D1肽(实心圆)和与单独的gp140寡聚体(虚线)结合后HR-2肽DP178的结合。
图11B.HR-2肽T649QL与89.6 gp140寡聚体(虚线)、CD4-gp140复合物(空心圆)和与CD4-gp140-D1复合物(实线)的结合。在sCD4固定化表面顺序注射89.6 gp140蛋白和CCR5-D1肽(参见图10C)。
图11C.HR-2肽DP178和对照紊乱型(scrambled)DP178肽与CD4-89.6 gp140复合物的结合。
图11D.在用CD4和CCR5-D1肽诱导后，HR-2肽DP178和T649QL与89.6 gp140结合的动力学数据。Rm是指在指定gp140复合物上注射相同浓度的HR-2肽(5mM)期间以稳态结合的RU。nm＝由于HR-2肽以极低的亲和力与gp140蛋白结合，因此不能测量速率常数。
图12显示HR-2肽的免疫沉淀和89.6 gp140包膜蛋白的蛋白质印迹分析。生物素化HR-2肽DP178组成型免疫沉淀经切割的gp41和未经切割的gp140蛋白。免疫沉淀gp140和gp41的水平因sCD4增加。将HIV 89.6 gp140蛋白与2.5μg生物素化DP178在有(泳道1和5)或无(泳道3和7)sCD4(2μg)的情况下保温。作为对照，也将HIV89.6 gp140蛋白与2.5μg生物素化紊乱型DP178肽在有(泳道2和6)或无(泳道4和8)sCD4(2μg)的情况下保温。第9泳道显示在gp140制备物中与mab 7B2(抗gp41)一起免疫印迹的gp140和gp41，而第10泳道显示在gp 140制备物中与mab T8(抗gp120)反应的gp120。
图13显示HR-2肽与可溶性HIV 89.6 gp140包膜的诱导结合。
图14A-14F显示可溶性CD4可诱导HR-2肽与89.6 gp140结合。图14A.可溶性89.6 gp140在CD4(实线)和T8(虚线)固定化表面的捕获。在CM5传感器芯片上大约固定3000-5000 RU sCD4和T8mab。然后在两个表面上以相同水平捕获可溶性89.6 gp140蛋白，并且分别用CD4-gp140和T8-gp140将其标记。图14B和14C.19b(图14B)和2F5(图14C)抗体与CD4-gp140(实线)和T8-gp140(虚线)复合物的结合。在gp140捕获稳定后，注射19b(抗gp120 V3)或2F5(抗gp41)抗体(300μg/ml)，以评价这两个表面gp120和gp41的相对量。图14D-14F.HP-2肽DP178(图14D)、紊乱型DP178(图14E)和T649Q26L(图14E)与CD4-gp140(实线)或T8-gp140(虚线)表面的结合。将50μg/ml每种HR-2肽以30μl/min注入到CD4和T8表面。
图15A-15E显示HR-2肽与CD4-gp140和CD4-gp120复合物的结合相互作用。图15A和15B.显示HR-2肽DP178(图15A)和T649Q26L(图15B)、以及CD4-gp120(虚线)和CD4-gp140(实线)之间相互作用的结合曲线。图15A和15B显示在CD4-gp140(实线)和CD4-gp120(虚线)表面12.5-100μg/ml HR-2肽DP178和T649Q26L的滴定。图15C.紊乱型DP178HR-2肽不与CD4-gp140或T8-gp140结合。图15D.CD4诱导HR-2肽与gp120包膜蛋白结合。HR-2肽与T8-gp120复合物没有特异性结合，而sCD4-gp120和sCD4-gp140表面的确稳定地结合HR-2肽。与CD4-gp120相比，观测到与CD4-gp140较高结合。图15E的表显示HR-2肽和CD4-gp120和CD4-gp140复合物的结合速率常数和解离常数。数据代表2个单独的实验。将HR-2肽以30μl/min同时注射到空白、sCD4和sCD4-gp120或sCD4-gp140表面。所示曲线表明与CD4-gp120或CD4-gp140特异性结合，并且在减去空白和sCD4表面的结合信号后获得所述曲线。
图16A-16F显示HR-2肽与固定化gp41的组成型结合且CD4诱导与gp140结合。图16A和16B.DP178(12.5-100μg/ml)与固定化ADAgp41和CD4-gp140(图16B)表面的结合。图16C和16D.紊乱型DP178(12.5-100μg/ml，图16D)与固定化ADA gp41的结合以及HR-2肽DP178(12.5-50μg/ml)与T8-gp140表面的结合。图16E和16F.DP178与gp41(图16E)和CD4-gp140(图16F)结合的RU vs RU/C的斯卡查德图(Scatchard plots)。数据代表2个单独的实验。
图17A和17B显示HR-2肽与gp120-gp41复合物结合的诱导。HR-2肽DP178(50μg/ml)与固定化gp41、gp41-gp120和gp41-gp120-CD4复合物的结合。与gp41表面相比，在gp41-gp120和gp41-gp120-CD4表面观测到DP178的较高结合。将可溶性89.6gp120(100μg/ml)或gp120-CD4混合物(与0.3mg/ml CD4一起预保温30分钟的gp120)以5μl/min注射到用ADA gp41固定的传感器表面达10分钟。注射结束时，让洗涤缓冲液(PBS)流过，直到表面稳定，无基线漂移。大约300 RU gp120和850 RU gp120-CD4与固定化gp41表面形成稳定的复合物。先注射再生缓冲液(10mM甘氨酸-HCl，pH 2.0)，然后注射gp120-CD4混合物，gp120-CD4结合随后减至约325 RU(大致相当于gp41-gp120表面)。因此这两个表面是稳定的并且相当于缔合gp120或gp120-CD4的量。
图18.可溶性CD4与非共价连接gp41的HIV gp120结合导致HR-2与gp120的结合以及gp41-gp120缔合的正调节。免疫原为可溶性形式的交联CD4-gp120-gp41。
图19.A32与非共价连接gp41的HIV gp120结合导致HR-2与gp120的结合以及gp41-gp120缔合的正调节。免疫原为可溶性形式的交联A32(完全Ig)-gp120-gp41或可溶性形式的交联A32(Fab或Fab2)-gp120-gp41。
图20.可溶性CD4与可溶性gp120结合导致CCR5结合部位和gp41 HR-2结合部位的暴露。
图21.A32 mab与可溶性HIV gp120结合导致CD4结合部位和CCR5结合部位的暴露。
图22.可溶性CD4与可溶性未经切割的HIV gp140结合正调节HR-2与gp41中的HR-1结合并且暴露CCR5结合部位。免疫原为与或不与DP178或T649Q26L结合的交联CD4-gp140。
图23.Mab A32与可溶性未经切割的HIV gp140结合正调节HR-2与gp41中的HR-1结合并且暴露CCR5结合部位。免疫原为具有或没有结合gp41或其它复合物组分的DP178或T649Q26L交联A32或其片段-gp140。
图24.可溶性CD4与非共价连接gp41的HIV gp120结合导致HR-2与gp120的结合以及gp41-gp120缔合的正调节。免疫原为可溶性形式的交联CD4-gp120-gp41，其中HR-2肽与HR-1结合。
图25.A32与非共价连接gp41的HIV gp120结合导致HR-2与gp1 20的结合以及gp41-gp120缔合的正调节。免疫原为可溶性形式的交联A32(完全Ig)-gp120-gp41或可溶性形式的交联A32(Fab或Fab2)-gp120-gp41，其中HR-2肽与HR-1或所述复合物中的其它组分结合。
图26.可溶性CD4可诱导HR-2肽与HIV 89.6 gp140结合。在所有三个表面以相同水平捕获可溶性89.6 gp140蛋白到并且用CD4-gp140、T8-gp140和A32 gp140将其标记。该图显示HR-2肽DP178与T8-gp1240复合物(圆形)、CD4-gp140复合物(实线)和A32-gp140复合物(虚线)的结合。将50μg/ml HR-2肽以30μl/min注射到A32、CD4和T8表面。显示在HR-2肽与sCD4、T8和A32表面的大量应答和非特异性结合后只有特异性结合。
发明详述本发明涉及诱导广泛反应性中和抗体的免疫原，其对于有效AIDS疫苗是必需的。在一个实施方案中，所述免疫原包含一种经切割或未经切割的gp140或gp160 HIV包膜蛋白，所述蛋白已经被“激活”，以暴露通常在HIV病毒体的表面只有瞬时暴露或极少暴露的保守中和表位的中间构象。所述免疫原是HIV包膜的“冻结(frozen)”触发形式，使得将可利用的特定表位呈递给B淋巴细胞。该表位呈递的结果是产生广泛中和HIV的抗体。
融合中间免疫原的概念符合以下观测结果gp41 HR-2区肽DP178可以捕获解螺旋构象的gp41(Furata等，Nature Struct.Biol.5276(1998))并且福尔马林固定的HIV感染细胞可以产生多种中和抗体(LaCasse等，Science 283357(1997))。最近，抗所述卷曲螺旋区的单克隆抗体与所述卷曲螺旋gp41结构HR1和HR-2区中的gp41构象决定簇结合，但不中和HIV(Jiang等，J.Virol.10213(1998))。然而，后者的研究证明，所述卷曲螺旋区可利用与其结合的抗体，如果产生正确抗体的话。
HIV包膜上的保守中和位点可以位于两个区上；它们可以位于gp41上以及它们可以位于gp120上。
可以预期在gp140或gp160“触发”(“激活”)期间暴露的gp41区和构象是保守的，因为i)卷曲螺旋区的氨基酸序列是保守的和ii)融合包膜复合物的功能是保守的并且对于病毒的致病性是必需的。这种保守对产生多种中和抗HIV抗体是关键的。
本发明一方面的免疫原包含例如在从表达gp140或gp160的细胞制备的细胞小泡中或者在含有跨膜脂双层HIV gp140或gp160包膜的脂质体中的可溶性形式或锚定的HIV包膜经切割或未经切割的gp140或gp160。或者，在aldrithio 1-2灭活HIV-1病毒体中的触发gp160可以用作免疫原。gp160也可以作为重组蛋白存在，或者为gp160或者gp140重组蛋白(gp140是具有跨膜区并且可能缺失其它gp41区的gp160)。结合的gp160或gp140可以是重组CCR5或CXCR4辅受体蛋白(或其胞外结构域肽或蛋白质片段)或与gp120上CXCR4或CCR5结合部位结合的抗体或其它配体和/或可溶性CD4或模拟CD4结合作用的抗体或其它配体(图1)。或者，含有CD4、CCR5(或CXCR4)的小泡或脂质体(图2)或者可溶性CD4和反映CCR5或CXCR4 gp120结合部位的肽(图3)。或者，最佳CCR5肽配体可以是得自CCR5 N端的肽，其中特定酪氨酸被硫酸化(Bormier等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 975762(2001))。图13中的数据清楚地表明，触发免疫原可能不需要与膜结合，而可以存在并且在溶液中被触发。或者，可溶性CD4(sCD4)可以被由于CD4肽模拟表位(mimetopes)触发的包膜(gp140或gp160)所置换(Vitra等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 961301(1999))。也可使用“触发”gp160或gp140经历与诱导细胞融合的gp160结构相关的变化的其它HIV辅受体分子。(另见图8)。实施例2中所示的数据证明，可溶性HIV gp140原代分离株HIV 89.6包膜与可溶性CD4(sCD4)的连接诱导gp41的构象变化(参见图13)。
在一个实施方案中，本发明涉及特征为具有CCR5结合区的连接受体(CD4)的包膜但与具有CD4结合部位被封闭的连接CD4的蛋白不同的免疫原，该免疫原具有暴露的CD4结合部位(open)。此外，该免疫原可以不含宿主CD4，从而在给予宿主后避免产生潜在有害的抗CD4抗体。(参见图18-25)。
所述免疫原可以包含与结合A32单克隆抗体(mab)所识别的gp120上位点的配体连接的gp120包膜(Wyatt等，J.Virol.695723(1995)，Boots等，AIDS Res.Hum.Retro.131549(1997)，Moore等，J.Virol.688350(1994)，Sullivan等，J.Virol.724694(1998)，Fouts等，J.Virol.712779(1997)，Ye等，J.Virol.7411955(2000))。已经显示一种A32 mab模拟CD4，并且当与gp120结合时，正调节(暴露)CCR5结合部位(Wyatt等，J.Virol.695723(1995))。gp120与这种配体的连接也正调节CD4结合部位并且不阻断CD4与gp120结合。最好是这类配体也正调节与经切割的gp120、未经切割的gp140和经切割的gp41结合的gp41的HR-2结合部位，从而进一步暴露这些蛋白质上的HR-2结合部位—每个结合部位都是抗HIV中和抗体的潜在靶。
在该实施方案的一个具体方面，所述免疫原包含与完整的A32mab、A32 mab的Fab2片段或A32 mab的Fab片段连接的可溶性HIVgp120包膜，结果为gp120上的CD4结合部位、CCR5结合部位和HR-2结合部位被暴露/正调节。所述免疫原可以包含与A32 mab(或其片段)结合的gp120或者可以包含与A32 mab(或其片段)结合的gp120并用诸如3％甲醛的交联剂或诸如DTSSP(Pierce Chemical Company)的异双官能交联剂交联。所述免疫原也可包含未经切割的gp140或未经切割的gp140、经切割的gp41和经切割的gp120的混合物。A32 mab(或其片段)与gp140和/或gp120结合或者结合与gp41非共价结合的gp120，导致正调节(暴露)gp41、gp120和未经切割的gp140中的HR-2结合部位。A32 mab(或其片段)与gp120或gp140的结合也是导致CD4结合部位和CCR5结合部位的正调节。与含gp120的复合物一样，包含未经切割的gp140和A32 mab(或其片段)的复合物可以用作用诸如3％甲醛或DTSSP的交联剂交联或者未交联的免疫原。在一个实施方案中，本发明涉及包含与A32 mab的Fab片段结合并交联、任选与HR-2结合蛋白结合并交联的可溶性未经切割的gp140的免疫原。
可以将用与gp120上的A32 mab结合部位结合的配体触发的gp120或gp140 HIV包膜蛋白与至少包含第二种包膜的第二种免疫原联合给予，所述第二种包膜被与不同于A32 mab结合部位的位点例如被mab 17b所识别的CCR5结合部位结合的配体触发。17b mab(Kwong等，Nature 393648(1998)，可得自the AIDS ReferenceRepository，NIAID，NIH)增强sCD4与gp120结合。该第二种免疫原(该免疫原也可以单独使用或者与非上述的触发免疫原联合使用)可以例如包含与完整17b mab、17b mab的Fab2片段或17b mab的Fab片段连接的可溶性HIV gp120包膜。人们将会认识到，可以用其它CCR5配体、包括可以导致使CD4结合部位暴露的其它抗体(或其片段)来代替17b mab。这种免疫原还可以包含与17b mab或其片段(或如上所述的其它CCR5配体)结合的gp120或者可以包含与17b mab或其片段(或如上所述的其它CCR5配体)结合且用诸如.3％甲醛的试剂或诸如DTSSP(Pierce Chemical Company)的异双官能交联剂交联的gp120。或者，该免疫原还可以包含单独存在的或者在经切割的gp41和经切割的gp120的混合物中的未经切割的gp140。在这样的混合物中与gp140和/或gp120结合的mab 17b或其片段(或如上所述的其它CCR5配体)导致CD4结合区的暴露。所述7b mab或其片段(或如上所述的其它CCR5配体)-gp140复合物可以以用诸如.3％甲醛或DTSSP的试剂交联或非交联的形式存在。
可以将可溶性HR-2肽例如T649Q26L和DP178(参见下文)加入至上述复合物中，以稳定gp120和gp41以及未经切割的gp140分子上的表位，并且可以将其与所述复合物交联或者不交联。
已经制备了一系列中和多种HIV原代分离株的单克隆抗体(mab)，除上述的17bmab外，还包括与gp120上CD4结合部位结合的mab IgGlb12(Roben等，J.Virol.68482(1994)，Mo等，J.Virol.716869(1997))、与gp120上构象决定簇结合的mab 2G12(Trkola等，J.Virol.701100(1996))和与gp41的膜近侧区结合的mab 2F5(Muster等，J.Virol.684031(1994))。可以用触发包膜免疫原的混合物来优化诱导中和各种各样的HIV原代分离株的抗体。这样的免疫原，当例如系统给予或者在粘膜部位给予灵长类时，可诱导抗HIV原代分离株的广泛反应性中和抗体。
如上所述，按照本发明，可以用各种方法“冻结”融合表位。例如，“冻结”可以通过加入代表所述卷曲螺旋区部分的DP-178或T-649Q26L肽而实现，并且当加入至CD4-触发包膜时可导致防止融合(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998)(参见图9和图13)。HR-2肽结合的gp140、gp41或gp160可以用作免疫原或者可以用诸如DTSSP或DSP(Pierce Co.)的试剂、甲醛或具有相似作用的其它交联剂(参见下文)交联。
“冻结”也可以通过加入0.1％-3％甲醛或低聚甲醛(两者均为蛋白质交联剂)至所述复合物中而实现，以稳定CD4、CCR5或CXCR4、HR-2肽gp160复合物或者稳定“触发”gp41分子或它们两者(LaCasse等，Science 283357-362(1999))。
再者，gp41或gp120融合中间体的“冻结”可以通过加入诸如DSP(二硫代双[琥珀酰胺基丙酸酯])(Pierce Co.Rockford，ILL.，No.22585ZZ)或水溶性DTSSP(Pierce Co.)(使用与氨基反应两种NHS酯)的异双官能试剂而实现，以交联和稳定CD4、CCR5或CXCR4、HR-2肽gp160复合物或者稳定“触发”gp41分子或它们两者。
在HIV分支的HIV分离株中以及在来自不同地理位置的患者的HIV分离株中存在固有的差异。用于HIV疫苗开发的触发复合物可以用来自不同HIV分支和不同地区的HIV包膜来制备。包含正调节CCR5结合部位、CD4结合部位或它们两者的抗体或其片段、或者为CD4诱导型的抗体或其片段的触发复合物，可以通过以二个顺反式方式在质粒中共表达两种gp120和例如所述抗体Fab区重链和轻链而产生，以便生产具有上述复合物特性的重组蛋白。
采用本领域众所周知的技术，可以将本发明的免疫原与药学上可接受的载体和/或佐剂(例如明矾)一起配制。本发明免疫原的合适给药途径包括系统(例如肌内或皮下)给药。当希望免疫应答在粘膜免疫系统(例如鼻内)中发生时，可以使用其它途径。
在以下非限制性的实施例中，更加详细地描述本发明的某些方面。
实施例1采用BiaCore 3000技术证实了本发明免疫原生产方案的可行性。
图4显示是CD4而不是CD8可与gp120结合。图5、图6显示gp120与原代分离株和实验室采用的HIV毒株的包膜相互作用中的差异。
图7显示来自用HIV-IIIB gp160转染的嵌合仓鼠卵巢细胞的小泡以及BiaCore L1芯片上存在的这些小泡，显示是稳定结合的可溶性CD4而不是CD8。
实施例2实验细节蛋白质可溶性单体gp120 JRFL、gp120 DH12和sCD4由Progenics生产，并且由the Division of AIDS，NIAID，NIH提供。HIVIIIB gp160得自Protein Sciences。来自HIV 89.6(分支B)和HIV CM235(分支E)原代分离株的包膜蛋白由Pat Earl，NIH采用重组痘苗病毒生产并且如已描述的方法纯化(Earl等，J.Virol.683015-3026(1994)，Earl等，J.Virol.75645-653(2001))。
概括地讲，160cm2培养瓶中的BS-C-1细胞用vBD1(HIV 89.6gp140)或vBD2(gp120)痘苗病毒感染。2小时后，将细胞在PBS中洗涤，置于无血清OPTI-MEM培养基(Gibco)中达24-26小时。然后通过离心和过滤(0.2μm)收获培养基，然后加入TX-100至0.5％(终浓度，v/v)。对于某些实验而言，将培养基浓缩15-30倍，用作多聚体gp140糖蛋白(一种经切割和未经切割的形式的混合物)的来源。采用两步法对这些糖蛋白进行进一步纯化。在第一步中，除去污染蛋白，使得自培养基的糖蛋白与兵豆凝集素柱结合，用甲基α-D-吡喃甘露糖苷洗脱。该制备物含有～50∶50经切割和未经切割的gp140，所述经纯化的培养上清液的浓缩液被称为“经切割的gp140”。最后，采用大小排阻色谱分离并纯化寡聚体gp140和二聚体gp140。该gp140制备物被称为“未经切割的gp140”。合并糖蛋白流分，采用微量浓缩器浓缩。
单克隆抗体抗gp120 V3环(19b)CCR5结合部位(17b)的人单克隆抗体和抗gp41免疫显性区的mab 7B2由James Robinson(Tulane University，NewOrleans，LA)馈赠。Mabs 2F5、IgGlb12和2G12得自the AIDS ReferencesRepository，NIAID，NIH。
CCR5和HR-2肽.
合成肽由SynPep Corporation，Dublin，CA合成并且通过反相HPLC纯化。通过HPLC测定，本项研究中使用的肽的纯度高于95％，并且经质谱法证实是正确的。肽CCR5-D1(MDYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAAR)衍生自人CCR5 N端(Bieniasz等，EMBO Journal 162599-2609(1997))。Gp41肽DP178YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112676-12680(1994))、T649WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))和T649-Q26L(WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQLEKNEQELLEL)(Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))衍生自HIV 89.6的HIV-1包膜gp41(Collmann等，J.Virol.667517-7521(1992))。作为HR-2肽结合的对照，也制备一种紊乱序列DP178肽。
表面胞质团共振生物传感器测定SPR生物传感器测定在BIAcore 3000(BIAcore Inc.，Uppsala，Sweden)仪器上进行。将HIV包膜蛋白(gp120、gp140、gp160)和sCD4在10mM乙酸钠缓冲液(pH4.5)中稀释至100-300mg/ml，然后采用蛋白质固定化的标准胺偶联方案(Alam等，Nature 381616-620(1996))，将其直接固定在CM5传感器芯片上。于25℃、以5-20ml/min连续流过PBS(pH7.4)，以实时监测蛋白质和肽的结合。取出分析物(蛋白质和肽)，传感器表面在每个结合循环后通过一份或双份5-10ml脉冲的再生溶液(10mM甘氨酸-HCl，pH 2.5或10mM NaOH)进行再生。
运用O′Shannessy等的非线性拟合方法(O′Shannessy等，Anal.Biochem.205132-136(1992))和BIAevaluation 3.0软件(BIAcoreInc)，进行所有分析。根据简单双分子相互作用的缪尔(Langmuir)公式(A+B＝AB)拟合的曲线，获得速率和平衡常数。
在初步SPR实验中，测定的结果是，与HIV gp120 DH12(结合的t1/2，25min)和HIV gp120 JRFL(结合的T1/2，14min.)相比，对于HIV89.6而言HIV gp120包膜蛋白以最大亲和力且相对非常少的基线漂移结合sCD4(结合的t1/2，105min.)。从而生产gp120和gp140，供后续实验用。
HIV包膜蛋白的免疫沉淀后蛋白质印迹分析。将可溶性HIV 89.6gp140或gp120蛋白与或不与2μg重组sCD4一起在50μl PBS的总体积中温育2小时，剂量在生物素化DP178或生物素化紊乱型DP178作为对照的范围内，然后与50μl链霉抗生物素蛋白-琼脂糖微珠(SigmaChemicals，St.Louis，MO)悬浮液一起温育(4小时)。免疫复合物用500μl PBS洗涤三次，重悬于含有2-ME的SDS-PAGE样品缓冲液中，煮沸5分钟，加样至4-20％聚丙烯酰胺凝胶的SDS-PAGE。将凝胶转移至用于蛋白质分析的含有mabs T8(抗gp120 N末端)或7B2(抗gp41免疫显性区)的免疫印迹膜中。
结果sCD4与经切割和未经切割的HIV包膜的结合。初步SPR研究表明，其中HIV gp120包膜JRFL、DH12和89.6、HIV 89.6 gp120证明与sCD4的结合最稳定(参见图10A)。因此，研究含有用于与sCD4结合的经切割的gp140或者主要是未经切割的gp140的HIV89.6 gp140包膜蛋白制备物。在SPR生物传感器测定中，测试未经切割的HIVCM235 gp140以及经切割的HIV 89.6 gp140结合芯片上共价锚定的sCD4的能力。经切割的89.6 gp140也结合sCD4(图10A)。得自ProteinSciences未经切割的杆状病毒生产的HIV IIIB gp160不结合sCD4(Mascola等，J.Infect.Dis.173340-348(1996))(图10B)。然而，gp140切割成gp120和截短的gp41不一定需要sCD4与包膜制备物的结合，因为未经切割的分支E包膜HIV CM235 gp140也结合sCD4(图10B)。
N末端CCR5胞外结构域肽与HIV 89.6gp140包膜的结合。HIVgp120上的CCR5结合部位可被sCD4诱导(Kwong等，Nature 393648-659(1998)，Rizzuto等，Science 2801949-1953(1998)，Wyatt等，Nature 393705-710(1998))。接下来确定是否可以制备与HIV 89.6gp140结合的N末端CCR5胞外结构域合成肽。从CCR5 N末端产生30个氨基酸肽(称为CCR5-D1)，并且测试其与经切割的HIV 89.6gp140结合的能力。
发现CCR5-D1肽与经切割的gp140的低水平组成型结合，而sCD4与经切割的gp140包膜结合可诱导CCR5-D1与gp140的结合更加稳定(图10C和10D)。Doms等已经发现，天然CCR5与sCD4连接的gp120的亲和力在膜结合的包膜情况下为500μM(Hoffman等，Proc.Natl.Acad.Sci.9711215-11220(2000))。发现该CCR5-D1 N末端结构域肽与sCD4连接的gp140的结合亲和力约为280μM(图10D)。
可溶性CD4和CCR5-D1胞外结构域肽对HR-2肽与经切割的HIV89.6gp140包膜蛋白结合的影响。本项研究的主要目的是确定gp41的融合相关构象是否可以采用HR-2肽结合的SPR测定来检测。显然如果HR-2肽可以结合gp140，则gp41卷曲螺旋结构必须是解螺旋的，使得内源HR-2不与HR-1结合。在本项研究中使用三种这样的HR-2肽-DP178(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112676-12680(1994)，Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))、T-649(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))和T649Q26L(Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))。DP178含有HR-2 C端氨基酸(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112676-12680(1994)，Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))，而T649Q26L含有更多的HR-2N端氨基酸(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998)，Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))。发现DP178与经切割的HIV 89.6 gp140低水平结合(图11A)，并且DP178对照紊乱型肽完全不结合(图11C)。
当测定HR-2肽对与sCD4连接的经切割的gp140的结合时，DP178 HR-2肽对经切割的gp140的结合可被sCD4诱导(图11A)。加入CCR5-D1 N端肽至sCD4-gp140复合物中不显著改变DP178与gp140结合的Kd(0.7至1.1μM)，但的确减慢DP178结合的缔合速率(7.9×10-3M-1s-1至3.47×10-3M-1s-1)，可能表明诱导了蛋白质构象变化(图11A，11B和图11中的表)。
将T649Q26L HR-2肽设计为对HR-1的结合亲和力高于对Q26L取代的结合亲和力(Shu等；Biochemistry 391634-1642(2000))，事实上，在本项研究中，T649Q26L也与连接的、经切割的CD4-gp140复合物结合。可溶性CD4增加DP178与经切割的gp140最大平衡结合(Rm)大约10倍(从DP178与没有sCD4的结合Rm为35 RU(反应单位)至sCD4的Rm为320RU)(图11)。在sCD4后，DP178与经切割的gp140结合的kd、s-1(解离速率)为.0056。sCD4与经切割的gp140寡聚体结合导致DP178结合的t 1/2为124秒。DP178与sCD4和CCR5-D1连接的、经切割的gp140 89.6结合的kd为1.1μM。HR-2肽结合特异性的另外的对照证明DP178 HR-2肽不与sCD4连接的gp120结合。
生物素化HR-2肽免疫沉淀HIV包膜蛋白的能力。为了鉴定溶液中HR-2肽与其结合的gp140中的组分，用生物素化DP178 HR-2肽免疫沉淀gp140包膜，然后通过蛋白质印迹分析分析与生物素化HR-2结合的蛋白质。图12显示在经切割的HIV 89.6 gp140中存在HIV包膜组分。第10泳道显示用抗gp120 mab T8免疫印迹的gp120和gp140。第9泳道显示用抗gp41 mab 7B2免疫印迹的未经切割的gp140和gp41。图12也显示在无sCD4的情况下生物素化HR-2肽DP178组成型免疫沉淀经切割的gp41(～33kd)和未经切割的gp140两者(泳道3)，并且sCD4增加生物素化HR-2免疫沉淀gp140和gp41的水平(泳道1)。第5和7泳道显示抗gp120 mab T8识别被生物素化HR-2免疫沉淀的gp140蛋白的gp120区。用紊乱型生物素化DP178肽的对照免疫沉淀不免疫沉淀显著水平的HIV包膜蛋白(泳道2、4、6和8)。
HR-2肽与HIV 89.6gp140包膜蛋白的CD4诱导的结合。本项研究的主要目的是确定gp41的融合相关构象是否可以采用HR-2肽结合的SPR测定来检测。显然如果HR-2肽可以结合gp140，则gp41卷曲螺旋结构必须是解螺旋的，使得内源HR-2不与HR-1结合。在本项研究中使用两种这样的HR-2-DP178(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112676-12680(1994)，Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))和T649Q26L(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998)，(Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))。DP178含有HR-2 C端氨基酸(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112676-12680(1994)，Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))，而T649Q26L含有更多的HR-2N端氨基酸(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998)，(Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))。
HIV包膜gp120蛋白以相对高的亲和力与sCD4结合(Myszka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 979026-9031(2000)，Collman等，J.Virol.667517-7521(1992))。在初步研究中，发现可溶性HIV 89.6gp120蛋白与固定化sCD4强结合，Kd为23nM，解离速率为1.1×10-4s1。因此，CD4固定化表面允许非常稳定地捕获HIV包膜，该方法已经用来测定HR-2肽与sCD4结合的HIV 89.6包膜蛋白结合。为了创建CM5传感器芯片上等同表面的粘连gp140和gp120，将固定在传感器芯片上的sCD4和抗gp120 mab T8用作捕获表面。空白芯片用作减去非特异性结合大量反应的一致参比表面。Mab T8结合HIV 89.6gp120的亲和力为5.6nM。因此，CD4和mab T8均提供用于锚定HIV包膜蛋白的稳定表面。
由于HIV 89.6 gp140既含有经切割的gp140又含有未经切割的gp140，因此重要的是显示在CD4或mab T8表面捕获gp140蛋白后在CD4-gp140复合物中存在gp41。当在这两种表面捕获到等同反应单位(RU)量的gp140蛋白时(图14A)，观察到相同水平的抗gp120 V3mab 19b和抗gp41 mab 2F5结合(图14B和图14C)。Mab 2F5反应性可以是或者与捕获的经切割的gp41反应，或者与未经切割的gp140中的gp41结合。尽管如此，在这两种表面捕获的gp140蛋白在其与抗gp120和抗gp41 mabs的反应性方面几乎相同。
测试HR-2肽与mab T8或sCD4表面捕获的gp140结合的能力。HR-2肽的结合表明在与mab T8和sCD4结合的gp140结合方面的定量差异。与T8-gp140表面相比(接近背景结合)，DP178 HR-2肽与sCD4-gp140表面特异性地结合(图14D)。然而，紊乱型DP178肽与mab T8-gp140或sCD4-gp140表面没有结合(图14D)。与HR-2肽DP178结合相似，HR-2肽T649Q26L显示不与mab T8-gp140表面结合，并而显示与sCD4-gp140表面结合(图14F)。综上所述，这些结果表明，sCD4诱导两种HR-2肽-DP178和T649Q26L与HIV 89.6 gp140的结合。
比较HR-2肽与CD4-gp140复合物和CD4gp120复合物的结合。Kowalski等已经表明，gp41 HR-2中的突变破坏gp41-gp120结合，并且HR-2含有gp41与gp120非共价相互作用的接触点部位(Alam等，Nature 381616-620(1996))。因此，值得在SPR测定中比较HR-2与sCD4-gp140复合物和sCD4-gp120复合物的结合。正如在图14中的实验中，在sCD4固定化表面以等同量捕获HIV 89.6 gp120或gp140蛋白。感兴趣的是，在sCD4-gp 140和sCD4-gp120表面检测到HR-2肽的特异性结合(图15A和15B)。然而，与sCD4-gp120表面相比，DP178和T649Q26L HR-2肽与sCD4-gp140表面的结合高得多(图15A，15B)。为了确定HR-2肽与gp120的结合是否被sCD4诱导，将HR-2与sCD4-gp120结合与HR-2与在T8 mab表面捕获的gp120蛋白结合进行比较。如图15C所示，HR-2肽DP178和T649Q26L与gp120的结合均被sCD4特异性地诱导，由于两种HR-2肽都不与T8 mab表面的gp120结合。没有检测到紊乱型DP178与CD4-gp140或CD4-gp120的结合(图15D)。
最后，为了评价HR-2肽与sCD4触发的HIV 89.6 gp140和gp120之间结合相互作用的亲和力，测量两种HR-2肽-DP178和T649Q26L与sCD-gp140和sCD4-gp120结合的速率常数和解离常数(Kd)(图15A、15B和15E)。HR-2肽与sCD4-gp140和sCD4-gp120结合的动力学方面几乎无差异，表明除了gp120上的结合部位外，HR-2肽与CD4-gp140较高水平的结合是由于HR1-gp41的诱导结合所致。HR-2肽对gp120和gp140的结合亲和力在1.2-2.5μM之间。在sCD4-gp120和sCD4gp140复合物上，具有相对低解离速率(以分钟计的t1/2值为7.7-10.5min)的HR-2结合是稳定的。
HR-2肽与重组gp41的结合。为了直接确定HR-2肽导否可以与纯化gp41组成型地结合，将重组ADA gp41固定在传感器表面，然后测定HR-2肽DP178的结合。HR-2肽DP178也结合固定化gp41(图16A)，而用紊乱型DP178肽没有观察结合(图16C)。为了比较DP178HR-2肽与重组gp41和HIV 89.6 gp140-sCD4复合物的结合，测量HR-2与两者结合的平衡结合常数(Keq)。当DP178与重组gp41弱结合，Keq为26.7μM时(图16E)，DP178与sCD4-gp140的结合强10倍，Keq为1.7μM(图16F)。
传感器表面上形成的gp120-gp41复合物可以被sCD4诱导以正调节HR-2肽的结合。在HIV 89.6gp140包膜制备物中，存在gp120和gp41的未经切割的gp140和经切割的gp140组分。因此，HR-2肽可以被诱导以结合未经切割的gp140和/或可以被诱导以结合经切割的gp120和gp41是可能的。为了直接测定sCD4与非共价结合gp41的gp120的结合是否可以正调节HR-2肽与sCD4-gp120-gp41复合物的结合，将重组ADA gp41固定在传感器芯片上，而让HIV 89.6 gp120或gp120 sCD4混合物流过传感器芯片。发现gp120与gp41稳定地结合(图17)。当HR-2肽DP178流过gp41-gp120-sCD4复合物时，HR-2的结合与HR-2与gp41或gp41-gp120复合物相比被正调节(图17)。因此，与gp41非共价结合的gp120的sCD4连接可以正调节或者gp41或者gp120，或者它们两者，以与HR-2结合。
在与sCD4连接之前和之后中和HIV 89.6 gp140上的表位。Mab2F5(抗gp41，ELDKWA)(Muster等，J.Virol.676642-6647(1993))中和HIV原代分离株。在经切割的89.6 gp140与sCD4连接之前，发现2F5 gp41表位被暴露。在sCD4连接之后，17b CCR5结合部位表位(2-4)被正调节，并且2F5表位继续表达。
实施例3实验细节蛋白质。可溶性CD4由Progenics，Tarrvtown，NY生产并且由theDivision of AIDS，NIAID，NIH提供。来自HIV 89.6原代分离株的可溶性gp120(VBD-2)包膜蛋白和gp140(VBD-1)包膜蛋白使用重组痘苗病毒生产并且如已描述的方法纯化(Earl等，J.Virol.6830153026(1994)，Earl等，J.Virol.75645-653(2001))。概括地讲，160cm2培养瓶中的BS-C-1细胞用vBD1(HIV 89.6 gp140)或vBD2(gp120)病毒感染。2小时后，将细胞在PBS中洗涤，置于无血清OPTI-MEM培养基(Gibco)中达24-26小时。然后通过离心和过滤(0.2μm)收获培养基，然后加入Tritox-X 100至0.5％。对于某些实验而言，将培养基浓缩15-30倍，用作gp140糖蛋白(一种经切割和未经切割的形式的混合物)的来源。兵豆凝集素柱纯化含有～50∶50经切割和未经切割的gp140的gp140。重组HIV ADA gp41蛋白得自Immunodiagnostics Inc.(Woburn，MA)。HIV-1 BAL gp120由ABL生产并且由the Divsion ofAIDS，NIAID，NIH提供。
单克隆抗体。Mab A32得自James Robinson(Tulane University，New Orleans，LA)(Boots等，AIDS Res.Hum.Res.131549(1997))。A32 mab采用Staph Protein-G柱从无血清培养基亲和纯化。
HR-2肽。合成肽由SynPep，Inc.，Dublin，CA合成并且通过反相HPLC纯化。通过HPLC测定，本项研究中使用的肽的纯度高于95％，并且经质谱法证实是正确的。gp41肽DP178，YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1912676-12680(1994))和T649-Q26L，WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQLEKNEQELLEL(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998)，Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))衍生自HIV 89.6 HIV-1包膜gp41(Collman等，J.Virol.667517-7521(1992))。作为HR-2肽结合的对照，制备一种紊乱序列DP178肽。为了免疫沉淀和选择性SPR实验，合成生物素化DP178和DP178紊乱型肽(SynPep，Inc.)。
表面胞质团共振生物传感器测定。在BIAcore 3000(BIAcore Inc.，Uppsala，Sweden)仪器上进行SPR生物传感器测定。将10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的抗gp120 mab(T8)或sCD4(100-300μg/ml)采用用于蛋白质固定化的标准胺偶联方案(Alam等，Nature 381616-620(1996))直接固定在CM5传感器芯片上。空白线内参比表面(用于胺偶联的活化和去活化)用来减去非特异性应答或大量应答。于25℃、以10-30μl/min连续流过PBS((150mM NaCl，0.005％表面活性剂p20)，pH 7.4)，以实时监测蛋白质和肽(生物素化或游离的DP178、T649Q26L、DP178-紊乱型)的结合。取出分析物(蛋白质和肽)，传感器表面在每个结合循环后通过一份或双份5-10μl脉冲的再生溶液(10mM甘氨酸-HCl，pH 2.5或10mM NaOH)进行再生。
运用O′Shannessy等的非线性拟合方法(O′Shannessy等，Anal.Biochem.205132-136(1992))和BIAevaluation 3.0软件(BIAcoreInc)，进行所有分析。根据简单双分子相互作用的缪尔公式(A+B＝AB)的曲线拟合，获得速率和平衡常数。
结果HR-2肽与HIV 89.6gp140包膜蛋白的CD4诱导的结合。本项研究的主要目的是测定gp41的融合相关构象是否可以采用HR-2肽结合的SPR测定来检测。显然如果HR-2肽可以结合gp140，则gp41卷曲螺旋结构必须是解螺旋的，使得内源HR-2不与HR-1结合。在本项研究使用两种这样的HR-2肽DP178(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1912676-12680(1994)，Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))和T649Q26L(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998)，Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))。DP178含有HR-2 C端氨基酸(Wild等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1912676-12680(1994)，(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998))，而T649Q26L含有更多的HR-2 N端氨基酸(Rimsky等，J.Virol.72986-993(1998)，Shu等，Biochemistry 391634-1642(2000))。
HIV gp120包膜蛋白以相对高的亲和力与sCD4结合(Myszka等，Proc.Natl.Acad.Sci.979026-9031(2000)，Collman等，J.Virol.667517-7521(1992))。在初步研究中，发现可溶性HIV 89.6 gp120蛋白与固定化sCD4强结合，其中Kd为23nM，解离速率为1.1×10-4s1。因此，CD4固定化表面允许非常稳定地捕获HIV包膜，并且使用该方法来测定HR-2肽与sCD4结合的HIV 89.6包膜蛋白结合。为了创建CM5传感器芯片上粘连gp140和gp120的等同表面，将固定在传感器芯片上的sCD4和抗gp120 mab T8用作捕获表面。空白芯片用作线内参比表面用以减去非特异性结合和大量应答。Mab T8结合HIV 89.6 gp120和亲和力为5.6nM。因此，CD4和mab T8均为锚定HIV包膜蛋白提供稳定的表面。
由于HIV 89.6 gp140既含有经切割的gp140又含有未经切割的gp140，因此重要的是说明在CD4或mab T8表面上gp140蛋白捕获之后在CD4-gp140复合物中存在gp41。当在这两种表面捕获到等同反应单位(RU)量的gp140蛋白时，观察到相同水平的抗gp120 V3 mab19b和抗gp41 mab 2F5结合。Mab 2F5反应性可能或者是与捕获的经切割的gp41反应，或者与未经切割的gp140中的gp41结合。尽管如此，在这两种表面捕获的gp140蛋白在其与抗gp120和抗gp41 mabs的反应性方面几乎相同。
接下来测试HR-2肽与mab T8或sCD4表面的捕获gp140结合的能力。HR-2肽的结合表明在与mab T8和sCD4结合的gp140结合方面存在定量差异。与T8-gp140表面相比(接近背景结合)，DP178HR-2肽与sCD4-gp140表面特异性地结合。然而，紊乱型DP178肽与mab T8-gp140或sCD4-gp140表面没有结合。与HR-2肽DP178结合相似，HR-2肽T649Q26L显示与mab T8-gp140表面没有结合，但显示与sCD4-gp140表面有结合。综上所述，这些结果表明，sCD4诱导两种HR-2肽-DP178和T649Q26L与HIV 89.6 gp140的结合。
已经报道A32 mab在触发HIV包膜正调节CCR5结合部位的可利用性方面重现sCD4的作用(Wyatt等，J.Virol 695723(1995))。因此，使用A32 mab表面来测定A32 mab是否可以模拟sCD4正调节HR-2与捕获gp140的结合。与sCD4相似，在与在mab T8表面捕获的gp140相比，A32 mab表面上捕获到gp140(未经切割的gp140、经切割的gp120和经切割的g41的混合物)时，HR-2肽结合明显被正调节(图26)。使用A32 mab和gp120获得相似的结果。
***以上引用的所有文献通过引用全部结合到本文中。
本领域技术人员根据本说明书的内容将会认识到，在不偏离本发明范围的情况下，可以在形式和细节方面进行各种变化。
权利要求
1.一种分离的免疫原，所述免疫原包含与配体结合的HIV包膜蛋白，所述配体正调节所述蛋白质上CD4结合部位和CCR5结合部位中的至少一个位点。
2.权利要求1的免疫原，其中所述HIV蛋白是gp120、未经切割的gp140或与gp41非共价结合的gp120。
3.权利要求1的免疫原，其中所述配体是一种抗体、或其Fab2或Fab片段。
4.权利要求2的免疫原，其中所述配体与gp120上的CCR5结合部位结合并且正调节gp120上的CD4结合部位。
5.权利要求4的免疫原，其中所述配体是一种抗体、或其Fab2或Fab片段。
6.权利要求4的免疫原，其中所述配体是单克隆抗体(mab)17b、或其Fab2或Fab片段、或其模拟物。
7.权利要求1的免疫原，其中所述配体正调节gp120上的CCR5结合部位和CD4结合部位。
8.权利要求7的免疫原，其中所述配体是一种抗体、或其Fab2或Fab片段。
9.权利要求7的免疫原，其中所述配体结合gp120上与mab A32结合的部位。
10.权利要求9的免疫原，其中所述配体是mab A32、或其Fab2或Fab、或其模拟物。
11.权利要求1的免疫原，其中所述蛋白和所述配体交联在一起。
12.权利要求1的免疫原，其中所述蛋白为可溶性形式。
13.权利要求1的免疫原，其中所述蛋白与细胞小泡或脂质体缔合。
14.权利要求1的免疫原，其中所述蛋白是与gp41非共价结合的gp120。
15.权利要求14的免疫原，其中gp120、gp41和所述配体交联在一起。
16.权利要求14的免疫原，其中所述免疫原还包含与所述蛋白结合的HR-2肽。
17.权利要求16的免疫原，其中gp120、gp41、所述配体和所述HR-2肽交联在一起。
18.一种组合物，所述组合物包含至少一种按照权利要求1的免疫原和载体。
19.一种在哺乳动物体内诱导产生抗HIV的中和抗体的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物足以实现所述诱导的剂量的按照权利要求1的所述免疫原。
20.一种筛选化合物正调节gp120上CD4结合部位的能力的方法，所述方法包括使所述化合物与gp120和mab 17b或其Fab2或Fab片段或其模拟物接触，然后测定所述化合物是否与mab 17b或其片段或模拟物竞争性与gp120上CCR5结合部位结合，其中与mab 17b或其片段或模拟物竞争的化合物是潜在正调节gp120上CD4结合部位的化合物。
21.权利要求20的方法，其中mab 17b或其片段或模拟物带有可检测标记。
22.权利要求20的方法，其中gp120与固体支持体结合。
23.权利要求22的方法，其中所述固体支持体是BIACORE芯片。
24.一种筛选化合物正调节gp120上CD4结合部位和CCR5结合部位的能力的方法，所述方法包括使所述化合物与gp120和mab A32或其Fab2或Fab片段或其模拟物接触，然后测定所述化合物是否与mab A32或其片段或模拟物竞争性与gp120结合，其中与mab A32或其片段或模拟物竞争的化合物是潜在正调节gp120上CD4结合部位和CCR5结合部位的化合物。
25.权利要求24的方法，其中mab A32或其片段或模拟物带有可检测标记。
26.权利要求24的方法，其中gp120与固体支持体结合。
27.权利要求26的方法，其中所述固体支持体是BIACORE芯片。
全文摘要
本发明总的来讲涉及免疫原，具体地说涉及用于诱导中和各种各样的HIV原代分离株的抗体的免疫原。本发明也涉及一种应用这种免疫原诱导抗HIV抗体的方法。
文档编号A61K47/48GK1505528SQ01819204
公开日2004年6月16日 申请日期2001年9月24日 优先权日2000年9月22日
发明者B·F·海尼斯, B F 海尼斯, D·D·帕特尔, 帕特尔, M·阿拉姆, ち, H·－X·廖 申请人:杜克大学