专利名称：：一种大规模纯化质粒的方法相关申请这是美国系列号08/446,118，提交时期1995年5月19日的专利的部分继续申请。
背景技术：
：从微生物发酵物中分离质粒DNA的经典方法适用于小规模或实验室规模的质粒制备。上述的一个方法必须包括含质粒的微生物宿主细胞碱裂解，接着被乙酸盐中和，引起宿主细胞基因组DNA沉淀，然后由例如离心去除蛋白质。液相含被乙醇沉淀的质粒DNA，然后在溴化乙锭存在下用CsCl进行等密度离心。需要溴化乙锭是为了把总质粒DNA分离成3种不同的类型；超螺旋(I型)、带切口环(II型)和线性(III型)，而收集所需的质粒类型。需要用丁醇进一步提取以去除残余的溴化乙锭，接着用乙醇沉淀DNA。接着附加的纯化步骤以去除宿主细胞蛋白。去除宿主蛋白用苯酚或苯酚和氯仿混合物重复抽提进行。质粒DNA被乙醇沉淀，残余的苯酚由异戊醇/氯仿重复抽提去除。最后乙醇沉淀的质粒DNA溶在水中或合适的缓冲液中。这种方法有许多的欠缺和限制因素，包括a)该方法需要使用昂贵和危险的化学药品(CsCl和EtBr在密度梯度离心中使用，EtBr是一种已知的诱变剂，必须从产物中去除；另外它是一种使质粒出现切口的嵌入剂)；b)密度离心步骤不易有一定的规模进行；c)需要有机溶剂抽提以去除残余的EtBr；d)苯酚抽提用于去除剩余的蛋白和DNA酶，该方法需要离心以使苯酚/水乳液分层；e)高度重复的步骤使该方法劳累费时(分离需要几天)；f)化学裂解步骤的规模操作性是一个障碍，即溶菌酶/碱/KOAc处理步骤小规模裂解细胞时有效，然而，粘度增加使大规模处理非常困难；和g)使用大量的溶菌酶在裂解前酶解弱化微生物细胞壁。然后混合物加酶中和，该步骤引起高分子量的染色体DNA沉淀。高分子量的RNA和蛋白-SDS复合体用添加高浓度的KOAc盐的方法沉淀。离心后质粒产物仍在纯化的上清中。此时的局限因素包括需要快速处理及放在冰上，以阻止核酸酶活性，要到苯酚抽提时该核酸酶才能被去除。与产物一起仍在上清中的主要污染物是RNA。另一个常用的从细菌中分离和纯化质粒DNA的方法提供了仅适于非常小规模制备的一种快速步骤。Holmes和Quigley(1981，分析生物化学，114，pp193-197)报道了一种简单和快速的制备质粒的方法，其中细菌用溶菌酶处理，然后在合适的缓冲液(STET)中约100℃煮20-40秒，形成基因组DNA、蛋白和碎片的不溶性凝块，质粒及作为主要污染物的RNA留在溶液中。这种技术明显地需要溶菌酶才行，照此加了一处理步骤，对大规模地生产DNA作人或兽用来说，较少需要处理步骤。不过，加溶菌酶可能增加裂解过程中的质粒释放。有一优点是热处理细胞也能使DNA酶变性。然而，这种技术不适用于一定规模直至大体积的微生物发酵物，仅适于少于5升的发酵物。对用CSCl等密度离心作质粒纯化方法的替代方法已经发表。这些方法仅适于实验室规模的质粒分离，包括a)大小排阻层析，该法本身受通过量的限制；b)羟基磷灰石层析，其不利之处是为提高效率需高浓度的尿素；c)反相层析；以及d)离子交换层析。因此，从大体积的微生物发酵物中大规模分离和纯化质粒DNA需要发展一种改进的质粒制备方法。在分子生物学许多领域中的最新发展需要一种用于大规模质粒DNA生产的分离和纯化的方法。特别是，基于多核苷酸的疫苗作人用和潜在地用于人类基因治疗的领域中的最新进展需要能产生大量的高度纯化型的多核苷酸疫苗。对于作生物药学用的DNA的发酵、分离；纯化和表征来说，需要新奇的技术以发展/完成一种大规模的商业上可行的方法。发明概述现在用于分离和纯化质粒DNA的实验室方法由一系列经典的不适用于生产方法的实验室技术组成。例如，密度梯度离心不能以一定规模进行；纯化步骤需要使用危险和昂贵的化学药品/溶剂，如溴化乙锭为一种已知的诱变剂，纯化步骤劳动强度大，费时。因此，发展了一种能以一定规模进行的替代方法，并且在此公开该法。此外，建立了一种HPLC测定方法，以跟踪通过该法各步骤的质粒产物及区别质粒类型。悬浮含质粒的微生物细胞，任选地在含去污剂的缓冲液中和溶菌酶温育，用流通(flow-through)热交换器加热以裂解细胞，接着离心。离心后主要含RNA和质粒产物的澄清裂解物滤过0.45微米的滤膜，然后在上阴离子交换柱前透滤。任选地质粒产物用RNA酶在过滤前或后处理，或较前步骤或较晚步骤处理。含质粒的阴离子交换产物级份上样到反相柱上，用合适的缓冲液洗脱，从而提供了适于人类使用高纯度的质粒DNA。附图简述图1显示一种合适的热交换器装置的图解。图2图示流出口温度和流速之间的关系。图3；显示用50mMEDTA和100mMEDTA在澄清的上清液中总质粒的比较层析谱。图4显示作为出口温度函数的超螺旋质粒的产率。图5显示用RNA酶处理过的(细线)和未处理过的(粗线)澄清裂解物过阴离子交换柱的洗脱图。图6显示用上柱前透滤过的澄清裂解物或上柱前未透滤过澄清裂解物的阴离子交换层析洗脱图。图7显示来自细胞裂解物的质粒DNA洗脱图。图8；显示琼脂糖凝胶电泳分析在纯化的各个中间步骤获得的DNA产物。图9显示DNA产物的阴离子交换HPLC分析示踪说明产物纯度。发明详述为大规模分离和纯化质粒，我们鉴定了一种新颖的，可按一定规模进行的，替代性去除裂解/碎片的方法，该方法利用一种快速加热法诱导细胞裂解，沉淀基因组DNA、蛋白和其他碎片，而把质粒保留在溶液中。该方法的效用是大规模的分离和纯化质粒DNA。我们发现把微生物细胞悬浮在修改过的STET缓冲液中(见下述)，然后用一流通热交换器把悬液加热到约70～100℃，结果使细胞完全彻底的裂解。裂解物的连续流动或分批式离心产生含细胞碎片，蛋白和大部分基因组DNA的沉淀，而质粒仍在上清中。本发明表现出许多优点，包括比化学裂解法更高的产物回收率，失活DNA酶、操作简单，可按一定的规模进行。本发明描述的方法用于大规模的从微生物发酵物中分离和纯化质粒DNA。应当认为在此所用的大规模微生物细胞发酵物是比约5升要更大的总细胞发酵物体积，或者从比约5升要更大的发酵物体积中收获的细胞。本发明也描述方法提供适于人类使用的高度纯化型质粒DNA，用于人类的DNA包括，但并不局限于，多核苷酸疫苗和用于人类基因治疗的DNA。多核苷酸疫苗意指直接给人注射〔Montgomery，D.L等，1993，细胞生物学，169，pp244-247；Ulmer，J.B等，1993，科学，25％，pp1745-1749〕。本发明也描述一种在线监测的方法，以跟踪经过分离和纯化各步骤的各种类型的质粒DNA，涉及通过本发明的方法能单独分离的上述质粒DNA的各种类型是I型(超螺旋质粒)、II型(带切口或松驰质粒)和III型(线性质粒)。本发明的方法适用于一般的微生物发酵物。对本领域的那些技术人员来说，很明显大量的各种微生物细胞适用于本发明的方法，包括但不局限于、包括酵母的真菌细胞和细菌细胞。优选的微生物发酵物是含有待分离和纯化的质粒的细菌细胞发酵物。优选的细菌发酵物是含有待分离和纯化的质粒的大肠杆菌发酵物。对本领域的那些技术人员来说，很明显除了大肠杆菌发酵物外的细菌发酵物也适用于本发明。微生物发酵物可以生长在任何适于被采用的细菌生长的液体培养基中。用本发明的方法分离和纯化的质粒可以是任一种染色体外DNA分子。质粒可以是每细胞高拷贝数或每细胞低拷贝数。质粒也可以为基本上任意大小。对本领域的技术人员来说很明显，在微生物细胞中基本上任何质粒可通过本发明的方法分离。含质粒的微生物细胞从发酵培养基中收集，以提供细胞糊或细胞浆液。任何常规的从液体培养基中收集细胞的方法是合适的，包括但不局限于离心或微过滤。使用目前实验室规模的方法，从收获的微生物细胞中分离质粒DNA主要由酶解处理微生物细胞以弱化细胞壁，接着进行细胞裂解。纯化步骤包括重复CSCl/EtBr离心，接着通过有机溶剂抽提和沉淀去除tRNA、剩余蛋白、EtBr和其他宿主污染物。这些步骤不能以一定规模进行，因此不适用于大规模处理。相比较而言，制备性规模层析是一种强有力的纯化工具，该法分辨率高，操作容易以及增加纯化DNA质粒产物的生产率。反相和阴离子交换这两种不同的层析方式显示在用于人要求的严格水平上纯化DNA质粒中的合适性。基于反相的分离由疏水相互作用控制，而作阴离子交换分离依据于静电相互作用。这2种互不相关的层析步骤实现了从各种质粒类型(超螺旋、开环松驰、线性和多联体)中分离，及去除象LPS(内毒素)、RNA、DNA和剩余蛋白的宿主污染物。在本发明的方法中，收获的微生物细胞重悬浮在改进的STET缓冲液中，STET缓冲液包含约50mMTRIS、大约50～100mMEDTA、大约8％蔗糖、大约2％TRITON-100，以及亚微克浓度的溶菌酶，pH6.0-10.0。在本发明的方法中选用的溶菌酶浓度基本上比在本领域己知的方法中所用的溶菌酶的浓度要低。对本领域的技术人员来说很明显，可进行修改这种基本缓冲液的配方而适用于本发明。对基本上不影响或改变本方法结果的这种基本缓冲液配方的修改意味着在本发明方法的范围之中。pH的范围可按照所用的特殊细菌菌株能达到的最好效果而调整。优选的pH范围为约8.0～8.5。然后悬浮液在流通热交换器中加热到约70～100℃，优选的大约70～77℃。离心裂解物以沉淀大的细胞碎片、蛋白和大部分基因组DNA。已制的原型热交换器说明流通热裂解含质粒的微生物细胞的可用性。特殊的热交换器由10英尺×0.25英寸O.D不锈钢管所弯成的盘管所组成。盘管完全浸在稳定的高温水浴中。盘管的内容量大约为50mL。用热电偶和一个测温仪分别检测进口和出口温度及水浴温度。产物流用安有聚硅氧烷管的Masterflex蠕动泵被泵进热的盘管中。细胞裂解物流出盘管，然后在BeckmanJ-21批量离心机中作澄清离心。图1提供这种特殊装置的图解，不过，其他类型的热交换器结构也适用于本发明，包括但不局限于优选的壳管结构。离心后，澄清裂解物可任选地用RNA酶处理，可过滤质粒产物以进一步去除小碎片。许多种类的过滤装置适用于本方法，包括但不局限于通过有小孔径膜的过滤法。优选的过滤法是通过0.45微米滤膜的过滤。为进一步去除来自DNA产物的污染物，可透滤上述物料。按照本领域熟知的标准技术，标准的，能购买到的透滤材料适用于本方法。优选的透滤法为根据质粒的大小，用截断分子量范围为30,000～500,000的超滤膜透滤。上述的DNA制备物，在上样到阴离子交换柱前用超滤膜(约截断100,000分子量)与柱缓冲液交换透滤。优选的是过阴离子交换柱前透滤，它能大大地增加上样到柱上的裂解物数量。许多种能购买到的阴离子交换基质适用于本发明，包括但不局限于从POROS阴离子交换树脂公司、Qiagen公司、TosoHaas公司、Sterogene公司、Spherodex公司、Nucleopac公司和Pharmacia公司能购到的那些基质。柱(PorosIIPI/M，4.5mm×100)开始时用20mMBis/TRIS丙烷及0.7MNaCl平衡。加样品，用同样的起始缓冲液流洗。然后在约25柱体积中使用洗脱梯度为0.5M～0.85M的NaCl，收集洗脱级份。阴离子交换层析是理想的第一完善的步骤，因为它能极好的清除RNA、基因组DNA和蛋白。图5(粗线)显示从阴离子交换柱过滤的澄清细胞裂解物的样品洗脱图。琼脂糖凝胶分析显示流通后出现的第二个峰包含质粒产物。较早的大峰是由于存在RNA。这可由上样到柱子前用核糖核酸酶与澄清细胞裂解物温育的方法所证实，结果显示大峰不见了，代之以几个较小的洗脱更快的洗脱峰，这是由于核糖核酸酶消化的降解产物引起的。阴离子交换产物级份上样到反相柱上。许多种可购买到的基质适用于本发明，包括但不局限于从POROS公司、PolymerLabs公司、TosoHaas公司、Pharmacia公司、PQCorp公司、Zorbax公司、BioSepra树脂、BioSepraHyperD树脂、BioSepraQ-HyoerD树脂和Amicon公司所购到的那些基质。基质也可以是聚合物基或硅基的。反相柱(PorosR/H)用约100mM碳酸氢铵，pH8.5的溶液平衡。然后用梯度0～11％异丙醇洗脱结合物料。上述I、II和III型的3种类型的质粒可由本方法分离。接着洗脱的质粒DNA可被浓缩和/或透滤以降低体积或改变缓冲液。对打算用于人的DNA，将DNA产物透滤到药学可接受的载体或缓冲液中，这可能是有用的。药学可接受的载体或缓冲液体本领域已经熟知，包括在如《Remington药用科学》的各种手册中所述的那些种类。任何适于浓缩DNA样品的方法适用于本发明。上述方法包括透滤、乙醇沉淀、冷冻干燥等，而优选的是透滤。透滤后最终的质粒DNA产物然后可灭菌。任何不影响DNA产物适用性的灭菌方法是合适的，如滤过有足够小的孔径，例如0.2微米或更小的膜进行灭菌。提供下列实施例说明本发明的方法，然而，并不是限制这些相同的方法。实施例1微生物细胞生长、细胞裂解和澄清用1升冷冻的大肠杆菌细胞浆液在STET缓冲液(8％蔗糖，0.5％TRITON，50mMTRIS缓冲液，pH8.5及50mMEDTA)中，制成8升细胞悬液。在600nM的细胞悬液吸光度值大约为O.D.30。不断旋转悬液以保证其均一性。测定的细胞悬液粘度值大约为室温(24℃)1.94cp。细胞悬液以81mL/分被泵通过热交换器，其速度与细胞液在热交换器中存在时间约35秒相应。水浴温度维持在92℃。分别测定细胞液的进口和出口温度，为大约24℃和大约89℃(平均值)。大约1升样品通过热交换器。尽管裂解物比开始时的细胞液有点更浓，但未观察到管中可见的凝块。裂解物冷却到室温，测定其粘度大约为40cp。细胞裂解物用BeckmanJ-21分批离心法以9000RPM离心50分钟澄清。分析上清证实有效的细胞裂解及产物回收。由流通热裂解法产生的产物产量至少与Quigley&Holmer煮沸法所得到的产物产量相仿。不过，后者的方法必须以成批方式实验室规模下进行，因此不适用于大规模(5升或更大)的处理。由于热交换方法是流通进行的，对能被处理的细胞悬浮体积没有最大量的限制。因此本方法能容纳非常大规模的细菌发酵物，而产生大量的高度纯化的质粒DNA。然后澄清裂解物通过孔径0.45微米的滤膜过滤，以去除更细的碎片。接着滤液用截断分子量约为100,000的滤膜透滤。实施例2用热交换器对细胞裂解的控制和可再生产性调整细胞浆液泵过热交换器的流速(即，存留时间)允许严格控制裂解温度，即出口温度。细胞浆液按实施例1所述的方法制备，泵过热交换器的流速范围为160～180mL/分。相应的出口温度范围分别为93℃～65℃。图2说明流速和温度之间的关系。细胞浆液的起始温度为24℃，水浴温度稳定维持在96℃。另外，进行了许多次运转后此时出口温度达到了80℃。同样获得每升澄清上清液24mg环状DNA的产量说明本方法的可再生产性。实施例3纯化质粒DNA微生物细胞和裂解物按实施例1和2所述的方法制备，并进行下列分析。为说明加100mMEDTA相对于加50mMEDTA增加超螺旋DNA的百分率，以及确定涉及超螺旋DNA回收的出口温度(即，裂解温度)的可接受范围，进行了如下的分析。质粒DNA的超螺旋型是合乎需要的，是因为它比松弛环状型更稳定。一种能使超螺旋的DNA转变成开环的方法是用DNA酶形成切口。我们发现在STET缓冲液中加100mMEDTA比50mM最小限度地降低开环质粒的形成。图3显示用50mMEDTA对100mMEDTA在澄清上清中总质粒的比较层析谱。细胞悬液按实施例1所述的方法制备。对这些运转的操作流速大约为186ml/分。进口、出口和水浴温度分别为24℃、92℃和96℃。裂解温度的可接受范围由测定每次运转产生的超螺旋质粒的百分率确定。图4说明作为出口温度函数的超螺旋质粒的浓度。可接受的裂解温度范围为75℃～92℃。低于75℃温度时，产生更多的松弛环状质粒，极有可能由于增加了DNA酶活性引起。超过93℃时，超螺旋质粒的水平显得减少，可能是由于热变性的关系。继续热裂解和离心后，1mL的澄清裂解物用5μgRNA酶温育2小时，或者不处理。然后DNA酶处理过的和未处理过的样品上样到阴离子交换柱(PorosQ/M4.6×100)上，该柱使用前已被溶剂A和B[HPLC溶剂A20mMTris/Bis丙烷，pH8.0；和溶剂B1MNaCl在20mMTris/Bis丙烷中，pH8.0]50-50的混合物平衡过。柱用超过100倍柱体积形成的50％～85％B梯度洗脱。开环质粒在大约68％B处洗脱下来，超螺旋质粒在72％B处洗脱下来。图5显示来自用RNA酶处理(细线)和未处理(粗线)的澄清裂解物的阴离子交换柱洗脱液的比较。大约在10分钟的峰是质粒DNA，接着在未处理样品中的大峰是RNA。在RNA酶处理过的样品中，大RNA峰已被消除，从污染峰中产生较大的分离质粒峰。正如上所述，阴离子交换层析前的透滤大大地增加了能上样到柱上的裂解物数量。这可用图6加以说明，图6显示阴离子交换层析前透滤过的澄清裂解物和未透滤过的澄清裂解物的比较。样品按上述方法制备，除了有一个样品在上样到阴离子交换柱前被透滤过，而另外的一个样品未被透滤。柱的操作和洗脱按上述方法进行。图6显示从柱上洗脱的污染物量在未透滤的样品中大为增加。结合在阴离子交换柱上的大量污染物能掩盖柱的最大结合容量，因为基质不能有效地结合任何更多的物质，引起DNA产物的丢失。因此，透滤去除污染物，允许更多的DNA产物结合在阴离子交换基质上，结果使上样到柱上的澄清裂解物的体积较大。从阴离子交换柱上洗脱的质粒DNA用反相HPLC分析分离成单独的类型。图7显示从带切口环(2型)质粒中分离超螺旋质粒(1型)。二种类型容易被分离，从而使质粒的单独类型得到分离。实施例4根据基于层析的方法高度纯化质粒DNA发酵细胞糊重悬浮在修改过的STET缓冲液中，然后以成批的方式热裂解。替代的方法是，发酵细胞糊重悬浮在修改过的STET缓冲液中，然后用上述的流通方法热裂解。裂解物按上述方法离心。20ml的上清按上述方法过滤，上样到阴离子交换柱上(PorosQ/M4.6×100，该柱使用前用上述缓冲液A和B的50-50混合物平衡过。超过50倍柱体积形成50％～85％B的梯度，流速为10ml/分。从柱上收集各级份，每一级份为2.5ml。超螺旋质粒DNA从柱上在72％B处洗脱下来。然后阴离子交换产物上样到反向层析柱上(PorosR/H)，该柱使用前已用pH8.0的100mM的碳酸氢铵平衡过，用0％～80％甲醇梯度洗脱结合的物质。高度纯化的超螺旋质粒DNA在22％甲醇处洗脱下来。图8显示从纯化方法的每一主要步骤来的产物级份的琼脂糖凝胶。根据琼脂糖凝胶的结果和比色法及实施例3所述的HPLC测定法的结果，在图9显示的最终产物是高度纯化的。产物由多于90％的超螺旋质粒和少于10％的开环质粒组成。RNA低于所用的测定方法的检测范围。基因组DNA和蛋白污染物水平也低于所用的测定方法的检测范围。在方法最后步骤的所有超螺旋质粒产量大约为在澄清裂解物中超螺旋质粒的60％。实施例5多克级规模质粒DNA的纯化用4.5升冷冻的大肠杆菌细胞浆液在STET缓冲液(8％蔗糖，2％Triton，50mMTris缓冲液，50mMEDTA，pH8.5)中，加溶菌酶2500单位/ml，制成33.7升细胞悬液。在600nM处细胞悬液的吸光度值大约为O.D.30。悬液室温下搅拌15分钟以确保适当的混合，然后37℃继续搅拌温育45分钟。温育后，继续在室温下混合，细胞悬液以500ml/分的流速泵过热交换器。批温度维持在100℃，测定的细胞悬液的进口和出口温度分别为大约24℃和70～77℃。流出热交换器的细胞裂解物收集在Beckman离心瓶中(每瓶500ml)，细胞裂解物立刻在BeckmanJ21离心机中用9000RPM离心50分钟。离心后，发现上清含质粒产物比不用溶菌酶温育的情况下多4-5倍，离心的上清产物立即以3倍体积的TE缓冲液(25mMTris-EDTA，pH8.0)透滤，然后室温下用20×105单位的大肠杆菌RNA酶温育2～4小时。完成温育后、接着产物溶液用100kDMWCO滤膜及TE缓冲液透滤成添加的6倍体积，然后通过0.45微米的滤膜过滤，去除残余碎片。滤过的裂解液用20mMBis/Tris丙烷-NaCl，pH7.5的缓冲液稀释至含0.7MNaCl，该步骤制备上样到阴离子交换柱上的稀释滤液。阴离子交换柱(POROSPI/M3.6升)使用前用20mMBis/Tris丙烷和0.7MNaCl平衡。上样的滤过裂解液达柱容量。在本情况下，5克超螺旋质粒上样到阴离子交换柱上。上样后，柱子用2-4倍柱体积的20mMBis/Tris丙烷和0.7MNaCl流洗。用10倍柱体积在20mMBis/Tris丙烷中的0.7MNaCl～2.0MNaCl梯度清除大部分的大肠杆菌蛋白、RNA和某些内毒素。超螺旋质粒级份在1.4M～2.0MNaCl中洗脱下来。从阴离子交换柱来的超螺旋质粒级份含4g的超螺旋质粒接着2-3倍无致热原的水稀释，调整至1.2％IPA，用1NNaOH调pH至8.5。然后稀释的阴离子交换超螺旋级份上样到7升的反相柱(POROSR2/M)上，该柱使用前已被含1.2％IPA的100mM碳酸氢铵平衡。在本情况下，3.2克的超螺旋质粒上样到反相柱上，然后柱子用6～10倍柱体积的在100mM碳酸氢铵中的1.2％IPA流洗。进行这种大量的流洗以清除不纯物。下一步，过5倍柱体积的1.2％IPA～11.2％IPA的梯度液。超螺旋质粒级份在约4％IPA处洗脱下来。从反相柱来的超螺旋产物级份接着被浓缩，用30KDMWCO膜透滤到普通生理盐水中。最终产物体积通过0.22微米滤膜过滤。表1提供的纯化表，描述经过该方法每一主要步骤时的不纯物去除率及产量。如实施例3描述的阴离子交换HPLC测定法所示，本方法的总产物产量多于在澄清细胞裂解物中的超螺旋质粒的50％。产物的纯度非常高，大肠杆菌RNA和蛋白小于1％，大肠杆菌基因组DNA小于2.9％。表1多克级纯化和回收总结</tables>*低于测定方法的检测范围权利要求1.一种从大规模的微生物细胞发酵物中大规模分离和纯化质粒DNA的方法，包括a)从大规模的发酵物中收获微生物细胞；b)向收获的微生物细胞中加入足够量的裂解液；c)在流通热交换器中，加热步骤b)的微生物细胞至温度70℃～100℃，以形成粗裂解物；d)离心粗裂解物；e)过滤和透滤步骤d)的上清，产生滤液；f)步骤e)的滤液与阴离子交换基质接触；g)从阴离子交换基质中洗脱和收集质粒DNA；h)来自步骤g)的质粒DNA与反相高效液相层析基质接触；i)从步骤h)的反相高效液相层析基质中洗脱和收集质粒；j)任选地把步骤i)的产物浓缩和/或透滤到药学上可接受的载体中；以及k)任选地灭菌DNA产物。2.权利要求1的方法，其中步骤b)的裂解液是修改过的STET缓冲液。3.权利要求1的方法，其中步骤c)加热至温度为70℃～77℃。4.权利要求1的方法，其中步骤b)的裂解液含亚微克浓度的溶菌酶。5.权利要求1的方法，任选地包括在步骤a)后任一步骤用RNA酶处理。6.一种用权利要求1的方法获得的分离和纯化的质粒DNA。7.权利要求6的质粒DNA，其中所述的质粒适合施用于人。8.权利要求6的质粒DNA，其中所述的质粒适于施用给不包括人的动物。9.权利要求6的质粒DNA，其中所述的质粒是一种多核苷酸疫苗。10.一种适合施用于人的分离和纯化的质粒DNA。11.权利要求10的质粒DNA，其中的质粒DNA是一种多核苷酸疫苗。全文摘要公开一种从大规模微生物发酵物中大规模分离和纯化质粒DNA的方法。应用公开的方法,能单独地分离到所有3种形态的质粒DNA;超螺旋(Ⅰ型)、带切口或松弛环状(Ⅱ型)和线性(Ⅲ型)。通过公开的方法提供了适于被包含在药用组合物中的高度纯化的DNA。文档编号A61K48/00GK1190435SQ96195329公开日1998年8月12日申请日期1996年5月15日优先权日1995年5月19日发明者A·L·李,S·沙加尔申请人:麦克公司