专利名称：一种作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学工程领域，更具体地说，本发明涉及一种作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡。
背景技术：
利用灭活或减毒病原体、细胞组分(如荚膜多糖)或非活性细菌毒素组成的传统疫苗通常可以诱导机体产生中和抗体来预防感染，免疫佐剂在此过程中发挥着重要的作用。所述免疫佐剂是这样一种物质，它单独施用时不产生致免疫性，而当与抗原结合时会诱发粘膜和/或系统免疫。目前大规模应用于人类疫苗的佐剂只有铝化合物，其中最主要的是Al(OH)3。现代应用铝化合物的疫苗分为两种，一种是铝化合物沉淀疫苗；另一种是铝化合物吸附疫苗。早期研究发现，抗原可以通过静电作用吸附在Al(OH)3胶体微粒表面形成抗原储池。后来发现它能够非特异性激活巨噬细胞，促进巨噬细胞产生IL-1，并且还可激活补体。铝化合物具有良好的安全性，但亦有缺点。首先，铝化合物的佐剂作用于在超过一定剂量以后逐渐下降，其原因可能是铝化合物在一定程度上对巨噬细胞有毒害作用。其次，铝化合物与许多重组或合成的多肽疫苗抗原或核酸(DNA)疫苗抗原共同免疫时未能激发有效的免疫应答，使其很难满足多肽疫苗和核酸(DNA)疫苗新型疫苗发展的需要。因此，对新佐剂的研究与开发势在必行。
超声微泡作为一种声学造影剂在器官、组织的超声显像中发挥了巨大的作用。随着超声技术如二次谐波、触发显像等的发展和造影剂制备技术的完善，微泡可大大提高对各种组织病变的诊断率。近年来将微泡作为新的药物运载工具，将药物与微泡结合起来，通过外周血管注射，以超声破坏携约物微泡，进行微泡在特定组织的定位释放，提供一种新的药物控释方法，具有无创、操作简便、靶向性好、效率高、安全且重复性好的优点。最近有研究也证实超声波破坏携靶基因的微泡定位释放技术，是一种新型的无创性基因转移技术。基本原理为声场内的超声波破坏微泡后，其产生的空化或机械效应可使细胞膜通透性增加，并致直径≤7μm的微血管破裂，内皮细胞间隙增宽。靶基因可通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达组织细胞内。超声波破坏微泡可使基因的转染率和表达提高。超声波破坏微泡增强空化效应后，可使裸露DNA的转染率提高3000倍，极大地提高了基因的转染率。利用超声波在特定时间和空间内击碎靶组织内微泡，提高基因疫苗的表达效率和靶向性。同时超声微泡具有抗原储库作用，抗原既可包裹在微泡内部，也可嵌入微泡膜上。最近研究发现壳聚糖及其衍生物、脂质体、表面活性剂以及多聚物等多具有免疫增强效应，即这些物质多可作为免疫佐剂使用。因此，以上述物质为膜材料的超声微泡有望开发成为一种新型免疫佐剂及疫苗载体，尤其是适用于多肽疫苗和核酸(DNA)疫苗以及病毒、细菌疫苗的新佐剂和载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，通过将超声微泡作为免疫佐剂以及疫苗的运载工具，提高疫苗的免疫效果，拓展超声微泡的应用领域。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的，即一种作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于由超声微泡表面粘附疫苗抗原，和/或超声微泡内包裹疫苗抗原构成，其中超声微泡为疫苗抗原的佐剂及运载疫苗抗原达到相应靶组织的载体。
本发明将疫苗抗原物质粘附于微泡表面和/或包裹于微泡内合成携疫苗抗原的超声微泡构筑成疫苗抗原储存库，运载疫苗抗原达到相应靶组织。由于所述超声微泡可以增强超声显像功能，超声波可对其进行监控以及定位触发、爆破，应用超声波破坏靶组织区的微泡，定位释放疫苗抗原物质，以及提高核酸表达水平，增强抗原的免疫活性。
本发明中疫苗抗原粘附和/包裹主要采用以下二种方法即(1)将疫苗抗原粘附于微泡的表面将选定的疫苗抗原与微泡充分混合(所述混合的配比中疫苗抗原的量为临床上能够接受的安全有效剂量)，可由静电吸附作用将疫苗粘附于微泡表面。微泡可为(但不仅限于)市场现有的微泡如美国生产的Sonovue、Optison、Albunex、德国生产的Levovist等产品，也可为自制的微泡，其膜材料可为脂类、多聚物、白蛋白、壳聚糖或表面活性剂类。其芯材料所采用的气体选自空气、氮气，二氧化碳、氟碳烃气体或烷烃类气体中的一种或几种。(2)将低温下为液态的氟碳液体与临床上能够接受的安全有效剂量的疫苗抗原混合后，在声振过程中形成由脂类、白蛋白、多聚物、壳聚糖、表面活性剂等材料包裹氟碳液体和疫苗的微球，在温度升高至37℃-45℃条件下变为微泡。用PBS清洗掉未裹入的疫苗抗原，所得到的即为包裹疫苗抗原的微泡。也可在声振过程中加入芯材料获得包裹疫苗抗原的微泡。芯材料所采用的气体选自空气、氮气，二氧化碳、氟碳烃气体或烷烃类气体中的一种或几种。当然，微泡的大小亦可为微米级或纳米级的。
上述脂类选自磷脂中的3-sn-磷脂酰胆碱、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油基-钠盐、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰酸-钠盐、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或氢化磷脂酰丝氨酸中的一种或几种。表面活性剂选自Tween表面活性剂和Span表面活性剂如单月桂酸酯(Tween20，Tween21，Span20)、单棕榈酸酯(Tween40，Span40)、单硬脂酸酯(Tw-een60，Tween61，Span60)、三硬脂酸酯(Tween65，Span65)、单油酸酯(Tw-een80，Tween81，Span80)和三油酸酯(Tween85，Span85)。多聚物可为(但不仅限于)多聚乳酸(polylactic acid，PLA)、明胶蛋白(gelatin)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚硅氧烷(polysiloxane)、聚氧化乙烯(polyethy-l ene oxide，PEO)、聚丙烯酰胺(polyacrylamid)、聚丙烯酸(酯)(polyacry-late)、聚氨酯(polyurethane，PU)、聚磷酸酯(polyphosphate ester)、聚羟基乙酸(酯)(polyglycolide，PGA)、聚羟基丁酸(酯)(polyhydroxylbutyrate，PHBT)、聚(酸)酐(polyanhydrides，PAN)、聚己内酰胺(polycaprolactone，PCL)、聚氨基酸(polyamine acid)、聚羟乙基甲基丙烯酸(酯)(polyhydroxy-ethylmethacrylate)及上述多聚物间的共聚物(co-polymer)。
首先将上述方法获得的载疫苗抗原的微泡通过静脉注射、动脉注射、腹腔注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射或局部包括粘膜、皮肤涂抹，然后进行定位超声处理。所述的超声波可为脉冲波或连续波，其频率为20KHz～10MHz，作用时间为0.25～30分钟。可以为聚焦或不聚焦的治疗或诊断用的超声波，其能量可以是低强度或也可是高强度的。由于微泡破坏后可释放其所携带的疫苗，达到其定位释放作用。同时，微泡破坏后的“空化效应”、“声孔效应”可致微血管破裂、增加血管通透性，可使核酸疫苗抗原在局部组织内的含量和表达水平明显提高，增强抗原的免疫活性。
对上述携疫苗的微泡增强靶向聚集作用而采取的措施是在微泡表面连接上针对特定组织抗原的相应抗体或针对特定受体的配体，可大大提高微泡的靶向作用。如抗CD34、抗ICAM、抗E-选择素、抗P-选择素等，将各种抗体在声振过程中混合入液体中，可形成具有靶向作用的超声微泡。为增加携疫苗抗原微泡的体内循环时间，可对其表面进行修饰获得长循环携疫苗抗原的微泡，如聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)及其衍生物的表面修饰等。
本发明不涉及新的疫苗及其制备过程，所选用的疫苗为可获得的一切疫苗。
本发明由于能够作为免疫佐剂及疫苗的载体而产生的积极效果是能将疫苗抗原物质粘附于微泡表面和/或包裹于微泡内合成携疫苗抗原的超声微泡构筑成疫苗抗原储存库，运载疫苗抗原达到相应靶组织，应用超声波破坏靶组织区的微泡，定位释放疫苗抗原物质，以及提高核酸表达水平，增强抗原的免疫活性。具有无创、操作简便、靶向性好、效率高、安全且重复性好的优点。
附图1光学显微镜下所见表面活性剂类微泡；附图2光学显微镜下所见脂质微泡；附图3光学显微镜下所见高分子材料-聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)微泡附图4为超声波“空化效应”、“声孔效应”对体外培养细胞细胞膜作用实验的电镜观测对照图。其中A图中箭头所指处为超声破坏微泡后使体外培养细胞的细胞膜上出现的可逆性小孔；而B图为单纯超声作用后的细胞和C图中细胞未进行超声破坏对照组则无明显差别。
具体实施例方式
实例1表面活性剂类微泡的制备将表面活性剂Span60；Tween 80按1∶1比例混合，同时以NaCl∶KCl∶Na2HPO4∶KH2PO4按200∶30∶5∶1质量比配比，加入100ml的去离子水，并用NaOH将混合液的pH值调定为7.36，以此为媒介液；将100ml媒介液加入Span60和Tween80混合物中，将上述得到了混合物在磁力搅拌仪上加热，温度加热至120℃，时间为10分钟，充分混匀，使其成为一个乳状悬浮状体系；将加热后所得的乳状混合液在声振处理的同时，加入全氟丙烷气体0.6ml，加入速度为0.5ml/s；声振仪探头置于液面下0.5～2.0cm处进行声振处理，最大输出功率的30％振荡，时间为3分钟。声振后的乳状混合液，静置35分钟后分3层，取出中间层用磷酸盐缓冲液稀释，获得表面活性类微泡(如图1)。
实例2脂质微泡的制备将卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇硬脂酰乙醇胺按质量比为1∶3∶3的比例用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；加入0.9％氯化钠溶液，丙二醇和甘油(0.9％氯化钠溶液∶丙二醇∶甘油＝8∶1∶1)，振荡洗膜，形成脂质体混悬液。冷冻过夜。解冻后，用声振仪以最大输出功率的30％振荡80s，同时经三通管在下方缓慢充入全氟丙烷气体0.6ml，形成脂质氟碳微气泡(如图2)。
实例3高分子材料-聚乳酸/羟基乙酸(PLGA)微泡的制备将0.1g樟脑加入20ml二氯甲烷中，充分搅拌使其完全溶解；将1.0g高分子材料聚乳酸/羟基乙酸聚合物(PLGA)加入上述溶液中，充分搅拌至其完全溶解，再将5％氯化铵3ml加入后，立即用声振仪以最大输出功率的30％振荡40s，成乳白乳液；将乳液加入3％聚乙烯醇液中均质机均质5min，而后加入2％异丙醇液中，室温下磁力搅拌器搅拌2-5小时，高速离心5min(速度3000-5000转)，反复3次；加入5％甘露醇充分混匀成乳白色溶液即得PLGA微泡(如图3)实例4白蛋白微泡的制备将20％人血清白蛋白与5％葡萄糖按1∶5的比例混合后在用声振仪以最大输出功率的30％振荡80s，同时经三通管在下方缓慢充入全氟丙烷气体0.6 ml，经冻干后制备白蛋白微泡。
实例5壳聚糖微泡的制备将0.1g樟脑加入20ml二氯甲烷中，充分搅拌使其完全溶解将1.0g壳聚糖加入上述溶液中，充分搅拌至其完全溶解，再将5％氯化铵3ml加入后，立即用声振仪以最大输出功率的30％振荡40s，成乳液将乳液加入3％聚乙烯醇液中均质机均质5min，而后加入2％异丙醇液中，室温下磁力搅拌器搅拌2-5小时，高速离心5min(速度3000-5000转)，反复3次；加入5％甘露醇充分混匀即得壳聚糖微泡。
上述实施例1、2、3、4、5获得的微泡可以通过前述的两种方法粘附和/包裹疫苗抗原而获得作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡。
实例6核酸疫苗包裹于微泡的合成在4℃下将全氟丙烷的液体与核酸疫苗以体积比为3∶1混合，形成氟碳液体与核酸疫苗的混合物，采用脂质材料卵磷脂、胆固醇、聚乙二醇硬脂酰乙醇胺按质量比1∶3∶3的比例用氯仿溶解，旋转真空蒸发成膜；加入适量水相溶剂0.9％氯化钠溶液；丙二醇；甘油＝8∶1∶1振荡洗膜，形成脂质体混悬液；冷冻过夜；解冻后，用声振仪以最大输出功率的35％声振适当时间120s，同时经三通管在下方缓慢冲入氟碳液体与核酸疫苗的混合物约6ml，形成脂质体氟碳微泡(外壳为脂质体，内包裹实心的氟碳液体和选定的疫苗)。用10ml PBS溶液洗涤3次，得到包裹了核酸疫苗的微泡。
实例7超声波“空化效应”对体外培养细胞细胞膜的作用将体外培养的血管平滑肌细胞制成单细胞悬液，摇匀后平均分为1.2ml，移入无菌聚乙稀试管内。分为对照组、单纯超声辐照组和微泡+超声辐照组三组。试管内加入由实施例4获得的微泡(50μl)，用一定能量(665KHz、0.5w/cm2)的超声波辐照20s，立即和继续培养24小时后，用扫描电镜观察细胞膜结构有无改变。结果显示超声破坏微泡后可使体外培养细胞的细胞膜上出现可逆性小孔(“声孔效应”所致)，而单纯超声作用后的细胞和对照组则无明显差别(如图4)。
实施8超声微泡介导甲胎蛋白核酸疫苗抗肿瘤免疫效果初步观察。
具体实验如下选择健康5-8周龄的健康雌性C57BL/6小鼠24只(重庆医科大学实验动物中心提供)，其体重为20±2g，随机分为实验组和对照组，实验组为超声微泡处理组(A)，对照包括空白对照组(B)，单纯超声辐照组(C)、单纯微泡处理组(D)。实验中所用的微泡为脂质微泡(载有甲胎蛋白核酸疫苗)，浓度为8×108个/ml，微泡大小为2.7±0.8μm。A组即采用肌肉局部输入载有甲胎蛋白核酸疫苗的脂质微泡，并用超声波辐照，其参数为发射频率1MHz，声强为2.0W/cm2，辐照1min；B组不采用超声和微泡处理，为空白对照组。C组不用微泡的前提下单纯采用超声辐照，其参数同A组；D组为单纯微泡处理组，不采用超声辐照。2周后在小鼠背部皮下按2×105个/100μl接种EL-4(pmAFP)细胞，观察肿瘤生长情况，每2周测量一次肿瘤体积，按3/4πr3计算肿瘤体积。结果发现A组肿瘤生长缓慢，其体积显著小于各对照组。表明超声微泡介导甲胎蛋白核酸疫苗的抗肿瘤免疫活性明显增强。
权利要求
1.一种作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于由超声微泡表面粘附疫苗抗原，和/或超声微泡内包裹疫苗抗原构成，其中超声微泡为疫苗抗原的佐剂及运载疫苗抗原达到相应靶组织的载体。
2.根据权利要求1所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述超声微泡为可以增强超声显像功能、可以对其进行监控并在超声波作用下定位触发、爆破的微泡；同时应包括在该超声微泡中加入对靶组织或病灶部位有特异亲和性的物质形成的靶向超声微泡以及通过表面进行修饰获得的长循环超声微泡。所述的超声波可为脉冲波或连续波，且其频率为20KHz～10MHz，作用时间为0.25～30分钟；所述的超声波为能聚焦或不能聚焦的治疗或诊断用的超声波，其能量可以是低强度或也可是高强度的。
3.根据权利要求1所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述疫苗抗原选自本身或在佐剂辅助下能产生免疫活性的一切疫苗，它来源于传统疫苗如细菌、病毒或寄生虫、细胞因子疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗以及病毒、细菌载体疫苗。
4.根据权利要求1、2所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述用作免疫佐剂和疫苗载体的超声微泡包括由成膜材料包裹芯体构成的非连续相和水性介质构成的连续相，其中所述非连续相均匀地分散在所述连续相中，所述非连续相的粒径为5nm～7μm。
5.根据权利要求4所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述超声微泡的成膜材料具有生物安全性和生物相容性，所述芯的材料采用气体、液体或纳米级生物相容性固体。
6.根据权利要求4所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述超声微泡的成膜材料为脂类、白蛋白、壳聚糖及其衍生物、表面活性剂以及多聚物中的一种或多种物质。
7.根据权利要求6所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述的脂类选自磷脂中的3-sn-磷脂酰胆碱、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰甘油基-钠盐、1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰酸-钠盐、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸或氢化磷脂酰丝氨酸中的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述的表面活性剂选自Tween表面活性剂和Span表面活性剂如单月桂酸酯(Tween20，Tween21，Span20)、单棕榈酸酯(Tween40，Span40)、单硬脂酸酯(Tween60，Tween61，Span60)、三硬脂酸酯(Tween65，Span65)、单油酸酯(Tween80，Tween81，Span80)和三油酸酯(Tween85，Span85)。
9.根据权利要求6所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述的多聚物包括多聚乳酸(polylactic acid，PLA)、明胶蛋白(gelatin)、聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)、聚硅氧烷(polysiloxane)、聚氧化乙烯(polyethylene oxide，PEO)、聚丙烯酰胺(polyacrylamid)、聚丙烯酸(酯)(polyacrylate)、聚氨酯(polyurethane，PU)、聚磷酸酯(polyphosphate ester)、聚羟基乙酸(酯)(polyglycolide，PGA)、聚羟基丁酸(酯)(polyhydroxylbutyrate，PHBT)、聚(酸)酐(polyanhydrides，PAN)、聚己内酰胺(polycaprolactone，PCL)、聚氨基酸(polyamine acid)、聚羟乙基甲基丙烯酸(酯)(polyhydroxyethyl methacrylate)及上述多聚物间的共聚物(co-polymer)。
10.根据权利要求5所述的作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡，其特征在于所述的芯材料所采用的气体选自空气、氮气，二氧化碳、氟碳烃气体或烷烃类气体中的一种或几种；所述的芯材料所采用的液体选自C5-C6烷烃、C5-C12氟碳烃、饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸中的一种或几种。
全文摘要
本发明属于生物医学工程领域，更具体地说，本发明涉及一种作为免疫佐剂及疫苗载体的新型超声微泡。通过将疫苗抗原物质粘附于微泡表面和/或包裹于微泡内合成携疫苗抗原的超声微泡；使用时将携疫苗抗原的微泡通过系统及局部作用于靶组织，应用超声波破坏靶组织区的微泡，定位释放疫苗抗原物质，增强抗原的免疫活性。有望开发成为一种新型免疫佐剂及疫苗载体，尤其是适用于多肽疫苗和核酸疫苗以及病毒、细菌疫苗的新佐剂和载体。
文档编号A61K38/39GK1935259SQ200610054509
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月18日 优先权日2006年10月18日
发明者许川山, 王志刚, 于廷和, 刘志君 申请人:许川山, 王志刚, 于廷和