专利名称：抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒的免疫球蛋白，国际专利分类号为A61K39/395。
背景技术：
猪传染性胃肠炎，猪流行性腹泻和猪轮状病毒感染是目前已经证实的、引起猪发生腹泻的重要的三个病毒传染性疾病。这三种疾病主要对仔猪的影响较大，是引起仔猪死亡的主要病毒性腹泻病。这三种疾病常常混合感染，在流行病学、临床症状、病理解剖学变化上都非常相似，很难区别到底是哪一种病毒感染，而且发病急速，在发病后近几个小时，就可波及全群，主要是造成哺乳期仔猪的大批死亡，给养猪生产造成巨大的损失。
猪传染性胃肠炎(Porcine Transmissible Gastroenteritis，TGE)是由冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪传染性胃肠炎病毒(Porcine TransmissibleGastroenteritis virus，TGEV)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染病，对新生仔猪具有高度致死率，通常为100％。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5周玲以上的猪感染后，死亡率很低。1945年Doyle在美国首次报道了这一疾病以后，世界上许多国家都相继报道了猪传染性胃肠炎。我国从1956年在广东首次发生这种疾病后，全国大多省份也有猪传染性胃肠炎的发生，给养猪业带来了严重危害。
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhae，PED)是由冠状病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhae virus，PEDV)引起的一种猪肠道传染病。以水泻、呕吐和脱水为特征。各种年龄的猪均易感，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％，尤其哺乳仔猪受害最严重。猪流行性腹泻主要发生在冬季和早春天气较为寒冷的季节，但夏季也可发生。上世纪70年代初期许多国家相继报道了猪流行性腹泻的发生，我国自上世纪80年代开始陆续有发生猪流行性腹泻的报道。
猪轮状病毒感染(Porcine Rotavirus Infection)是由呼肠孤病毒科(Reoviridae)的轮状病毒属(Rotavirus)的轮状病毒引起的一种幼龄猪的一种急性消化道传染病。幼猪的主要症状为厌食、不安，偶尔会出现呕吐。重症猪在发病1～4小时后出现大容量腹泻，排水样粪便，颜色为黄色到白色，含有絮状物。腹泻可持续3～5天，在腹泻期间，仔猪出现脱水和死亡，死亡率可达50％～100％。流行病学调查显示，猪群中轮状病毒的带毒率非常高，中猪和大猪多为亚临床感染和隐性感染，即只携带病毒但不发病，发病的只是仔猪。因此说轮状病毒感染只是影响仔猪成活率的一种传染病。
目前主要用疫苗来预防这三种疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病的特效药物，因此在临床治疗上主要采取对症治疗和用抗生素类药物预防并发症的发生，其治疗效果不理想。此外，由于这三种疾病发病急速，出现腹泻后，仔猪大多由于腹泻而脱水，很快就会由于衰竭而死亡。因此在生产中急需一种既具有特异性，疗效又确实，治疗效果迅速显现的治疗制剂。而抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白就是具有上述优点的治疗药物。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种采用三种免疫原制备治疗或预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三种疾病，具有特异性高，针对性强，疗效确实的抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白。
本发明的免疫原采用细胞培养物经浓缩后加完全弗氏佐剂制备而成，其中猪传染性胃肠炎病毒用乳猪肾原代细胞或猪肾细胞(PK-15)传代细胞培养；猪流行性腹泻病毒用Vero细胞进行培养；猪轮状病毒用MA104细胞系或CV1细胞培养；浓缩后这三种病毒的校价不得少于106，将这三种免疫原以体积比(1～3)∶(1～3)∶(1～3)的比例混合后以体积比1∶1加入弗氏完全佐剂作为免疫原免疫动物；同时使用吉林鲸象动物药业有限公司研制成的苷肽注射液(发明名称为一种提高动物免疫功能的苷肽注射液，中国专利申请号为2005 10016626.2)作为免疫增强剂，5毫升/支，以提高抗体效价。
本发明的免疫动物使用经过严格检疫的猪、马(骡、驴)作为免疫动物；免疫程序免疫途径采用皮内、皮下或穴位、肌肉多点注射。基础免疫剂量为每头猪3ml，马(骡、驴)5ml。免疫方式猪为皮下或肌肉多点注射，马(骡、驴)用皮内、皮下或穴位多点注射。间隔28天进行第一次加强免疫，免疫剂量为猪8ml，马(骡、驴)12ml。以后每间隔15天进行加强免疫一次，经2～4次加强免疫后，检测抗体效价，抗体效价≥2048时视为合格，如抗体效价达不到此标准，继续加强免疫一次，然后对马(骡、驴)颈静脉采血或对免疫猪颈动脉或心脏直接放血。
抗体效价检测分别使用检测这三种疾病的ELISA方法检测血清抗体效价。检测抗原用细胞培养物经浓缩的并经过相应处理的病毒，第二抗体采用相对应的兔抗猪(鼠抗猪)或兔抗马(鼠抗马)，同时设立阴、阳性血清对照。血清抗体效价合格者方能进行采血或作为合格产品出厂。
采血和血清提取首先用1％～5％无菌氯化钠溶液将采血的容器内壁完全打湿。每个容器应标明动物号码、最后一次加强免疫日期和采血日期。无菌采血后将采集的血液在20℃在～25℃放置，待其全部凝固并有血清析出时，加入灭菌的压砣，48～72小时后，以无菌方式提取血清。同时按血清总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀，放置于2℃～15℃冷暗处，沉淀澄清。同时每瓶血清应贴有动物号、血清量和分离日期。
血浆提取将血液收集于盛有5％灭菌枸橼酸钠溶液的灭菌玻璃瓶中，血液和枸橼酸钠溶液的比例为9∶1；经48～72小时沉淀，抽取上清，并按总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀。每瓶血浆应作详细记录。
血清(血浆)精制将要精制的血清(血浆)混合至同一灭菌容器中，按血清(血浆)总量的2倍量加入蒸馏水，充分搅拌均匀；用2mol/L盐酸调节pH至3.0，加入盐酸调节pH时，要缓慢加入，边加边搅拌边测量，防止局部pH过酸对免疫球蛋白的活性产生影响。放置60分钟，再用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.2～3.4。然后按照每1ml 6～9单位的量加入胃蛋白酶，并按总量的0.2％加入甲苯，在29℃～31℃条件下消化2～24小时，消化期间要经常搅拌。
将消化完的溶液按照总量的15％加入硫酸铵，充分溶解后，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.5～4.7，60℃水浴60分钟。待溶液冷却至43℃以下时，用帆布过滤，收集滤液，去掉沉淀。对收集到的滤液进行计量，并放于同一个灭菌的容器中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.1～7.3，按照总量的20％加入硫酸铵，充分搅拌均匀后，用灭菌的帆布过滤，收集沉淀物。然后对沉淀进行称量，放入到一个无菌容器中，并向沉淀物中加入5～6倍的蒸馏水，溶解沉淀物，待沉淀物充分溶解后，按照总量加入10％的明矾溶液，使明矾总含量达到1％。再用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7～7.8，静置2～4小时使其沉淀，然后用无菌帆布过滤，收集滤液。
将收集到的滤液放置于同一个无菌容器中，按总量的38％加入硫酸铵，充分搅拌后用无菌帆布过滤，弃上清收集沉淀，将沉淀压干后用透析袋分袋包装，每袋约200～250g，加入少许氯仿，扎紧透析袋后放置于流水槽内透析48～72小时。然后收集袋内的血清，按总量的0.5％加入氯仿、0.85％加入氯化钠，0.0035％加入硫柳汞。充分溶解后在无菌条件下用0.22um膜过滤，放置于5℃～15℃静置沉淀。然后取少量血清进行抗体效价检测，并对其保护效力进行测定。
按照中华人民共和国农业部2000年出版的《中华人民共和国兽用生物制品规程》对生产的血清进行无菌检验。
保护效力检测试验将60头体重在2～3kg的、出生后3～5天的哺乳仔猪随机分为8组，前四组为试验组每组10头，第一、二、三组分别用经检测过的，病毒效价为106猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒液2ml口服感染试验仔猪，同使用经ELISA检测过的，抗体效价≥2048的高免免疫球蛋白2～3ml给试验猪肌肉注射；第四组用三种病毒混合液给试验猪口服，同时注射抗体效价≥2048的高免免疫球蛋白2～4ml；连续观察20日，出现腹泻者视为发病，不出现腹泻者视为保护。第五、六、七、八组为对照组，每组5头猪，第五、六、七组分别用病毒效价为106猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒液2ml口服感染，第八组用三种病毒混合液感染，用生理盐水替代高免免疫球蛋白，观察时间和判定标准与试验组相同。试验期间对发病死亡的试验猪，以及在试验结束后对对照组的仔猪进行病理解剖，观察是否发生与疾病相关的病理变化。
保护效力检测结果第一组用猪传染性胃肠炎病毒的高免免疫球蛋白试验组全部保护，没有发现腹泻现象的发生。相对应的对照组第五组5/5发生腹泻。第二组用猪流行性腹泻病毒攻毒的试验猪9/10没有腹泻现象的发生，其精神、哺乳均正常，其中有一头猪出现轻微的腹泻症状，未经治疗在第二天自然康复，视为保护。第六组的对照组全部发病。第三组用猪轮状病毒攻毒组全部保护，其对照组(第七组)全部发生腹泻。第四组用混合病毒液攻毒的试验组9/10保护，1/10出现腹泻，未经治疗在第三天自然康复。其对照组(第八组)全部发病。
产品分装将半成品经适当稀释后，作为成品分装时，抗体效价应比规定标准高出20％，即使用时的抗体效价为≥2048时，分装成品的抗体效价应≥2640。使用剂量为1ml/kg体重。保存期为36个月。
本发明具有以下优点和积极效果①安全性好 在免疫球蛋白的加工工艺中使用胃蛋白酶对免疫球蛋白进行消化，将抗体的FC片断切掉，使免疫球蛋白的分子量缩小将近一倍，同时用硫酸胺沉淀法将血轻重的白蛋白除去，这样就不会引起过敏反应；②由于这种抗体具有高度的特异性，因此，用这种特异性高免免疫球蛋白对发病猪进行治疗或紧急预防就会取得迅速、特异的疗效；③临床应用效果好 实际应用证明，用这种高免免疫球蛋白治疗或预防猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒性腹泻其疗效是确实和迅速的，用药后(肌肉注射)可见到明显的效果，结合补液、抗酸中毒等对症疗法，在24小时即可达到临床治愈，患病猪食欲、精神等项临床体症都恢复正常。一般较为轻型病例，一次用药就可治愈，对于个别重症病例，在1～2天后再重复注射一次，即可达到临床治愈的效果。
⑤不会产生药物残留 由于免疫球蛋白的半衰期短，代谢较快，在体内没有蓄积作用，没有药物残留。可以生产出高质量、绿色的猪肉产品。
⑦保存和使用方便 本品为淡黄色透明液体，4℃保存36个月内检测抗体效价仍在≥2048以上，非常稳定。在使用上，一针即可预防和治疗三种疾病。
具体实施例方式
实施例1本发明的免疫原采用细胞培养物经浓缩后加完全弗氏佐剂制备而成，其中猪传染性胃肠炎病毒用乳猪肾原代细胞或猪肾细胞(PK-15)传代细胞培养；猪流行性腹泻病毒用Vero细胞进行培养；猪轮状病毒用MA104细胞系或CV1细胞培养；浓缩后这三种病毒的校价不得少于106，将这三种免疫原以1∶2∶1的比例混合后以体积比1∶1加入弗氏完全佐剂作为免疫原免疫动物；同时使用吉林鲸象动物药业有限公司研制成的苷肽注射液，5毫升/支，作为免疫增强剂。
免疫程序免疫途径采用皮内、皮下或穴位、肌肉多点注射。基础免疫剂量为每头猪3ml，马(骡、驴)5ml。免疫方式猪为皮下或肌肉多点注射，马(骡、驴)用皮内、皮下或穴位多点注射。间隔28天进行第一次加强免疫，免疫剂量为猪8ml，马(骡、驴)12ml。以后每间隔15天进行加强免疫一次，经2～4次加强免疫后，检测抗体效价，抗体效价≥2048时视为合格，如抗体效价达不到此标准，继续加强免疫一次，然后对马(骡、驴)颈静脉采血或对免疫猪颈动脉或心脏直接放血。
抗体效价检测分别使用检测这三种疾病的ELISA方法检测血清抗体效价。检测抗原用细胞培养物经浓缩的并经过相应处理的病毒，第二抗体采用相对应的兔抗猪(鼠抗猪)或兔抗马(鼠抗马)，同时设立阴、阳性血清对照。血清抗体效价合格者方能进行采血或作为合格产品出厂。
采血和血清提取无菌采血后将采集的血液在20℃在～25℃放置。血清提取待其全部凝固并有血清析出时，加入灭菌的压砣，48～72小时后，以无菌方式提取血清。同时按血清总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀，放置于2℃～15℃冷暗处，沉淀澄清。
血浆提取将血液收集于盛有5％灭菌枸橼酸钠溶液的灭菌玻璃瓶中，血液和枸橼酸钠溶液的比例为9∶1；经48～72小时沉淀，抽取上清。
血清(血浆)精制将要精制的血清(血浆)混合至同一灭菌容器中，按总量的2倍量加入蒸馏水，用2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置60分钟，再用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.2～3.4。然后按照每1ml 6～9单位的量加入胃蛋白酶，在29℃～31℃条件下消化2～24小时。
将消化完的溶液按照总量的15％加入硫酸铵，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.5～4.7，60℃水浴60分钟。待溶液冷却至43℃以下时，过滤，收集滤液，去掉沉淀。计量并放于同一容器中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.1～7.3，按照总量的20％加入硫酸铵，用灭菌的帆布过滤，收集沉淀物。称量后放入到容器中，加入5～6倍的蒸馏水，溶解沉淀物后，按照总量加入10％的明矾溶液，再用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7～7.8，静置2～4小时使其沉淀，过滤并收集滤液。
将收集到的滤液放置于同一容器中，按总量的38％加入硫酸铵，搅拌后用无菌帆布过滤，弃上清收集沉淀，将沉淀压干后用透析袋分袋包装，每袋约200～250g，扎紧透析袋后放置于流水槽内透析48～72小时。收集袋内的血清，充分溶解后在无菌条件下用0.22um膜过滤，放置于5℃～15℃静置沉淀。
按照中华人民共和国农业部2000年出版的《中华人民共和国兽用生物制品规程》对生产的血清进行无菌检验。
产品分装将半成品经适当稀释后，作为成品分装时，抗体效价应比规定标准高出20％，即使用时的抗体效价为≥2048时，分装成品的抗体效价应≥2640。使用剂量为1ml/kg体重。保存期为36个月。
实施例2本发明的免疫原采用细胞培养物经浓缩后加完全弗氏佐剂制备而成，其中猪传染性胃肠炎病毒用乳猪肾原代细胞或猪肾细胞(PK-15)传代细胞培养；猪流行性腹泻病毒用Vero细胞进行培养；猪轮状病毒用MA104细胞系或CV1细胞培养；浓缩后这三种病毒的校价不得少于106，将这三种免疫原以1.5∶2∶3的比例混合后加入弗氏佐剂作为免疫原免疫动物；同时使用吉林鲸象动物药业有限公司研制成的苷肽注射液作为免疫增强剂。
制备方法与实施例1相同。
权利要求
1.抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白，免疫原采用猪传染性胃肠炎病毒用乳猪肾原代细胞或猪肾细胞(PK-15)传代细胞培养、猪流行性腹泻病毒用Vero细胞进行培养、猪轮状病毒用MA104细胞系或CV1细胞培养；免疫佐剂为弗氏佐完全剂；免疫增强剂为吉林鲸象动物药业有限公司研制的苷肽注射液。
2.根据权利要求1所述的抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白，其特征是所述的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三种免疫原以(1～3)∶(1～3)∶(1～3)的比例混合；所述的弗氏完全佐剂与免疫原的体积混合比例为1∶1；所述的免疫增强剂苷肽注射液为5毫升/支。
3.根据权利要求1所述的抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白，其特征是所述的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒三种免疫原浓缩后病毒的效价不得少于106。
全文摘要
抗猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联高免免疫球蛋白，免疫原用取细胞培养物经浓缩后加完全弗氏完全佐剂制备而成，即将这三种病毒浓缩后按照(1～3)∶(1～3)∶(1～3)的比例混合制备抗原免疫动物，同时用苷肽注射液作为免疫增强剂，以提高抗体效价；其制备方法按照中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)规定的方法对制备的高免免疫球蛋白进行加工。本发明主要是针对引起仔猪死亡的主要病毒性腹泻病，对治疗这三种猪病毒性腹泻特效药物有特效，同时还具有特异性高，针对性强，疗效确实、安全性好、不会产生药物残留、保存和使用方便等优点。
文档编号A61P31/00GK1958070SQ20061013163
公开日2007年5月9日 申请日期2006年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者张中洋 申请人:张中洋