专利名称：通过干扰cd99l2阻断白细胞迁出和炎症的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗炎症方法，特別是调节白细胞的经内皮迁移，和阻 断白细胞经内皮迁移的组合物。
背景技术：
本说明书中用数字引用的参考文献列于实施例后面的"参考文 献"一节中。
先前的研究(1-12)已经证实了血小板/内皮细胞粘附分子-1 (PECAM)在嗜中性粒细胞(PMN)、单核细胞(Mo)和自然杀伤 细胞(NK)的经内皮迁移(TEM)中的关键作用。但是，甚至在最 理想的环境下，抗-PECAM试剂仅仅阻断白细胞流入的80-90%。虽 然这与通过靶向单个分子所获得的炎症阻断一样好或更好，但是剩余 的10-20%的未阻断的白细胞可能代表了在慢性病症下的临床上重要 的群体。而且，至少有一些PECAM不起作用的炎性模型。 炎症中白细胞的迁移
白细胞向炎症部位的迁移涉及由几个粘附分子家族介导的几个 步骤。我们的研究集中在经内皮迁移(TEM)的步骤上，因为它是白 细胞不可逆转地进入发炎组织的步骤。我们先前已经描述了在所有 Mo和PMN表面上表达并且在内皮细胞边界上浓缩的PECAM在TEM 中的关键作用。在最佳控制的条件下，抗-PECAM试剂在体外和许多 体内模型中阻断80-90%的TEM。但是，总是有至少10-20%的白细胞
5逃避了这种阻断(l, 2, 4, 6, 8)。而且，至少描述了一种体内模型， 其中抗-PECAM抗体没有效果(9)。靶向清除PECAM产生在急性炎 性应答中没有显著缺陷的小鼠(26)。因此，存在独立于PECAM的 TEM的机制。了解这些机制将导致更好地理解炎症。以这些途径为 靶标可能是针对PECAM的抗炎症治疗的有用的辅助手段。 白细胞迁出(emigration)中分子上可分割的歩骤 炎性反应是一把双刃剑。白细胞移动到炎症病灶对于感染的快速 消退和由多#损伤引起的组织损伤的恢复是关键的。'另 一方面，大多 数人类病理学是由于误导或拖延的炎症引起的，造成宿主组织被损 伤。常见的例子包括炎性关节病、肺纤维化和动脉粥样硬化症，其通 常被看作一种动脉壁的慢性炎性疾病(13)。因此，已经将大量的注 意力集中于在分子水平上了解炎症，以希望可以更好地调节炎症。
白细胞迁出的过程在下列工作模型中分为 一 系列连续的粘附事 件。我们可将白细胞迁出分为这些步骤，因为我们具有可阻断每个步 骤的试剂。
虞动。在第一个步骤中， 一些进入毛细管后小静脉的炎症区域的 白细胞在一个被适当地称为"滚动"的过程中离开循环流并松散、暂时 且可逆地与内皮细胞表面粘附。粘附分子的选择家族和它们的唾液酸 化的-lexisX-修饰的配体表现为主要负责这种初始相互作用(在(M， 15)中综述)。滚动的白细胞直接与内皮接触，将它们暴露于多种能 够促进接下来的步骤一活化白细胞特异性整合蛋白 一的信号。白细胞 与E-选择素的结合本身可能就是一种充分的信号(16)。可选地或另 外，被选择素限制的白细胞现在能够被血小板活化因子(17)或其他 脂质调节物(18)、与内皮表面糖胺聚糖结合的趋化因子(19)、可溶 性化学引诱物(20)或交联白细胞CD31的配体(3， 21， 22)活化。
^/^。在它们的整合素被活化为高亲和力结合状态后，白细胞停 止滚动并紧密地与内皮表面粘附。对于表达(31和P2家族的整合素的 单核细胞和淋巴细胞，每种整合素的参与可能足以促进粘附，以利于 接下来的变移(transmigration) (23)。鉴定的(31和(32整合素介导的粘附的反受体包括ICAM-1、 ICAM-2和VCAM-l,它们是免疫球蛋 白基因超家族的成员。与内皮细胞内腔表面紧密结合的白细胞快速蠕 动到细胞间连接处，该过程需要粘附和解粘附的连续循环，因为白细 胞在它们的前端粘附并且在后端释放。
^r移。在到达连接处后，白细胞在紧密相对的内皮细胞间插入伪 足并以阿米巴样的方式蠕动通过，同时保持与内皮细胞紧密接触。这 一步骤被称为血细胞渗出、经内皮迁移(TEM)或变移。该步骤涉及 血小板/内皮细胞粘I^分子-l(PECAM,也称为CD31),它差免疫球 蛋白超家族的一种CAM (24)，在白细胞和血小板表面表达并且在内 皮细胞间的边界中浓缩。白细胞PECAM和内皮PECAM之间的接触 对于大多数嗜中性粒细胞和单核细胞在体外(1)和在体内(2， 8)的变 移是关键的。这包括结合PECAM结构域1和/或2并且阻断该关4建位 点的mAb,或至少包含结构域1的可溶性重组PECAM-IgG嵌合体， 它们竟争性地抑制这种相互作用(4, 6， 25)。因此，依赖于PECAM 的变移是抗炎治疗的有希望的靶标。
尽管对分子和白细胞滚动和与内皮顶面粘附的机理的了解具有 一定的进展(15， 46, 47),但是现在对经内皮迁移的了解仍然明显 缺乏。在迄今研究的大多数炎性病症中，PEC AM显然在大多数PMN 和单核细胞的TEM中起重要作用。PECAM介导变移而不影响顶部粘 附的功能将TEM定义为白细胞迁出中的独立步骤。然而，虽然 PECAM是已经被鉴定为在TEM中起独特作用的唯一分子，但是它显 然不是TEM中涉及的唯一分子。
CD99
CD99是一种32kD的高度0-糖基化的分子，表达于大多数白
等人，2002， Nat Immunol 3 : 143-150)。直到最近，CD99仍属于未知的 基因家族(Aubrit, F.等人.1989, Eur J Immunol 19: 1431 - 1436; Gelin; C.等人，1989， EMBO J. 8:3253-3259)。但是，随着人和鼠基因组的克 隆，预测了一种相关蛋白质，CD99L2 (Suh, Y.H.等人，2003， Gene307.'63-76)。已经描述了 CD99为T细胞和胸腺细胞上的共刺激分子， 但它在经内皮迁移中的作用仅仅在最近才被认识到(Schenkel等人)。 类似于PECAM-1(CD31), CD99在变移中以嗜同性方式起作用。白细 胞或内皮细胞上CD99的阻断作用阻断了单核细胞的血细胞渗出，两 种细胞类型上的CD99的同时阻断也是如此。对于嗜中性粒细胞的血 细胞渗出也是这样的。抗-CD99单克隆抗体的Fab片段在一 种经内 皮迁移的体外模型中阻断了超过90%的血细胞渗出(Schenkel等人)。 CD99在血细胞渗出中控制的^骤与PECAM-1控制的步骤不同。同 时阻断CD99和PECAM-1产生了加成效果，基本上完全消除了血细 胞渗出(Schenkel等人)。依赖于CD99的步骤远离被PECAM-1控制 的步骤。在依赖于CD99的步骤中被阻断的白细胞在穿过内皮连接点 的中途^d亭止。白细胞的最前端在内皮细胞之下，但是细胞的大部分 仍然在连接点中，并且尾端保持在单层的顶面上。这证实了血细胞渗 出被在两个独立步骤中作用的至少两组独立的嗜同性相互作用控制。
发明内容
本发明提供了 一种调节白细胞经内皮迁移(TEM)的方法，所述方 法包括抑制CD99L2-介导的白细胞穿过内皮的变移。在该方法的一个 实施方式中，CD99L2位于内皮细胞上。在另一个实施方式中，CD99L2 位于白细胞上。在一个进一步的实施方式中，TEM在活化的内皮细 胞之间发生。在一个另外的实施方式中，活化的内皮细胞由于与选自 肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-1 (IL-1 )的促炎细胞因子接触而被 活化。在另一实施方式中，内皮细胞在保持在组织培养物中的切下的 内皮组织上发现。
在本方法的一个特定实施方式中，内皮细胞在体外在透性膜上培 养。在本实施方式的一个方面，内皮细胞是人脐静脉内皮细胞 (HUVEC )。在另一实施方式中，发生穿过组织中的内皮细胞的TEM, 所述组织选自动脉内皮、静脉内皮、小静脉内皮和毛细血管后小静脉 内皮。在另一实施方式中，发生进入炎症部位的TEM。本发明进一 步提供一种抑制CD99L2 -介导的白细胞变移的方 法，其包括将白细胞、内皮、或此两者与CD99L2结合抑制剂接触。 在本方法的一个实施方式中，CD99L2结合抑制剂是一种抗-CD99L2 抗体分子。在另一实施方式中，抗-CD99L2抗体分子具有抗CD99L2 单克隆抗体的结合特异性。在一个进一步的实施方式中，CD99L2结 合抑制剂是一种可溶性CD99L2分子或其片段。
本发明也提供一种在体内治疗炎性病症的方法，所述方法包括抑 制CD99L2-介导的白细胞的经内皮ii移(TEM)。在本方法的一个 实施方式中，发生穿过组织中的内皮细胞的TEM,所述组织选自动 脉内皮、静脉内皮、毛细血管内皮、小静脉内皮和毛细血管后小静脉 内皮。在另一实施方式中，炎性病症是一种急性炎性病症。在另一实 施方式中，炎性病症由注射引起。在一个进一步的实施方式中，炎性 病症是一种慢性炎性病症。
本发明的一个实施方式提供一种抑制CD99L2-介导的TEM的方 法，包括将白细胞、内皮、或此两者与一种CD99L2结合抑制剂接触。 在本实施方式的一个方面，CD99L2结合抑制剂是一种抗-CD99L2 抗体分子。在另一方面，抗-CD99L2抗体分子具有抗CD99L2单克 隆抗体的结合特异性。在一个进一步的方面，CD99L2结合抑制剂是 一种可溶性CD99L2分子或其片段。
本发明进一步提供一种抗-CD99L2单克隆抗体分子，其中该抗 -CD99L2单克隆抗体抑制CD99L2-介导的白细胞的经内皮迁移 (TEM)。在本发明的一个实施方式中，该单克隆抗体分子结合单核细 胞、血小板和粒细胞或内皮细胞上的CD99L2。在另一实施方式中， 该单克隆抗体分子具有抗CD99L2单克隆抗体的结合特性。在一个优 选实施方式中，该单克隆抗体分子是一种人源化单克隆抗体。
本发明还提供一种筛选可抑制CD99L2-介导的白细胞TEM的 化合物的方法，所述方法包括鉴定结合CD99L2的化合物。
本发明进一步提供一种筛选抑制CD99L2-介导的白细胞TEM的 化合物的方法，所述方法包括鉴定一种抑制白细胞与CD99L2的结合的化合物。在本方法的一个实施方式中，所述化合物抑制白细胞与内 皮细胞的结合。在另一实施方式中，所述化合物抑制白细胞的变移。 在一个进一步的实施方式中，白细胞和内皮细胞在促进白细胞变移的 条件下在所述化合物存在下体外共培养，进一步包括检测白细胞穿过
内皮细胞的变移程度。在另一实施方式中，所述化合物结合CD99L2。
附图说曰月
图1. muCD99L2的cDNA序列(SEQ ID NO:l )。 图2.利用MAXHOM同源性算法与人CD99 ( SEQ ID NO:3 )比 对的muCD99L2的预测的氨基酸序列(SEQIDNO:2),显示了这两 种分子之间实质上具有同源性和同一性。关键字h二疏水性的，1=脂
肪族的，t二转角样的，&=芳香族的，s二小的，u—艮小的，p二极性的， +=正电荷，-=负电荷，o-醇，c二带电的。(软件来源Expasy.org网 站)
图3A和图3B,鼠CD99L2一皮兔抗血清特异性识别。(A)免疫前 血清显示了非特异性染色的背景水平。(B)用纯化的muCD99L2免 疫的兔的血清将用muCD99L2转染的COS细胞染色，该细胞类似于 用人CD99转染的细胞优先在其边界处表达所述分子。两种血清都以 1: 100稀释，并用Alexa488-标记的山羊抗兔IgG检测。
图4A-4D.鼠CD99L2在内皮上原位表达。小鼠肾(A， C)或心 脏(B, D)的冷冻切片与大鼠抗鼠CD99L2血清(A, B)或正常大 鼠血清(C, D)的1:1000稀释液孵育30分钟，清洗，与HRP标记 的兔抗大鼠IgG孵育，之后用二氨基联苯胺和过氧化氢显色。在肾和 心脏两者中，动脉(a)和静脉(v)的内皮都被清楚地染色(箭头)。 另外，在肾中，肾小球(g)和肾小管周围毛细血管被染色(图A), 心脏中肌纤维之间的毛细血管也是如此(B )。用非免疫血清未见明显 的染色。线段=200 iLim。
图5A和5B. muCD99L2在血细胞上的表达。最终稀释度为1: 1000的大鼠抗-muCD99L2用于染色抗凝的小鼠血液以进行流式细胞分析。白细胞和红细胞(RBC)通过前向和侧向散射特征圈选，并 且分开显示结果。(A)白细胞(灰色柱状图)显示强烈的焚光，而 RBC的染色是可检测的，但大约低1000倍(黑色柱状图)。(B)利 用生物素化兔抗-大鼠IgG和PE-标记的链霉亲和素检测染色。黑色柱 状图=没有添加第一抗体。
图6.鼠CD99L2在小鼠组织和细胞中的表达。利用大鼠抗 -muCD99L2抗血清的Western印迹分析4企测肾裂解液(K )、全血(B )、 纯化的白细胞('W)和腹膜灌洗细胞(P)中的一种大约'45kD的蛋白 质，该蛋白质与用muCD99L2 cDNA转染的COS细胞表达的蛋白质 一起迁移。在未转染的COS中没有检测到所述条带(未显示)。注意 到在纯化的白细胞和腹膜灌洗样品中白细胞的数量大约是全血中的 1/10。在COS细胞裂解液中的成对物可能代表不同的糖基化形式。来 自不同印迹的条带在该图中进行了比较。
图7A和7B.抗-muCD99L2在体内阻断急性炎症。在腹膜内注射 巯基乙酸培养液或磷酸盐緩冲液(PBS)之前1小时静脉内注射100 pi 大鼠抗-muCD99L2 (抗-CD99L2 )或正常大鼠血清(大鼠血清)作为 对照。18小时后通过通过腹膜灌洗收获白细胞，(A)抗-muCD99L2 导致PMN水平降低。(B)抗-muCD99L2导致单核细胞/巨噬细胞水 平降低。
图8. muCD99L2-Fc的表达。来自用编码muCD99L2-Fc嵌合体的 cDNA构建体稳定转染的COS细胞的培养上清液进行SDS-PAGE和 Western印迹法以分析分子的表达。通过我们的兔和大鼠抗muCD99L2 抗血清和一种人IgG的Fc部分特异性的山羊抗体可检测到预期分子 量为100KD (对于二聚体形式)的单一条带。右道中的150KD的条 带代表了抗-人IgG与存在于培养基中的牛IgG的交叉反应性。
图9A-9B.mAb9G5与muCD99L2转染的COS细胞结合。用 muCD99L2-FLAG转染的两种COS细胞系被无酶重悬浮，并且与mAb 杂交瘤上清液在冰上孵育30分钟，然后清洗并在AlexaFluo化8-标记 的山羊抗-大鼠IgG中在冰上孵育30分钟，清洗并通过流式细胞术分析。(A) 4FS是一种典型的阴性杂交瘤。用正常大鼠血清可见相同的
染色。(B) 9G5特异性地染色muCD99L2-转染的细胞，因为它不与 未转染的COS细胞反应(未显示)。
图10A-10B. mAb9G5选择性地与muCD99L2-转染的L细胞反应。 稀释的mAb9G5培养上清液(1: 100稀释)与(A)对照细胞(D6 系)或(B) muCD99L2-转染的L细胞(XFL1系)反应，如图9所 示，用荧光第二抗-大鼠IgG检测(用更浓缩的上清液在转染细胞上 可见更强的染色，但在4照细胞上没有见到)。 '
图11A-11C. mAb9G5识别小鼠白细胞的主要亚群。肝素化小鼠 血液与(A )正常大鼠血清、(B )MEC13.3(单克隆大鼠抗-小鼠PECAM ) 或(C) 9G5 (单克隆大鼠抗-小鼠CD99L2)孵育30分钟，然后裂解 RBC，清洗细胞，并与AlexFluor488-标记的山羊抗-大鼠IgG孵育， 进行流式细胞术分析。
图12A和12B. muCD99L2的表达使L细胞成纤维细胞具有相互 粘附的能力。用muCD99L2转染的两种独立的L细胞系进行两种独 立的试验。在(A)中研究了细胞系XFL8。在(B)中研究了细胞系 XFL1。在这两种情况中聚集是依赖于时间的，如先前所发现的一样 (Muller等人，1992， J. Exp. Med. 175: 1401 -1404; Schenkel等人，2002， Nature Immunol. 3: 143-150)。在(A)中，L细胞系D6用作阴性对照。 这些细胞代表了用与其他细胞相同、但以相反方向表达人PECAM的 质粒转染的亲本L细胞系。阳性对照是表达人PECAM的#6细胞和表 达人CD99的弁1细胞。在(B)中，阳性对照也是表达在二价阳离子 存在下(+ )聚集的人CD99的W细胞。阴性对照是在没有(-)二价 阳离子的条件下孵育的相同细胞系(Schenkel等人，2002， Nature Immunol. 3 : 143-150)。
图13.整合一个muCD99L2的缺陷拷贝到小鼠ES细胞中的靶向 载体的图示。这种载体可用于产生传统的"敲除，，小鼠(通过同源重组 置换muCD99L2)和可诱导的转基因小鼠。所述载体设计为在外显子 4-6附近整合。在自然状态下，neo盒破坏阅读框并消除该基因。在
12ES细胞期通过暴露于Cre重组酶去除Neo盒，靶向载体重组入小鼠 基因组DNA内，重建了一种功能性基因。在成年小鼠接下来暴露于 Cre重组酶后，外显子4-6和介于之间的内含子被删除，产生了条件"敲
除"。 一个Sacl位点已经被构建到3， loxP位点，以使该载体向基因组 DNA内的插入可用设计为与插入点直接3'侧的基因组杂交的探针进 行检测。用Sacl消化基因组DNA从这一区域产生15.2kb的条带。在 质粒整合后，该限制性片段的长度变为13.8kb。
发明详述
先前对于PECAM-1和CD99的研究提示，在白细胞和内皮细胞 上都表达的并且能够进行嗜同性相互作用的其他分子的存在可能与 经内皮迁移有关。发明人已经发现CD99L2正是这样的一种分子。虽 然鼠和人CD99L2的预测的结构已经被公开(Suh等人)，但是没有推 测出这种分子的功能。基于鼠CD99L2(muCD99L2)的独立的cDNA克 隆和对其作用的体内和体外研究，发明人已经发现muCD99L2在血细
胞渗出中起作用，并且muCD99L2的阻断抑制炎症。基于发明人的研
究和与人CD99L2的相近的同源性，很明显人CD99L2在炎症中具有
重要功能，阻断CD99L2的功能将是一种有用的抗炎症策略。
本申请部分地基于鉴定在汇合的内皮细胞的边界处和在白细胞
表面上表达的45kD膜蛋白。该蛋白质被鉴定为鼠CD99L2。在一种 体内测试中， 一种抗该分子的多克隆抗体选择性阻断了单核细胞和嗜 中性粒细胞向炎症部位的迁移。很可能muCD99L2 (参考同源的人 CD99L2)的最重要的生理学功能与白细胞变移有关，其中抗紧密相 关的家族成员CD99的mAb阻断变移超过90% (Schenkel等人)。
发明人已经克隆了 muCD99L2， 一种具有与人CD99高度同源、 与人CD99L2更高度同源的区域的鼠CD99旁系同源物(paralogue )。 人CD99位于X染色体的q臂上(Suh等人)。cDNA序列显示于图1 中，预测的氨基酸序列和与人CD99的同源性显示于图2中。
在此提供的实施例证明了 ，产生的抗muCD99L2的多克隆和单克隆抗体识别存在于动脉、静脉和许多器官的毛细血管的血管内皮细胞
(图4, 6)以及白细胞(图5)上的CD99L2。功能数据证实成纤维 细胞中的CD99L2表达使它们具有相互粘附的能力(图12)。这暗示 了白细胞上的CD99L2介导了与内皮细胞上的CD99L2的粘附相互作 用，其作用方式类似于相关但不同的分子CD99的作用方式(Schenkel 等人)。更重要的是，两种不同的多克隆抗-CD99L2抗体(一种在兔 子,中制备，一种在大鼠中制备)在一种腹膜炎体内模型中阻断炎症(图 7): '
人CD99和CD99L2之间的相似性突出了 muCD99L2研究在发展 靶向于人CD99L2用于治疗人类患者群体中的炎症和炎性疾病的治疗 方法中的重要性。类似于CD99， muCD99L2和人CD99L2序列编码 具有几个潜在O-连接糖基化位点而没有N-连接糖基化位点的I型膜 蛋白。鼠CD99L2在小鼠的内皮细胞、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞一已知在人类中表达CD99的所有细胞一上表达。类似于人 CD99，以及人CD99L2, muCD99L2与炎症有关。关于muCD99L2 在炎症中的作用的研究将提供有关人CD99L2功能的重要理解。
鼠CD99L2
发明人已经克隆了 muCD99L2 (也被称为CD99L2或 muCD99L2), —种具有与CD99高度同源的区域的鼠CD99旁系同源 物。muCD99L2也与人类的第二 CD99-相关基因CD99L2类似。人 CD99L2位于X染色体的q臂上。
尽管对与白细胞迁出相关的白细胞和EC分子的了解具有一定的 进展，但是调节血细胞渗出的机理还是未知的。PECAM和CD99被 组成型表达(Schenkel,等人，2002, Nature Immunol. 3: 143-150)。因此， 理解分子如何控制血细胞渗出功能可以促进开发更好和更多的选择
性抗炎症治疗。包含PECAM的表面连接区(SCC)是内皮中的一种 新的细胞器官。它是重要的，因为它在血细胞渗出中的作用证明EC 活跃地参与促进血细胞渗出，这不仅仅是通过适于白细胞识别的粘附分子的表达，而且参与白细胞穿过血管内膜的物理运动(Mamdouh，等 人，2003， Nature 421 :748-753)。 PECAM和CD99在血细胞渗出中具有 连续的、不相重叠的功能(Schenkd等人，2002, Nature Immunol. 3: 143-150)。然而，CD99没有已知的信号基序，并且是不同于任何其 他白细胞-内皮细胞粘附分子的非常小的独特分子家族的 一个成员。 因此，它的结构中没有任何关于它如何作用的暗示。
已经鉴,定了 CD99L2的鼠形式，或者被称为muCD99L2。关键的 是要知道鼠CD99L2在体内是否如同在体外一样在击细胞迁出中起类 似的作用。这是特别重要的，因为鼠CD99L2显示出相比人CD99更 类似于人CD99L2。很可能人CD99在炎症中的作用出现在基因从产 生鼠CD99的共同祖先进化之后。muCD99L2在所有测试的鼠细胞类 型中表达，所述细胞的人类对应物表达CD99。抗muCD99L2的抗体 阻断PMN和单核细胞向体内急性炎症区域的补充。在此提供的研究 检测了 muCD99L2在几种急性炎症模型中的作用。
人CD99和muCD99L2之间的相似性突出了 muCD99L2研究在 发展治疗人类患者群体的炎症或炎性疾病的CD99靶向治疗方法中的 重要性。类似于CD99, muCD99L2序列编码具有几个潜在O-糖基化 位点而没有潜在N-糖基化位点的I型膜蛋白。muCD99L2在小鼠的单 核细胞、淋巴细胞、粒细胞和红细胞一在人类中已知表达CD99的所 有细胞一上表达。类似于人CD99, muCD"L2与白细胞迁移和炎性 反应有关。
两种鼠急性炎症模型(可以用于定量和定性地评价阻断性mAb 的效果)可显示通过干扰CD99型分子产生的阻断是在TEM或粘附 的水平上。在野生型小鼠和其中PECAM被最大阻断的小鼠中评价 muCD99L2的作用。muCD99L2活性也可在三种小鼠品系中的任何一 种中测试，所述小鼠品系中PECAM缺失或没有功能，因此TEM不 依赖于PECAM发生。不依赖于PECAM的途径或替代途径在这些小 鼠中更易于鉴定。阻断这些新分子的抗体的效果在以下小鼠中检测 野生型小鼠，用于确定它们自身阻断这些分子的效果；組成型表达循环PECAM-IgG并且具有最大PECAM功能阻断的Tg8小鼠；PECAM 缺失(敲除)小鼠，其没有PECAM;和Tg5和Tgl小鼠，其组成型 表达超过治疗水平的可溶性PECAM-1并且其效应不感受，尽管在其 内皮细胞和白细胞上具有正常水平的PECAM。这些研究可以更好地 理解涉及白细胞经内皮迁移的CD99L2-介导的机理并且鉴定了用于 抗炎治疗的附加治疗化合物。
如此处使用的术语"经内皮迁移"(TEM)指白细胞从内皮细胞的 顶面到基底层并越过基底层的运动。白细胞在各个内皮细胞'之间的内 皮中形成的连接点之间迁移。通常，TEM发生于当内皮细胞被激活 时，例如，被TNF、 IL-1或其他促炎介体激活时。TEM也可组成型 发生，特别是对于单核细胞和淋巴细胞，由于白细胞粘附而以较低、 较弱的水平穿过内皮细胞发生，甚至在不存在内皮细胞直接活化的情 况下。因此，TEM在体内在炎性病灶处发生；在体外，穿过培养的 内皮细胞、优选地在内皮细胞活化和/或产生趋化梯度之后发生。发明 人已经发现了该体外系统复制了体内的炎性状况，用于高预测性地研 究TEM。
术语"白细胞，，包括，但不限于，多形核白细胞(如，嗜中性粒细 胞)、单核细胞(其在变移到它们被吸引的部位之后分化为树突细胞 或巨噬细胞)、粒细胞(包括嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)、自然杀 伤细胞和淋巴细胞，如，T淋巴细胞，以及循环树突细胞前体。
术语"内皮细胞，，(或EC)具有本领域中的通常含义。内皮细胞 构成内皮，内皮尤其在遍布全身的血管组织(静脉、动脉和毛细血管) 的内腔中发现。内皮的"顶面，，是内腔表面，即，与血液接触。基底层 或基膜是将内皮与血管壁隔开的细胞外基质层。对于大多数炎症来 说，白细胞穿过毛细血管后小静脉迁出，毛细血管后小静脉壁由将血 管与它供应的组织隔开的不连续血管平滑肌细胞层组成。
内皮细胞的活化可以由于与刺激性介体接触而引起。对于本发明 的目的，内皮细胞的活化由于与促炎细胞因子接触而引起，所述促炎 细胞因子例如是，但不限于，肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素-1(IL-1),特別是IL-1卩。
本发明包括在体外和体内试验中评价CD99L2-介导的TEM和作 为该过程的候选抑制剂的化合物。对于体外试验，内皮细胞优选地在 透性膜或胶原凝胶上培养。在体内，TEM在炎症部位发生，其可被 诱导(例如，用巯基乙酸或巴豆油处理诱导)或由自然炎性疾病(感 染、受伤、自身免疫)引起。
"CD99L2抑制剂"是阻断或降低CD99L2与其自身或与其嗜异性 结合配偶体(即，CD99L2酉L体或CD99L2受体)结合的分子，即，' 防止CD99L2与嗜异性或嗜同性结合配偶体相互反应(例如，结合) 和介导TEM的分子。在一个特定实施方式中，抗-CD99L2单克隆抗 体分子是这样的抑制剂。可选地，CD99L2的细胞外片段是一种抑制 剂，更特别地，是竟争性抑制剂。"CD99L2的细胞外片段"可以是整 个细胞外结构域，即，从N-末端到大约跨膜区域的起点，或包含 CD99L2与其结合配偶体相互作用的结构域的较d、部分(包括CD99L2 细胞外结构域的嵌合构建体，例如，具有免疫球蛋白分子的Fc结构 域)；碳水化合物，特别是O-连接的碳水化合物；或凝集素配体。因 此，适当的抑制剂可与CD99L2碳水化合物相互作用；所述抑制剂可 以是多种凝集素。可选地，可溶性碳水化合物或碳水化合物模拟物可 用于阻断与CD99L2的关键碳水化合物相互作用的凝集素。类似地， 肽或拟肽可以阻断与CD99L2的多肽相互作用结构域的相互作用。而 且，在某些情况下，上述的组合可证明在抑制CD99L2方面最有效。 在一个特定实施方式中，所述抑制剂是一种抗-CD99L^抗体分子，更 特别地，是一种抗-CD99L2单克隆抗体分子。
术语抗-CD99L2抗体分子包括识别小鼠、人类或其他物种的 CD99L2同源物的免疫球蛋白，也可以使用至少具有所述CD99L2同 源物的配体结合部分的所述抗体的衍生物，包括但不限于，单链、Fv、 Fab、 Fab'、 F ( ab') 2、嵌合抗体、人源化抗体等。
术语"炎性疾病"指急性或慢性炎性疾病，其可由感染或非感染原 因引起。多种感染疾病包括脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、皮炎、和成人呼吸窘迫综合症。非感染性原因包括外伤(烧伤、砍伤、擦伤、 撞伤)、自身免疫疾病、和器官排斥事件。因此，在特定实施方式中， 炎性疾病由选自下列的疾病引起动脉粥性硬化症；自身免疫疾病，
例如多发性硬化、系统性红斑狼疮、风湿性多肌痛(PMR)、类风湿
性关节炎和其他形式的炎性关节炎、舍格伦综合症、进行性系统性硬 化症(硬皮病)、强直性脊柱炎、多肌炎、皮肌炎、天疱痴、类天疱 疮、I型糖尿病、重症肌无力、桥本氏曱状腺炎、格雷夫斯病、古德 帕斯彻氏病、混合结締组织病、硬化ko旦管炎、包括克罗恩病(局限
性肠炎)和溃疡性结肠炎的炎性肠病、恶性贫血、炎性皮肤病；普通 间质性肺炎(LFIP)、石棉沉着病、硅肺病、铍中毒、滑石肺、所有 形式的尘肺病的不同形式、结节病(在肺和任何其他器官中)、脱屑 性间质性肺炎、淋巴样间质性肺炎、巨细胞间质性肺炎、细胞间质性 肺炎、外源性变应性肺泡炎、韦格纳肉芽肿和相关形式的脉管炎(颞 动脉炎和结节性多动脉炎)；推定为不是自身免疫病的炎性皮肤病； 慢性活动性肝炎；迟发型超敏反应(例如，毒漆藤皮炎)；肺炎或其 他由于任何原因引起的呼吸道炎症；由于任何病因引起的成人呼吸窘 迫综合症(ARDS);脑炎，伴有炎性水肿；速发型超敏反应，包括但 不限于，哮喘、花粉症、皮肤变态反应、急性过敏反应；涉及免疫复 合物急性沉积的疾病，包括但不限于，风湿热，由于任何病因引起的 急性和/或慢性肾小球肾炎，特别包括感染后(例如，链球菌感染后) 肾小球肾炎，系统性红斑狼疮的急性恶化；肾盂肾炎；蜂窝织炎；膀 胱炎；急性胆嚢炎；和在胃肠道、膀胱、心脏或其他器官、特别是易 于破裂的器官的任何地方产生短暂性局部缺血的疾病；器官移植或组 织同种异体移植后遗症，包括在同种异体器官或组织移植之后急性期
的同种异体移植物排斥和慢性宿主抗移植物排斥。
短语"药学上可接受的"，不管是与本发明的药物组合物还是与本 发明的疫苗组合物联用，指生理上可耐受的并且一般不会产生不利反 应例如胃不适、晕眩等的分子实体。优选地，如此处所用术语"药学 上可接受的，，表示被联邦或州政府的管理机构认可或列在美国药典或其他公认的药典中用于动物，更特别地用于人类。术语"载体，，指与化 合物一起施用的稀释液、佐剂、赋形剂或介质。所述药物载体可以是 无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、纟直物或合成来源的，例如 花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。优选地用水或水溶液盐水溶液 和葡萄糖和甘油水溶液作为载体，特別用于注射溶液。适合的药物载
体描述于E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"(第18
版)。，
术语"大约"或"近似"是本领域熟练技术人'员根据本公开内容已知 的。优选地，该术语表示在给定的值或范围的20%之内，优选10% 之内，更优选5%之内。可选地，特别在生物系统中，术语"大约"优 选地表示在给定数值的大约一个对数(即， 一个数量级)之内，优选 地在两倍之内，这依赖于如何定量测定。
"編码序列"或"编码"一种表达产物例如RNA、多肽、蛋白质或 酶的序列是一种核苷酸序列，当该序列表达时，导致RNA、多肽、 蛋白质或酶的产生，即，核苷酸序列编码所述多肽、蛋白质或酶的氨 基酸序列。蛋白质的编码序列可以包括起始密码子(通常ATG)和终 止密码子。
术语"基因，，，也被称为"结构基因"，表示一种DNA序列，其编 码或对应于包含一种或多种蛋白质妁全部或部分的特定氨基酸序列， 并且可包含或可不包含调节DNA序列，例如启动子序列，该启动子 序列例如决定了基因被表达的条件。基因的转录区除翻译(编码)区 以外还可包括5'-和3'-非翻译区(UTR)和内含子。
"启动子序列，，是能够结合细胞内的RNA聚合酶并启动下游(3， 方向)编码序列的转录的DNA调节区。为了限定本发明的目的，启 动子序列在其3，末端被转录起始位点限制'向上游(5'方向)延伸， 包括以高于背景的可检测水平启动转录所需的最小数量的碱基或元 件。在启动子序列中将发现转录起始位点(方便地，例如通过用核酸 酶Sl作图进行确定)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构 域(共有序列)。当RNA聚合酶将编码序列转录为mRNA时，编码序列在细胞中 在转录和翻译控制序列的"控制之下，，或与之"有效连接，，，然后反式-RNA剪接(如果包含内含子)，并翻译为该编码序列编码的蛋白质。
术语"表达"的意思是允许或使基因或DNA序列中的信息表现出 来，例如通过活化与相应基因或DNA序列的转录和翻"i争有关的细胞 功能而产生蛋白质。DNA序列在细胞中表达或被细胞表达，形成"表 达产物"，例如,mRNA或蛋白质。表达产物自身，例如，产生的mRNA 或蛋白质，也可被称为被细胞"表达"。表达产物可以表々正为细胞内的、 细胞外的或分泌的。术语"细胞内的"表示在细胞内的某些物质。术语 "细胞外的"表示在细胞外的某些物质。如果一种物质从细胞上或细胞 内某处以显著的量出现在细胞外，则该物质是被细胞"分泌"的。"允 许表达的条件"，在体外是温度(通常大约37GC)、湿度(潮湿的空气)、 维持pH的二氧化碳浓度(通常大约5% C02到大约15% C02)、 pH(通 常大约7.0到8.0,优选7.5)和培养液成分等培养条件，其依赖于宿主 细胞类型。在体内，允许表达的条件主要是非人转基因动物的健康， 其依赖于充分的营养、水、生活环境和环境条件(明-暗循环、温度、 湿度、噪音水平)。在任一系统中，如本领域公知的，表达可依赖于 阻抑物或诱导物控制系统。
术语"转染，，表示"外源，，(即，外来的或细胞外的)基因、DNA或 RNA序列导入到宿主细胞中，以致宿主细胞表达导入的基因或序列 以产生期望的物质， 一般是被导入基因或序列编码的蛋白质或酶。导 入的基因或序列也可被称为"克隆的"或"外源的"基因或序列，可包括 调节或控制序列，例如起始、终止、启动子、信号、分泌或细胞遗传 机制中使用的其他序列。基因或序列可包括非功能序列或没有已知功 能的序列。接受并表达被导入的DNA或RNA的宿主细胞已经被"转 染"并且是"转染子"或"克隆"。导入到宿主细胞中的DNA或RNA可 来源于任何来源，包括与宿主细胞相同属或种的细胞，或不同属或种 的细月包。
术语"载体"、"克隆载体"和"表达载体"表示可将DNA或RNA序列(例如，外源基因)导入宿主细胞内的运载工具，以转化该宿主并 促进导入序列的表达(例如，转录和翻译)。载体包括质粒、噬菌体、 病毒，等等；它们在下面更详细地讨论。
载体一般包括可传递物质的DNA,外源DNA插入其中。将一种 DNA片断插入另 一种DNA片断的常用方法涉及使用被称为限制性酶 的酶，所述酶在被称为限制性位点的特定位点(特定核苷酸组)切割 DNA。"盒"(cassette )是指可在特定的限制性位点插入到载体或另一 种DNA片断中的DNk片断。优选地，盒是一种"表达盒"，真中的 DNA是编码表达产物的DNA的编码序列或片断，其可在特定的限制 性位点插入到载体中。盒限制性位点通常设计为确保盒在正确的阅读 框内插入。通常，外源DNA在载体DNA的一个或多个限制性位点处 插入，然后与可传递载体DNA—起被载体带入宿主细胞中。具有插 入的或添加的DNA的DNA片断或序列，例如表达载体，也可一皮称为 "DNA构建体"。载体的常见类型是"质粒"，它通常是双链DNA的自 包含分子，通常是细菌来源的，其可容易地接受附加的(外源)DNA, 并可容易地导入适合的宿主细胞中。质粒载体通常包含编码DNA和 启动子DNA,并具有适于插入外源DNA的一个或多个限制性位点。 已经描述了大量载体(包括质粒和真菌载体)在多种真核和原核宿主 中的复制和/或表达。非限制性的实例包括pKK质粒(Amersham Pharmacia Biotech)、 pUC质粒、pET质粒(Novagen. Inc.， Madison， WT)、 pRSET或pREP质粒(Invitrogen, San Diego, CA)、或pMAL质粒(New England Biolabs, Beverly, MA)，和许多适当的宿主细胞，利用本文已
组克隆载体通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统、 一种或 多种用于在宿主中选^^的标记物如抗生素抗性、和一种或多种表达盒。
术语"宿主细胞，，表示以任何方式选择、修饰、转化、生长、或使 用或处理的任何生物体的任何细月包，其用于由细胞产生物质，例如由 细胞表达基因、DNA或RNA序列、蛋白质或酶。宿主细胞进一步可用于筛选或其他测试，如下文所述。宿主细胞可在体外发现，即，在 组织培养物中，或在体内发现，即，在微生物、植物或动物中。
术语"表达系统"表示在适当条件下的宿主细胞和相容的载体，例
如，用于表达被载体携带并导入宿主细胞的外源DNA所编码的蛋白
质。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细 胞和杆状病毒载体、和哺乳动物宿主细胞和载体。在一个特定实施方
式中，蛋白质在COS-l或CHO细胞中表达。其他适合的细胞包括 NSO细胞、HeLa细胞、293T'(人肾细胞)、小鼠原代成肌细胞、和 NIH3T3细胞。
术语"异源"指非天然存在的元件的组合。例如，异源DNA指非 天然位于细胞或细胞染色体位点上的DNA。异源表达调节元件是与 一种基因有效连接的元件，该基因不同于其天然有效连接的基因。在 本发明的上下文中，蛋白质编码序列对于为了克隆或表达而插入的载 体DNA来说是异源的，并且对于包含所述载体并表达所述载体的宿 主细胞例如CHO细胞来说是异源的。
根据本发明，可以应用本领域技术内的常规分子生物学、微生物 学和重组DNA技术。所述技术在文献中充分阐述。见例如，Sambrook， Fritsch和Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (本文称为"Sambrook等人，1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization, B. D. Haines 和S丄Higgins eds, (1985); Transcription And Translation, B.D. Hames 和S丄Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture, R丄Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press, (1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubd等人.(eds.)， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994)。产生抗体分子的方法
技术领域：
本发明的抗体分子可通过任何本领域已知的合成免疫球蛋白的 方法产生，特别地，通过化学合成或通过重组表达产生。包含编码抗 体分子的核苷酸序列的分离核酸可利用任何本领域已知的方法产生。
抗体片段，例如Fab和F (ab，) 2，可通过对完整的抗体进行蛋白水 解处理而产生。
, 本领域已知的多种方法可用于产生CD99L2的多克隆抗体或其衍 生物或类似物。对于抗体的产生，可通ii用CD99L2多肽或其衍生物
(例如，片段或融合蛋白)注射而免疫多种宿主动物，包括但不限于 兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊，等等。在一个实施方式中，CD99L2 多肽或其片段可与免疫原性载体例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔戚 血蓝蛋白(KLH)偶联。多种佐剂可用于增强免疫应答，依赖于宿主 种类，包括但不限于弗氏(完全和不完全)佐剂、矿物凝胶例如氢氧 化铝、表面活性剂例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、 匙孔戚血蓝蛋白、二硝基酚、和潜在有用的人用佐剂例如BCG(卡介 苗)禾口少豆小才奉习犬才干菌(Cor_ywe/)ac/^r/iw2 p"rvww )。
对于CD99L2多肽或其片段、类似物或衍生物的单克隆抗体的制 备，可以使用任何通过连续细胞系培养生产抗体分子的技术。这些技 术包括4旦不限于最初由Kohler和Milstein (Nature 1975， 256:495-497) 发展的杂交瘤技术、三体瘤(trioma)技术、人B-细胞杂交瘤技术 (Kozbor等人，Immunology Today 1983， 4:72; Cote等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80:2026-2030)、生产人单克隆抗体的EBV-杂交 瘤^支术(Cole等人,in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc., pp. 77-96， 1985)。在本发明的另外一个实施方式中，单克 隆抗体可在无菌动物中产生(PCT公开WO 89/12690)。实际上，根 据本发明，也可以使用为生产"嵌合抗体，，而发展的技术(Morrison等人， J. Bacteriol.， 1984, 159:870; Neuberger等人，Nature 1984, 312:604-608; Takeda等人，Nature 1985， 314:452-454),该技术包括剪接来源于 CD99L2多肽特异性小鼠抗体分子的基因和来源于具有适当生物活性
23的人抗体分子的基因；这些抗体在本发明的范围内。所述人或人源化 嵌合抗体优选用于治疗人类疾病或失调(下文描述)，因为人或人源 化抗体诱导免疫应答、特别是变应性应答的可能性比异种抗体更小。 根据本发明，描述的生产单链抗体的技术(美国专利Nos.
5，476,786、 5，132，405和4,946,778)可适用于生产CD99L2多肽-特异 性单链抗体。实际上，可递送这些基因，以在体内表达。本发明的另 夕|、一种实,施方式利用了描述的构建Fab表达库的技术(Huse等人. Science 1989, 246: 1275-1281)，以允许快速并容^地鉴定对CD99L2 多肽或其衍生物或类似物具有预期特异性的单克隆Fab片段。
CD99L2多肽表达
一旦包含至少编码CD99L2的配体结合部分的核苷酸序列的核酸 被克隆，将该编码序列插入一种重组表达载体中。所述编码序列的工 程化可通过本领域已知的常规重组DNA技术完成。
编码多肽的核酸任选地包含编码引导蛋白质分子分泌的前导序 列的核苷酸序列。在作为跨膜糖蛋白的CD99L2的具体情况中，可构 建一种分泌形式，其仅仅编码细胞外部分，或细胞外部分的有限区域， 以确4呆分)必。
然后可通过常规技术在体外或体内将表达载体转移入宿主细胞 中，并且通过常规技术培养转染的细胞，以产生CD99L2。例如，通 过将编码CD99L2的表达载体瞬时转染入COS细胞中，将细胞培养 允许表达的一段适当的时期，然后吸取COS细胞的上清液，所述上 清液包含分泌的表达的CD99L2。
用于表达CD99L2的宿主细胞可以是细菌细胞例如大肠杆菌或真 核细胞。特别地，与载体一起使用的哺乳动物细胞例如中国仓鼠卵巢 细胞(CHO)或COS细胞是有效的表达系统，所述载体中CD99L2 的表达在来源于人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件的控 制之下。
多种宿主-表达载体系统可用于表达CD99L2。所述宿主-表达系统代表可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，但是也产生当
用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可在原位展现CD99L2的细 胞。这些系统包括但不限于用包含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、 质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的微生物例如细菌(如，大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌)；用包含CD99L2编码序列的重组酵母表达载体 转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用包含CD99L2編码序列的重组病 毒表达载体(例如>,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表 达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV;烟草花叶病毒,'TMV)感 染的或用包含CD99L2编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒) 转化的植物细胞系统；含有包含源于哺乳动物细胞基因组的启动子 (例如，金属硫蛋白启动子)或源于哺乳动物病毒的启动子(例如， 腺病毒晚期启动子、牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺 乳动物细胞系统(例如，COS、 CHO、 BHK、 293和3T3细胞)。
蛋白质或多肽的表达可被任何本领域已知的启动子/增强子元件 控制，但这些调节元件必须在为表达选择的宿主中是有功能的。可用 于控制基因表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子(美 国专利Nos. 5.385,839和5,168,062)、 SV40早期启动子区(Benoist和 Chambon, Nature 1981， 290:304-310)，包含于劳斯肉瘤病毒的3'长末 端重复中的启动子(Yamamoto,等人，Cell l兆0， 22:787-797)、疱疹胸苷 激酶启动子(Wagner等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981， 78: 1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人.，Nature 1982, 296:39-42);原核表达载体，例如(3-内酰胺酶启动子(Villa-Komaroff, 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75:3727-3731),或tac启动子 (DeBoer等人，Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1983, 80:21-25);参见在 Scientific American 1980, 242:74-94 中的"Useful proteins from recombinant bacteria";源于酵母或其他真菌的启动子元件，例如Gal4 启动子、ADC(乙醇脱氬酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、 碱性磷酸酶启动子；和特别是展现造血组织特异性的转录控制区；在 骨髓细胞中具有活性的p-珠蛋白基因控制区(Mogram等人，Nature1985, 315:338-340; Kollias等人，Cell 1986, 46:89-94)、造血干细胞分化 因子启动子、促红细胞生成素受体启动子(Maouche等人，Blood 1991， 15:2557)等等。
在细菌系统中，根据表达的CD99L2的预期用途，可有利地选^奪 许多表达载体。例如，当为了产生CD99L2的药物组合物而生产大量 的所述蛋白质时，引导表达易于纯化的高水平融合蛋白产物的载体是 预期的。所述载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278 (Ruther 等人，EMBO J. 1983,2: 1791)，在其中CD99L2编码序列可与lacZ'编 码区符合读框地单独连接入载体中，以产生融合蛋白；pIN载体 (Inouye和Inouye， Nucleic Acids Res. 1985, 13:3101-3109; Van Hleeke 和Schuster, J. Biol. Chem. 1989， 264:5503-5509);等等。pGEX载体也 可用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。 通常，所述融合蛋白是可溶的，并且可通过吸附和结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠基质上、然后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱而从裂解的细胞 中容易地纯化。pGEX载体"i殳计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割 位点，以使克隆的目标基因产物可从GST部分上释放。
在昆虫系统中，苜蓿l艮纟丈夜蛾(JWograp/z" ca/z/orm'c")核型多 角体病毒(AcNPV)用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾 (印t^o/^ra/n/g^m^ )细胞中生长。CD9礼2编码序列可被单独克 隆入病毒的非核心区域(例如，多角体蛋白基因)，并且置于AcNPV 启动子(例如，多角体蛋白启动子)的控制之下。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的和非基于病毒 的表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况中，目标CD""编码序 列可与腺病毒转录/翻译控制复合物例如晚期启动子和三联前导序列 连接。然后可通过体外或体内重组将该嵌合基因插入到腺病毒基因组 中。向病毒基因组的非必需区(例如，E1或E3区)的插入将产生一 种存活的并能够在感染的宿主内表达抗体的重组病毒(见例如，Logan 和Shenk, Pro" Natl. Acad. Sci. USA， 1984, 81:3655-3659)。特定的起始 信号对于插入的抗体编码序列的有效翻译也是需要的。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。而且，起始密码子必须与期望的编码序 列的阅读框相符，以确保全部插入部分的翻译。这些外源翻译控制信 号和起始密码子可以是来自多种来源的，是天然的和合成的。表达效
率可通过包括适当的转录增强元件、转录终止子等来提高(见Bittner 等人，Methods in Enzymol. 1987， 153:516-544)。
另外，可选择调节插入序列的表达或以期望的特定方式修饰和处 理基因产物的宿主细胞抹。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的 翻译后处理和修饰的特性和特定的才几理。可选择适当的细胞系或宿主 系统以确保正确地修饰和处理表达的外源蛋白。为此，可以使用具有 正确处理基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化的细胞机制的真核 宿主细胞。所述哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、 VERO、 BHK、 HeLa、 COS、 MDCK、 293、 3T3、 WI38。
为了长期、高产量地产生重组蛋白，稳定的表达是优选的。例如， 可以构建稳定表达CD99L2的细胞系。代替使用包含病毒复制起点的 表达载体，可用由适当表达控制元件(例如，启动子、增强子序列、 转录终止子、多聚腺香酸化位点，等等)和选择性标记控制的DNA 转化宿主细胞。在导入外源DNA之后，可使工程化细胞在富集培养 基中生长1到2天，然后转入选择培养基中。重组质粒中的选择性标 记提供选择抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合入其染色体中并生长 形成转化灶，转化灶又可以被克隆并扩增为细胞系。本方法可有利地 用于工程化表达抗体的细胞系。所述工程化细胞系在筛选和评价直接 或间接与抗体相互作用的化合物中是特别有用的。
可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶 (Wigler等人，Cell 1977， 11 :223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 (Szybalska和Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1962， 48:2026)和腺 。票呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，Cell 1980, 22:817)基因可分别用 于tk-、 hgprt-或aprt-细胞。另外，抗代谢物抗性可用作选择下列基因 的基础dhfr，其提供氨曱喋呤抗性(Wigler等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, 77:3567; O，Hare等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981， 78:1527); gpt,其提供霉酚酸抗性(Mulligan和Berg,Proc. Natl. Acad. Sci. USA1981, 78:2072); neo，其提供氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，J. Mol. Biol. 1981, 150: 1);和hygro,其提供潮霉素抗 性(Santerre等人，Gene 1984, 30: 147)。
CD99L2的表达水平可通过载体扩增而提高(综述见Bebbington 和Hentschel， The Use of Vectors Based on Gene， Ampliflication for the Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells in DNA, Cloning, Vol. 3., Academic Press, New York， 1987)。当表达'CD99L2的载体系统内的 标记物可扩增时，宿主细胞的培养基中存在的抑制剂水平的提高将提 高标记物基因的拷贝数。因为扩增的区域与CD99L2基因相连，蛋白 质的产量也将提高(Crouse等人，Mol. Cell. Biol. 1983， 3:257)。
病毒和非病毒载体
在体外和体内有用的载体是病毒载体，例如慢病毒、逆转录病毒、
疱瘆病毒、腺病毒、腺伴随病毒、痘苗病毒、甲病毒、杆状病毒、和 其他具有期望的细胞向性的重组病毒。因此，编码功能性或突变蛋白
或其多肽结构域片段的基因可利用病毒载体或通过直接DNA导入而 在体内、离体或在体外导入。在目标组织中的表达可通过将转基因载 体輩巴向到特定细胞而实现，例如使用病毒载体或受体配体，或通过利 用组织特异性启动子，或使用这两种手段。靶向基因递送在PCT公 开WO 95/28494中描述。
常用于体内或离体靶向和治疗程序的病毒载体是基于DNA的载 体和逆转录病毒载体。构建和利用病毒载体的方法是本领域已知的 (见例如，Miller和Rosman， BioTechniques 1992， 7:980-990)。优选地， 病毒载体是复制缺陷型的，即，它们不能在目标细胞内自主复制。优 选地，复制缺陷型病毒是一种最小的病毒，即，它仅仅保留对于用壳 体包裹基因组以产生病毒颗粒而言必需的基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒的或缺陷的DNA病毒,例如但不限于， 单纯疱渗病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)等。优选缺陷病毒，其全部或几乎全部缺失病毒基 因。缺陷病毒在进入细胞后是非感染性的。使用缺陷病毒载体允许在 特定的、局部的区域施用细胞，而不用担心该载体会感染其他细胞。 因此，可以特异性地靶向特定的组织。特别的载体的例子包括但不限
于缺陷疱渗病毒1 (HSV1 )载体(Kaplitt等人，Molec. Cell. Neu薩i. 1991,2:320-330)、缺少糖蛋白L基因的缺陷疱渗病毒载体、或其他缺 陷疱瘆病毒,体(PCT公开WO 94/21807和WO 92/05263);减毒腺 病毒载体，例如Stratford-Perricaudet等人描述的载4(J. Clin. Invest. 1992，90:626-630;参见La Salle等人，Science 1993， 259:988-990);缺 陷腺伴随病毒载体(Samulski等人，J. Virol. 1987, 61:3096-3101; Samulski等人,J. Virol. 1989， 63:3822-3828; Lebkowski等人，Mol. Cell. Biol.， 1988, 8:3988-3996);和辛德毕斯病毒( 一种甲病毒)(PCT公开 WO 98/06237;美国专利No. 5,091,309)。
许多公司都商业化生产病毒载体，包括但不限于，Avigen, Inc. (Alameda, CA; AAV载体)、Cell Genesys (Foster City, CA;逆转录病 毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)、Clontech(逆转录病毒和杆状 病毒载体)、Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA;腺病毒和AAV载体)、 Genvec (腺病毒载体)、IntroGene (Leiden, Netherlands;l^病毒载体)、 Molecular Medicine (逆转录病毒、腺病毒、AAV和疱渗病毒载体)、 Norgen (腺病毒载体)、Oxford BioMedica (Oxford, United Kingdom;慢 病毒载体)、和Transgene (Strasbourg, France;腺病毒、痘苗病毒、逆 转录病毒和慢病毒载体)。
在另一实施方式中，载体可通过脂转染、作为棵DNA或利用其 他转染促进试剂(肽、聚合物，等等)在体内导入。合成的阳离子脂 质可用于制备在体内转染编码标记物的基因的脂质体(Feigner，等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987， 84:7413-7417; Feigner和Ringold, Science l卿，337:387-388;参见Mackey,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988， 85:8027-8031; Ulmer等人.Science 1993, 259: 1745-1748)。 对于转移核苷酸有用的脂质化合物和组合物描述于PCT专利公开
29WO 95/18863和WO 96/17823和美国专利No. 5，459，127中。脂质可 与其他以靶向为目的的分子化学偶联(见Mackey等人，上述)。被耙 向的肽，例如激素或神经传递质，和蛋白质例如抗体，或非肽分子， 可与脂质体化学偶联。
其他分子对于促进体内核酸转染也是有用的，例如阳离子寡肽 (例如，PCT专利公开WO 95/21931)、衍生自DNA结合蛋白的肽(例 如，PCT专利公开WO 96/25508)或阳离子聚合物(例如，PCT专利 公开WO 95/21931)。 '
也可能在体内作为棵DNA质粒导入载体。用于基因治疗的棵 DNA载体可通过本领域已知的方法导入期望的宿主细胞中，这些方 法例如是，电穿孔、显^f敬注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉 淀、利用基因枪、或利用DNA载体转运体(参见例如，Wu等人，J. Biol. Chem. 1992, 267:963-967; Wu和Wu， J. Biol. Chem. 1988, 263: 14621-14624;加拿大专利申请No. 2，012，311; Williams等人，Pro" Natl. Acad. Sci. USA 1991 , 88:2726-2730)。也可使用受体介导的DNA 递送方法(Cmiel等人，Hum. Gene Ther. 1992, 3: 147-154; Wu和Wu, J. Biol. Chem. 1987， 262:4429-4432)。美国专利Nos. 5,580,859和 5,589,466公开了在哺乳动物中递送外源DNA序列，没有使用转染促 进剂。最近，描述了一种相对低电压、高效率的体内DNA转移技术， 称为电转移(Mir等人，CP. Acad. Sci. 1988, 321:893; PCT公开WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175)。
CD99L2抑制剂的治疗应用
本发明也提供了通过施用本发明的治疗剂治疗或预防与CD99L2 依赖性经内皮迁移有关的疾病和病症(例如，任意一种或多种上述炎 性疾病)的方法。所述治疗剂包括前述抗体分子、小分子、寡肽、蛋 白质，包括可溶性非膜结合的CD99L2,和其组合。
通常，优选施用与受试者相同种的物种来源或物种反应性的产 品。因此，对于人类施用，本发明的治疗方法利用一种抗体分子，该抗体分子优选地来源于人抗体，但可以是来自异源物种例如小鼠的抗 体，其可被人源化或可不被人源化。
为了提高本发明中包含的治疗方法的有效性，这些治疗可与阻断 其他白细胞经内皮迁移相关分子的功能的其他治疗方法联合应用。
CD99L2之外的白细胞经内皮迁移相关分子可包括PECAM。
本发明适用的受试者可以是任何哺乳动物或脊稚动物种，包括但 不限于，牛、马、绵羊、猪、家禽(如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、 小鼠、大鼠、猴、兔、黑猩猩和人。在一个优选实施方式中，受试者 是人。
基因治疗
在一个特定实施方式中，施用包含编码蛋白质(包括但不限于如 上所述的抗体分子，或CD99L2)的序列的载体，以治疗或预防与 CD99L2在白细胞经内皮迁移中的功能相关的疾病或病症。在本发明 的一个特定实施方式中，CD99L2或上述抗体分子在患者的血流中以 可溶性的、非膜结合的形式表达。可溶性CD99L2或抗体分子与位于 白细胞或内皮细胞膜上的CD99L2结合，由此阻止这两种细胞类型的 细胞间结合，并抑制CD99L2-介导的白细胞经内皮迁移。
在本发明的该实施方式中，治疗载体编码一种序列，该序列在细 胞外(具有前导序列)产生本发明的蛋白质。
根据本发明可以使用本领域可用的任何基因治疗方法。示例性的 方法如下所述。
基因治疗方法的综述参见，Goldspiel等人，Clinical Pharmacy 1993, 12:488-505; Wu和Wu， Biotherapy 1991 , 3:87-95; Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1993, 32:573-596; Mulligan, Science 1993, 260:926-932; Morgan和Anderson, Ann. Rev. Biochem. 1993， 62: 191-217; May， TIBTECH 1993, 11:155-215)。可利用的重组DNA技术 领域公知的方法描述于Ausubel等人，(eds.)， 1993， Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; Kriegler， 1990, GeneTransfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY;和 第12、 13章,Dracopoli等人，(eds.), 1994, Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY。适于基因治疗的载体如上所述。
在一个方面，治疗载体包含在适当的宿主中表达本发明蛋白质的 核酸。特别地，所述载体具有与编码蛋白质的序列有效连接的启动子。 启动子可以是诱导型的或组成型的，和任选地组织特异性的。在另一 实施方式中，使用一种核酸分子，其中蛋白质编码序列和任何其他期 望的序列的侧翼为促进在基因组的期望'位点处同源重组的区域，从而 提供蛋白质的染色体内表达(Koller和Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86:8932-8935; Zijlstra等人，Nature 1989， 342:435-438)。
载体向患者中的递送可以是直接的，在此情况中患者直接暴露于 载体或递送复合物，或是间接的，在此情况中细胞首先用载体体外转 化，然后移植入患者中。这两种方法分别作为体内和离体基因治疗是 已知的。
在一个特定实施方式中，载体在体内直接施用，它进入生物体细 胞中并介导蛋白质的表达。这可通过本领域已知的任何方法而完成， 例如，通过构建为适当表达载体的一部分并施用，以4吏其成为细胞内 的，例如，通过利用缺陷或减毒的逆转录病毒或其他病毒载体感染 (见，美国专利No, 4,980,286)，或通过直接注射棵DNA,或通过利 用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic, Dupont);或用脂质或细胞表面 受体或转染试剂包裹，在生物聚合物内包封(例如，聚-S-l-64-N-乙 酰葡糖胺多糖；见，美国专利No. 5,635,493),在脂质体、微颗粒、 或微胶嚢内包封；通过与已知进入细胞核的肽或其他配体连接施用； 或通过与经历受体介导的胞吞作用的配体连接施用(参见例如，Wu 和Wu， J. Biol. Chem. 1987, 62:4429-4432 ),等等。在另一实施方式中， 可形成一种核酸配体复合物，其中配体包含破坏内体的促融合病毒 肽，使核酸避免溶酶体降解。在另一实施方式中，为了细胞特异性摄 取和表达，可通过靶向特定受体而在体内靶向核酸(见例如，PCT公 开WO 92/06180、 WO 92/22635、 WO 92/20316和WO 93/14188)。可选地，核酸可在细胞内导入并通过同源重组结合入宿主细胞DNA中
用于表达(Koller和Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989， 86:8932-8935; Zijlstra,等人，Nature, 1989, 342:435-438)。这些方法是以 上在"病毒和非病毒载体，，中所述的方法的补充。
可选地，也可以施用抗体分子，例如，通过利用例如描述于 Marasco等人Proc. Natl. Acad Sci. USA, 1993,90:7889-7893中的技术， 通过在，标细胞群中表达编码单链抗体的核苷酸序列进行施用。
预期使用的治疗'性核酸的形式和量取决于'疾病的类型和所需效 果的程度、患者状态，等等，并且可由本领域熟练技术人员确定。
制剂和给药
根据本发明使用的治疗组合物可以4吏用 一 种或多种生理上可接 受的载体或赋形剂以任何常规方法配制。
因此，本发明的蛋白质或编码它们的核酸和它们的生理上可接受 的盐和溶剂可配制用于通过吸入(肺)或吹入(通过口或鼻)给药、 经皮给药、或经粘膜给药，包括但不限于口服、含服、经鼻、经眼、 阴道或直肠给药。
对于口服给药，治疗剂可采用例如片剂或胶嚢剂的形式，它是通 过常规方法用药学上可接受的赋形剂制备的，该赋形剂例如是粘合
剂(例如，预凝胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基曱基纤维素)； 填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬 脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，土豆淀粉或羟基乙酸淀粉钠)； 或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠。片剂可通过本领域公知的方法包衣。 口服给药的液体制剂可采用例如溶液、糖浆、乳剂或悬浮液的形式， 或它们可作为在使用前用水或其他适当载体构建的干产物形式存在。 所述液体制剂可通过常规方法利用药学上可接受的添加剂制备，该添 加剂例如是悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氬化可食 用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯树胶)；非水载体(例如， 杏仁油、油脂、乙醇或分馏植物油)；和防腐剂(例如，曱基或丙基-对-羟基苯甲酸酯或山梨酸)。该制剂也可包含适当的緩冲盐、调味剂、
着色剂和甜味剂。
口服给药的制剂可适当地配制为控制释放活性化合物。
对于含服给药，治疗剂可采用以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。
对于吸入给药，根据本发明的治疗剂以来自加压包或喷雾器的气 雾喷雾剂的形式,,利用适当的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、 二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体方便地给药。'在加压喷雾 剂的情况中，可以通过设置递送计量量的阀门来确定剂量单位。例如， 用于吸入剂或吹入剂的明胶胶嚢和药筒，可配制为包含化合物和适合 的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
治疗剂可配制为通过注射例如通过弹丸注射或持续输注肠胃外 给药(例如，静脉内、肌肉内、皮下、皮内)。注射制剂可以单位剂 量形式存在，例如，存在于添加有防腐剂的小瓶或安瓿或多剂量容器 中。组合物可采用诸如在油或水载体中的赋形剂、悬浮液、溶液或乳 液的形式，并且可包含配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。可选 地，活性成分可以为冻干的(即，冷冻干燥的)粉末形式，以在使用 前用适当的载体例如无菌无热原水或盐水构建。
治疗剂也可配制为直肠组合物，例如栓剂或保留灌肠剂，例如包 含常规栓剂基质，如可可脂或其他甘油酯。
除了前述制剂之外，治疗剂还可配制为储库型制剂。这种长效制 剂可通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射而施用。因 此，例如，化合物可用适当的聚合或疏水性材料(例如，作为在可接 受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶性的衍生物， 例如微溶性的盐。
本发明的蛋白质可以在聚乙醇酸/乳酸(PGLA)微球中递送(见 美国专利Nos. 5，100，669和4,849,222; PCT公开WO 95/11010和WO 93/07861)。
本发明的蛋白质可作为具有通过常规化学方法或分子生物学方法连接的一种以上抗体的分离组合物或单个组合物给药。另外，本发 明抗体的诊断和治疗价值可通过它们与放射性核素或毒素例如蓖麻 毒素或化疗剂例如氨甲喋呤联合使用而得以增大。
如果需要，所述组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂或pH緩 冲剂。该组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶嚢、 持续释放制剂、或粉末。口服制剂可包括标准载体，例如制药等级的 甘露醇、乳糖、淀粉、，脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁，等等。
通常，所述成分分开或混合在一起以单位剂量形式提供，例i口， 作为在密封容器例如标示活性剂含量的安瓿或药嚢中的冻干粉末或 无水浓缩物。在组合物通过注射给药的情况中，可提供无菌稀释液的 安瓿，以^吏得成分可在给药前混合。
本发明也提供了 一种包含填满了 一种或多种本发明制剂成分的 一种或多种容器的药物包装或试剂盒。附着在所述容器上的可以是管 理药品或生物产品制造、使用或销售的政府机构所规定的形式的通 知，该通知反映了该机构批准对于人类给药的制造、使用或销售。
如果需要，组合物可以存在于包含一种或多种包含活性成分的单 位剂量形式的包装或分配装置中。所述包装例如可以包含金属或塑料 箔，例如泡罩包装。所述包装或分配装置可附有给药指导。也可制备 包含在相容药物载体中配制的本发明化合物的组合物，置于适当的容 器中，并且贴上治疗说明的疾病的标签。
可利用许多方法导入本发明的制剂；这些方法包括但不限于口 服、脑内、皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内途径，和通 过划痕(通过皮肤顶层的刮擦，例如，使用分叉针)或任何其他标准 给药途径。
有效剂量
本文描述的化合物和载体可以治疗有效剂量施用于患者以治疗 某种疾病或病症。治疗有效剂量指足以在被治疗的受试者中导致健康 益处的治疗量。
35本发明具体实施的在制剂中使用的治疗剂的精确剂量将取决于 给药途径和患者疾病的状态，并且应该根据医师的判断和每个患者的 情况依照标准临床技术决定。术语"抑制"表示降低了可测量的量。本 发明的治疗组合物或疫苗产生这种效果的能力可在体外^^佥测，例如利 用如前所述的经内皮迁移试验来检测。抑制的进一 步实验证据包括观 察动物模型体内炎症的抑制。因此可从动物模型测试系统获得的剂量 反应曲线推断有效剂量。
化合物的毒性和治疗效果可it过标准药学程序在细胞培养物或
实验动物中确定，例如，确定LD5q (导致50%群体死亡的剂量)和
ED5。(在50%群体中有治疗效果的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比 是治疗指数，它可表示为LD5()/ED5()。优选显示出大的治疗指数的治 疗剂。虽然可以使用显示出毒性副作用的治疗剂，但是应该注意设计 一种将所述化合物靶向于患病组织部位的给药系统，以使对于未感染 细胞的潜在损害最小化，并因此减少副作用。
从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类 的 一 定范围的剂量。所述化合物的剂量优选地位于循环浓度的范围 内，所述浓度包括具有很小或没有毒性的ED,所述剂量可在此范围 内改变，依赖于使用的剂量形式和采用的给药途径。对于任何在本发 明方法中使用的化合物，最初可从细胞培养试-验中估计治疗有效剂 量。可在动物模型中设计一种剂量，以获得包括在细胞培养中确定的 ICso(即，达到症状最大抑制的一半的受试化合物浓度)的循环血浆 浓度范围。所述信息可用以更精确地确定用于人的有效剂量。例如， 可以通过高效液相色谦法测定血浆中的水平。
体外变移试验
在 一种典型的在組织培养插入物中的"变移试验，，中，将白细胞放 置于内皮单层上的悬浮液中，所述内皮单层在内源(内皮产生的)或 外源化学引诱物的下孔之上的多孔滤膜上生长。计数在试验结束时终 止于底室中的白细胞作为变移的白细胞，减少其数目的试剂被认为阻断变移。然而，为了获得这些，白细胞必须与内皮结合，蠕动到连接 点附近，穿过内皮渗出，通过内皮下基底层迁移，蠕动穿过滤器支持 物(通常比内皮自身厚许多倍)，并且从滤器下侧分离。阻断本过程 中的任何步骤的任何试剂将被认为阻断变移。
对于经内皮迁移的体外试验，内皮细胞(E.C.)在用纤连蛋白覆 盖的水合I型胶原凝胶上培养。培养基组份渗入多孔凝胶中。生长于 多，滤器上表面的E.C.悬浮于更大的培养容器中。培养基分別置于内
室k外室中以达到单层的顶表面和底表面'。在优选的胶原凝胶方法
中，保持在顶表面上的附着的白细胞可从视觉上与已经变移的区分 开。在过滤室方法中，通过直接计数计算添加到上部室中的白细胞在 下室中出现的百分比。但是，为了计数为"变移的"，白细胞必须l) 附着于内皮的顶表面，2)迁移到细胞间的连接处，3)在内皮细胞之
间渗出，4)从内皮细胞上脱离并渗入它们的基底层中，5)蠕动穿过 滤器自身，并6)从滤器上脱离并落入下面的室中。阻断任何这些步 骤的试剂将因此阻断该系统内的变移的读数。
根据本发明利用的优选的变移试验(即，上面的那个)特别可区 别顶部粘附与变移(l, 5),并且可在内皮下基底层水平上检测变移 细^^的阻断(4)。
经内皮迁移试验
所有的HUVEC、 PMN、 Mo和NK都以单峰分布方式表达PECAM (5， 6, 11, 45)。我们还不能通过表面标记物或形态学辨别被抗 -PECAM试剂阻断的和未被阻断的白细胞之间的任何差异。因此，利 用功能性试验揭示体内替代分子的功能。HUVEC如(48)所述在培 养基199+20%正常人血清中的水合胶原凝胶上培养，并且优选地如以 前发表的那样(l， 45 )进行经内皮迁移试验。单核细胞的迁移可在 存在或不存在内皮的细胞因子刺激的条件下进行。对于研究嗜中性粒 细胞的TEM的实验，通过在试验前四小时添加3 I.U./ml的IL-I(3到 培养基中而活化HUVEC单层。筒言之，以Ficoll/Hypaque梯度从健康供体静脉血中新鲜分离单 核细胞或嗜中性粒细胞，使其在37°C和存在或不存在测试试剂的条件 下置于汇合的HUVEC单层上。优选地，试验在培养基199+0.1%人 血清白蛋白上进行，但当在完全培养基中进行时没有区别(45)。在 对照组进行充分时间的TEM后(通常1小时)，用lmM EGTA充分 清洗单层，以除去任何通过依赖二价阳离子的相互作用仍然附着的白 细胞(选跨素或整合素)，然后用具有二价阳离子的磷酸盐緩冲液漂 洗，并在2.5%戊二醛中固定过夜。这加强了胶原岁i胶，以致当从96 孔板中除去时更容易地操作。这些单层用赖特-吉姆萨染色并置于载 玻片上，在Nomarski光学装置下直接观察。
与内皮单层顶表面的紧密粘附是白细胞迁出中的限速步骤(4 5 ), 并且在紧密粘附后，迁出过程不依赖于剪切应力(56)。因此培养系 统中没有液体剪切应力具有很少的生理学相关性，并且基于这种体外 模型进行的预测在几个体内模型中得到支持(2, 6, 8, 9， 12)。该 试验的关键是观察与汇合的内皮细胞单层相关的原位白细胞。利用
与已经变移的白细月包。然后，可通过目测或通过荧光标记的白细月包的 定量对与单层相关的白细胞的总数进行定量(1, 45),以评价试剂对
与内皮粘附的效果。变移被定量为已经迁移到单层之下、保持与单层 结合的白细胞的百分比。因此，TEM测量不依赖于与单层粘附的程 度，并且可独立地评价抗体或其他试剂对粘附和TEM的效果。
显然，如果白细胞不粘附于内皮表面，它不能变移。有人可能认 为，例如，在抗-CD18存在下正常变移的白细胞群可以是分离的亚群 或可能利用与"CD18依赖性"白细胞(在mAb的存在下不结合)不同 的粘附途径。为解决这一问题，可如下重复对步骤进行了修改的这些 试验优化细胞因子活化条件，使得有多种粘附受体在内皮表面上表 达(E-和P-选择素、ICAM-1、 VCAM-1),以致由于粘附分子过多， 阻断任何特定的一种不会显著影响白细胞群的顶部粘附。TEM试验 将在这些条件下进行。如果测试mAb的存在对粘附的影响最小但是TEM降低，则可以得出如下结论所研究的分子在TEM中起作用， 与它在顶部粘附中的作用无关。标准TEM试验的其他改变将参考特 定条件在下面讨论。
CD99L2在经内皮迁移中的作用
与白细胞或内皮细胞选择性地预结合的CD99L2的纯化的Fab和 F(ab，)2可用于确定萍原对于哪些细胞是关键的。这避免了使用与白细 胞通过其高亲和力Fc受体结合的带有完整Fc的抗体或将内k细胞单 层转化为免疫复合物以及刺激白细胞通过低亲和力Fc受体与结合于 内皮上的mAb粘附中潜在的问题。剂量应答试验将确定最佳阻断浓 度。用PMN重复这些试验。
为了显示白细胞CD99L2对于TEM是关4建的，单核细胞或PMN 在具有饱和浓度的CD99L2的Fab片段(通过流体细胞术确定)的悬 浮液中在4。C下孵育30分钟，然后清洗除去未结合的mAb。将白细 胞加入到未处理的HUVEC单层中，并且常规进行TEM试验。作为 阳性对照，可在持续存在最适浓度的CD99L2的条件下(已知该条件 可阻断TEM )进行TEM试验。如果仅与白细胞结合的CD99L2的Fab 片段对TEM的阻断与同时加入到两种细胞类型中的Fab —样有效， 则可以将其解释为CD99L2对于白细胞是关键的。然而，这并不排除 内皮CD99L2的作用。如果仅仅添加到白细胞中的CD99L2非常差地 阻断TEM，这与带有关键CD99L2的内皮细胞是一致的，可能与白 细胞上的不同分子结合。如果添加到白细胞中的CD99L2部分阻断， 则提示白细胞和内皮细胞上的CD99L2都是关键的，但是它们与相对 的细胞上的不同分子结合。
为了显示内皮CD99L2对于TEM是关键的，汇合的HUVEC单 层与CD99L2的Fab或F(ab，)2片段在通过免疫荧光和流式细胞术确定 可在连接处产生最大和饱和CD99L2染色的条件下孵育。(对于抗 PECAM和VE-钙粘着蛋白的mAb，在4。C孵育l小时就足够了，但 这也可以通过经-睑确定。)清洗掉未结合的mAb,加入未处理的Mo或PMN,将共培养物加热到37。C进行TEM试验。阳性对照也优选地 在持续存在最佳浓度的CD99L2的条件下进行。如果当仅仅向内皮细 胞中加入CD99L2时产生的TEM阻断与两种细胞类型都暴露于mAb 的阳性对照一样强，则提示内皮细胞上的CD99L2是关键的。在这些 条件下较差的阻断提示内皮上的CD99L2在这些条件下是不重要的。 此外，中等水平的阻断提示白细胞和内皮CD99L2是相关的，也许与 彼此上的不同分子结合。 ，
CD99L2在白细胞和内皮细胞上的存在提示白细胞上的CD99li 可能以嗜同性方式与内皮上的CD99L2相互作用。如果通过mAb与 白细胞或内皮细胞结合可获得TEM的最佳阻断，并且当将mAb添加 到两者中时没有加成的阻断，则提示白细胞上的CD99L2与内皮细胞 上的CD99L2以一种类似于PECAM-1的嗜同性方式直4妾相互作用。 这可用克隆的蛋白质直接验证。
对于这些试验中的不完全阻断，存在另外的解释。最通常的一种 是在试验过程中细胞结合的mAb的胞吞作用或破坏，以致它下降到 不足以阻断TEM的水平。如果当mAb在上述试验中与细胞预结合时 存在不完全阻断，这种可能性可通过如下述改变TEM试-睑而l全i正 在CD99L2与期望的细胞类型预结合之后，清洗掉未结合的mAb并 且将细胞保持在4。C。将白细胞添加到在冰上的HUVEC单层中，并 且保持在低温下。在这些条件下，抗体不象保持在单层表面上的白细 胞那样被代谢。在低温下它们粘附得不紧密。当大多数细胞已经固定 时，培养容器迅速在孵箱中升温到37°C,并且白细胞紧密粘附并在 5-10分钟之内变移。免疫荧光显微镜方法证实了大多数mAb在这一 时期最后仍然存在于细胞上。这种方法的修改允许研究添加的mAb 在被代谢之前的效果。
当仅仅添加到一种细胞类型时CD99L2不能阻断TEM的另一种 解释是被mAb CD99L2识别的CD99L2表位不是该细胞类型使用的表 位。例如，如果内皮CD99L2的氨基末端与靠近膜的白细胞CD99L2 的表位相互作用，并且所述CD99L2表位在CD99L2的氨基末端上，则可以预期向HUVEC上添加CD99L2将阻断TEM,但仅仅向白细胞 中添加CD99L2将不阻断TEM。
也可评价CD99L2在粘附事件的顺序中相对于PECAM的位置。 当阻断PECAM功能时，甚至在EDTA存在下，白细胞保持与内皮在 细胞边界紧密粘附。这提示它们通过不同于二价阳离子依赖性整合素 /ICAM相互作用的分子结合。如果白细胞通过CD99L2结合，当添加 阻断性mAb时，它们将被释放。这与CD99L2部分阻断Mo和PMN 粘附的数据是相符的。如果CD99L2^离PECAM较远的步骤中起作 用，则在这一阶段添加mAb将没有效果。
为了显示这一点，进行了几个系列的试验，其中在TEM中首先 用抗-PECAM的mAb阻止白细胞。在第一系列中，随后在持续存在 抗-PECAM的条件下加入CD99L2或同种型对照mAb。如果结合的白 细胞被释放，则CD99L2很可能是在PECAM阻断中结合白细胞的分 子。不能释放白细胞可能是由于多种因素。因此，进行第二组试验， 其中在用抗-PECAM mAb阻止TEM之后，清洗掉抗-PECAM试剂并 且添加CD99L2或对照mAb。在抗-PECAM mAb被清洗掉之后，TEM 恢复正常并且在不存在附加抑制剂的情况下在30-90分钟内完成(1 )。 如果CD99L2在最接近PECAM的步骤中起作用，我们不能预期看见 任何阻断，并且TEM将正常完成。但是，如果CD99L2涉及到远离 PECAM的步骤，我们预期TEM的阻止将会继续。
第三系列的试验可以类似于第二系列进行，其中将应用mAb的 顺序颠倒。首先应用mAb CD99L2阻止TEM,然后在清洗掉CD99L2 之后添加抗-PECAM。在这些试验中，如果抗-PECAM mAb接近于 CD99L2发挥作用，则当CD99L2 一皮清洗掉之后它不应阻止随后的 TEM,但是如果PECAM在很远处发挥作用则应该阻止。由于一皮抗 -PECAM试剂阻止的白细胞保持与内皮细胞紧密粘附，重复颠倒试剂 顺序的第 一 系列试验将是无益的，但可以作为内部对照进行。
CD99L2的表征所述分子的完全功能和重要性的暗示来自几种直接的试验(45 ，
48, 57-59 )。这些生化和免疫研究补充了对该分子进行克隆和测序所 获得的数据。
该蛋白质的生物合成和更新率
在脉冲追踪试验中，在没有甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中预处 理HU，VEC单层1小时，用"S-曱硫氨酸和半胱氨酸代谢标记1小时， 然后在非放射性培养基中进行"追踪"。在不同'的时间点，裂解细胞并 用CD99L2和对照mAb进行免疫沉淀以回收CD99L2和对照抗原。 通过SDS-PAGE分析并进行放射自显影(48 )。通过对放射自显影图 的密度测定或直接通过从凝胶上切下放射性带，相对于内皮膜的其他 标记物例如PECAM-1、 VE-《丐粘着蛋白(连接分子)和ICAM-1或 MHCI类(在质膜上广泛表达)确定合成和翻译后修饰的比率(58， 59)。更新率可直接在独立试验中确定，其中将HUVEC代谢性标记 为稳定状态，然后除去放射性培养基。细胞裂解液的免疫沉淀在超过 两天的时间点进行，并如上所述分析放射性CD99L2和对照细胞标记 物的存在。
CD99L2的替fC形式
裂解内皮细胞、单核细胞、PMN、血小板和淋巴细胞，并用抗 -CD99L2抗体通过Western印迹法才佥测。这种方法已经通过HUVEC 的Western印迹法和免疫沉淀法鉴定了 一种45kD的分子。但是，在 不同条件下(例如，细胞因子刺激)生长的HUVEC可能表达以与静 止条件下细胞不同方式糖基化的选择性剪接形式的CD99L2。这一发 现提示CD99L2在这些条件下具有不同的(或提高的)功能，所述功 能可通过在细胞因子条件下进行TEM试验而直接4企-睑。白细胞可能 表达具有相同CD99L2表位的结构不同的分子。如果这样，该分子在 这些细胞类型以及多于一种的cDNA克隆上可能具有不同的相互作 用或信号途径。与其他分子的结合
在用磷酸緩冲液中的0.1。/。NonidetP-40提取，接着用0.5% NP-40 + 0.1% SDS清洗免疫沉淀物的条件下，没有其他分子与CD99L2从 HUVEC裂解液中共纯化。在不同去污剂条件下从白细胞或EC裂解 液中的免疫沉淀可能揭示了与其他可传导信号或可将其与细胞骨架 连接的分子的结合。基于与商业上可获得的已知信号和结构分子的抗 体的反应性，定这些分子，并且将产生关于信号传导途径或与 CD99L2相互作用的细胞骨架元件的第 一假说。 '
在对炎性细胞因子的应答中CD99L2表达的变化
CD99L2与炎症的关系提示CD99L2可能对炎性细胞因子应答。 当HUVEC被IL-ip、 TNF-a刺激时ICAM-1表达提高(45， 60)。对 于细胞因子处理，PECAM水平不提高，但是IFN-y处理导致PECAM 从连接点向细胞顶表面重新分布(61)。在一个特定试验中，汇合的 HUVEC单层用与炎症相关的细胞因子处理(例如，IL-1(3, 3-10 IU/ml， 6到24小时；IFNy, 100 I.U./ml, 1到3天)，并且利用免疫荧光法 评价表达或分布的变化。已知的细胞因子反应性粘附分子(例如，分 別为ICAM-1和MHC II类或PECAM)可用作阳性对照。表达水平的 变化例如可通过流式细胞术进行定量。
过氧化物酶组织化学法可用于确i在来自人体多种器官的发炎^织 中脉管系统上的细胞表达和分布，并与来自相应普通组织的脉管系统 上的表达对比。多种"废组织，，对于检验是可利用的，例如，来自外科 病理学和尸检标本，或牛皮癣患者的皮肤。可以比较在同一时间来自 同 一人的损害和未损害皮肤，和在时间过程内采集的活检组织。
CD99L2的作用机理
该分子的预测氨基酸序列给出了它潜在功能的线索，如从CD99 中所见(图2)。"序列观察"提供了试验的起始位置。克隆的分子在多种哺乳动物细胞中表达，以确定表达分子使这些细胞具有哪些功能，
例如，类似于连接粘附分子PECAM (7, 49， 53， 65)和VE-钓粘着 蛋白(29)的试验。特别重要的是CD99L2的可溶形式，即，其配体 结合部分的胞外域，其可以用作CD99L2功能的抑制剂。在一个特定 方案中，制备类似于以上所述的PECAM-Ig嵌合构建体的CD99L2-Ig
嵌合体。
CD99L2在白细胞，内皮上的表达提示了它介导这些细胞之间的 嗜同性相互作用。这种介导在以前所述的短期(L-细胞聚集试会)和 长期(培养)试验中得到证实(7， 29, 49， 53, 65 )。
L细胞是显示很小的彼此自然结合倾向性的鼠成纤维细胞系。通 过转染表达外源粘附分子使它们具有这些分子的粘附性质。用 CD99L2 cDNA转染的L细胞通过在10 mM EDTA中短时孵育非酶重 悬浮，清洗，并以106细胞/011在緩冲液中重悬浮。将lml这种悬浮 液置于24孔培养板的每个孔中，并置于90rpm的gyrotory振荡器上。 在零时刻和直到1小时的不同时间点，通过添加戊二醛至终浓度为2% 的终止聚集。如果在表面表达CD99L2的L细胞彼此结合，它们将形 成聚集体，在血细胞计上定量。粘附的温度依赖性和二价阳离子依赖 性在所述试验中容易地被验证。粘附的潜在抑制剂在零时间点加入， 并且定量它们对粘附的效果。特别地，阻断白细胞变移的mAb CD99L2应当阻断粘附。
因为EC和白细胞都有CD99L2,合理地假设CD99L2-介导的粘 附是嗜同性。也就是说， 一种细胞上的CD99L2分子与相对细胞上的 CD99L2分子结合。为了验证该假设，将两种L细胞群体混合。CD99L2 转染体在聚集试验中与等量的荧光标记的亲本细胞混合。在试验最
后，在焚光显微镜下检测聚集体。如果结合是嗜同性的，应该仅有 CD99L2转染体在聚集体中，其是非荧光的。如果结合是嗜异性的 (CD99L2与L细胞表面上内源表达的另一种分子结合)，则可见标 记的和未标记的细胞的混合聚集体。然后变换为标记的群体用其重复 该试-验。这些试验证实了 CD99L2转染的L细胞以嗜同性方式聚集。 这些试验可通过混合CD99L2转染体与白细胞或内皮细胞而重 复，这些细胞推定地包含CD99L2配体。在此例子中，CD99L2转染 体与白细胞或内皮细胞结合，添加CD99L2到转染体中可阻断这种结 合，但添加CD99L2到白细胞或EC中不阻断这种结合。
在长期试验中，转染的细胞与非转染的成纤维细胞在培养物中混 合，其还可通过外源标记而识别。细胞共培养数天，然后用CD99L2 染色以确定分布。如果结合在连'接点是嗜同性的，则CD99L2将仅仅 在转染的细胞相互形成的边界处浓缩，而不在与非转染的细胞形成的 边界处浓缩。
如果在内皮细胞和白细胞上的CD99L2之间的相互作用是嗜异性 的，这产生了在白细胞上具有内皮CD99L2独特性配体和在内皮细胞 上具有白细胞CD99L2独特性配体的可能性。白细胞和内皮细胞上的 CD99L2配体可通过将CD99L2转染体分别与大量放射标记的白细胞 和内皮细胞混合而鉴定。这些细胞在温和去污剂条件下裂解，并且裂 解液通过CD99L2-Sepharose柱。这将结合CD99L2和它附着的配体。 洗脱下结合的物质并且进行SDS-PAGE。放射条带代表候选的 CD99L2配体。这些条带从凝胶上切下，并进行蛋白质测序。
CD99L2在TEM中的功能
CD99L2具有至少两种与炎症相关的功能。它是可潜在地将白细 胞与内皮细胞结合的粘附分子(图12)。抗鼠CD99L2抗体在体内阻 断炎症。特别地，预先注射抗-CD99L2抗体阻止嗜中性粒细胞和单核 细胞(分别是急性和慢性炎症的主要细胞介质)迁移进入发炎的腹膜 腔(图7 )。
已知内皮细胞中细胞内游离钙离子的增多对于TEM是必需的 (66 )。阻断这种增多将抑制变移，但不粘附PMN到内皮细胞上(66 )。 Fluo3 ( Molecular Probes, Eugene, OR)或其他〔&++敏感试剂可用于 确定是否在白细胞/EC接触后很短时间内发生细胞内钙流出(flux)。
45在一个特定实施方式中，洗去汇合的HUVEC单层中的血清，与
Fluo3-AM ( 3.3mM，溶解在Pluronic F-127和DMSO中)在热灭活的 小牛血清中室溫孵育40分钟。这扩散进细胞中，在其中细胞质酯酶 切割乙酸基曱酯，使染料不可透过膜。加入苯磺唑酮(0.25mM)或 丙磺舒(2.5mM)阻断将染料泵出细胞并泵入内体中的有机阴离子转 运体(67)。细胞内钙离子的增多导致Fluo3荧光明显升高，其可在 qytofluo^仪器上定量，通过焚光显微镜显现，或在FITC通道上通过 流 式细胞术#:测。
当白细胞迁移穿过这些载有Fluo3的HUVEC单层时，由于胞质 游离钙离子[(Ca++ ) i]的增多导致荧光升高。钙流出可被CD99L2 mAb 阻断；如果这样，CD99L2是产生这种信号的原因。CD99L2在钙信 号中的直接参与可通过设计CD99L2转染体复制相同现象的条件进行 检测。如果在白细胞和内皮之间的嗜同性CD99L2相互作用刺激 [(Ca++) i]升高，则HUVEC上的CD99L2被mAb的交联也可刺激 [(Ca++) i]升高。
PECAM缺陷小鼠中的变移试验
我们最近产生了组成型表达作为二聚PECAM-IgG嵌合蛋白的可 溶性鼠PECAM的转基因小鼠。具有20(ig/ml循环浓度(对应于最大 阻断炎症的外源施用的PECAM-IgG剂量到达的水平)的Tg82o系小 鼠在动物设备的清洁环境下是健康的，但具有严重钝化的急性炎性应 答。与野生型同窝出生仔相比，它们仅仅动员了 10-20。/。的PMN和单 核细胞。这提示正常的宿主不耐受治疗水平的这种抗-PECAM试剂。 这些小鼠对于研究PECAM在慢性炎症中的作用和长期干扰PECAM 功能对炎性应答的效果是有价值的。这些小鼠也证实了治疗水平的炎 症抑制物(即PECAM-IgG)的表达不抑制基础炎性应答例如亚临床 创伤修复，并且不会使小鼠成为免疫缺陷的。因此，可能长期施用治 疗水平的抗-CD99L2试剂，而对涉及基线免疫功能的细胞没有不利效应。多个实验室已经确定了 PECAM在嗜中性粒细胞(PMN)、单核 细胞(Mo)和自然杀伤细胞(NK)的TEM中起关键作用。PECAM 功能抑制物在几个不同模型中(2, 8-11)在体外(1, 4， 6, 7)和 体内都阻断大多数TEM。但是，甚至在最佳条件下，我们利用单克 隆或多克隆抗体、可溶性PECAM-IgG嵌合体或其组合(4, 6)从来 不能阻断80-90%的TEM。甚至组成型暴露于最大治疗浓度(20mg/ml) 的Tg82o,转基因PECAM-IgG小鼠响应于急性炎症刺激仍然动员 10-20%的白细胞。这些数据提示不依赖于PECAIvi的途径正常存在， 并且当最大PECAM阻断前负责残留白细胞的迁出。在一些炎性病症 特别是慢性病症中，残留TEM当最大有效抗-PECAM治疗前可足够 产生临床症状。因此，鉴定这些替代TEM途径、确定它们如何作用、 并且如何最好地抑制它们是重要的。
在一种急性炎症模型中，其中通过直接对大鼠肠系膜应用趋化性 肽甲酰基-曱硫氨酰基-亮氨酰-苯基丙氨酸(fMLP)刺激嗜中性粒细 胞迁出，抗-PECAM抗体不阻断PMN渗出，但是当用IL-1(3活化肠 系膜小静脉的内皮时同样的抗体阻断PMN渗出(9)。因此，在野生 型动物中至少有一种引起不依赖于PECAM的白细胞迁出的刺激物。 当在C57B1/6系中进行缺失时，靶向PECAM-1缺失的纯合小鼠在多 种急性炎症模型中不显示任何显著缺陷(26)。这些定义的小鼠利用 了替代的TEM机理。但是，当在FVB/n系中进行相同PECAM缺失 时，小鼠不能对急性炎性刺激应答，即使在基线时它们是健康的 (Schenkel等人.，2004, J. Immunol. 173:6403-6408)。
抗-PECAM治疗已经证明可阻断肠系膜(2, 6， 8, 9)、肺(S)、 皮肤(8, 11 )、心肌(10， 12)和(或许)角膜(27)中的TEM。 但是，这造成了在其他脉管床中PECAM作用的重要性更低的可能性。 大多数白细胞在急性炎症部位的迁出穿过毛细血管后小静脉。但是， 在肺中，发生穿过毛细血管的迁出。在动脉粥样硬化症和许多形式的 动脉炎中，白细胞迁出穿过动脉内皮发生。
在体内表征CD99L2的巨大的障碍是在野生型小鼠中抗-PECAM试剂阻断变移。考虑到在动物试验中固有的标准误差，当抗-PECAM
阻断85±10%的白细胞迁出时，鉴定残余的 15%的阻断可能是非常困 难的。因此发展了两种不同类型的小鼠来研究不依赖于PECAM的变 移途径。在这些小鼠中，所有的TEM通过不依赖于PECAM的途径 发生。具有PECAM-1基因靶向缺失的C57B1/6系小鼠具有正常的白 细胞计数，在炎性应答中仅有非常小的缺陷。已经发展了PECAM缺 失的这些小鼠，因>此它们必须利用替代粘附分子进行TEM。另外， 已经发展了组成型表达超治疗水平的可溶性PECAM-IgG無合体的两 种独立的转基因小鼠系[Tg5KHK)和Tgll1()()()],其血液中的循环浓度是 500到2000 jug/ml。虽然当转移给野生型小鼠时他们表达的转基因蛋 白具有完全活性，但矛盾的是，这些小鼠对于抗炎效应是抗性的。由 于这些小鼠在它们的淋巴细胞和内皮细胞上具有正常水平的内源 PECAM,它们一定是利用不依赖于PECAM的途径进行TEM。
PECAM"敲除"的正常炎性表型提示不依赖于PECAM的途径可 从数量上扩大到支持正常水平的TEM。使用转基因小鼠Tg51G(K)和 Tgll咖。的结果提示非常高水平的循环抗-PECAM试剂可使宿主随着 时间对抗炎效应脱敏。这些转基因小鼠用于更充分地表征TEM的 CD99L2途径。
筛选和化学
根据本发明，源于编码CD99L2的基因的核苷酸序列，和源于 CD99L2的肽序列，对于鉴定对治疗炎性病症有效的药物是有用的靶 标。药物靶标包括但不限于(I)源于编码CD99L2的基因的分离的 核酸；(ii)源于CD99L2多肽的分离的肽和多肽；源于CDE99结合 配偶体的分离的肽和多肽；在CD99L2上发现的碳水化合物基团；及
其小分子模拟物或类似物。
特别地，鉴定作为TEM的重要介质的CD99L2可开发筛选试验， 特別是用于高通量筛选上调或下调CD99L2活性的分子。相应地，本 发明涉及利用本领域已知的不同筛选试验鉴定特定的CD99L2配体的方法。
任何本领域已知的筛选技术可用于篩选CD99L2激动剂或拮抗 剂。本发明涉及小分子配体或配体类似物和模拟物的篩选方法，和筛 选在体内结合并激动或拮抗CD99L2的天然配体的方法。所述激动剂 或拮抗剂可以，例如，干扰CD99L2的TEM性质或粘附性质，对 CD99L2功能产生影响。例如，可利用本发明的试验篩查天然产物库， 以筛选激动或拮抗CD99L2,活性的分子。
对CD99L2—级序列的了解，和该序列与具有已知功能的蛋白k 的相似性，可以提供作为该蛋白质抑制剂或拮抗剂的最初暗示。确定 蛋白质的结构特征进一步有利于拮抗剂的鉴定和筛选，例如，利用
X-射线晶体照相术、中子衍射、核磁共振光i普和其他结构确定技术进 行确定。这些技术提供了激动剂和拮抗剂的合理的设计或鉴定。
另一方法利用重组噬菌体产生大文库。利用"噬菌体方法"(Scott 和Smith, Science 1990, 249:386-390; Cwirla,等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:6378-6382; Devlin等人，Science, 1990,49:404-406),可 构建非常大的文库(106-108化学实体)。第二种方法利用主要是化学 的方法,例长口 Geysen的方法(Geysen等人.，Molecular Immunology 1986, 23:709-715; Geysen等人.J. Immunol. Meth. 1987， 102:259-274); 例子有Fodor等人的方法(Science 1991. 251:767-773)。 Furka等人 (14th International Congress of Biochemistry 1988, Vol. 5, Abstract FR:013; Furka， Int. J. Peptide Protein Res. 1991, 37:487-493)、 Houghton (美国专利No. 4,631，211)和Rutter等人(美国专利No. 5,010,175)描述 了制备可检测为激动剂或拮抗剂的肽混合物的方法。
在另一方面，可以利用合成文库(Needels等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993， 90: 10700-4; Ohlmeyer等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993，卯10922-10926; PCT公开WO 92/00252和WO 9428028)等筛选 根据本发明的CD99L2配体。
法用于随机和定向合成基于糖、肽和核酸的化合物。合成化合物文库在商业上可获自Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK)、 Comgenex (Princeton, NJ)、 Brandon Associates (Merrimack, NH)和 Microsource (New Milford, CT)。 一种罕见的化学文库可/人Aldrich (Milwaukee, WI)获得。可选地，细菌、真菌、植物和动物提耳又物形式 的天然化合物文库可从例如Pan Laboratories (Bothell， WA)或 MycoSearch (NC)获得，或容易地产生。另外，天然和合成产生的 文库和化合物通过常规化学、物理和生化方法可容易地修饰(Blondelle 等人，Tib Tech 1996， 14:60)。
体外筛选方法
将候选试剂添加到内皮细胞的体外细胞培养物中，或添加到纯化 的CD99L2 (优选地为稳定的可溶形式，例如，表达为CD99L2/Ig嵌 合构建体)，并且评价它们结合CD99L2的能力(特别对于鉴定候选 化合物的初步筛选)或更优选地，它们抑制白细胞与CD99L2结合的 能力。在内皮细胞培养系统中，可以评价抑制TEM的能力。
上面描述了多种适当的体外系统。
体内筛选方法
表达编码CD99L2的基因的完整细胞或完整动物可用于鉴定并进 一步表征候选药物的筛选方法中。上述的任何动物模型或转基因动物 才莫型适于筛选CD99L2拮抗剂。
在一系列的实施方式中，建立一种7Jc久细月包系。可选地，例如通 过利用上述载体系统导入适当的DNA或mRNA，将细胞(包括但不 限于哺乳动物、昆虫、酵母或细菌细胞)短暂地编程为表达CD99L2 基因。候选化合物的鉴定可利用任何适当的试验进行，包括但不限于 (i)测定测试化合物与CD99L2的选择性结合的试验，(ii)测定测 试化合物改变(即，抑制或增强)CD99L2的可检测活性或功能的能 力的试验，和(iii)测定化合物改变(即，抑制或增强)源于CD99L2 基因启动子(即，调节)区的序列的转录活性的能力的试验。
50利用转基因动物的体内试验
可制备转基因哺乳动物以评价CD99L2的分子机理。优选地，为 了评价用于人类治疗的化合物，动物就CD99L2而言被人源化。所述 哺乳动物提供了筛选或测试药物候选物的很好的模型。术语"转基因，， 通常指其种系和体细胞包含目标转基因即CD99L2的动物。但是，短 期转基因动物可通过离体或体内导入本发明的表达载体而产生。两种 类型，的"转基因"动物预期用于本发明中，例如，评价测试化合物对 CD99L2活性的效果。 '
因此，可制备表达人CD99或人CD99L2或此两者的"敲入"哺乳 动物，用于比应用人类受试者更详细地评^H亥系统的分子生物学。也 可以在人或鼠CD99"敲除"动物中评价化合物或疾病，例如，用于鉴 定可补偿人或鼠CD99活性缺陷的化合物。这两种技术允许操作在细 胞基因组的自然位置中的单个单元的遗传信息，以在最终分化的生物 体的背景中检验该操作的结果。
尽管大鼠和小鼠以及兔最常被用作转基因动物，特别是用于体内 蛋白质功能和基因调节的实验室研究，但是在本发明的实践中可以使 用任何动物。
"敲入"哺乳动物是其中 一种内源基因用 一种异源基因取代的哺 乳动物(Roemer等人，NewBiol. 1991 , 3:331)。优选地，异源基因被"敲 入，，到感兴趣的基因座，这是评价同源基因的表达或功能的对象(在 此情况中基因可以是报告基因，见Elefanty等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998, 95: 11897),因此将异源基因表达与源于适当启动子的转录 耳关系起来。这可通过同源重组、寿争座子(Westphal和Leder. Curr. Biol. 1997, 7:530, 1997)、利用突变重组位点(Araki等人，Nucleic Acids Res. 1997, 25:868)或PCR(Zhang和Henderson, Biotechniques 1998， 25:784) 来实现。参见Coffman, Semin. Nephrol. 1997， 17:404; Esther等人，Lab. Invest. 1996， 74:953; Murakami等人.Blood Press. Suppl. 1996， 2:36。
"敲除哺乳动物，，是在其基因组中包含通过基因打靶方法(见，例 如，美国专利No. 5,777，195和No. 5,616,491 )灭活了特定基因的哺乳动物(例如小鼠)。敲除哺乳动物可以是杂合敲除(即， 一个突变等 位基因和一个野生型等位基因)或纯合突变体(即，两个突变等位基 因)。敲除哺乳动物的制备需要首先向被称为胚胎干细胞的未分化细 胞型中导入用于抑制特定基因表达的核酸构建体。然后将这种细胞注 射入哺乳动物胚胎中。然后将具有整合的细胞的哺乳动物胚胎植入代
孕母体中度过妊娠期。Zhou等人(Genes and Development 1995， 9:2623-34)描述了 PPCA敲除小鼠。
术语"敲除"指细胞内内源DNA序列编码的蛋白i的至少一部分 的表达被部分或全部抑制。术语"敲除构建体"指设计为降低或抑制由 细胞内内源DNA序列编码的蛋白质表达的核酸序列。用作敲除构建 体的核酸序列典型地包含(1 )源于待抑制的基因某部分的DNA (外 显子序列，内含子序列，和/或启动子序列)和(2)用于检测细胞内 敲除构建体的存在的标记序列。将敲除构建体插入细胞中，在阻止或 中断天然DNA序列的转录的位点处与细胞基因组DNA整合。所述插 入通常通过同源重组实现(即，当敲除构建体插入细胞并重组时，与 内源DNA序列同源的敲除构建体的区域相互杂交，导致敲除构建体 并入内源DNA的相应位点)。敲除构建体的核酸序列可包含1 )待抑 制的基因的一种或多种外显子和/或内含子的全部或部分序列，2)待 抑制的基因的全部或部分启动子序列，或3)它们的组合。典型地， 将敲除构建体插入胚胎干细胞(ES细胞)中并整合入ES细胞基因组 DNA中，通常通过同源重组过程进行。然后将该ES细胞注射到发育 的胚胎中并与之整合。然而，本发明并不需要任何特别的方法制备转 基因动物。
通常，对于同源重组，DNA的长度至少为大约1千碱基(kb), 优选3-4kb,因而当导入构建体时为重组提供充分互补的序列。转基 因构建体可以导入ES细胞的基因组DNA中，通过显微注射或通过 任何本领域已知的方法导入已受精卵母细胞的雄性原核中，例如，如 美国专利Nos. 4,736,866和4,870,009， Hogan等人，Transgenic Animals: A Laboratory Manual, 1986, Cold Spring Harbor所述。可以使用转基因建立者(founder)动物繁殖其他的转基因动物；可选地，可以克隆转 基因建立者以产生其他的转基因动物。
在本发明范围内包括其中两种或更多种基因被敲除或敲入或既 有敲除也有敲入的哺乳动物。所述哺乳动物可通过重复本文所述的产 生每种敲除构建体的程序而产生，或通过单个基因被敲除的哺乳动物 互相繁殖并且筛选具有双敲除基因型的动物而产生。
调节的敲除动物，利用多种系统制备，例如tet-抑制子系统(见 美国专利No. 5,654,168 )或cre-lox系统(见美国专利No. 4》59,317 和No. 5，801 ,030)。
高通量篩选
本发明的试剂可通过在高通量试验中筛选来鉴定，该试验包括但 不限于基于细胞或无细胞的试验。本领域技术人员将会预期不同类型 的试验可用于检测不同类型的试剂。最近几年发展了几种自动化测定 方法，其允许在短时间内筛选上万种化合物。特别优选这种高通量筛 选方法。如本发明所提供的，大量纯化多肽的可获得性大大促进了高 通量筛选试验测试试剂的应用。
实施例
通过参考下述实施例将更好地理解本发明，这些实施例用于对本 发明进行说明而不是限制。
实施例1:鼠CD99L2
用人CD99 cDNA克隆探测几种鼠cDNA文库以发现鼠CD99。 当鼠基因组序列开始在公共数据库中积累时，产生了 一个突破。 根据三种EST和一种基因组序列粘粒(分别为Genbank登录号 AI466980、 AW227546、 AW320831和AF125314),预测编码一种^皮 称为XAP89 (X染色体相关蛋白89)的假定蛋白质的推定的开放阅 读框具有与人CD99高度同源的几个区域(Butcher, E. C. 1991 Cell 67:1033-1036)。然而，由于替代密码子的使用，其核苷酸序列与人CD99 显著不同。这种序列用于设计引物，以通过利用鼠胸腺cDNA文库的 5，-RACE完成cDNA序列。 一种843bp的cDNA克隆(图1 )编码一 种237个氨基酸的蛋白质，该蛋白质沿着几个高度保守的片段，特别 是在跨膜结构域，与人CD99具有显著的同源性(图2)。预测该蛋白 质是I型膜蛋白，其类似于人CD99具有几个潜在的O-糖基化位点， 但没有N-连接的糖基化位点。，两种分子的亲水性曲线是类似的。非 糖基化蛋白质的大小预测为25.46kD,稍微大于非糖基化人CD99 (18kD)。这种蛋白质与genebank中的蛋白质的比较显示该分子与人 CD99L2比与人CD99更同源。最接近的匹配是随后作为鼠 CD99L2(GenBank登录号AY078163)提出的序列。这种分子的鼠形式 在本申请中称为鼠CD99L2或muCD99L2。
如基于人CD99的组织表达所预期的那样，在骨髓和胸腺中检测 到muCD99L2的转录物。用Flag-标记形式的muCD99L2克隆转染的 COS细胞在细胞表面上表达在细胞边界处浓缩的该物质，如基于人 CD99局部化所预期的那样(2)。利用从转染的细胞中纯化的鼠 CD99L2接种兔，以产生抗-muCD99L2抗体。来自被免疫兔的免疫J求 蛋白以一种连接方式染色相同的被转染的COS细胞，证实了特异性 染色(图3)。相同的抗血清染色来自鼠外周血的单核细胞、淋巴细胞、 粒细胞和红细胞一已知在人类中具有CD99的所有细胞(未显示)。 而且，在血管内皮细胞上可见特异性的染色，在血管平滑肌细胞上可 见较弱的染色，这类似于用人CD99所发现的(图4)。
被免疫的大鼠用于生产单克隆抗体。来自被免疫大鼠的免疫球蛋 白染色白细胞和红细胞(图5)。对于我们的体内研究幸运的是， muCD99L2在RBC上的表达非常低，允许使用大鼠抗血清进行初步 研究。来自鼠组织的免疫印迹显示了具有大约45kD的表观分子量的 单个条带，其大小类似于在转染的COS细胞中克隆的基因产物的电 泳迁移率(图6)。因此，本发明人已经鉴定、克隆并发展了鉴定 muCD99L2的试剂。实施例2: muCD99L2在体内变移中的作用
初步数据显示了大鼠抗-muCD99L2血清可阻断巯基乙酸盐腹膜 炎模型中的炎症。在巯基乙酸盐给药18小时后检测，抗-muCD99L2 血清，而不是正常大鼠血清，阻断60%的PMN积累并使单核细胞流 入降低到接近背景水平(图7)。使用多克隆兔IgG获得类似的数据。
我们也发展了一种muCD99L2-Fc嵌合体，其中CD99的细胞外 结构域与人IgGl的Fc部分融合。我们已经成功地利用一种类似的 PECAM-Fc嵌合体在体外(34 )和体内('35， 36 )阻断了依赖于PECAM 的步骤的变移。muCD99L2-Fc嵌合体从;帔转染的细胞上清液中纯化， 在SDS-PAGE上表现出预期的100kD的Mr (对于二聚体)(图8 )。 由于muCD99L2在白细胞上的高水平表达和muCD99L2在RBC上的 低水平表达(见图5)，这种试剂具有结合白细胞而不结合RBC的预 期的性质(未显示)。
实施例3:抗-muCD99L2单克隆抗体的产生
雌性Fisher大鼠用100 )ag在COS细胞中产生的muCD99L2-Flag
蛋白质腹膜内免疫，并用同样的材料加强免疫两次。最后一次加强免 疫4天之后，从大鼠个体中收获脾脏，利用聚乙二醇将脾细胞与Y3 大鼠骨髓瘤细胞无菌融合。存活的杂交细胞以每孔"105细胞的密度 接种于11块Costar 96孔板(每块板仅仅使用中间60个孔)的HAT
培养基中。
具有丰富细胞生长的孔中的杂交瘤上清液如前所述通过免疫过 氧化物酶细胞化学法筛选(Muller等人，l989, J. Exp. Med. nO, 399-414)。简言之，培养的表达muCD99L2的COS细胞或亲本细胞 的单层在多聚甲醛中固定，并风干。将2pl小滴的杂交瘤培养上清液 置于细胞顶部，其位置通过在培养板背部所画的格子来确定。在室温 下孵育30分钟之后，清洗培养板并相继在兔抗-大鼠IgG、猪抗-兔IgG 和兔抗-过氧化物酶与辣根过氧化物酶的可溶性复合物中孵育(30分 钟，每次孵育在抗体间进行充分清洗)。各自杂交瘤上清液的反应性通过用二氨基联苯胺-11202显色HRP反应来检测。
液的杂交瘤^t认为是阳性的。重复该试验，并且将6个在两种筛选中 均测试为阳性的杂交瘤在胸腺细胞滋养层中扩增以进行克隆。同时，
通过利用非透化活细胞的流式细胞术;险测这些扩增的培养物抗 muCD99L2的反应性。六个杂交瘤中的两个持续地染色muCD99L2-转染的fOS细胞、muCD99L2-转染的L细胞和鼠白细胞。
从一个杂交瘤(9G5)中产生识别muCD99亡2的稳定的克隆。该 杂交瘤产生抗-CD99L2 mAb (图9 )。 9G5特异性染色muCD99L2-转 染的细胞，因为它不与未转染的COS细胞反应(未显示)。mAb9G5 也与muCD99L2-转染的L细胞选择性反应。将稀释的mAb 9G5培养 上清液(1: 100稀释)与对照L细胞(图10A)或muCD99L2-转染 的L细胞(图10B)反应，用荧光第二抗-大鼠IgG纟企测。用更浓缩 的上清液对转染的细胞可见更强烈的染色，但对于对照细胞则不是这 样。肝素化小鼠血液与正常大鼠血清(图IIA)、 MEC13.3 (大鼠抗-小鼠PECAM;图11B)或9G5 (大鼠抗-小鼠CD99L2;图11C) 一 起孵育30分钟，然后RBC被裂解，清洗细胞，并与AlexaFluor488-标记的山羊抗-大鼠IgG—起孵育以进行流式细胞分析。图ll显示了 mAb 9G5识别小鼠白细胞的主要亚群。
实施例4: muCD99L2的表达提供粘附能力
无酶重悬浮的L细胞成纤维细胞不相互粘附。当这些相同细胞用 PECAM (Muller等人,1992, J. Exp. Med. 175:1401-1404)或人CD99 (Schenkel等人，2002, Nature Immunol. 3: 143-150)转染时，这些分子的 表达使它们具有以依赖于特定粘附分子功能的方式相互粘附的能力。
检测了用muCD99L2转染的L细胞聚集的能力(XFL1细胞；图 12A)。用人CD99转染的L细胞作为阳性对照，用反义方向的人 PECAM转染的细胞作为阴性对照。
转染的L细胞在无血清培养基中清洗，并通过在包含10mM的Hanks'平衡緩冲盐溶液(HBSS)中孵育而重悬浮，直到它们可以从培 养板表面轻轻地吸出，而具有最小的细胞存活力损失。重悬浮的细胞 在冷HBSS中清洗，在包含二价阳离子的温HBSS中以浓度lxl0Vml 重悬浮。对于每个测试样品，24孔培养板的每孔转移lml的细胞悬 浮液。培养板在gyrotory振荡器(90rpm )上在37°C下孵育指定的时 间。为终止反应，向孔中添加戊二醛到终浓度为2%,然后在血细胞 计的室中检测重,浮的样品。对于每个样品，定量血细胞计室中全部 九个方格的单个细胞和聚集体(^3个细胞粘附在一起)"数量(Muller 等人，1992， J. Exp. Med. 175: 1401 - 1404)。
在存在生理水平的Ca+2和Mg+2 (分别为1 mM和0.5 mM)时， CD99L2转染的L细胞以时间依赖方式聚集到类似于阳性对照人 CD99-转染的L细胞的程度(图12A)。作为对比，仅仅用载体转染的 对照L细胞基本不聚集。可进行另外的试验以确定muCD99L2的粘 附相互作用是嗜异性的还是嗜同性的、粘附是否需要二价阳离子、是 否它可被纯化的抗-CD99L2mAb 9G5阻断。
实施例5: TEM中muCD99L2的转基因小鼠研究
muCD99L2在TEM中的作用在两个不同的急性炎症模型中检测， 在所述模型中白细胞与内皮粘附的阻断可与TEM的阻断区别开来。 该试验是巯基乙酸盐培养液腹膜炎试验，和巴豆油耳部肿胀试验。在 每个试验中，定量评价阻断该分子的效果对于血细胞渗出的选择性作 用。检测了 muCD99L2在野生型小鼠中的作用，以观察对其单独阻断 对炎症有何效果。评价了 muCD99L2在PECAM功能被最大阻断的小 鼠Tg820中的作用，以观察它们是否补充PEC AM阻断，或需要PEC AM 阻断来起作用。评价了 muCD99L2在Tg5咖o和Tglh,小鼠中的作 用，以观察它们在PECAM不起作用的条件下如何起作用，并且评价 了其在PECAM敲除小鼠中的作用，以观察在PECAM不存在的情形 下它们如何起作用。这后两种条件在这两种动物模型中可能显示出 muCD99L2的作用在野生型小鼠中可能不明显，在野生型小鼠中
57PECAM在TEM中具有支配地位。
巯基乙酸盐培养液诱导的腹膜炎模型
这种才莫型评价PECAM在TEM中的作用(2, 6)，和其他粘附分 子在急性炎症中的作用(72-74)。系统性注射试剂(阻断性的mAb 或CAM-IgG嵌合体)，并检测它们阻断白细胞进入腹膜腔的能力。收 获肠系膜并用显微镜检查以确定阻断是在粘附水平还是在TEM水 平。在几个先前的研究中，已经明显地证实了当tem被抗PEcXm 的mAb (2)或mPECAM-IgG (6)阻断时白细胞在肠系膜小静脉内 皮上停止，但当粘附被抗CDllbmAb阻断时不是这样。测试的mAb 或同种型对照IgG通过尾静脉静脉内注射。 一个小时后通过26G 3/8" 针头腹膜内注射lml 4%的巯基乙酸盐培养液。对巯基乙酸盐的应答 在18小时测试，以观察试验性干扰对PMN和单核细胞的效果。将时 间过程调节到较短的时间(4-12小时)，以使对PMN的效果更显著， 并且使对MO的效果更显著的时间更晚(可达4天)。在测试时，杀 死小鼠。通过用Hanks平衡盐溶液灌洗而分离腹膜细胞。定量总腹膜 细胞数，并且在赖特-吉姆萨染色的细胞离心涂片上进行差别计数。 为了总WBC计数和差别涂片收集外周血。重要的是确定进入腹膜腔 中的白细胞的减少不是由于循环中数量的减少引起的。选择的器官也 在此时收获，包括肠系膜，在福尔马林中将其固定以进行组织学检查。
巴豆油皮炎试验
这是一种非特异性炎症试验，其中将10ml的巴豆油(2%,在丙 酮橄榄油的4: 1混合物中)应用于小鼠的一只耳朵(72)。对侧耳 接受10ml的载体并作为背景炎症的内部对照。巴豆油产生急性炎症 反应，其中受影响的耳朵变红并肿胀。在组织学上，有肥大细胞的脱 粒和白细胞从局部小静脉向耳真皮软组织中的补充。据我们所知，最 大的白细胞迁出(主要是PMN)发生在应用刺激物后的8小时。测 试阻断TEM的能力的试剂在应用巴豆油1小时前腹膜内注射。
杀死小鼠，除下两只耳朵，检查几个横切片以定量白细胞流出。这可手工操作或利用图像分析软件来定量PMN/mm2。可选地，可以 应用具有荧光标记的抗-PMN mAb,并且利用感光成像仪定量总荧光。 对耳朵的仔细组织学检查也可告诉我们阻断是在TEM水平还是在粘 附水平上。阻断TEM导致PMN在小静脉壁上聚集。这也是一种良好 的系统，其中检验PECAM敲除或PECAM抗性小鼠(高剂量转基因) 通过不同的血管途径(例如，毛细血管而不是小静脉)迁出的可能性， 因为白细胞倾向于停留在与它们々人该模型中迁出的血管相对较近的 位置。
CD99L2在TEM中的作用
测试了抗鼠形式CD99L2的单克隆抗体(mAb)在这些模型中的 阻断能力。抗muCD99L2的mAb预期在体内抑制TEM,其方式与人 CD99在体外抑制人细胞的TEM的方式相同。测试了纯化的、无菌的、 无内毒素的抗鼠CD99L2的mAb的Fab和F(ab，)2片段。
野i藝V、處。由于人CD99在没有PECAM阻断的情况下阻断 TEM,预期鼠形式将在体内类似地起作用。白细胞迁出被最佳浓度的 抗鼠CD99L2 mAb显著抑制。检查小鼠耳朵和肠系膜的小静脉。TEM 中的选择性阻断导致血管壁上的白细胞增多，其反映了这些细胞的迁 出减少。但是，如果CD99L2与比PECAM更早的TEM阶段有关， 则体内阻断CD99L2可能不产生停止在血管壁上的白细胞的表型。如 果与CD99L2相互作用的中断不使它们通过一些其他的机理与内皮紧 密地粘附，则它们可能在血流中被带走，并且在体外在静止条件下产 生的表型将无法看见，尽管迁出的白细胞显著减少。
rgS^小虞。对CD99L2和抗-PECAM抗体的联合作用进行体内 测试。知道阻断白细胞或内皮上的任意两种分子是否能产生体内完全 阻断在临床上是重要的。预期阻断鼠CD99L2和鼠PECAM产生近乎 完全的白细胞迁出的阻断。这通过注射抗鼠CD99L2mAb到Tg820小 鼠和PECAM缺陷小鼠中进行检测，所述小鼠以FVB/n为背景小鼠， 其中PECAM被最大地阻断。可能难以确定(如果不是不可能的话) 体内的阻断部位，因为在FVB/n背景小鼠中的Tg82o和PECAM-缺陷小鼠已经显示了如此多的停止在血管壁上的白细胞。但是，在腹膜腔 或耳朵真皮中的白细胞数的减少应该值得注意。
rg5,。。。和7^ ^, V、處。在这些小鼠中，不依赖于PEC AM的TEM
途径占主导地位，因为这些小鼠似乎不利用它们自己的PECAM。抗 鼠CD99L2的单克隆抗体可能比在野生型小鼠中具有更大的效果。在 此坚持关于在流动状态下与变移相比更可能阻断粘附的观点，与野生 型^、鼠一样。 ，
在C575〃6 ff,的i^C4Af-^潜V、處。PECAM敲除 小鼠必须利用不依赖于PECAM的TEM途径。它们移动与野生型小 鼠相同数量和类型的白细胞到炎症部位，因此它们扩大了对这些途径 的利用以支持正常水平的TEM。在这些条件下，可以简单地观察到 阻断替代的粘附分子的效果。确定敲除小鼠用于TEM的分子与那些 具有PECAM但不能利用它的小鼠(例如，Tg5!。。。和Tglh。。Q)所使 用的分子是否相同是有益的。
实施例6: muCD99L2"敲除"小鼠的产生
构建打靶载体以在C57B1/6背景中产生muCD99L2敲除小鼠是 复杂的，需要连接散布有LoxP位点的鼠基因组DNA的大片断。这 种策略用于产生打靶载体，在全基因组切除muCD99L2导致胚胎致死 性的情况下，该载体可用于产生传统的"敲除"小鼠(通过同源重组替 换muCD99L2)和可诱导的转基因小鼠。
打靶载体将muCD99L2的外显子4-6置于来自muCD99L2基因 的内含子DNA的长臂和短臂之间(图13)。存在一个新霉素抗性盒， 用于正选择打靶载体已正确插入其中的胚胎干细胞中，而编码白喉毒 素A片段的下游盒将引起非同源重组的整合事件。发生这些不希望的 事件的ES细胞将因此不在培养物中生长。
如果意图通过同源重组删除muCD99L2将导致胚胎致死性，则 "Cre-LVox"方法可用同样的构建体产生可诱导的敲除。在这一例子中， 通过将Cre重组酶瞬时转染到ES细胞中并选择已经选择性清除了Neo抗性盒的克隆，从LoxP位点中删除新霉素抗性基因。将产生的
ES细胞注射入表达Cre重组酶的转基因小鼠的胚泡中。这种重组酶 将特异性切开DNA中的LoxP位点，导致两者之间的基因组部分一 在此情况下为鼠CD99L2的外显子4-6—的删除。存在以组织-(甚至 细胞-)限制性的方式表达可诱导形式的Cre重组酶的转基因小鼠。因
由于打,耙构建体的大尺寸，无法获得允许从较十片段逐片构建该 载体的限制性酶。MultiSite Gateway克隆系统(Invitrogen)利用了噬 菌体整合位点允许同时连接多个DNA片段。
测试该载体，以确保当它并入基因组DNA时可被4笨针检测到， 并且在ES细胞中的muCD99L2序列不包含将会改变对于检测整合关 键性的限制性酶切位点的多态性。
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本发明不限于在此描述的特定实施方式的范围。实际上，除了在 此描述的之外，本领域技术人员根据前述描述应当明白本发明的多种 修改。所述修改落入所附的权利要求的范围之内。
进一步应当理解的是所有数值是近似的，是为了说明而提供的。 在此引用的所有专利、申请、出版物、实验方法、文献和其他材 料均引入本文作为参考，包括这些文献引用的文献。
权利要求
1. 一种调节白细胞的经内皮迁移(TEM)的方法，所述方法包括抑制CD99L2介导的白细胞穿过内皮的变移。
2. 根据权利要求1的方法，其中CD99L2位于内皮细胞上。
3. 根据权利要求1的方法，其中CD99L2位于白细胞上。
4. 根据权利要求1的方法，其中TEM在活化的内皮细胞之间发生。
5. 根据权利要求4的方法，其中所述活化的内皮细胞由于与选自 肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-1 (IL-1 )的促炎细胞因子接触而被 活化。
6. 根据权利要求1的方法，其中内皮细胞存在于保持在组织培养 中的切下的内皮组织上。
7. 根据权利要求1的方法，其中内皮细胞在透性膜上在体外培养。
8. 根据权利要求7的方法，其中内皮细胞是人脐静脉内皮细胞 (HUVEC )。
9. 根据权利要求1的方法，其中穿过组织中的内皮细胞而发生 TEM,所述组织选自动脉内皮、静脉内皮、小静脉内皮和毛细血管后 小静脉内皮。
10. 根据权利要求1的方法，其中发生进入炎症部位的TEM。
11. 根据权利要求1的方法，其中抑制CD99L2介导的白细胞变移 包括将白细胞、内皮或此两者与CD99L2结合抑制剂接触。
12. 根据权利要求11的方法，其中CD99L2结合抑制剂是一种抗 -CD99L2抗体分子。
13. 根据权利要求12的方法，其中抗-CD99L2抗体分子具有 CD99L2单克隆抗体的结合特异性。
14. 根据权利要求11的方法，其中CD99L2结合抑制剂是一种可 溶性CD99L2分子或其片段。
15. —种在体内治疗炎性病症的方法，所述方法包括抑制CD99L2 介导的白细胞的经内皮迁移(TEM)。
16. 根据权利要求15的方法，其中穿过组织中的内皮细胞而发生 TEM,所述组织选自动脉内皮、静脉内皮、毛细血管内皮、小静脉内 皮、和毛细血管后小静脉内皮。
17. 根据权利要求15的方法，其中炎性病症是一种急性炎性病症。
18. 根据权利要求15的方法，其中炎性病症由感染引起。
19. 根据权利要求15 ^方法，其中炎性病症是一种慢性炎性病i。
20. 根据权利要求15的方法，其中抑制CD99L2-介导的TEM包 括将白细胞、内皮或此两者与CD99L2结合抑制剂接触。
21. 根据权利要求20的方法，其中CD99L2结合抑制剂是一种抗 -CD99L2抗体分子。
22. 根据权利要求21的方法，其中抗-CD99L2抗体分子具有 CD99L2单克隆抗体的结合特异性。
23. 根据权利要求20的方法，其中CD99L2结合抑制剂是一种可 溶性CD99L2分子或其片段。
24. —种抗-CD99L2单克隆抗体分子，其中该抗-CD99L2单克 隆抗体抑制CD99L2介导的白细胞的经内皮迁移(TEM)。
25. 权利要求24的单克隆抗体分子，其结合单核细胞、血小板和 粒细胞或内皮细胞上的CD99L2。
26. 权利要求25的单克隆抗体分子，其具有CD99L2单克隆抗体 的结合特性。
27. 权利要求26的单克隆抗体分子，它是一种人源化单克隆抗体。
28. —种筛选可抑制CD99L2介导的白细胞TEM的化合物的方 法，所述方法包括鉴定结合CD99L2的化合物。
29. —种筛选抑制CD99L2介导的白细胞TEM的化合物的方法， 所述方法包括鉴定抑制白细胞与CD99L2结合的化合物。
30. 根据权利要求29的方法，其中所述化合物抑制白细胞与内皮 细胞的结合。
31. 根据权利要求29的方法，其中所述化合物抑制白细胞变移。
32. 根据权利要求31的方法，其中在所述化合物的存在下在促进 白细胞变移的条件下体外共培养白细胞和内皮细胞，进一步包括检测 白细胞穿过内皮细胞的变移程度。
33. 根据权利要求29的方法，其中所述化合物与CD99L2结合。
全文摘要
本发明提供了调节白细胞经内皮迁移(TEM)的方法和组合物。特别地，抑制TEM可提供一种治疗炎性病症的有效的治疗方法。本发明特别涉及粘附分子CD99L2介导白细胞TEM的发现。CD99L2存在于内皮细胞和白细胞上，并且介导白细胞-内皮细胞粘附。利用特异性抗体阻断CD99L2阻断了白细胞向炎症部位的迁移。CD99L2显示与结构相关分子CD99具有功能相似性，它的抑制与PECAM的抑制协同导致几乎全部的TEM阻断。因此，阻断内皮细胞或单核细胞上的CD99L2可阻断80-90％的迁移。与PECAM抑制剂协同，TEM阻断作用可达到100％。涉及CD99L2抑制的治疗方法在治疗炎性病症中显示出重要的希望。
文档编号A61K39/385GK101437539SQ200680024804
公开日2009年5月20日 申请日期2006年6月30日 优先权日2005年7月5日
发明者A·R·申凯尔, W·A·马勒 申请人:康奈尔研究基金会(有限公司)