专利名称：一种亲环素a抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及化工领域及医药领域，涉及一种亲环素A抑制剂在制备抗艾滋病 药物中的应用。
背景技术：
亲环素Cycliphilins (CyPs)是普遍分布的细胞内蛋白，在植物、细菌和哺 乳动物中均存在，具有高度保守性，最初是作为环孢素A的细胞受体被发现的。 环孢素A (CyclosporinA， CsA)是从真菌代谢产物中分离得到的含11个氨基酸 的环状多肽，作为免疫抑制剂药物在临床上常用于治疗器官移植后所产生的排斥 反应及自身免疫系统疾病。目前已发现和克隆的CyPs有130多种异构体[Galat A，Metcalfe SM. Peptidyl proline cis-trans iso-merases. Prog Biophys Molec Biol, 1995; 63:67.]，它们构成了 Cyclophilins家族。CyPs具有肽脯氨酰顺反 异构酶(PPIase)活性，催化蛋白质折叠过程，尤其是富含脯氨酸的蛋白质折叠， 并且起着分子伴侣作用[Ivery MT. I隱unophilins:switched on protein binding domains Med Res Rev. 2000; 20(6) :452-484.]。与此同时，CyPs也广泛参与 相关的生物学过程如细胞凋亡[Lee JP， Palfrey HC， Bindokas VP, et al. The role of immunophilins in mutant superoxide dismutas-1 linked familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci USA. 1999; 96(6):325卜3256.]和细胞间信号传导[Jin ZJ， Melaragno MG, Liao DF， et al. Cyclophiin A is a secreted growth factor induced by oxidative stress. Circ Res. 2000; 87(9) :789-796.]等。
有许多研究显示，CyPA能够与人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag多聚蛋白 (Gag polyprotein)结合。这种结合使得CypA能够被特异地包装到HIV-1病毒 体中，而不被包装到其它逆转录病毒中[Franke EK, Yuan HE, Luban J. Specificincorporation of cyclophilin A into HIV-l virions.Nature. 1994; 372(6504) :359-362.]。在HIV-1型病毒自组装过程中，CyPA作为特定的组成部 分进入病毒，在HIV-1感染细胞的早期阶段发挥作用[Braaten D, Franke EK, Luban J. Cyclophilin A is required for an early step in the life cycle of human immunodeficiency virus type 1 before the initiation of reverse transcription. J Virol. 1996; 70(6) :3551-3560. ] 。 CypA与Gag的互作位点 目前己经被确定在Gag的N端CA结构域(该结构域在HIV-1成熟后经过切割成为 p24外壳蛋白)，CypA的脯氨酸异构酶活性能够协助病毒完成感染细胞后的脱衣壳 过程 [Gamble TR， Vajdos FF， Yoo S， Worthylake DK, Houseweart M, Sundquist WI, Hill CP. Crystal structure of human cyclophilin A bound to the amino—terminal domain of HIV—1 capsid. Cell. 1996; 87(7):1285-1294.]。 使用RNAi技术沉默CypA的表达[Braaten D， Luban J, Cyclophilin A regulates HIV-1 infectivity, as demonstrated by gene targeting in human T cells. EMBO 2001; 20(6) :1300-1309; Sokolskaja E, Sayah DM, Luban J. Target cell cyclophilin A modulates human immunodeficiency virus type 1 infectivity. J Virol. 2004; 78 (23) : 12800-12808.]，或者使用CsA及其衍生物[Sokolskaja E， Sayah DM,Luban J.Target cell cyclophilin A modulates human immunodeficiencyvirustype1infectivity. JVirol. 2004; 78(23):12800-12808.; Bartz SR, Hohenwalter E， Hu MK， Rich DH， Malkovsky M.Inhibition of humanimmunodeficiency virusreplication by nonimmunos叩pressive analogs of cyclosporin A. Proc Natl Acad Sci USA. 1995; 92(12):5381-5385.; Steinkasserer A, Harrison R， Billich A, Hammerschmid F, Werner G， Wolff B， Peichl P， Palfi G, Schnitzel W, Mlynar E, et al. Mode of action of SDZ NIM 811, a nonimmunosuppressive cyclosporin A analog with activity against human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1): interference with early and late events in HIV-l replication. J Virol. 1995; 69(2) :814-824.]来抑制CypA的活性，均能干扰HIV-1病毒的复制。
然而，到目前为止，尚未有人报道具有抗HIV病毒的CypA抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种亲环素A抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用。 本发明提供了一种亲环素A抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用，该亲环素
A抑制剂结构为<formula>formula see original document page 5</formula>
R,为3-甲基苯基、n-, p-, o-甲基苯基、n-, p-, o-氨基苯基或者苯基中的一个; R2为3-甲基苯基、n-, p-， o-甲基苯基、n-, p-, o-氨基苯基或者苯基中的一个; R:,为氟、羟基、氨基或者溴中的一个；R4为羟基、氨基、氟或者甲氧基中的一个。 本发明还包括对上述亲环素A抑制剂进行常规基团替代所得到的化合物，统称为 FDIO。
本发明中，R,可以是苯基。 本发明中，R2可以是苯基。 本发明中，R,可以是溴。 本发明中，R4可以是甲氧基。
本发明的一个实施例中，R,和R2是苯基，R:,是溴，R4是甲氧基，由此，所述 的亲环素A抑制剂即为2-{2-溴-6-甲氧基-4-[U)-(5-氧代-1， 3-二苯基-1, 5-二 氢-4*吡唑-4-基烯)甲基]苯氧}乙酰胺(即
2_{2-bromo-6—methoxy—4-[(力-(5-oxo-l， 3-diphenyl-l， 5-dihydro-4/^pyrazo
1-4-ylidene)methyl]phenoxy} acetamide)，其分子量为506. 35,结构式为
鉴于抑制CypA活性的物质可能干扰HIV-l病毒的复制，本发明针对CypA的活 性位点设计了若干小分子抑制剂。由于是针对细胞靶点设计的药物，而细胞靶点 相对于病毒靶点来说突变速率相对较慢，因此不易形成耐药性，适合AIDS患者终 身用药的需求。
首先，本发明对CypA小分子抑制剂进行了虚拟筛选。
Cycl叩hilin A (CypA, PPIA)基因在人类基因组数据库中已经被登录，其录 入号为剛—021130。在PDB蛋白结构数据库中，检索到了人类CypA蛋白的X光衍 射晶体结构(PDB代码1CWA)。这个结构是CypA与其天然抑制剂环孢菌素A (CsA) 的复合物晶体结构。从这个结构中，确定了CypA的活性位点，并且确定了活性位 点中，能够被CsA所抑制的若干关键氨基酸位点。根据这些结构信息，本发明针 对CypA活性位点，对若干小分子数据库进行了筛选。用于筛选的小分子数据库主 要包括SPECS和CNPD，最后筛选到了本发明的FDIO。整个计算过程是在中科院上 海药物所64CPU-SGI 0RIGN3800计算机和上海超算中心392CPU-神威I超级计算 机上进行的。
其次，本发明利用BIAcore分子互作仪验证虚拟筛选结果 BIAcore分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子间的相 互作用，无需任何标记物，因此最大限度的保证了实验结果的真实性。实验时， 将目的生物分子(CypA蛋白)固定在传感芯片表面，然后将小分子化合物溶于溶 剂并且流过芯片表面。监测器能实时跟踪检测溶液中的分子与芯片表面目的生物 分子结合、解离整个过程的变化。通过BIAcore的结合数据，我们最终确定了 12 个能够与CypA发生结合的小分子化合物，并且计算出了这些小分子化合物与CypA 结合的平衡一解离常数KD。本发明的2-{2-溴-6-甲氧基-4-[C2)-(5-氧代-1，3-
二苯基-1, 5-二氢-4*吡唑-4-基烯)甲基]苯氧}乙酰胺其平衡解离常数KD (M)为 KD=3.95±0. 24X10—6， Chi2=0. 125。其中，Chi2是BIAcore统计软件中用于检测实 验误差的一个数据。
再次，本发明利用酶活实验证明小分子化合物对CypA酶活抑制的能力，从而 ^-找出CypA的抑制剂。
测定CyP活性的方法很多，但以a -胰凝乳蛋白酶活性测定法(a -chymotrypsin-coupled enzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物， 如N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe p-m'troanilide)在溶液中其顺式、反式结构处于平衡，CyP能催化该底物发生 顺反异构作用，即催化脯氨酸由顺式变为反式；当其处于反式结构时，C端 p-nitroanilide被a-胰凝乳蛋白酶裂解，释放出色素基团对硝基苯胺，在390nm 连续测定吸光值的变化即可得知CyP的PPIase活性。
我们以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应，测定各个小分子配体在不同 浓度下对酶活反应的抑制率，从而计算出各个小分子配体的ICs。值。本发明的 2-{2-溴-6-甲氧基-4-[(》-(5-氧代-1,3-二苯基-1,5-二氢-4f吡唑-4-基烯)甲 基]苯氧l乙酰胺其酶活抑制ICs。值(MM)为3.98士1.39。
最后，本发明还测定了 CypA小分子抑制剂对HIV—1病毒复制的影响
化合物抗HIV-l病毒增值测试简单的说，就是利用双抗夹心法测定每个孔 内p24蛋白产生的量。以空白对照孔的光吸收值为参照，计算各个化合物抑制 HIV-l病毒p24蛋白产生的ICs。值。结果2-{2-溴-6-甲氧基-4-[U)-(5-氧代-1，3-二苯基-l， 5-二氢-4f吡唑-4-基烯)甲基]苯氧}乙酰胺抑制HIV-1病毒p24蛋白产 生的[" 值(ug/ml)为33. 80±7. 28。可见，2-{2-溴-6-甲氧基-4-[U)-(5-氧 代-1， 3-二苯基-1, 5-二氢-4/^吡唑-4-基烯)甲基]苯氧}乙酰胺具有抑制HIV— 1 病毒复制的能力，可以作为新的抗艾滋病药物进行开发。
本发明的小分子化合物可以采用各种常规的制备方法制备。例如，采用人工 化学合成的方法。
利用本发明小分子化合物，通过各种常规筛选方法，可筛选出与FD10发生相 互作用的物质，如受体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明及其抑制剂、拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不
同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载 体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制 物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途 径进行给药，其中包括(但并不限于)肌内、腹膜内、皮下、皮内、或局部给药。 以本发明的人FD10为例，可以将其与合适的药学上可接受的载体联用。这 类药物组合物含有治疗有效量的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这类载
体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药
物制剂应与给药方式相匹配。本发明的人raio可以被制成针剂形式，例如用生
理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶 囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片 剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1 微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的FD10还可与其他治疗剂一
起使用。
本发明的人FD10在制备抗艾滋病药物中的应用中，可以是针剂或者片剂。 当本发明的人FD10多肽被用作药物时，可将治疗有效剂量的该多肽施用于 哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情 况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/ 千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是 熟练医师技能范围之内的。
艾滋病(AIDS)是一种由艾滋病病毒，即人体免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，简称HIV)侵入人体后破坏人体免疫功能，使人体发生 多种不可治愈的感染和肿瘤，最后导致被感染者死亡的一种严重传染病。被称为 "当代瘟疫"和"超级癌症"的艾滋病已引起世界卫生组织(WHO)及各国政府的 高度重视，无论是人员和经费的投入均放在首位，我国已将其列入乙类法定传染 病，并为国境卫生监测传染病之一。然而，到目前为止，尚无可以治愈该病的有 效药物。本发明的小分子化合物FD10具有抑制HIV—l病毒复制的能力，而且是 针对细胞靶点设计的药物，不易形成耐药性，适合AIDS患者终身用药的需求。因 此，本发明的FD10可以作为新的抗艾滋病药物进行开发，为治疗和治愈艾滋病
提供了一种新的途径和手段。
具体实施例方式
实施例1 CypA小分子抑制剂的虚拟筛选
Cycl叩hilin A (CypA, PPIA)基因在人类基因组数据库中己经被登录，其录 入号为NM_021130。在PDB蛋白结构数据库中，我们检索到了人类CypA蛋白的X 光衍射晶体结构(PDB代码1CWA)。这个结构是CypA与其天然抑制剂环孢菌素A (CsA)的复合物晶体结构。从这个结构中，我们确定了 CypA的活性位点，并且 确定了活性位点中，能够被CsA所抑制的若干关键氨基酸位点。根据这些结构信 息，我们与中国科学院上海药物所合作，针对CypA活性位点，对若干小分子数据 库进行了筛选。用于筛选的小分子数据库主要包括SPECS和CNTO。最后筛选到了 本发明的FDIO。整个计算过程是在中科院上海药物所64CPU-SGI 0RIGN3800计算 机和上海超算中心392CPU-神威I超级计算机上进行的。
实施例2利用BIAcore分子互作仪验证虚拟筛选结果
BIAcore分子互作仪是基于表面等离子共振技术来实现跟踪生物分子间的相 互作用，无需任何标记物，因此最大限度的保证了实验结果的真实性。实验时， 将目的生物分子(CypA蛋白)固定在传感芯片表面，然后将小分子化合物溶于溶 剂并且流过芯片表面。监测器能实时跟踪检测溶液中的分子与芯片表面目的生物 分子结合、解离整个过程的变化。通过BIAcore的结合数据，我们最终确定了 12 个能够与CypA发生结合的小分子化合物，并且计算出了这些小分子化合物与CypA 结合的平衡一解离常数KD。本发明的2-{2-溴-6-甲氧基-4-[U)-(5-氧代-1，3-二苯基-1，5-二氢-4f吡唑-4-基烯)甲基]苯氧l乙酰胺其平衡解离常数KD (M)为 KD=3. 95±0.24X10—6， Chi2=0. 125。其中，Chr是BIAcore统计软件中用于检测实 验误差的一个数据。
实施例3利用酶活实验证明小分子化合物对CypA酶活抑制的能力 测定CyP活性的方法很多，但以a -胰凝乳蛋白酶活性测定法(a -chymotrypsin-coupledenzymic assay)最常用。其原理是含脯氨酸的寡肽底物，
如N-琥珀酰-Ala-Ala-Pro-Phe对硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe piitroanUide)在溶液中其顺式、反式结构处于平衡，CyP能催化该底物发生 顺反异构作用，即催化脯氨酸由顺式变为反式；当其处于反式结构时，C端 p-mtroanilide被a-胰凝乳蛋白酶裂解，释放出色素基团对硝基苯胺，在390nm 连续测定吸光值的变化即可得知CyP的PPIase活性。
我们以不加小分子抑制剂的反应作为对照反应，测定各个小分子配体在不同 浓度下对酶活反应的抑制率，从而计算出各个小分子配体的IC5()值。本发明的 2-{2-溴-6-甲氧基-4-[(》-(5-氧代-1, 3-二苯基-1， 5-二氢-4f吡唑-4-基烯)甲 基]苯氧l乙酰胺(CAS No 354781-78-5, Specs AN-655/14573061 )。其酶活 抑制ICw值(幽)为3.98士1.39，例如，6.11、 6. 25或者8. 59。
实施例4化合物抗HIV-1病毒增值测试
MT-2细胞种于96孔板中，每孔1(T个。培养基为含10X胎牛血清的RPMI 1640 培养基。HIV-1病毒以100个50%组织感染当量来感染细胞，同时加入不同浓度 梯度的化合物培养过夜(以不加化合物的孔为空白对照)。次日，更换不含小分子 化合物的新鲜培养基。第四天，取100uL培养液上清，加入5^体积的Triton — X100处理后得到病毒裂解液，然后用ELISA方法测定p24蛋白含量(p24是HIV-1
的外壳蛋白，可以作为衡量病毒粒子数量的指标)。简单的说，就是利用双抗夹心 法测定每个孔内p24蛋白产生的量。将抗HIV免疫球蛋白包板过夜(pH 9.6碳酸 缓冲液，4° C)，然后加入含4X脱脂奶粉的PBS封闭；加入100uL病毒裂解液后 于37° C孵育l个小时，用预冷PBS冲洗若千次；加入辣根过氧化物酶标记的抗 p24单克隆抗体，用TMB显色一刻钟；然后加入1N的硫酸溶液终止反应，在酶标 仪上读取450nm时的光吸收值。以空白对照孔的光吸收值为参照，计算各个化合 物抑制HIV-1病毒p24蛋白产生的ICs。值。
结果2-{2-溴-6-甲氧基-4-(5-氧代-1，3-二苯基-1,5-二氢-4/Hi比唑 -4-基烯)甲基]苯氧}乙酰胺抑制HIV-1病毒p24蛋白产生的ICs(,值如下(ug/ml): 33. 80±7. 28。
权利要求
1.一种亲环素A抑制剂在制备抗艾滋病药物中的应用，其特征在于，该亲环素A抑制剂结构为；其中，R1为3-甲基苯基、n-，p-，o-甲基苯基、n-，p-，o-氨基苯基或者苯基中的一个；R2为3-甲基苯基、n-，p-，o-甲基苯基、n-，p-，o-氨基苯基或者苯基中的一个；R3为氟、羟基、氨基或者溴中的一个；R4为羟基、氨基、氟或者甲氧基中的一个。
2. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，！^为苯基。
3. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，R2为苯基。
4. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，&为溴。
5. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，R4为甲氧基。
6. 如权利要求l所述的应用，其特征在于，该抗艾滋病药物为针剂或者片剂。
全文摘要
本发明涉及化工领域，涉及一种具有抗HIV活性的小分子化合物，其制备方法及应用。CyPA能够与人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag多聚蛋白结合。使用RNAi技术沉默CypA或者抑制CypA的活性，均能干扰HIV-1病毒的复制。本发明的小分子化合物是CyPA抑制剂，具有抗HIV-1病毒的功能，而且本发明的小分子化合物是针对细胞靶点设计的，不易形成耐药性，适合AIDS患者终身用药的需求。因此，本发明的小分子化合物可以作为新的抗艾滋病药物进行开发，为治疗和治愈艾滋病提供了一种新的途径和手段。
文档编号A61P31/00GK101108183SQ20061002917
公开日2008年1月23日 申请日期2006年7月20日 优先权日2006年7月20日
发明者龙 余, 唐丽莎, 蒋华良, 赵雪梅, 帅 陈 申请人:复旦大学