专利名称：一种检测转基因玉米的方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测转基因玉米的方法及其专用试剂盒。
背景技术：
基因工程技术的诞生使转基因产品逐渐走上人们的餐桌，丰富了人们的物质生活。为确保转基因产品及相关产品的生物安全性，尽量减少其潜在的生物损害性，急需建立转基因产品标签制度。核酸具有更高的稳定性，同时基于核酸的检测方法与技术具有更高的灵敏度等优点，所以基于核酸的检测方法已经成为转基因产品及相关产品的主要检测方法。现有的基于核酸的转基因产品及相关产品检测方法主要为针对外源目的基因的核酸检测技术，大致分三类一是分子杂交技术(Southern blot) ;二是基于PCR扩增的方法；三是基因芯片技术。由于分子杂交技术没有使用序列扩增与放大过程，相对于基于PCR扩增的检测技术，其灵敏度较低。基因芯片技术因受制于昂贵的检测设备以及大规模的信息处理与分析能力，目前的应用并不广泛，只有少量的应用实例见诸报道。基于PCR扩增的检测技术是目前最主要的，也是最准确的转基因产品及相关产品检测技术。该类技术主要是依据扩增特异性的外源目的基因片段，常见的转基因PCR检测技术主要有定性PCR检测方法、巢式PCR检测、复合定性PCR检测方法、竞争性定量PCR检测、PCR-ELISA检测以及荧光定量PCR检测方法。品系特异性PCR检测技术检测的是外源载体与宿主基因的连接区基因片段，该片段具有单拷贝特性，所以该技术具有非常高的特异性和准确性，是目前转基因产品及相关产品检测研究的重点。现在需要检测的转基因产品及相关产品越来越多，对当前的检测技术提出了更高的要求，不但要便捷、准确、灵敏，还要有一定量的检测通量。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测η种转外源DNA植物的试剂盒。本发明提供的试剂盒，包括检测探针组和通用引物对；所述转外源DNA植物为将外源DNA分子转入目的植物得到的转基因植物；所述通用引物对由引物I和引物2组成；所述引物I和所述引物2为均不与η种所述转外源DNA植物的基因组和所述目的植物的基因组特异结合的单链DNA分子；所述检测探针组包括η组检测探针对组成，每一组所述检测探针对均由I条检测探针L和其对应的I条检测探针R组成；每一条所述探针L自5’端到3’端依次由所述引物2、长度编码区、限制性内切酶识别位点和与一条检测靶序列特异结合的识别序列组成；每一条所述探针R自5’端到3’端依次由所述引物I和与所述检测靶序列特异结合的识别序列组成；每条所述检测靶序列为每种所述转外源DNA植物的基因组中所述外源DNA与所述目的植物基因组的连接序列。上述引物对也不与所述目的植物的基因组结合。所述引物2的5’末端标记荧光基团；
所述每一组检测探针对特异结合一条所述检测靶序列；所述长度编码区为不与所述转外源DNA植物的基因组特异结合的单链DNA分子；每一条所述检测探针L的长度编码区的大小均不相同；不同的所述外源DNA对应不同的所述检测靶序列；所述限制性内切酶识别位点为StuI识别位点；所述η不小于I; 所述检测探针组和通用引物对均为独立包装。所述试剂盒还包括对照探针对，所述对照探针对由I条对照探针L和I条对照探针R组成；所述对照探针L自5’端到3’端依次由所述引物2、对照长度编码区、限制性内切酶识别位点和与对照靶序列特异结合的识别序列组成；所述对照探针R自5’端到3’端依次由所述引物I和与所述对照靶序列特异结合的识别序列组成；所述对照靶序列为所述目的植物的基因组中保守基因与所述目的植物基因组其他区域连接的序列；所述对照长度编码区为不与所述目的植物的基因组特异结合的单链DNA分子；所述对照探针L的长度编码区与每一条所述检测探针L的大小均不相同。所述长度编码区的大小具体为0_30nt ；所述靶序列和所述对照靶序列均为20_80nt的寡核苷酸；所述对照探针对、检测探针组和通用引物对均为独立包装。上述的试剂盒中，所述对照探针Rl和所述对照探针LI的核苷酸序列分别为序列表中的序列I和序列2 ；所述检测探针组由如下I) -3)的3组探针对组成I)探针L2和探针R2，所述探针R2和所述探针L2的核苷酸序列分别为序列表中的序列3和序列4 ；2)探针L3和探针R3，所述探针R3和所述探针L3的核苷酸序列分别为序列表中的序列5和序列6 ；3)探针L4和探针R4，所述探针R4和所述探针L4的核苷酸序列分别为序列表中的序列7和序列8 ；所述通用引物对中的引物I的核苷酸序列为序列表中的序列9，所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列10 ;所述荧光基团为FAM。所述各引物和各探针之间均不互补。上述的试剂盒中，每条所述检测靶序列可以包括13_28bp的外源DNA和ll_28bp目的植物基因组；所述对照靶序列具体可以包括13_28b的所述保守基因和ll_28b所述目的植物基因组其他区域；上述的试剂盒中，所述η个转外源DNA植物为转基因玉米ΝΚ603、转基因玉米Μ0Ν863、转基因玉米Μ0Ν810 ;所述目的植物为玉米，所述保守基因为zein基因；所述zein基因的核苷酸序列为序列表中的序列15 ；所述转基因玉米NK603的检测靶序列为序列表中的序列12或序列16 ;与所述序列12所示的检测靶序列特异结合的探针对为2)所示的探针对；所述转基因玉米M0N863检测靶序列为序列表中的序列13或序列17 ;与所述序列13所示的检测靶序列特异结合的探针对为3)所示的探针对；所述转基因玉米M0N810检测靶序列为序列表中的序列14或序列18 ;与所述序列14所示的检测祀序列特异结合的探针对为4)所示的探针对；所述对照靶序列为序列表中的序列11 ;与所述序列11所示的对照靶序列特异结合的对照探针对为I)所示的探针对。序列12为序列16中的一部分,且为连接外源基因和基因组DNA的部分；序列13为序列17中的一部分，且为连接外源基因和基因组DNA的部分；序列14为序列18中的一部分,且为连接外源基因和基因组DNA的部分。上述对照靶序列为玉米特异基因zein的部分片段。上述的试剂盒在检测转外源DNA植物中的应用也是本发明保护的范围；在上述应用中，所述转外源DNA植物具体为所述转基因玉米NK603、所述转基因玉米M0N863和/或所述转基因玉米M0N810。本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助待测样本是否为转外源DNA植物的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)先确定转外源DNA植物中的检测靶序列和目的植物中的对照靶序列，再根据所述检测靶序列和所述对照靶序列设计权利要求1-4中任一所述的试剂盒中的所述检测探针组和所述通用引物对；所述转外源DNA植物为将外源DNA分子转入所述目的植物得到的转基因植物；所述检测靶序列为所述转外源DNA植物的基因组中所述外源DNA与所述目的植物基因组连接的序列；所述对照靶序列为所述目的植物的基因组中保守基因与目的植物基因组其他区域连接的序列；2)以所述待测样本的基因组DNA为模板，用所述检测探针组进行扩增，得到扩增产物；3)以所述扩增产物为模板，用所述通用引物对进行再次扩增，得到荧光标记扩增产物；4)用限制性内切酶酶切所述荧光标记扩增产物，得到酶切产物；5)HPLC检测所述酶切产物，根据酶切产物是否含有对应的所述检测靶序列和所述对照靶序列，鉴定待测样本是否为目的转外源DNA植物。上述方法中，步骤I)中，所述η不小于I ;步骤2)中，所述扩增的退火温度为58°C ；步骤3)中，所述再次扩增的退火温度为68°C ；步骤4)中，所述限制性内切酶为StuI ；步骤5)中，鉴定待测样本是否为所述转外源DNA植物为若所述酶切产物中含有所述检测靶序列和所述对照靶序列，则所述待测样本为或候选为所述转外源DNA植物；若所述酶切产物中不含有所述检测靶序列和所述对照靶序列，则所述待测样本不为或候选不为 所述转外源DNA植物。上述方法中，步骤5)中，所述待测植物为η种，所述η不小于I ;所述目的转外源DNA植物为转基因玉米ΝΚ603、转基因玉米Μ0Ν863、转基因玉米M0N810 ;所述目的植物为玉米，所述保守基因为zein基因；所述zein基因的核苷酸序列为序列表中的序列15 ；所述转基因玉米NK603的检测靶序列为序列表中的序列12或序列16 ;与所述序列12所示的检测靶序列特异结合的探针对为2)所示的探针对； 所述转基因玉米M0N863检测靶序列为序列表中的序列13或序列17 ;与所述序列13所示的检测靶序列特异结合的探针对为3)所示的探针对；所述转基因玉米M0N810检测靶序列为序列表中的序列14或序列18 ;与所述序列14所示的检测祀序列特异结合的探针对为4)所示的探针对；所述对照靶序列为序列表中的序列11 ;与所述序列11所示的对照靶序列特异结合的对照探针对为I)所示的探针对。上述方法中，步骤5)中，所述HPLC的流动相为流动相A和流动相B，所述流动相A为pH为7. O、浓度为O. IM醋酸三乙胺水溶液；所述流动相B按照如下方法制备将乙腈溶于所述流动相A中，所述乙腈在所述流动相B中的浓度为25% (体积百分含量)；所述流速为lml/min ；所述序列11所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为19. 2min ；所述序列12所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为21. 4min ；所述序列13所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为23. 3min ；所述序列14所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为25. Omin。上述HPLC的洗脱为25min内流动相B从50%增加到58%，IOmin内流动相B从58%增加到60%。本发明的实验证明，本发明提出了一种基于巢式PCR和生物编码色谱的品系特异性转基因玉米检测方法，该方法依靠巢式PCR反应进行目标基因的特异性识别与扩增，从而产生大量的荧光标记的扩增产物，然后通过限制性内切酶将该扩增产物转化成目标基因特异的编码长度荧光标记核酸片段，最后利用HPLC进行分离检测，该方法克服了常用于转基因产品检测的多重PCR扩增技术中存在的条件优化繁琐、非特异性扩增难以控制、扩增效率差异大、探针设计难、探针合成费用较高以及方法检测灵敏度不够等缺点，实现了对不同目标基因的特异性以及多目标的同时检测，从而实现对目标基因的高灵敏、低成本、简便、重现性好的多目标同时检测。
图I为内引物浓度的优化结果2为针对Tl (ZEIN)玉米植物特异性基因的HPLC荧光峰面积响应3为HPLC检测结果图4为不同目标基因同时扩增情况以及限制性内切酶酶切情况考察结果
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、引物和探针的设计
—、样品的制备品系特异性检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝，所以品系特异性检测方法具有较高的特异性和准确性。转基因植物鉴定方法采用转外源DNA植物的连接区，参考文献许文涛、白卫滨、罗云波、元延芳、黄昆仑，农业生物技术学报，2008，16 (4) :714-722。连接区是指包含连接点以及侧翼序列的一个区域，下述连接区的核苷酸序列和取其部分的靶序列均包括连接点和侧翼序列，只不过连接点两侧的侧翼序列长度不同。转外源DNA植物的连接区为外源DNA与植物基因组的连接区序列，根据该连接区上的部分序列作为靶序列进行设计引物和探针，具体如下
转基因玉米NK603的连接区为外源插入片段NK603的5'端与玉米基因组的连接区序列，该连接区的核苷酸序列为序列表中的序列16 (genbank号的AX342368. 1，EP167531A1， Detection of Genetically Modified Maize M0N810 and NK603 byMultiplex and Real-Time Polymerase Chain Reaction Methods, J. Agric.FoodChem. 2004，52，3264-3268，公众可从清华大学获得转基因玉米NK603。)，选取其中包含部分外源插入基因和部分玉米基因的序列作为靶序列Τ2，T2的核苷酸序列为序列表中的序列12 ；转基因玉米M0N863的连接区为外源插入片段M0N863的5'端与玉米基因组的连接区序列，该连接区的核苷酸序列为序列表中的序列17 (Event Specific Qualitativeand Quantitative Polymerase Chain Reaction Detection of Genetically ModifiedM0N863Maize Based on the 5' -Transgene Integration Sequence,LITAO YANG,SONGCIXU, AIHU PAN, CHANGS0NG YIN, KEffEI ZHANG, ZHENYING WANG, ZHIGANG ZHOU, AND DABINGZHANG, J. Agric.Food Chem. 2005，53，9312-9318,公众可从清华大学获得转基因玉米M0N863。)，选取其中部分序列作为靶序列T3，T3的核苷酸序列为序列表中的序列13 ；转基因玉米M0N810的连接区为外源插入片段M0N810的5 '端与玉米基因组的连接区序列，该连接区的核苷酸序列为序列表中的序列18 (5'-Nuclease PCRfor quantitative event-specific detection of the genetically modifiedMon8IOMaisGard maize, Askild Hoick、Marc Na、Luc Didierjean、Knut Rudi, Eur FoodRes Technol (2002) 214:449 - 453，公众可从清华大学获得转基因玉米M0N810。)，选取其中部分序列作为靶序列T4，T4的核苷酸序列为序列表中的序列14 ；以未转入任何外源基因的玉米(郑单14)作为对照，zein基因为玉米中特异性zein基因，其核苷酸序列为序列表中的序列15，选取该基因与玉米基因组其他区域的连接区的部分片段作为靶序列Tl，Tl的核苷酸序列为序列表中的序列11。分别提取上述玉米、转基因玉米NK603、转基因玉米M0N863、转基因玉米M0N810的基因组DNA，得到DNAl、DNA2、DNA3、DNA4,将4种DNA混合(等体积混合，终浓度均为lfM)，得到混合DNA样品。二、引物和探针的设计I、引物的设计引物对的设计遵循通用引物设计原则，引物I和引物2均不能结合玉米、转基因玉米NK603、转基因玉米M0N863、转基因玉米M0N810的基因组DNA，且引物I和引物2 二者不互补，具体序列如下引物I :5’ -TCCAAACTCATCAATGTATC-3’(序列 9)；引物2 :5’ -FAM-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT-3’(序列 10);引物2的5’末端标记荧光基团FAM。2、探针的设计根据玉米、转基因玉米NK603、转基因玉米M0N863、转基因玉米M0N810的靶序列设计4种探针对如下，每一种探针对均由一个探针L和一个探针R组成每一个探针L的5’端到3’端依次为引物2序列，长度编码区序列(粉红色加粗碱 基)、限制性内切酶识别序列(半个，斜体碱基)和与靶序列特异结合的识别序列I (绿色下划线碱基);下面的探针LI、探针L2、探针L3、探针L4分别能特异结合玉米、转基因玉米NK603、转基因玉米M0N863、转基因玉米M0N810的靶序列；探针LI长度编码区序列长度为Ont，探针L2长度编码区序列长度为10nt，探针L3长度编码区序列长度为20nt，探针L4长度编码区序列长度为30nt。每一个探针R的5’端到3’端依次为引物I序列和与所述靶序列特异结合的识别序列2 (红色下划线碱基);下面的探针LI、探针L2、探针L3、探针L4分别能特异结合玉米、转基因玉米NK603、转基因玉米M0N863、转基因玉米M0N810的靶序列。探针Rl :5，-TCCAAACTCATCAATGTATCGTTGCATCATGCAGTACTGCA-3’(序列I);探针LI : 5，-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT 'AGGCCT TGGGTACCATGAACCCATGCA-3，(序列 2)；探针R2 :5 ’ -TCCAAACTCATCAATGTATCGGGATATCAAGCTTGGTACCACG-3，(序列3)；探针L2 :5，-TCTAAAAGCTGCGGAATTGT 'GTGTCTGTCT/ GGCiTi CTTGTAGCGGCCCACG-3，(序列 4);探针R3 :5’ -TCCAAACTCATCAATGTATCCGGAAAGTTTGGTACACTTTGG-3>(序列7)；探针L3:
TCTAAAAGCTGCGGAATTGT ’GTGTGTGTCrrGTCTGTGTGTdGQ—'( GTTCGGATGGGTGTTCACC-3，(序列 8)；探针R4 :5’ -TCCAAACTCATCAATGTATCAATAAAGTGACAGATAGCTGGGCAA-3> (序列 9)；探针L4:
5’ -TCTAAAAGCTGCGGAATTGT ’GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTJGGCCL ACTCTAACGTTTAACATCCTTTGCCA-3 (序列 10)；Tl (ZEIN)的特异探针为探针LI和探针R1、T2(NK603)的特异探针为探针L2和探针R2、T3(M0N863)的特异探针为探针L3和探针R3、T4 (M0N810)的特异探针为探针L4和探针R4。AGGCCT为StuI限制性内切酶。
实施例2、鉴定转基因玉米鉴定的反应原理在对目标链基因检测的过程中，目标特异性区分探针Probe R和Probe L分别与目标基因的正负链退火杂交。在第二圈PCR退火杂交的过程中，ProbeR可以与Probe L的第一圈PCR扩增产物退火杂交，在聚合延伸的过程中，跨越探针L中的半个限制性内切酶识别序列产生完整的内切酶识别序列。经过几圈的第一阶段PCR扩增产生一定数量的带有通用引物序列的扩增产物，以此扩增产物为模板，通用PCR引物I与荧光标记的通用PCR引物2，在Vent exo-聚合酶和dNTPs存在的情况下进行第二阶段的PCR扩增，从而产生大量的带有荧光标记和内切酶识别序列的扩增产物。在限制性内切酶的作用下，荧光标记的PCR扩增产物从限制性内切酶酶切位点处被水解成两段，其中带有荧光标记的
一段的长度是预先编码的、特定的，通过带有荧光检测器的HPLC分离检测从而实现对目标基因的特异性检测。一、引物和探针浓度的摸索I、低温PCR反应PCR 体系为 50 μ L，其中 50 μ L IXThermopol buffer (IOmM KCl,20mM Tris-HCl,IOmM(NH4)2SO4,和O. I % Trion-X-100, pH8. 8),5 μ L探针对混合溶液(该混合溶液包含探针L1-L4和R1-R4) ；0. 5 μ L Taq DNA聚合酶(购白大连宝生物)，10 μ L IOOfM的DNA(在PCR反应体系的终浓度为IOfM)、I μ L IOmM的dNTPs (A、T、G、C四种碱基在PCR反应体系的终浓度均为200 μ Μ)。对各探针组中的各条探针在PCR反应体系的不同终浓度进行考察探针LI和Rl在PCR反应体系的终浓度均为10ρΜ、20ρΜ、30ρΜ ；探针L2和R2在PCR反应体系的终浓度均为10ρΜ、20ρΜ、30ρΜ ；探针L3和R3在PCR反应体系的终浓度均为ΙΟρΜ、20pM、30pM ；探针L4和R4在PCR反应体系的终浓度均为10pM、20pM、30pM ；上述DNA 分别为 DNAl、DNA2、DNA3、DNA4 ；低温PCR反应程序为95°C变性3min，10个循环95°C变性IOs ;58°C退火30s ；72°C延伸反应15s ;最后72°C延伸4min。得到PCR产物。2、高温扩增分别向由I得到的PCR产物中加入2μ L通用引物I和引物2的混合溶液(在反应体系中的终浓度均为ΙμΜ)，进行第二阶段的高温通用PCR扩增，反应程序为95°C变性3min，30个循环95°C变性IOs ;68°C退火30s ;72°C延伸反应15s，最后72°C延伸7min,4°C避光保存备用，得到荧光标记扩增产物。将荧光标记扩增产物进行检测，结果如图1A)所示，其中A、B、C、D分别代表针对 Tl(88bp)、T2(95bp)、T3 (107bp)、T4 (127bp)的扩增产物，1、2、3 分别代表 10pM、20pM、30pM的探针浓度，可以看出，Tl (ZEIN)的特异探针LI和探针Rl的最佳终浓度均为30pM ；T2 (NK603)的特异探针L2和探针R2的最佳终浓度均为IOpM ；T3 (Μ0Ν863)的特异探针L3和探针R3的最佳终浓度均为30ρΜ ；Τ4(Μ0Ν810)的特异探针L4和探针R4的最佳终浓度均为20ρΜο采用上述方法和体系，以DNA1、DNA2、DNA3、DNA4为模板，用上述优化的探针浓度对不同 Tl (ZEIN)、T2(NK603)、T3(M0N863)、T4(M0N810)进行扩增T1 (ZEIN)的特异探针 LI和探针Rl的最佳终浓度均为30pM ；T2 (ΝΚ603)的特异探针L2和探针R2的最佳终浓度均为IOpM ；Τ3 (ΜΟΝ863)的特异探针L3和探针R3的最佳终浓度均为30ρΜ ；Τ4 (Μ0Ν810)的特异探针L4和探针R4的最佳终浓度均为20ρΜ。结果如图IB 所示，Α、B、C、D 分别代表针对 Tl (ZEIN)、Τ2 (ΝΚ603)、Τ3 (Μ0Ν863)、Τ4 (Μ0Ν810)四个目标基因的实时PCR扩增结果，Α、B、C、D所对应的特异性区分探针对每条探针的终浓度分别均为30ρΜ、10ρΜ、30ρΜ、20ρΜ，可以看出，在以上所选特异性区分探针浓度下，相同浓度的不同的目标基因能够获得数量相当的最终PCR扩增产物，由此确证针对不同目标基因所选的特异性区分探针的浓度是合适的。二、灵敏度检测
按照上述一的方法体系，Tl (ZEIN)的特异探针LI和探针Rl的终浓度均为30ρΜ ；Τ2 (ΝΚ603)的特异探针L2和探针R2的终浓度均为IOpM ；Τ3 (Μ0Ν863)的特异探针L3和探针R3的终浓度均为30ρΜ ；Τ4(Μ0Ν810)的特异探针L4和探针R4的终浓度均为20ρΜ，以0,0. 01fM、0. lfM、lfM、10fM、100fM、lpM、2. 5pM、5pM、IOpM 不同终浓度的 DNAl 为模板进行Tl (ZEIN)扩增。结果如图2所示，可以看到，随着DNAl浓度的逐渐增加，所获得的荧光峰面积逐渐增大。目标链的浓度范围跨越了大约5个数量级，从O. IfM到ΙΟρΜ，所获得的荧光峰面积与目标链浓度对数在O. IfM到IpM浓度范围内成准线性关系，检测下限为O. OlfM。三、鉴定转基因玉米I、低温PCR反应PCR 体系为 50yL，其中 50 μ L IXThermopol buffer (IOmM KCl, 20mMTris-HCl, IOmM(NH4)2SO4,和 0. l%Trion-X-100, pH 8. 8)、含有 5 μ L 目标特异性区分探针对混合溶液(探针LI到L4以及Rl到R4，其中LI和Rl的终浓度均为30pM，L2和R2的终浓度均为ΙΟρΜ，L3和R3的终浓度均为30pM，L4和R4的终浓度均为20pM) ;0. 5 μ L Taq DNA聚合酶(大连宝生物)，10 μ L模板、I μ L IOmM的dNTPs (A、T、G、C四种碱基的终浓度均为200 μ Μ),用水补足体积。低温PCR反应程序为95°C变性3min，10个循环95°C变性IOs ;58°C退火30s ；72°C延伸反应15s ;最后72°C延伸4min。上述模板分别为由实施例I的一单独的DNAl、DNA2、DNA3、DNA4和混合DNA样本。得到PCR产物。2、高温扩增向由I得到的PCR产物中加入2 μ L通用引物I和引物2的混合溶液(终浓度均为I μ Μ)，进行第二阶段的高温通用PCR扩增，反应程序为95°C变性3min，30个循环95°C变性IOs ;68°C退火30s ;72°C延伸反应15s，最后72°C延伸7min，4°C避光保存备用，得到荧光标记扩增产物。3、限制性内切酶反应取26 μ L上述2的反应液(荧光标记扩增产物)，添加I μ L StuI限制性内切酶，3μ L 10ΧΝΕΒ buffer 2 (500mM NaCl, IOOmM Tris-HCl, IOOmM MgCl2, and IOmM DTT, pH
7.9)，混匀，于37V反应2h，然后65°C加热20min进行StuI限制性内切酶的灭活处理，然后4°C避光保存备用，得到酶切产物，即为待测反应混合溶液。3) HPLC 检测取10 μ L的待测反应混合溶液注入LC-20AT高效液相色谱仪(Shimadzu，Japan)中进行分析。色谱条件为分离色谱柱为Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, 150 X 4. 6mm),保护柱为 Shim-pack VP-ODS (4. 6 μ m, I X 4. 6mm)，柱温为 40°C，流速为 lml/min。流动相 A 为 0. IM醋酸三乙胺水溶液(TEAA)，pH 7. O ;流动相B为O. IM含25%乙腈的TEAA, pH 7. O。线性洗脱梯度为25min内流动相B从50%增加到58%，IOmin内流动相B从58%增加到60%。检测器为RF-IOAxl突光检测器(Shimadzu, Japan),最大激发光波长设定为492nm,最大发射光波长设定为520nm。结果如图3所示，a、b、c、d分别为单独的DNA1、DNA2、DNA3、DNA4的检测结果；Mix为混合DNA (均为IfM)检测结果；·可以看出，混合的和单独的能找到对应的峰DNAl的样本的靶序列的对应峰保留时间为19. 2min ；DNA2的样本的靶序列的对应峰保留时间为21. 4min ；DNA3的样本的靶序列的对应峰保留时间为23. 3min ；DNA4的样本的靶序列的对应峰保留时间为25. Omin ；说明该方法可以同时检测多种转基因玉米或者单独检测一种转基因玉米。将上述保留时间对应的峰送去测序，结果为DNAl的样本靶序列的核苷酸序列为序列表中的序列11、DNA2的样本靶序列的核苷酸序列为序列表中的序列12、DNA3的样本靶序列的核苷酸序列为序列表中的序列13、DNA4的样本靶序列的核苷酸序列为序列表中的序列14，进一步说明上述鉴定出3种转基因玉米均转入对应的外源基因，其中DNAl的靶序列作为鉴定是否为玉米或者反应体系是否正确的对照。将上述各种酶切产物经凝胶电泳显色(依靠的是通用引物2自身标记的FAM荧光基团，因FAM荧光基团的最大激发波长为492nm，凝胶成像系统的最大激发波长为300nm，所以所有条带亮度显得较暗)，结果如图4所示，A、B、C、D分别代表Tl (ZEIN)、T2 (NK603)、T3 (M0N863), T4 (M0N810) DNA的扩增产物出代表四个DNA同时扩增产物；a、b、c、d、e分别代A、B、C、D、E五种扩增产物的酶切结果，可以看出A、B、C、D分别得到88bp、95bp、107bp、127bp的片段，E得到前面所有的目的片段;a、b、c、d得到23bp，33bp，43bp，53bp的片段，与预先编码好的特定长度片段23bp，33bp，43bp，53bp大小符合，e得到前面所有的预先编码好的特定长度片段。上述电泳结合酶切结果是由于该PCR扩增产物在特定位置包含有限制性内切酶的酶切位点，经过限制性内切酶的消化处理，该PCR产物被水解成两段，其中一段是预先编码设计好的，长度是特定的，且带有荧光标记；剩余的另一段是随意的，没有荧光基团标记，故在此实验中看不到。因此，该图再次证明本实验的多重通用PCR扩增反应的可行性。综上所述，说明本专利所建立的品系特异性转基因玉米多目标同时检测方法的是可行的。
权利要求
1.一种用于检测n种转外源DNA植物的试剂盒，包括检测探针组和通用引物对；所述转外源DNA植物为将外源DNA分子转入目的植物得到的转基因植物； 所述通用引物对由引物I和引物2组成；所述引物I和所述引物2为均不与n种所述转外源DNA植物的基因组和所述目的植物的基因组特异结合的单链DNA分子； 所述检测探针组包括n组检测探针对组成，每一组所述检测探针对均由I条检测探针L和其对应的I条检测探针R组成；每一条所述探针L自5’端到3’端依次由所述引物2、长度编码区、限制性内切酶识别位点和与一条检测靶序列特异结合的识别序列组成；每一条所述探针R自5’端到3’端依次由所述引物I和与所述检测靶序列特异结合的识别序列组成；每条所述检测靶序列为每种所述转外源DNA植物的基因组中所述外源DNA与所述目的植物基因组的连接序列。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于 所述引物2的5’末端标记突光基团； 所述每一组检测探针对特异结合一条所述检测靶序列； 所述长度编码区为不与所述转外源DNA植物的基因组特异结合的单链DNA分子； 每一条所述检测探针L的长度编码区的大小均不相同； 不同的所述外源DNA对应不同的所述检测靶序列； 所述限制性内切酶识别位点为StuI识别位点； 所述n不小于I ; 所述检测探针组和通用弓I物对均为独立包装。
3.根据权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于 所述试剂盒还包括对照探针对，所述对照探针对由I条对照探针L和I条对照探针R组成；所述对照探针L自5’端到3’端依次由所述引物2、对照长度编码区、限制性内切酶识别位点和与对照靶序列特异结合的识别序列组成；所述对照探针R自5’端到3’端依次由所述引物I和与所述对照靶序列特异结合的识别序列组成；所述对照靶序列为所述目的植物的基因组中保守基因与所述目的植物基因组中的其他区域连接的序列； 所述对照长度编码区为不与所述目的植物的基因组特异结合的单链DNA分子； 所述对照探针L的长度编码区与每一条所述检测探针L的大小均不相同。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于 所述对照探针Rl和所述对照探针LI的核苷酸序列分别为序列表中的序列I和序列2 ； 所述检测探针组由如下I) -3)的3组探针对组成 1)探针L2和探针R2，所述探针R2和所述探针L2的核苷酸序列分别为序列表中的序列3和序列4 ； 2)探针L3和探针R3，所述探针R3和所述探针L3的核苷酸序列分别为序列表中的序列5和序列6 ； 3)探针L4和探针R4，所述探针R4和所述探针L4的核苷酸序列分别为序列表中的序列7和序列8 ； 所述通用弓I物对中的引物I的核苷酸序列为序列表中的序列9，所述引物2的核苷酸序列为序列表中的序列10 ;所述荧光基团为FAM。
5.根据权利要求1-4所述的试剂盒，其特征在于所述n个转外源DNA植物为转基因玉米NK603、转基因玉米M0N863、转基因玉米M0N810 ;所述目的植物为玉米，所述保守基因为zein基因；所述zein基因的核苷酸序列为序列表中的序列15 ； 所述转基因玉米NK603的检测靶序列为序列表中的序列12或序列16 ;与所述序列12所示的检测祀序列特异结合的探针对为2)所示的探针对； 所述转基因玉米M0N863检测靶序列为序列表中的序列13或序列17 ;与所述序列13所示的检测靶序列特异结合的探针对为3)所示的探针对； 所述转基因玉米M0N810检测靶序列为序列表中的序列14或序列18 ;与所述序列14所示的检测祀序列特异结合的探针对为4)所示的探针对； 所述对照靶序列为序列表中的序列11 ;与所述序列11所示的对照靶序列特异结合的对照探针对为I)所示的探针对。
6.权利要求1-5中任一所述的试剂盒在检测转外源DNA植物中的应用；所述转外源DNA植物具体为所述转基因玉米NK603、所述转基因玉米M0N863和/或所述转基因玉米M0N810。
7.—种检测或辅助检测待测样本是否为转外源DNA植物的方法，包括如下步骤 1)先确定转外源DNA植物中的检测靶序列和目的植物中的对照靶序列，再根据所述检测靶序列和所述对照靶序列设计权利要求1-5中任一所述的试剂盒中的所述检测探针组和所述通用引物对； 所述转外源DNA植物为将外源DNA分子转入所述目的植物得到的转基因植物； 所述检测靶序列为所述转外源DNA植物的基因组中所述外源DNA与所述目的植物基因组连接的序列；所述对照靶序列为所述目的植物的基因组中保守基因与目的植物基因组其他区域连接的序列； 2)以所述待测样本的基因组DNA为模板，用所述检测探针组进行扩增，得到扩增产物； 3)以所述扩增产物为模板，用所述通用引物对进行再次扩增，得到荧光标记扩增产物； 4)用限制性内切酶酶切所述荧光标记扩增产物，得到酶切产物； 5)HPLC检测所述酶切产物，根据酶切产物是否含有对应的所述检测靶序列和所述对照靶序列，鉴定待测样本是否为目的转外源DNA植物。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述n不小于I; 步骤2)中，所述扩增的退火温度为58°C ； 步骤3)中，所述再次扩增的退火温度为68°C ； 步骤4)中，所述限制性内切酶为StuI ； 步骤5)中，鉴定待测样本是否为所述转外源DNA植物为若所述酶切产物中含有所述检测靶序列和所述对照靶序列，则所述待测样本为或候选为所述转外源DNA植物；若所述酶切产物中不含有所述检测靶序列和所述对照靶序列，则所述待测样本不为或候选不为所述转外源DNA植物。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于 步骤5)中，所述待测植物为n种，所述n不小于I ;所述目的转外源DNA植物为转基因玉米NK603、转基因玉米M0N863、转基因玉米M0N810 ;所述目的植物为玉米，所述保守基因为zein基因；所述zein基因的核苷酸序列为序列表中的序列15 ； 所述转基因玉米NK603的检测靶序列为序列表中的序列12或序列16 ;与所述序列12所示的检测祀序列特异结合的探针对为2)所示的探针对； 所述转基因玉米M0N863检测靶序列为序列表中的序列13或序列17 ;与所述序列13所示的检测靶序列特异结合的探针对为3)所示的探针对； 所述转基因玉米M0N810检测靶序列为序列表中的序列14或序列18 ;与所述序列14所示的检测祀序列特异结合的探针对为4)所示的探针对； 所述对照靶序列为序列表中的序列11 ;与所述序列11所示的对照靶序列特异结合的对照探针对为I)所示的探针对。
10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于 步骤5)中，所述HPLC的流动相为流动相A和流动相B，所述流动相A为pH为7. O、浓度为0. IM醋酸三乙胺水溶液；所述流动相B按照如下方法制备将乙腈溶于所述流动相A中，所述乙腈在所述流动相B中的浓度为25% (体积百分含量)； 所述流速为lml/min ； 所述序列11所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为19. 2min ； 所述序列12所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为21. 4min ； 所述序列13所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为23. 3min ； 所述序列14所示的检测靶序列对应的峰的保留时间为25. Omin。
全文摘要
本发明公开了一种检测转基因玉米的方法及其专用试剂盒，本发明提供的试剂盒，包括对照探针对、检测探针组和通用引物对；所述转外源DNA植物为将外源DNA分子转入目的植物得到的转基因植物；所述通用引物对由引物1和引物2组成；所述引物1和所述引物2为均不与n种所述转外源DNA植物的基因组和所述目的植物的基因组特异结合的单链DNA分子。本发明的实验证明，本发明的方法灵敏度高、成本低廉、容易设计、操作便捷、重现性好、实现了多目标转基因样品的同时检测。
文档编号C12Q1/68GK102676671SQ20121014101
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月8日 优先权日2012年5月8日
发明者刘洋, 李景虹, 王红旗 申请人:清华大学