专利名称：纤维素酶制备魔芋甘露寡糖的生产方法
技术领域：
本发明涉及微生物酶解工程，属于功能性寡糖酶解法生产技术。
背景技术：
寡糖(低聚糖)是2-10个单糖借助一定位置的糖苷键连接而成的小聚合物的总称。甘露寡糖(或称葡甘露低聚糖)是甘露聚糖(葡甘聚糖)的酶解物，广泛存在于魔芋、瓜儿豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁中。甘露寡糖作为一种新型的微生态效应添加剂具有吸附肠道病原菌和发挥免疫调节作用的双重功能，是最有希望的抗生素替代品之一。同时，该产品在食品医药等行业都有相当广泛的用途。
1、用于饲料添加剂，国内年需量在20万吨以上。
大量研究表明，甘露寡糖可广泛用于各种畜禽、水产养殖。能激活和提高动物的免疫力，降低胃肠道疾病的发生率和动物死亡率提高日增重和饲料转化率、降低粪便中氮的排放量，防止污染，改善动物的生长环境。据相关部门统计，2004年，我国全价配合饲料总产量9500万吨、浓缩饲料1500万吨、预混料500万吨，按全价配合饲料中平均添加量0.1％推算，甘露寡糖的需求量在20万吨以上。
2、在(保健)食品、医药上的应用潜力巨大，具有广阔的市场前景。
甘露寡糖可显著改善人体微生态环境，增强人体免疫能力，促进人们的身心健康。据相关资料报道，经临床试验证明，甘露寡糖具有明显的降血压、降血糖、调节胆固醇、防止心脑血管疾病，以及防治肿瘤、缓解便秘等功效，同时，也可以用于减肥。在医药和保健食品应用方面具有巨大的发展潜力。
目前，国内生产和研制魔芋甘露寡糖主要通过多糖水解化学法或生物酶解法实现。水解化学法条件要求苛刻，设备腐蚀严重，环境污染突出，而生物酶解法则能很好地克服这些缺点，是较为理想的途径，但以魔芋为原料制备甘露寡糖的技术研究国内刚刚起步，采用的主要技术都是用甘露聚糖酶来降解魔芋中的甘露聚糖，其成本高、效率低，不能达到规模化制备魔芋甘露寡糖的经济和技术要求。
相关文献文献1、《中性β-甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露低聚糖技术》/陈一平，中国科学院成都生物研究所//中国专利ZL01128868.X。
涉及一种中性β-甘露聚糖酶降解魔芋精粉生产葡甘露瓜果糖技术，通过在选定的培养基中接种Bacillus sp.M10种子液，在优化产酶事件下发酵得到粗酶液，再将该粗酶液用于酶解魔芋精粉，得到葡甘露低聚糖糖浆产品。
文献2、《魔芋葡村露寡糖的制备、化学结构及对胰岛NO自由基释放量的影响》陈秀敏吕秀菊等，中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，中国生物化学与分子生物学报.2002，18(6)魔芋精粉经β-甘露聚糖酶酶解成寡糖后，用活性炭柱进行分离纯化，以不同浓度(5，10，20)的乙醇洗脱，研究不同洗脱组分对链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病模型的胰岛NO自由基释放量的影响，发现ling/ml]以5乙醇洗脱的寡糖可以使胰岛培养液中的NO自由基释放量平均下降25.4(P＜＝0.05)，0.1mg/ml以5乙醇洗脱的寡糖使NO自由基水平下降20(P＜＝0.05)。
而张迎庆等人提出了利用纤维素酶制备魔芋葡甘低聚糖的技术方案。
文献3、《纤维素酶制备魔芋葡甘低聚糖》/张迎庆 干信 谢笔钧，华中农业大学食品科技学院天然产物化学研究室，湖北工学院生物工程系，吉首大学学报自然科学版.2003，24(3)。
利用纤维素酶(绿色木霉，Ec 3.2.1.4)酶解魔芋葡甘聚糖，10g魔芋精粉，500U纤维素酶，在40℃，pH值为5.0时反应2h为最适条件，此条件下所得低聚糖数均相对分子量为5100，重均相对分子量为7160。
其不足之处在于用该工艺条件制得的低聚糖分子个数大约在28个，分子链过大，不利于最大限度的激活和提高动物的免疫力和改善人体微生态环境，增强人体免疫能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种改进的纤维素酶制备魔芋甘露寡糖的生产方法，提高酶解效率，缩短甘露寡糖分子链、降低其分子个数，提高甘露寡糖激活和提高动物的免疫力，和改善人体微生态环境、增强人体免疫力的能力，是工艺简单、成本低、生产高纯度甘露寡糖的新技术。
本发明的技术方案是一种纤维素酶制备魔芋甘露寡糖的生产方法，其工艺流程为酶解、过滤、脱色、浓缩、干燥，其特征在于按魔芋精粉1g∶80-120u酶活单位投入纤维素酶、半纤维素酶混合物，纤维素酶、半纤维素酶混合物中酶活比例为2.5-3.5∶1；酶解终止后依次采用离心过滤、膜过滤，得到甘露寡糖混合液和滤渣；离心过滤除掉粗渣，超滤膜过滤得到甘露寡糖混合液，去掉大分子；所用的过滤膜的孔径为2-10微米。
本发明的具体生产方法为酶解酶解器中，按100-140g∶1000ml比例加入魔芋精粉和水，按魔芋精粉1g∶80-120u酶活单位投入纤维素酶、半纤维素酶混合物，纤维素酶、半纤维素酶混合物中酶活比例为2.5-3.5∶1，控制酶解的pH值为4.5-5.5，温度45℃±2℃，反应时间5-7小时后终止酶解反应；过滤酶解终止后依次采用离心过滤、膜过滤，得到甘露寡糖混合液和滤渣；离心过滤除掉粗渣，超滤膜过滤得到甘露寡糖混合液，去掉大分子；所用的过滤膜的孔径为2-10微米；脱色甘露寡糖混合液，采用柱层析分离耦合，洗脱液用活性炭脱色；浓缩真空浓缩，控制温度60℃，真空度-0.8mPa，得到甘露寡糖糖浆；干燥采用喷雾干燥，干燥温度75-80℃。
本发明具有以下优点1、采用了非特异性商业酶(纤维素酶和半纤维素酶)，成本低，效率高，适合产业化；2、采取离心过滤、膜过滤的过滤方法，优化超滤膜分离耦合纯化技术获取甘露寡糖，纯度高，得到的魔芋甘露寡糖主要是2-5个单糖通过糖苷键连接而成的直链或分支链，其分子量为300-2000；3、酶解工艺简单，收率高，达到77.7％。
图1，是本发明的实施例中6种产物的分子结构2，是薄层层析法分析结果图。
图3、图4，是离子色谱法分析结果图。
具体的实施方式一、工艺技术(一)主要材料魔芋精粉、纤维素酶、半纤维素酶、氢氧化钠(NaOH)、工业乙醇。
(二)主要实验仪器恒温水浴、电动搅拌器、离心机、超滤膜过滤器、活性炭层析柱、旋转浓缩蒸发器、喷雾干燥机、硅胶真空干燥器。
(三)工艺流程酶解、过滤、脱色、浓缩、干燥。
(四)项目的技术原理寡糖是2-10个单糖借助一定位置的糖苷键连接而成的小聚合物的总称。甘露寡糖是甘露聚糖(葡甘聚糖)的酶解物，广泛存在于魔芋、瓜儿豆胶、田菁胶及多种微生物细胞壁中。魔芋的主要成分为魔芋葡甘聚糖，分子式为(C6H10O5)n，平均相对分子量在20-200万之间，是一种由D-葡萄糖和D-甘露糖按2∶3或1∶1.6的摩尔比通过β-1、4和β-1、3等糖苷键连接而成的天然多糖，含量一般为44-65％，其中白魔芋、花魔芋品种的含量可达到50-65％。魔芋葡甘聚糖与纤维素结构类似，都是通过β-1、4糖苷键连接，利用纤维素酶和半纤维素酶进行酶解，旨在利用其对β-1、4和β-1、3等糖苷键的破坏作用，将魔芋葡甘聚糖切割成许多短链，降解为低聚糖。所选择的纤维素酶和半纤维素酶混合的生物酶之所以能对魔芋葡甘聚糖起作用，是因为糖苷酶的底物(β-1、4糖苷键连接的多糖)专一性，包括糖基一侧的专一性、糖苷键的α-、β-异头专一性。
二、实验方法实施例11)酶解在1000毫升蒸馏水中，加入125克魔芋精粉，搅拌均匀，调节其温度至45℃，并用0.5M(摩尔浓度)的NaOH(氢氧化钠)溶液调节酸碱度至pH 5。加入总酶活12500u(国际单位)的纤维素酶和半纤维素酶(酶活比例为3∶1)混合物，在45℃、pH5的条件下搅拌反应7小时。反应过程中，用0.5M的NaOH溶液调节保持pH5。反应结束后，沸水浴15分钟灭活，室温下静置过夜。
2)分离耦合纯化将上步骤的产物，在3600转/分条件下离心10分钟除去沉淀。该沉淀物干燥后可以作为饲料，也可以再次投入酶解。离心母液进一步通过2-10微米孔径的超滤膜过滤，滤渣干燥后返回下一次酶解步骤，滤液通过活性炭柱层析法分离耦合得到纯化后的甘露寡糖的混合物溶液。进行柱层析前，用8升蒸馏水洗柱，然后用40L 0-30％(W/W)的乙醇线性剃度洗脱，洗脱速度为500毫升/小时，用自动分布收集器收集并编号保存。分离产物中的寡糖含量和组成分别用苯酚—硫酸法和TLC法来检测。根据检测结果合并滤液。
3)浓缩、脱色、干燥上一步骤的甘露寡糖混合物溶液，用活性炭脱色，过滤后的上清液在温度为60℃以下、真空度-0.8mPa的条件下进行真空浓缩，得到甘露寡糖糖浆。糖浆经过喷雾干燥得到97.2g甘露寡糖粉状产品，收率77.7％。用这种方法，得到的甘露寡糖有六种成分，根据活性炭柱的洗脱顺序依次为I(A)，II(B)，III(C)，IV(D)，V(E)，VI(F)。(见图1)实施例21)酶解在1000毫升蒸馏水中，加入110g魔芋精粉、15克离心分离滤渣、3克超滤膜分离滤渣，搅拌均匀，加入纤维素酶和半纤维素酶混合物(纤维素酶酶活∶半纤维素酶酶活＝3∶1，总酶活12500u)，充分混匀，调节其温度至50℃，并用0.5M(摩尔浓度)的氢氧化钠(NaOH)溶液调节pH至5，在50℃、pH5的条件下搅拌反应7小时，终止酶解反应。在反应过程中，用0.5M的NaOH溶液调节保持pH5。反应终止后，沸水浴15min灭活，室温下静置过夜。
2)分离耦合纯化将上步骤的产物，在3600转/分条件下离心10分钟除去沉淀。该沉淀物干燥后可以作为饲料，也可以处理后按比例再次投入酶解。离心母液进一步通过2-10微米孔径的超滤膜过滤，滤渣干燥后返回下一次酶解步骤，滤液通过活性炭柱层析法分离耦合得到纯化后的甘露寡糖的混合物溶液。进行柱层析前，用8升蒸馏水洗柱，然后用40L 0-30％(W/W)的乙醇线性剃度洗脱，洗脱速度为500毫升/小时，用自动分布收集器收集并编号保存。分离产物中的寡糖含量和组成分别用苯酚—硫酸法和TLC法来检测。根据检测结果合并滤液。
3)浓缩、脱色、干燥上一步骤的滤液，用活性炭脱色，过滤后的上清液在温度为60℃以下、真空度-0.8mPa的条件下进行真空浓缩，得到甘露寡糖糖浆。糖浆经过喷雾干燥得到88.6g甘露寡糖粉状产品，相对(魔芋精粉投料量)收率80.5％，绝对收率(总投料量)69.2％。用这种方法，得到的甘露寡糖有六种成分，根据活性炭柱的洗脱顺序依次为I(A)，II(B)，III(C)，IV(D)，V(E)，VI(F)。(见图1)相对收率80.5％，绝对收率69.2％三、结果分析1、分析方法(1)离子色谱(HPAEC)法仪器离子色谱IC2500，采用ED50检测器、GP50泵、CarboPac色谱柱。
条件流动相ANaOH(A.R.)100mM，B水；梯度40mM-70mM淋洗30分钟；30℃；进样量10μL。
(2)薄层层析(TLC)法展开剂 乙腈∶水＝8∶2(V/V)；展开次数三次显色剂 5％H2SO4的甲醇溶液(V/V)显色条件110℃，10分钟2、检测结果(1)薄层层析(TLC)法结果见图2。
(2)离子色谱(HPAEC)法结果见图3、图4。
权利要求
1.一种纤维素酶制备魔芋甘露寡糖的生产方法，其工艺流程为酶解、过滤、脱色、浓缩、干燥，其特征在于按魔芋精粉1g∶80-120u酶活单位投入纤维素酶、半纤维素酶混合物，纤维素酶、半纤维素酶混合物中酶活比例为2.5-3.5∶1；酶解终止后依次采用离心过滤、膜过滤，得到甘露寡糖混合液和滤渣；离心过滤除掉粗渣，超滤膜过滤得到甘露寡糖混合液，去掉大分子；所用的过滤膜的孔径为2-10微米。
全文摘要
一种纤维素酶制备魔芋甘露寡糖的生产方法，其工艺流程为酶解、过滤、脱色、浓缩、干燥，其特征在于按魔芋精粉1g∶80－120u酶活单位投入纤维素酶、半纤维素酶混合物，纤维素酶、半纤维素酶混合物中酶活比例为2.5－3.5∶1；酶解终止后依次采用离心过滤、膜过滤，得到甘露寡糖混合液和滤渣；离心过滤除掉粗渣，超滤膜过滤得到甘露寡糖混合液，去掉大分子；所用的过滤膜的孔径为2－10微米。本发明采用了非特异性商业酶(纤维素酶和半纤维素酶)，适合产业化；采取离心过滤、膜过滤的过滤方法，优化超滤膜分离耦合纯化技术获取甘露寡糖，纯度高，得到的魔芋甘露寡糖主要是2－5个单糖通过糖苷键连接而成的直链或分支链，其分子量为300－2000；酶解工艺收率高达77.7％。
文档编号A61P37/00GK1904059SQ20061001917
公开日2007年1月31日 申请日期2006年5月29日 优先权日2006年5月29日
发明者詹志春 申请人:湖北广华生物有限公司