专利名称：一种猪传染性胃肠炎病毒毒株的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物病毒领域，涉及病毒新毒种，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒毒株及其生物学特性。
背景技术：
2012年I月，郑州市新郑市某猪场猪群10头7日龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水。采集发病猪的肠道、淋巴结，置于冰盒中并在24h内送至实验室。研磨病料，12000 r/min,离心10 min,过滤上清,接种ST细胞，结果分离到一株疑似猪传染性胃肠炎病毒，经分子水平鉴定后确定其为HN-2012猪传染性胃肠炎病毒。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪传染性胃肠炎病毒毒株，分类命名猪传染性胃肠炎病毒 TGEN HN-2012,拉丁文学名swine transmissible gastroenteritis virus,保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称CCTCC，保藏单位地址湖北省武汉市武昌区珞珈山路16号武汉大学，保藏日期2012年4月13日，保藏编号CCTCC NO :V201216。本发明的技术方案是一种猪传染性胃肠炎病毒毒株，猪传染性胃肠炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus), CCTCC NO :V201216o所述的猪传染性胃肠炎病毒毒株具有下述特点
(I)所述毒株在电镜下显示呈圆形，有的呈椭圆形或多边形。有双层膜，囊膜上覆有花瓣状纤突。病毒粒子的直径为90 200 nm，符合猪传染性胃肠炎病毒粒子的形态特征。
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(2)分离的病毒能够感染ST细胞，出现典型的病变。(3)经猪传染性胃肠炎病毒阳性血清中和后不能引起细胞病变。(4)所述毒株对乙醚、氯仿和酸敏感；日光下6 h、紫外线照射均能使其灭活；不凝集鸡、豚鼠和小鼠的红细胞。(5)病毒的 TCID5tl 为 I(T7 67A). 2mL。(6)所述毒株的核酸类型是单股RNA病毒。(7)利用TGEV N基因的特异性引物对所述毒株进行PCR扩增并克隆测序，在NCBI上进行blast结果显示其为TGEV的N基因序列。(S)TGEV N基因全场1171bp，编码382个氨基酸，同源性结果分析显示，所述毒株与美国强毒株代表DQ811785同源性最高，为99. 5%。进化树结果分析显示，所述毒株与韩国AF302264毒株是一大分支。HN-2012猪传染性胃肠炎病毒毒株可应用于制备TGEV疫苗的生产毒种。本发明的有益效果是本发明的HN-2012猪传染性胃肠炎病毒灭活后免疫猪只，可以给猪提供有效的保护，是一株比较理想的制苗候选毒株。
图1为TGEV N基因的测序结果，M =Marker 2000 ；1 =TGEV阳性对照；2 :分离样品；3 :阴性对照；
图2为TGEV N基因同源性分析；
图3为TGEV N基因进化树分析。
具体实施例方式2012年I月，郑州市新郑市某猪场猪群10头7日龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水。其发病表现与国内报道的其他地区发病的猪传染性胃肠炎症状大致相似，初步判断为猪传染性胃肠炎。采集发病猪的肠道、淋巴结，置于冰盒中并在24 h内送至实验室。研磨病料，12000r/min,离心10 min,过滤上清,接种ST细胞,结果分离到一株疑似传染性胃肠炎病毒,用特异性引物进行分子鉴定后确定其为猪传染性胃肠炎病毒。
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该病毒能够感·染ST细胞，造成细胞拉网脱落等病变。对所述毒株进行N基因的PCR扩增并克隆测序，NCBI上BLAST得出其为猪传染性胃肠炎病毒。本发明中，毒株定名为TGEV HN-2012。1、流行病学调查2012年I月，郑州市新郑市某猪场猪群10头7日龄猪只先后发病，其中一头小猪在发病两天后死亡，发病猪临床症状为呕吐、严重腹泻、脱水。并且具有传染性，其发病表现与国内报道的其他地区发病的猪传染性胃肠炎症状大致相似，初步判断为猪传染性胃肠炎。采集发病猪的肠道、淋巴结，置于冰盒中并在24 h内送至实验室。2、病毒分离采集病死猪的空肠及肠系膜淋巴结，用缓冲盐水或含0.5%乳白蛋白水解物的D-HankJ S液制成1:5 1:10悬液，加入青霉素和链霉素各1000 u/ml或1000ug/ml,超声波出来后,2000 r/min离心沉淀20 min,吸取上清液用滤膜(孔径0. 2 um)过滤，滤液即为接种材料。接种细胞为猪睾丸细胞(ST细胞)。结果表明最初几代无细胞病变(CPE)，盲传至5-6代后出现典型的CPE，表现为细胞聚集、变圆，皱缩，细胞呈拉网状，最后出现空泡病变。3、病毒PCR鉴定根据GenBank数据库中已有的猪传染性胃肠炎病毒的N基因核苷酸序列，用Clustal、DNAstar等生物软件进行同源性分析后，选出较为保守的核苷酸区域，应用Primer 5. 0设计N基因的特异性引物。参照GENEray高纯总RNA快速提取试剂盒的说明书进行，具体操作步骤如下取新鲜的病毒样品400 U L加入装有400 V- L Trizol的1. 5 mL RNase-free离心管中混合均匀，剧烈震荡直到液体清亮；加入100 u L氯仿/异戊醇,剧烈震荡混匀30 s ;台式离心机上12000 r/min,离心5 min ;将上清液小心转到无菌1. 5 mL RNase-free离心管里,加入150 u L无水乙醇，混匀(此处可能会出现絮状沉淀物);将上述溶液(包括沉淀)转移到套放于2 mL收集管内的GenClean柱中，室温放置2 min, 12000 r/min离心I min ;小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，加入450 UL RPE Solution, 12000 r/min,室温离心30 s ;重复上一步骤一次；小心取出柱子，弃去收集管中的废液，将柱子放回收集管中，10000 r/min,室温离心30 s ;小心取出柱子,放入无菌RNase-free的1. 5 mL离心管里，在柱内膜的中央小心加入40 uL DEPC-H2O, 55 58 °C放置2 min (室温放置产率约低20%左右)；12000 r/min，室温离心I min。收集管内的溶液为RNA样品，可立即使用或者-70°C保存。反转录过程，根据Fermentas 公司的 RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit试剂盒说明书进行，具体步骤是取11 uL DEPC处理水溶液中的RNA;oligo (dT)18primer I iiL,70°C水浴 10 min,快速放置冰上 5 min ;按顺序加入 5XReaction buffer 4U L, RiboLock RNase Inhibitor I u L, 10 mM dNTP Mix 2 u L,瞬时离心后，放入 42°C水浴 2min ;快速加入 I u L RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase,总体积 20 uL,瞬时离心后继续放入42 °C水浴60 min, 70 °C水浴15 min,即为反转录的cDNA,可立即使用或者-70°C保存。PCR反应体系
cDNA2 UL
Premix EX Taq12. 5 U L
上游引物PlI UL
上游引物P2I UL
ddH208. 5 u L
Total Volume25 u L
PCR反应条件依次加入表中各成分，混匀离心，PCR扩增程序为95 °C预变性5 min,94 °C变性30 s，53 °C退 火30 s，延伸72 °C I min，运行30个循环后于72 °C延伸10 min。反结束后取PCR产物5 y L，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果如图1所示。图1为TGEV的结构蛋白N基因的PCR扩增结果，图中M泳道为DNA ladder marker 2000 (2000, 1000,750，500，250, 100);泳道2为目的基因PCR扩增结果，片段大约都在1171bp，阳性毒株和分尚毒株均在1171bp出扩出条带，与预期大小相符。4、生物学特性研究
4.1 TGEV红细胞凝性的测定
用新鲜制备的鸡、豚鼠、小鼠等动物的I %红细胞悬液与新鲜收获的病毒液做HA试验，结果显示所述毒株对上面几种动物的红细胞均无凝集性。4. 2脂溶剂敏感性试验
4.2.1对乙醚的敏感试验
将病毒液加入两个灭菌小管中，I mL/管，于其中I管内加入乙醚0. 2 mL至终浓度为200 mL/L，另一管加灭菌生理盐水作阴性对照，斡旋振荡10 min, 4 °C作用24 h。加入乙醚的小管，可分为清晰的两层。吸取下层病毒液，移入另一小管内，使残余乙醚全部挥发。然后分别取上述两份病毒液测定TCID5tl,如经过乙醚处理的病毒液和对照组的病毒液血凝价相差2个滴度以上，则判为病毒对乙醚敏感。4. 2. 2对氯仿的敏感试验
将新鲜病毒液加入两个灭菌小管中，I mL/管，加入终浓度为48 mL/0.2分析纯氯仿混合振荡，置于4 V作用10 min。另一组用灭菌生理盐水代替氯仿作阴性对照，每个处理样品测定TCID5tl,氯仿处理过的病毒液滴度比对照管病毒液滴度下降2个滴度以上，则判为病毒对氯仿敏感。
4. 2. 3对酸(PH 2. 0)的敏感性试验
取2只经高压灭菌的离心管，在超净台内分别加入3 mL的新鲜病毒液，一组用0.1mol/L的盐酸调PH至2.0，于37°C水浴中作用I h，随后用500 r/min的速度离心5 min，然后吸取上层液体测定病毒TCID5tlt5另一组加入和盐酸用量相等的灭菌生理盐水室温用作为对照，同样处理后测定TCID5Q。试验管和对照管相差2个滴度以上者判为敏感。理化特性试验表明所述毒株经过氯仿、乙醚和酸处理后，不能再感染细胞，判断其对脂溶剂敏感。4. 3病毒滴度TCID5tl的测定
将消化吹散的ST细胞悬液加入96孔细胞培养板，于5% CO2, 37 °C恒温培养箱中培养，待其贴壁后弃上清及非粘附细胞。取新鲜病毒液用2% DMEM分别连续倍比稀释KT1 10_8，每个稀释度各做8个重复，接种96孔细胞培养板，每孔0. 2 mL,设一行正常细胞生长对照孔，逐日观察细胞病变并统计结果。按照Reed-Muench法计算病毒滴度TCID5tlt5具体计算如下
权利要求
1. 一种猪传染性胃肠炎病毒毒株，其特征在于猪传染性胃肠炎病毒(SWine transmissible gastroenteritis virus), CCTCC NO :V201216o
全文摘要
本发明公开了一种猪传染性胃肠炎病毒毒株，其特征在于猪传染性胃肠炎病毒(swine transmissible gastroenteritis virus)，CCTCC NOV201216。本发明的猪传染性胃肠炎病毒灭活后免疫猪只，可以给猪提供有效的保护，是一株比较理想的制苗候选毒株。
文档编号C12R1/93GK103045543SQ20121052232
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者胡慧, 魏战勇, 崔保安, 陈雅君, 张莉娟, 刘中原, 寇亚楠 申请人:河南农业大学