专利名称：一种利用生物反应器生产猪传染性胃肠炎病毒的方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒的生产方法，具体地，涉及一种猪传染性胃肠炎病毒的生产 方法，更具体地，涉及一种利用生物反应器生产猪传染性胃肠炎病毒的方法。
背景技术：
猪传染性胃肠炎(PorcineTransmissible Gastroenteritis, TGE)是由冠状 病毒科(Coronaviridae)、冠状病毒属(Coronavirus)的猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transmissible Gastroenteritis virus,TGEV)引起的以猪呕吐、腹湾、脱水为特征的传染 病，对新生仔猪具有高度致死率，通常为100%。虽然不同年龄的猪对这种病毒均易感，但5 周龄以上的猪感染后，死亡率很低。Doyle于1945年报道美国首次发生该病后，世界上许多 国家都相继报道了猪传染性胃肠炎，1956年我国广东首次发生该病后，全国大多省份也有 发生，给养猪业带来了严重危害。目前，国内猪传染性胃肠炎疫苗生产唯一依靠细胞转瓶培养法实现。该传统工艺 劳动强度大，耗时长、效率低，生产成本高；容易被环境污染；不同生产批次间或同一生产 批次不同瓶间的差异大；难以扩大生产；容易出现被细菌或其它病毒污染而致的疫苗质量 隐患，涉及生物安全和公共卫生问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供一种利用生物反应器生产猪传染性胃肠炎病毒的 方法。本发明提供的方法，包括如下步骤1)制备单层传代细胞；2)制备猪传染性胃肠炎病毒生产用种毒；3)将步骤1)制备的单层传代细胞消化后，用细胞生长液进行悬浮，制备成细胞密 度为1-3 X 105个/mL的细胞悬液，接种到生物反应器内，使传代细胞在生物反应器中的微 载体上吸附培养；4)当传代细胞长至微载体的80% -90%，空球率低于5%，满球率大于80%，细胞 计数达到3-5X 106个/mL以上时，以2-5%的接种量接种步骤2)制备的种毒，进行病毒的 吸附培养；4)当微载体上的传代细胞80%以上病变时，收获病毒液。其中，所述方法还包括在步骤3)中的细胞悬液接种到生物反应器之前，按生物反 应器总体积的50-70%加入无菌细胞生长液，且每升无菌细胞生长液中按4-10g/L浓度加 入微载体，启动生物反应器，低转速搅拌20-50分钟。其中，所述的方法还包括将微载体加入到细胞生长液之前将微载体进行清洗和灭 菌的步骤，依次为用PBS浸泡微载体3小时以上；用PBS清洗微载体3-5遍；用PBS浸泡微 载体，121°C蒸汽灭菌20-50min。
其中，步骤2)猪传染性胃肠炎病毒生产用种毒的制备具体包括如下步骤用病毒培养液将猪传染性胃肠炎病毒种毒按2-5%比例接种到单层传代细胞中进 行培养，至细胞80%以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞 适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID5(i和无菌检测，传至病毒TCID5(i稳定且达 到107TCID5(l/mL以上时停止复壮，作为生产用种毒。其中，所述的病毒培养液可为本领域常 规的病毒培养液，优选的配方为质量分数分别是98% -99% MEM液、1 % -2%牛血清、终浓 度为100-200IU/mL的抗菌素，pH值为6. 8-7. 5。其中，步骤3)中的单层传代细胞用EDTA-胰酶消化液进行消化，所述的EDTA-胰 酶消化液为含有质量体积分数为0. 05% -0. 25%的胰酶和0. 02%的EDTA的Hank’ S液。其中，步骤3)中所述的细胞悬液中传代细胞的密度为1-3X105个/mL。其中，步骤3)中所述的细胞生长液的配方为质量分数为95%-98% MEM液、 2% -5%牛血清、终浓度为100-200IU/mL的抗菌素，pH值为6. 8-7. 5。其中，所述的传代细胞可为本领域中常规用于病毒培养的细胞，优选为ST细胞或 veix)细胞，最优选为ST细胞。本发明中，生物反应器设定的参数优选为培养温度35-381411值6.8-7.5、溶氧 50% -70%、搅拌速度 50-80rpm。其中，所述的猪传染性胃肠炎病毒可为任何常规的猪传染性胃肠炎病毒毒株，优 选为浮羽疫苗株、h-5疫苗株或华毒株。其中，所述的微载体可为本领域常规的任何微载体，常见的有大孔明胶微载体、聚 苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体、磁性 微载体、Cytodexl、Cytodex 2、Cytodex 3、Cytopore 和 / 或 Cytoline,优选为 Cytodexl、 Cytodex 2、Cytodex 3、Cytopore 和 / 或 Cytoline。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果(1)用生物反应器微载体细胞培养技术代替转瓶细胞培养技术制造猪传染性胃肠 炎病毒疫苗，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低的问题，通过生产技术和生 产工艺的改变，提高病毒单位培养效价5-10倍，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安 全性。以vero细胞为例，国内先进水平的生物反应器生产可达10VmL，而转瓶生产一般106/ mL已经为极限。(2)本发明可以大量降低生产成本，而且生产周期短，每个生产周期仅需5-6天， 相比现有转瓶细胞培养法的6-7天以上明显缩短。(3)低污染1罐=100 2000个转瓶，概率来讲操作环节越少污染几率越低。(4)生产工艺可控高精密培养、实时监测溶氧、产气、PH、细胞状态等等，综合参 数设定培养曲线、直接保证载体细胞的状态；批量大、批间差小；节省空间、人员(最高可达 1 : 75);一旦成型工艺将按部就班十分稳定。
图1为本发明利用生物反应器生产猪传染性胃肠炎病毒的方法流程图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1(1)选择生物反应器作为培养的手段7L瑞士 Lambda生物反应器。(2)选择微载体作为细胞贴附生长的载体微载体Cytodex 2。(3)微载体的清洗、灭菌方法1)称量Cytodex 2微载体lOg/し使用2L PBS液浸 泡3小时。2~)每次用2し？85液清洗3遍。幻加入2し？85液浸泡微载体，121で蒸汽灭菌 30mino(4)选择ST细胞作为制苗用细胞。(5)制苗用细胞的传代与培养上述细胞经601ム_胰酶(*0.25^^*_、0.02% EDTA的Hank，S液)消化传代，以含95% MEM液、5%小牛血清、200贝/^し的青霉素钠和硫 酸链霉素…！！值调整为7. 2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C。形成良好单层时，用 于接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。(6)细胞毒种的繁殖用病毒培养液(含小牛血清2%的1^1液、终浓度为200贝/ mL的青霉素钠和硫酸链霉素，将猪传染性胃肠炎病毒华毒株的种毒按体积比2%比例接种 生长良好的上述细胞单层，继续培养，培养温度为35°C。至细胞80%以上病变时收获病毒 液；测定病毒的几105(|，待病毒效价稳定且达到107TCID5(l/mL以上时停止复壮，将该病毒作 为生产用种毒。(7) ST在生物反应器中的微载体悬浮培养取方瓶上生长良好的ST細胞，用pH值 为7. 2的？85清洗ー遍，加入前述的EDTA-胰酶消化液消化，待细胞层开始出现整片脱落， 加入所述的细胞生长液，吹悬制成细胞悬浮液，细胞计数密度按2 X 10VmL接种反应器中。 生物反应器设定如下參数温度37°C、pH值7. 2、搅拌速度60印!^、溶氧含量50%进行反应器 自动控制培养。(8)制苗毒液的繁殖培养后第三日待观察微载体上细胞基本长满(95%以上)， 且细胞计数结果达もズ川ツ！^以上后，按体积比为？^接种病毒。设定温度34で、？11值6.8、 搅拌速度70印1^、溶氧含量30%等培养參数，进行反应器自动控制培养。接毒后每隔ー定时 间取反应器中微载体，用显微镜观察细胞病变情况，并检测样品的TCID5tlt5待观察微载体上 细胞基本全部脱落(约36h)，且00值明显上升趋势，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反 应器底部后，分别收获上清液和微载体。收获病毒液的处理收获上清经3次反复冻融后，过滤去除细胞碎片后_20で冷冻 保存备用。实施例2(1)选择生物反应器作为培养的手段7L瑞士 Lambda生物反应器。(2)选择微载体作为细胞贴附生长的载体微载体Cytodex 3。(3)微载体的清洗、灭菌方法1)称量Cytodex 3微载体eg/し使用2L PBS液浸 泡3小时。2~)每次用2L PBS液清洗3遍。幻加入2LPBS液浸泡微载体，121で蒸汽灭菌 30mino(4)选择vero细胞作为制苗用细胞。(5)制苗用细胞的传代与培养上述细胞经601ム_胰酶(*0.25^^*_、0.02% EDTA的Hank，S液)消化传代，以含96% MEM液、4%小牛血清、200贝/^し的青霉素钠和硫酸链霉素，pH值调整为7. 2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C。形成良好单层时，用 于接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养。(6)细胞毒种的繁殖用病毒培养液(含小牛血清1%的MEM液、终浓度为100IU 的青霉素钠和硫酸链霉素，pH值调整为7. 3),将猪传染性胃肠炎病毒华毒株的种毒按体积 比为5%比例接种生长良好的上述细胞单层，继续培养，培养温度为35°C。至细胞80%以上 病变时收获病毒液；测定病毒的TCID5(I，待病毒效价稳定且达到107TCID5(l/mL以上时停止复 壮，将该病毒作为生产用种毒。(7)vero细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养取方瓶上生长良好的vero细 胞，用pH值为7. 2的PBS清洗一遍，加入前述的EDTA-胰酶消化液消化，待细胞层开始出现 整片脱落，加入所述的细胞生长液，吹悬制成细胞悬浮液，细胞计数密度按1 X 105/mL接种 反应器中。生物反应器设定如下参数温度37°C、pH值7. 2、搅拌速度60rpm、溶氧含量50% 进行反应器自动控制培养。(8)制苗毒液的繁殖培养后第三日待观察微载体上细胞基本长满(95%以上)， 且细胞计数结果达5X106/mL以上后，按体积比为2%进行病毒接种。设定温度38°C、pH值 7. 5、搅拌速度50rpm、溶氧含量50%等培养参数，进行反应器自动控制培养。两天后收获病 毒液。收获病毒液的处理收获上清经3次反复冻融后，过滤去除细胞碎片后-20°C冷冻保 存备用。对比例1转瓶培养猪传染性胃肠炎病毒(1)选择转瓶作为培养的手段3L细胞培养转瓶，ZP-01-16转瓶机。(2)选择vero细胞作为制苗用细胞。(3)制苗用细胞的传代与培养上述细胞经EDTA-胰酶(含0. 25 %胰酶、0. 02 % EDTA的Hank’ S液)消化传代，以含95% MEM液、5%小牛血清、200IU/mL的青霉素钠和硫 酸链霉素，pH值调整为7. 2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C。形成良好单层时，用 于接种于转瓶培养。(4)细胞毒种的繁殖用病毒培养液(含血清1%的MEM液、终浓度为200IU的青 霉素钠和硫酸链霉素，pH值调整为7. 3),将猪传染性胃肠炎病毒华毒株的种毒按体积比为 5%比例接种生长良好的上述细胞单层，继续培养，培养温度为35°C。至细胞80%以上病变 时收获病毒液；测定病毒的TCID5(I，待病毒效价稳定且达到107TCID5(l/mL以上时停止复壮， 将该病毒作为生产用种毒。(5) vero细胞在转瓶中的培养取方瓶上生长良好的vero细胞用pH值为7. 2的 PBS清洗一遍，加入所述的EDTA-胰酶消化液消化，待细胞层开始出现整片脱落，加入所述 的细胞生长液，吹悬制成细胞悬浮液，细胞计数密度按3 X 105/mL接种3000mL转瓶，转瓶培 养量为300mL，37°C，20rpm/h,培养至细胞长成单层。(6)制苗毒液的繁殖培养后第三日待观察，转瓶壁上细胞基本长满(95%以上)， 且细胞计数结果达5X 106/mL以上后进行病毒接种。按体积比为2%的接种量接种病毒，4 天后收获病毒上清液。收获病毒液的处理收获上清经3次反复冻融后，过滤去除细胞碎片 后-20°C冷冻保存备用。试验例1半成品检验1.收获病毒液毒价的测定将以上收获的细胞病毒液混合后取样，测定毒价。
结果表明，实施例I和2用生物反应器生产的病毒的病毒含量彡107TCID5(l/mL,而对比例I转瓶培养生产的病毒含量< 106TCID5(l/mL。2.灭活后半成品检验灭活按总量的O. 2%向实施例I 2和对比例I的病毒液中加入甲醛溶液，振摇2分钟，置37°C条件灭活24小时，期间定时搅拌混匀。无菌检验按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页进行，本发明实施例和对比例的病毒均无菌生长。灭活检验灭活后，以无菌操作从病毒灭活液中取样，按I %比例接种健康ST细胞单层，37°C培养3天，按此方法，连续传代3代，细胞不应出现病变为合格，本发明实施例和对比例均无病变，故产品合格。3.生物反应器培养病毒与转瓶培养病毒免疫效果的比较各取200 μ L效价为I X 106/mL的病毒免疫无TGEV中和抗体的仔猪各二十头，以200 μ L病毒培养液作为空白对照，结果生物反应器培养病毒免疫组的中和抗体效价比转瓶培养的高4倍，结果如下表。表I生物反应器培养病毒与转瓶培养病毒免疫效果的比较
权利要求
1.一种利用生物反应器生产猪传染性胃肠炎病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤 1)制备单层传代细胞； 2)制备猪传染性胃肠炎病毒生产用种毒； 3)将步骤I)制备的单层传代细胞消化后，用细胞生长液进行悬浮，制备成细胞密度为1-3 X IO5个/mL的细胞悬液，接种到生物反应器内，使传代细胞在生物反应器中的微载体上吸附培养； 4)当传代细胞长至微载体的80%-90%，空球率低于5%，满球率大于80%，细胞计数达到3-5X106个/mL以上时，以2-5%的接种量接种步骤2)制备的种毒，进行病毒的吸附培养； 4)当微载体上的传代细胞80%以上病变时，收获病毒液。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括在步骤3)细胞悬液接种到生物反应器之前，按生物反应器总体积的50-70%加入无菌细胞生长液，且每升无菌细胞生长液中按4-10g/L浓度加入微载体，启动生物反应器，低转速搅拌20-50分钟。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，还包括将微载体加入到细胞生长液之前将微载体进行清洗和灭菌的步骤，依次为用PBS浸泡微载体3小时以上；用PBS清洗微载体3-5遍；用PBS浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌20-50min。
4.根据权利要求I 3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)猪传染性胃肠炎病毒生产用种毒的制备具体包括如下步骤 用病毒培养液将猪传染性胃肠炎病毒种毒按2-5%比例接种到单层传代细胞中进行培养，至细胞80%以上病变时收获病毒液；再将此病毒液作为种毒，在细胞上进行细胞适应性连续传代复壮，每次传代产物进行病毒TCID5tl和无菌检测，传至病毒TCID5tl稳定且达到107TCID50/mL以上时停止复壮，作为生产用种毒。
5.根据权利要求I 3任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中的单层传代细胞用EDTA-胰酶消化液进行消化，所述的EDTA-胰酶消化液为含有质量体积分数为0.05% -0. 25%的胰酶和 0. 02%的 EDTA 的 Hank’ S 液。
6.根据权利要求I 3任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中所述的细胞生长液的配方为质量分数为95% -98% MEM液、2% _5%牛血清、终浓度为100_200IU/mL的抗菌素，pH 值为 6. 8-7.5。
7.根据权利要求I 3任一项所述的方法，其特征在于，所述的传代细胞为ST细胞或vero细胞。
8.根据权利要求I 3任一项所述的方法，其特征在于，生物反应器设定的参数为培养温度 35-38°C、pH 值 6. 8-7. 5、溶氧 50% -70%、搅拌速度 50_80rpm。
9.根据权利要求I 3任一项所述的方法，其特征在于，所述的猪传染性胃肠炎病毒为浮羽疫苗株、h-5疫苗株或华毒株。
10.根据权利要求I 3任一项所述的方法，其特征在于，所述的微载体为大孔明胶微载体、聚苯乙烯微载体、PHEMA微载体、甲壳质微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体、磁性微载体、CytodexK Cytodex 2、Cytodex 3, Cytopore 和 / 或 Cytoline0
全文摘要
本发明提供一种利用生物反应器生产猪传染性胃肠炎病毒的方法，包括如下步骤1)制备单层传代细胞；2)制备猪传染性胃肠炎病毒生产用种毒；3)将步骤1)制备的单层传代细胞制备成细胞悬液，接种到生物反应器内，使传代细胞在生物反应器中的微载体上吸附培养；4)当传代细胞长至微载体的80％-90％，空球率低于5％，满球率大于80％，细胞计数达到3-5×106个/mL以上时，以2-5％的接种量接种步骤2)制备的种毒，进行病毒的吸附培养；4)当微载体上的传代细胞80％以上病变时，收获病毒液。本发明方法可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低的问题，可提高病毒单位培养效价5-10倍，全面提升疫苗质量和产量，提高疫苗的安全性。
文档编号C12R1/93GK102660510SQ20121014145
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者于萍萍, 侯艳红, 王贵华 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 福州大北农生物技术有限公司