专利名称：从废血中提取免疫增强剂的联产方法
技术领域：
本发明涉及从废血中提取免疫增强剂的方法，尤其涉及从废血中同时
提取SOD、 Ig及STF的方法。
背景技术：
S0D、 Ig及STF是免疫调节剂，都能提高免疫功能，三种产品都是可以
从血中分离得到的。
目前，许多专利文献报道了 S0D、 Ig及STF的提取方法，但均为单产。 因此，如何从动物血同时提取SOD、 Ig及STF，以提高动物血的利用率
和提取效率，是人们所十分关注的课题。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种从废血中提取免疫增强剂的联 产方法，以克服现有技术存在的缺陷。 本发明的方法包括如下步骤
(1) 将柠檬酸三钠加入动物血中，离心分离10-30分钟，获得血浆和
血球；
柠檬酸三钠的加入量为动物血重量的2~5%; 离心分离时的转速为2500~3500r.p.m.;
所说的动物血优选采用羊的新鲜血、牛的新鲜血猪的新鲜血或马的新 鲜血。
(2) SOD的提取
将血球用重量浓度为0.5 1.2%的NaCl水溶液洗涤，然后在 2500 3500r.p.m.的转速下离心分离，获得红血球，加入等量的水溶血0.5-1.0 小时，获得溶血液，接着加重量浓度为0.03 1.0%的二价金属氯化物，去除
血红蛋白，离心得粗酶液，然后用截留分子量为30000以下，通常是 6000-10000的超滤膜浓縮至原体积的1/10~1/2，获得超滤液，加入超滤液 体积1/10-1/2的水，超滤，获得的超滤液可反复加水超滤浓縮，以达到纯 化的目的，超滤液加保护剂，冷冻干燥，得浅绿色冻干粉，即为超氧化物 歧化酶，简称SOD;
SOD测活采用连苯三酚氧化法，医药工业，1988， 19(5): 217;
二价金属氯化物的加入量为溶血液体积的0.3~0.1%;
所说的二价金属氯化物选自氯化铜、氯化钙、二氯化锰或氯化镁中的 一种；
SOD的活性易失活，通常保护剂可选用蔗糖、乳糖、甘露醇、海藻糖 等糖类，优选海藻糖；
(3) Ig的提取
(3.1) 将步骤(1)获得的血浆加入硫铵至50~55%的饱和度，4~10 i:静置8~16小时，然后在3000 5000 r.p.m的转速下离心分离20~30分钟， 得沉淀物和清液；
(3.2) 沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝胶(G25)按照常规的 方法脱盐，然后在所获得的脱盐溶液中，加入加利凡诺，沉淀，加入酸性 物质或碱性物质，控制pH为7.6~8.6，收集清液，用截留分子量为2000-3000 的超滤膜浓縮至原体积的1/10~1/2，冻干，获得产品，成品为混合物，内含 IgG、 IgM和IgA。
所说的利凡诺的化学名称为6，9 二氨基2-乙氧基吖啶乳盐； 酸性物质选自盐酸、醋酸或磷酸； 碱性物质选自氢氧化钠、氢氧化钙或氢氧化钾；
(4) STF的提取将葡聚糖凝胶(G25)加入步骤(3.1)中获得的清 液脱盐； .
将脱盐清液先用截留分子量为6000~10000的中空纤维超滤膜超滤，除 去分子量6000以上的生物大分子，然后用截留分子量为2000 3000的超滤 膜超滤，最后在20 3(TC下真空浓縮，获得胸腺因子STF浓縮液，冻干， 获得产品；
所说的胸腺因子(STF)为9肽，分子量为1500, STF的氨基酸组成 为pGlu-Ala-Lys-Ser画Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-OH。
术语
超氧化物歧化酶(SOD) Superoxide dismutase
胸腺因子(STF) Serum Thymic Factor
免疫球蛋白(Ig) Immunoglobulin 葡聚糖凝胶(G-25) SephdexG-25 本发明的方法， 一次投料同时可获三种产品Ig、 STF和SOD，大大 提高了血液的利用率，制备过程中反复用超滤技术，并且用分子量截留新 思路，将产品一一分开，这是一种物理法，安全实用效果好，在SOD提取 过程中采用二价金属氯化物和热变性去血红蛋白，以替代原工艺的氯仿和 乙醇，便于工业化生产。 ^
具体实施例方式
实施例1
(1) 将10克柠檬酸三钠加入1000克羊的新鲜血中，3500r.p.m.离心 分离30分钟，获得650克血浆和350克血球；
(2) SOD的提取
将血球用重量浓度为0.9%的NaCl水溶液洗涤，然后在3500r.p.m.的转 速下离心分离，获得红血球，加入等量的水溶血30分钟，获得溶血液，接 着加入重量浓度为3.0%的氯化铜水溶液15ml，去除血红蛋白，离心得粗酶 液，然后用截留分子量为10000的超滤膜浓縮至原体积的1/10,获得超滤 浓縮液40ml,超滤液加15mg乳糖，冷冻干燥，得浅绿色冻干粉125mg SOD;
(3)SOD测活采用连苯三酚氧化法，医药工业，1988， 19 (5): 217;
(3) Ig的提取.-
(3.1) 将步骤(1)获得的血桨加入硫铵至50%饱和度，4r静置15 小时，然后在5000r.p.m的转速下离心分离30分钟，得沉淀物和清液；
(3.2) 沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝胶(G25)脱盐，然后 再在所获得的脱盐溶液中，加入7克加利凡诺沉淀，用氢氧化钠控制pH为 8.6，收集清液，用截留分子量为3000的超滤膜浓縮，得免疫球蛋白Ig浓 縮液，加乳糖保护剂，冻干，获得650mg产品。
(4) 胸腺因子的提取将葡聚糖凝胶(G25)加入步骤(3.1)中获得 的清液按照常规方法脱盐；
将脱盐清液先用截留分子量为6000的中空纤维超滤膜超滤，然后用截 留分子量为2000的超滤膜超滤，最后在25'C下真空浓縮，获得胸腺因子 STF浓縮液，冻干，获得65mg产品。
实施例2
(O将10克柠檬酸三钠加入1000克牛的新鲜血中，3000r.p.m.离心分 离20分钟，获得600克血浆和400克血球；
(2) SOD的提取
将血球用重量浓度为0.9%的NaCl水溶液洗涤，然后在3000r.p.m.的转 速下离心分离，获得红血球，加入等量的水溶血0.5小时，获得溶血液，接 着加重量浓度为5n/。的氯化锌水溶液25ml，去除血红蛋白，离心得粗酶液， 然后用截留分子量为10000的超滤膜浓縮至原体积的2/10，获得超滤膜浓 縮，反复加水超滤，最后获得70ml浓縮液，加50mg蔗糖，冷冻干燥，得 浅绿色冻干粉135mgSOD;
(3) Ig的提取
(3.1)将步骤(1)获得的血浆加入硫铵至55%饱和度，6'C静置16
小时，然后在5000^.111的转速下离心分离30分钟，得沉淀物和清液；
(3.2)沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝胶(G25)按照常规方
法脱盐，然后在所获得的脱盐溶液中，加入7克加利凡诺沉淀，加入氢氧
化钠控制pH为8.6，收集清液，用截留分子量为3000的超滤膜浓縮，得免
疫球蛋白(Ig)，冻干，获得1.0克产品。
(4)胸腺因子的提取将葡聚糖凝胶(G25)加入步骤(3. 1)中按照
常规方法脱盐；
将脱盐清液先用截留分子量为1000的中空纤维超滤膜超滤，然后用截 留分子量为3000的超滤膜超滤，最后在25'C下真空浓縮至原体积的1/10， 获得胸腺因子(STF)浓縮液，加乳糖保护剂，冻干，获得70mg产品。
权利要求
1.从废血中提取免疫增强剂的联产方法，其特征在于，包括如下步骤(1)将柠檬酸三钠加入动物血中，离心分离，获得血浆和血球；(2)将血球用NaCl水溶液洗涤，然后在2500～3500r.p.m.的转速下离心分离，获得红血球，加入等量的水溶血，获得溶血液，接着加二价金属氯化物，离心得粗酶液，然后用截留分子量30000以下的超滤膜浓缩至原体积的1/10～1/2，获得超滤浓缩液，加入水，再浓缩超滤，最后超滤液加保护剂，冷冻干燥，得浅绿色冻干粉，即为超氧化物歧化酶(SOD)；(3)Ig的提取(3.1)将步骤(1)获得的血浆加入硫铵至50～55％的饱和度，4～10℃静置，然后在3000～5000r.p.m的转速下离心分离，得沉淀物和清液；(3.2)沉淀物加入水溶解，然后加入葡聚糖凝胶(G25)脱盐，然后在所获得的脱盐溶液中，加入加利凡诺，沉淀，加入酸性物质或碱性物质，控制pH为7.6～8.6，收集清液，用截留分子量为3000～4000的超滤膜浓缩至原体积的1/10～1/2，冻干，获得产品；(4)将葡聚糖凝胶(G25)加入步骤(3.1)中获得的清液脱盐；将脱盐清液先用截留分子量为6000～8000的中空纤维超滤膜超滤，然后用截留分子量为1000～3000的超滤膜超滤，最后在25～30℃下真空浓缩，浓缩液加保护剂，冷冻干燥，获得产品胸腺因子(STF)。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，柠檬酸三钠的加入量为 动物血重量的2 5%。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)离心分离时的 转速为2500~3500r.p.m.。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，二价金属氯化物的加入 量为溶血液体积的0.3~0.1%。 .
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所说的二价金属氯化物 选自氯化铜、氯化钙、二氯化锰或氯化镁中的一种；保护剂选用蔗糖、乳 糖、甘露醇或海藻糖。
6. 根据权利要求1 5任一项所述的方法，其特征在于，所说的动物血 采用羊的新鲜血、牛的新鲜血、猪的新鲜血或马的新鲜血。
全文摘要
本发明公开了一种从废血中提取免疫增强剂的联产方法，本发明的方法，一次投料同时可获三种产品Ig、STF和SOD，大大提高了血液的利用率，制备过程中反复用超滤技术，并且用分子量截留新思路，将产品一一分开，本法主要采用物理法，尽量避免和少加有机溶剂，故安全实用，效果好。在SOD提取过程中采用二价金属氯化物和热变性去血红蛋白，以替代原工艺的氯仿和乙醇，便于工业化生产。
文档编号A61K39/395GK101112390SQ20061002944
公开日2008年1月30日 申请日期2006年7月27日 优先权日2006年7月27日
发明者李爱国, 袁勤生, 健 赵 申请人:上海汉德食品有限公司;赵 健