抗凝剂及其用途的制作方法

专利名称：抗凝剂及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及血液学领域且尤其涉及止血的分科领域。更具体来说， 本发明涉及l)抑制哺乳动物血液凝固的药剂，以及这些药剂在治疗和 预防诸如中风、心肌梗塞以及深部静脉血栓形成的疾病中的应用；2) 在如下临床情况下(诸如血栓形成、血栓性栓-了以及不稳定的斑块等) 能诊断和鉴定活化血小板的探针。
背景技术：
血管损伤后机体控制血流的能力对延续生存至关重要。血液凝固 的过程以及受损组织修复后随后的血凝块溶解被称为止血。止血由血 管整体性丧失后的一系列按固定顺序发生的事件组成。这个过程的起始阶段是血管的縮窄，由此限制了损伤部位的血液 流动。下一步，血小板经凝血酶活化并聚集在损伤部位，形成一个暂 时的、疏松的血小板栓子。纤维蛋白原主要负责刺激血小板的聚集成 块。血小板通过与血管内皮内层破裂后暴露出的胶原结合而聚集成块。 在活化过程中，血小板释放5'-二磷酸腺苷(ADP)和TXA2(活化更多的 血小板)，5-羟色胺，磷脂，脂蛋白以及其他对于凝固级联反应很重要 的蛋白质。除了诱发分泌，活化的血小板还改变其形状以适应栓子的 形成。为确保初步形成的疏松血小板栓子的稳定性，会形成一纤维蛋白 网(也称作血凝块)并把栓子网住。最后，血凝块必须被溶解使正常血流 在组织修复后再流通。血凝块的溶解通过纤维蛋白酶的作用而发生。两条途径引起纤维蛋白凝块的形成内源性途径和外源性途径。 虽然这两条途径是通过截然不同的两种机制启动的，但它们都会会聚 到一条共同的通路通向弓I起凝块形成。在组织无损伤的情况下对异常 血管壁反应而形成的红色血栓或凝块是内源性途径的结果。而对组织损伤反应形成的纤维蛋白凝块则是外源性途径的结果。以上两种途径 均很复杂，且均涉及众多不同的称为凝血因子的蛋白质。血小板活化和血管假性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)止血如要发生，则血小板必须粘附到暴露的胶原上，释放其颗粒 的内容物，并发生聚集。血小板粘附到内皮细胞表面暴露的胶原是通 过血管假性血友病因子(vWF)介导的。vWF的功能是在血小板表面的 一个特异糖蛋白(GPIb/IX)和胶原纤维之间搭起一座桥梁。除了在血小 板和内皮细胞表面上暴露的胶原之间作为桥梁的作用以外，vWF结合 到凝血因子VIII并使其稳定。凝血因子VIII和vWF的结合对于凝血因子vm在血液循环中的正常生存是必需的。vWF是一种复杂的多聚糖蛋白，其产生并存储在血小板内。vWF 还能被巨核细胞合成，而且还发现vWF与内皮下结缔组织有关。血小 板的活化最初是由凝血酶与血小板表面特异性受体结合而诱导的，从 而启动信号转导级联反应。凝血酶受体偶联在一个G-蛋白上，而G-蛋白反过来激活磷脂酶C-y(PLC-Y)。PLC-Y水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸 (PIP2)，导致肌醇三磷酸(IP3)和甘油二酯(DAG)生成。IP3再诱导细胞 内储库的Ca^释放，DAG则激活蛋白激酶C(PKC)。血小板粘附的胶原以及细胞内C的释放导致磷脂酶A2(PLA2) 活化，然后水解膜磷脂，从而使花生四烯酸释放。花生四烯酸的释放 引起血栓烷A2(TXA2)的生成增加及其随后的释放。这是另一种通过 PLC-Y途径的血小板活化剂。另一种被胞内(^2+储库释放激活的酶是 肌球蛋白轻链激酶(MLCK)。活化的MLCK使肌球蛋白轻链磷酸化， 磷酸化的肌球蛋白轻链与肌动蛋白作用，导致血小板形态和运动力发 生变化。PKC的众多效应之一是一个特异的47,000-道尔顿血小板蛋白的磷 酸化和活化。该活化蛋白诱导血小板颗粒内容物释放；其中之一就是 ADP。 ADP进一步刺激血小板增强总的活化级联反应；其也能改变血 小板膜，使纤维蛋白原粘附到血小板表面，引发纤维蛋白原诱导的血 小板聚集。血小板的活化对于血小板聚集形成血小板栓是必需的。然而活化 血小板表面磷脂在凝血级联反应活化过程中的作用同样重要。当血液和暴露的内皮细胞表面接触以后，内源性凝血机制启动。外源性途径和内源性途径的交汇点在因子X活化为因子Xa。因子Xa 有一种功能是将因子VII进一步活化为VIIa。活性因子Xa也能水解 并活化凝血酶原变成凝血酶。然后，凝血酶激活因子XI、 VIII和V， 进一步推进级联反应。最终凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，并 激活因子XIII成为XIIIa。因子XIIIa(又称谷氨酰胺转移酶)交联纤维蛋 白聚合物使血凝块固化。凝血的内源性途径需要凝血因子vm、 IX、 X、 XI和XII。也需要 激肽释放酶原和高分子量激肽原的蛋白以及从血小板释放的钙离子和 磷脂。参与两种途径的各要素最终使因子X(无活性)转化为因子Xa(有 活性)。当激肽释放酶原、高分子量激肽原、因子XI和因子XII接触到 带负电的表面时就启动了内源性途径。这称为接触期。胶原暴露于血 管表面是接触期的主要刺激。接触期各成分的集中导致激肽释放酶原转变为激肽释放酶，激肽 释放酶反过来活化因子XII成为因子XIIa。然后因子XIIa可水解更多 的激肽释放酶原，使之成为激肽释放酶，建立起一个彼此互相激活的 级联反应。因子XIIa也能将因子XI激活成为因子XIa，并引起缓激肽 释放，缓激肽是一种源自高分子量激肽原的强有力的血管扩张剂。在有012+存在的条件下，因子XIa活化因子IX为因子IXa。因子 IX是含维生素K依赖的Y-羧基谷氨酸残基(gla)的酶原，其丝氨酸蛋白 酶活性在C^+结合到这些gla残基后被激活。级联反应的若干丝氨酸 蛋白酶(因子II、 VII、 IX和X)都是含gla的酶原。活化的因子IXa在 一个内部精氨酸-异亮氨酸键处将因子X切断，由此激活因子Xa。因子Xa的活化需要活化的血小板表面上集中有tenase复合体(Ca2〖 和因子Villa、因子IXa和因子X)。血小板对活化的反应之一是将磷脂 酰丝氨酸和磷脂酰肌醇提呈至其表面。这些磷脂的暴露使tenase复合 体得以形成。因子VIII在这个过程中的作用是以因子VIIIa的形式作 为因子IXa和因子X的受体。因子VIIIa被称为凝血级联反应的辅因子。因子vn[活化为因子vniia(事实上的受体)在微量凝血酶的存在下即可发生。当凝血酶浓度增加了以后，因子vnia最终被凝血酶裂解和灭活。凝血酶对因子VIII的这种双向作用限制了 tenase复合体的形成， 因而也限制了凝血的级联反应。如上所述，活化的因子Xa是内源性和外源性凝血级联反应会聚的地方。在损伤部位处对组织因子(因子m)释放的反应启动了外源性途径。组织因子在因子VIIa催化的因子X活化中是辅因子。含gla残基 的丝氨酸蛋白酶，因子VIIa裂解因子X成为Xa，其方式与内源性途 径的因子IXa活化完全相同。因子VII的活化需要通过凝血酶或因子 Xa的活化。因子Xa活化因子VII的能力在内源性和外源性途径之间 建立了联系。在两种途径之间的另一种联系是组织因子和因子Vila活 化因子IX的能力。但还有一些不明确的地方，似乎在因子VIIa和组 织因子之间复合体的形成相信是整个凝血级联反应中的主要步骤。抑 制外源性途径的主要机制发生在组织因子一因子VlIa—C^+—Xa复合 体处。而蛋白质LACI (脂蛋白相关凝血抑制物)可特异地结合这种复合 体。LACI也被称为外源性凝血途径抑制物(EPI)或者组织因子通路抑制 物(TFPI)，过去曾被称为anticonvertin。 LACI由三个串联的蛋白酶抑制 物结构域组成。结构域1结合因子Xa，结构域2只在因子Xa存在时 才结合因子VIIa。凝血酶原转化为凝血酶外源性和内源性凝血途径的共同点是因子X活化为因子Xa。因子 Xa活化凝血酶原(因子n)成为凝血酶(因子IIa》凝血酶反过来将纤维 蛋白原转化为纤维蛋白。凝血酶的活化发生在活化的血小板表面，且 必须形成凝血酶原酶复合体。此复合物由血小板磷脂、磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、Ca2+、因子Va和因子Xa，以及凝血酶原组成。因子V 在凝血酶原酶复合体形成过程中是辅因子，类似于因子VIII在tenase 复合体形成中的作用。同因子VIII活化一样，因子V被微量活化成因 子Va，并通过凝血酶水平的升高而灭活。因子Va结合到活化血小板 表面上的特殊受体上，并与凝血酶原和因子Xa组成复合体。凝血酶原是一种N端区域含有十个gla残基的单链蛋白，分子量 为72,000-道尔顿。在凝血酶激酶复合体中，凝血酶原被因子Xa在两处切断，产生含有A和B链的双链活性凝血酶分子，这两条链通过一 个二硫键连接在一起。除了在活化纤维蛋白凝块形成中的作用以外，凝血酶还在凝血过 程中起重要的调节作用。凝血酶与存在于内皮细胞表面的血栓调节素结合，形成复合体，该复合体将蛋白C转化为蛋白Ca。辅因子蛋白S 和蛋白Ca降解因子Va和因子VIIIa，从而限制了这两种因子在凝血级 联反应的活性。凝血酶还可以结合G-蛋白偶联蛋白酶激活受体(PAR，具体是 PAR-1、 PAR-3和PAR-4)并使其释放。这些蛋白的释放导致众多信号 级联的激活，反过来又增加了白介素IL(IL-1和IL-6)的释放、细胞间 粘附分子-l(ICAM-l)以及血管细胞粘附分子-l(VCAM-l)的分泌。凝血酶诱导的信号传递也能使血小板活化和白细胞粘附增加。凝血酶还能 激活凝血酶可活化的纤溶抑制物(TAFI)，从而调节纤维蛋白溶解(纤维 块的降解)。TAFI也被称为羧基肽酶U(CPU)，其活性能从部分降解的 纤维蛋白切除C-端赖氨酸。这将有损于纤溶酶原激活，从而减少纤维 蛋白凝块溶解的速率(即，纤维蛋白溶解》凝血酶水平的控制机体不能控制活性凝血酶的循环水平将导致可怕的后果。凝血酶 活性的调节有两种主要的机制。凝血酶在循环中的主要形式是无活性 的凝血酶原，其活化需要上述的凝血级联中的酶原激活通路。在级联 中的每一步，都有反馈机制调节活性酶和无活性酶之间的平衡。凝血酶的激活也被四种特异性凝血酶抑制物所调节。抗凝血酶III 是最重要的一种，因为它还能抑制因子IXa、 Xa、 XIa和XIIa的活性。 抗凝血酶ffl的活性在有肝素存在的条件下通过以下方式得以强化肝素结合到抗凝血酶m上的特异位点，改变了蛋白质的构象，新构象对凝血酶和其的其他底物有更高的亲和力。肝素的这种效应是其作为临床抗凝剂的基础。抗凝血酶m的天然肝素激活剂以血管内皮细胞表面上的肝素和硫酸肝素而存在。这种特性能控制内源性凝血级联的激活。尽管如此，凝血酶活性还受到(x2-巨球蛋白、肝素辅因子n和(xi-抗胰蛋白酶的抑制。虽然对凝血酶调节作用较弱，al-抗胰蛋白酶却是人血清中主要的丝氨酸蛋白酶抑制物，其生理学意义由下面的事实而 证明该蛋白在肺气肿的发生中具有决定性的作用。纤维蛋白原活化为纤维蛋白纤维蛋白原(因子1)由三对多肽链组成([A-a][B-(3]M)2。这六条链在 其近N-端通过二硫键共价连接。A-cc和B-卩链的A和B部分分别包含 纤维蛋白肽A和B。纤维蛋白原的纤维蛋白肽区域含有若干谷氨酸和 天冬氨酸残基，这些残基对此区赋予了高度的负电荷，且有助于纤维 蛋白原在血浆中的溶解度。活化的凝血酶为丝氨酸蛋白酶，该蛋白酶 在纤维蛋白肽和该蛋白a、b部分之间的4个精氨酸-甘氨酸键处水解纤 维蛋白酶原。凝血酶介导的纤维蛋白肽释放产生了带有(oc-(3-力2亚单位结构的纤 维蛋白单体。这些单体以规律的阵列自发聚集，形成较弱的纤维蛋白凝块。除了纤维蛋白活化以外，凝血酶将因子xm转化为因子xnia，后者是高度特异的谷氨酰胺转移酶，其在谷氨酸中酰胺氮和纤维蛋白 单体内赖氨酸的e-氨基之间引入了由共价键组成的交联。纤维蛋白凝块的溶解纤维蛋白凝块的降解是纤维蛋白溶酶的功能。纤维蛋白溶酶是一 种丝氨酸蛋白酶，其以无活性的酶原(纤溶酶原)形式进行循环。任何游 离的循环纤维蛋白溶酶会迅速地被a2-抗纤溶酶抑制。纤溶酶原与纤维 蛋白原和纤维蛋白都结合，因此能在凝块形成时结合在凝块中。组织 纤溶酶原激活物(tPA)以及尿激酶(程度较小)都是将纤溶酶原转化为纤 维蛋白溶酶的丝氨酸蛋白酶。，无活性tPA在损伤后从血管内皮细胞 中释放出来；其结合到纤维蛋白并因此被活化。尿激酶则以尿激酶原 的前体形式由上皮细胞内层分泌导管产生。尿激酶的作用是激活可在 这些导管中沉积的纤维蛋白凝块的溶解。活性tPA裂解纤溶酶原为纤溶酶，纤溶酶再消化纤维蛋白，产生 可溶性降解产物，该产物既不与纤溶酶结合，也不与纤溶酶原结合。 随着纤溶酶原和纤溶酶的释放，它们迅速被其各自的抑制物灭活。tPA 活性的抑制源于与特异抑制蛋白的结合。至少有4种独特的抑制物已经被发现，其中2-纤溶酶原激活物抑制剂1型(PAI-1)和2型的生理学 意义是最大的。从上面的叙述可以看出，凝血涉及的生理学机制极其复杂，要理 解的是在设计或鉴定能安全地调控凝血过程中的许多相关通路的药剂 是非常困难的。凝血系统的多重级联反应使其触发信号得以巨大的放大。以外源性凝血为例，前转变素(proconvertin)(VII)、 Stuart因子(X)、 凝血酶原以及纤维蛋白原在血浆中的浓度分别为<1、 8、 150和 4000 mg/mL。因此， 一个很小的信号很快被放大为有效的止血控制。凝血必须严格地受到调控，因为任何一个不恰当的血凝块都可以 造成致命的后果。的确，血液凝块就是中风和心脏病发作的主要原因， 这两种情况是人类死亡的两种主要因素。所以，凝血的控制是医学上 关心的一个主要问题。若干抑制剂已被开发出来，它们抗凝作用的机 制不同。这些抑制剂包括肝素类、香豆素类和1，3-茚满二酮。肝素是一种粘多糖，分子量6，000 40，000 Da，大多数市售肝素制 剂的平均分子量为12,000 15,000。多聚链由经内糖苷键连接的D-葡 糖醛酸和糖醛酸的双糖重复单位组成。糖醛酸残基可以是D-葡糖醛酸 或L-艾杜糖醛酸。在这些单糖残基上的少数羟基基团可被硫酸化，形 成带高度负电荷的聚合物。每个糖类残基平均负电荷为大约2.3。肝素的关键结构单位是其独特的五聚糖序列。这个序列由三个D-葡糖胺和两个糖醛酸残基组成。中心的D-葡糖胺残基包含一个独特的 3-0-硫酸根部分，其在该序列之外很少见。肝素和抗凝血酶形成高亲和力的复合体。抗凝血酶-肝素复合体的 形成极大地增强了两种主要促凝血蛋白酶(因子Xa和凝血酶)的抑制速 率。正常情况下抗凝血酶单独对这两种酶的缓慢抑制速率( 103-104 M/s)可被肝素提高大约1,000倍。这两种蛋白酶的活性形式的加速灭活 防止了随后纤维蛋白原到纤维蛋白的转化，而这对血凝块的形成至关 重要。肝素相对无毒，但使用过量或过敏可引起过度的出血。对于这些 过度的出血并发症可用鱼精蛋白作解毒药。香豆素类及其衍生物是主要的口服抗凝剂。华法令是香豆素的衍 生物，在市场上销售的是R、 S异构体的外消旋混合物。香豆素起效慢，体内在4 12小时的潜伏期后发挥作用，其药效 持续1.5 5天。起效慢的原因可能是需要一段时间来降低药物前体凝 血酶原的血浆水平，而华法令所观察到的长药效时间可能是肝脏重新 合成凝血酶原至前体药物的血液水平所需要的滞后期引起的。香豆素类和1,3-茚满二酮(见前)还有一个缺点是它们和某些药物会发生相互作用。例如口服抗凝剂的效果会被保泰松和水杨酸盐增强，却会被巴比妥酸盐和维生素K所拮抗。在凝血酶原生物合成中，香豆 素类是维生素K的竞争抑制物。凝血级联反应依赖于一个非常重要的步骤中的凝血酶原到凝血酶的转化。但这种转化取决于凝血酶原N-端上的10个g-羧基谷氨酸(GLA) 残基的存在。多个Gla残基形成了 012+的结合位点。 一般情况下，凝 血酶原的10个谷氨酸残基(Glu)在翻译后修饰中转变为Gla残基。这种翻译后修饰是由维生素K还原酶和维生素K环氧化物还原酶 催化的。维生素K是此转化反应的辅因子。这样，维生素K就在还原 型和环氧化物型之间循环。由于和维生素K在结构上的相似性，香豆 素类被认为能结合酶类，维生素K还原酶和维生素K环氧化物还原酶， 而不促使凝血酶原的Glu残基转变为Gla。因此，凝血酶原不会和因子 Xa发生作用。在本领域中1,3-茚满二酮自上世纪四十年代就被认为是抗凝剂。茴 茚二酮的起效和持续时间类似于香豆素类。茴茚二酮的主要缺点是其 副作用。某些患者对它过敏，出现皮疹、发热和白细胞减少。尽管总体上能达到一些益处，但目前使用的治疗性抗凝剂仍然是 发病率和死亡率的主要原因，这是由于抗凝剂的疗效有限和更多的是 出血并发症所引起的。为克服这些问题，已经开发了许多新的药剂。 但看起来治疗用抗凝剂无法避免其固有的问题，即效果越好，出血并 发症越多。以凝血为耙标的抗凝剂可能代表着能打破上述的致命性的 恶性循环。如果把针对凝血特异性抗原表位的抗体和抗凝剂融合起来， 则能使抗凝剂富集在血凝块上而使抗凝剂在血液中的循环浓度保持低 水平。成功的血凝块靶向作用取决于选择作为靶标的抗原表位丰度和特 异性。过去的研究证明纤维蛋白可用于血凝块靶向。但纤维蛋白或纤 维蛋白降解产物可在血中循环，导致抗凝剂在循环中的错误靶向。在本领域中更进一步的问题涉及到凝血疾病的诊断。 一般公认的 是许多凝血性疾病可被预防，或者至少被防止进展至更严重的地步。 因此，对临床医生而言需要有一种诊断早期凝血障碍的指标。这就是本发明要克服或减轻现有技术问题的一个方面，即提供一 种有效但又不延长凝血时间的抗凝剂。本发明进一步提供了诊断一种 凝血相关障碍的方法和试剂。包括在本说明书中的对文件、法条、材料、论文以及类似物的讨 论仅是为了理解本发明而提供一些背景知识。并不推荐或代表任意的 或所有的这些内容形成现有技术的一部分或是与本发明相关的领域中 的公知的一般知识，如同其在本申请的每个权利要求的优先权日之前 就存在一样。发明内容在一个方面，本发明提供了一种抗凝剂，其包括能抑制凝血的第 一种组分和能耙向活化血小板的第二种组分，其中当将该药剂给予受 试者时，第二种组分引导第一种组分至活化的血小板上。本申请人已 经证明，将抗凝剂靶向到活化的血小板提供了 一种能抑制凝血而没有 过多出血危险的手段。在本发明的一种形式中，第二种组分靶向活化的纤维蛋白原/纤维蛋白结合GPIIb/IIIa上的配体诱导结合位点(LIBS)， 该位点在血凝块上很丰富并特异表达，表现为血凝块特异性靶标。为 了进行血凝块靶向，制造了抗-LIBS单链抗体(scFv抗.uBs)。作为第一种 组分，使用了一个高效的直接因子Xa(仅a)抑制剂，壁虱抗凝肽(TAP)。 在流式细胞仪中证实融合分子scFv抗-ubs-TAP的特异抗体结合，抗-汉a 活性在生色测定中证明。在氯化铁诱导的小鼠颈动脉血栓形成模型中 用多普勒血流测量法以闭塞时间(OT)测定体内抗凝效果。scFv ffi .IJBS-TAP的OT延长与依诺肝素、等摩尔剂量的重组TAP和非耙向的 mut-scFv-TAP相当，即使在后面这些对照不显示抗凝血效果的低剂量下也能延长OT。与检测的其它抗凝剂相比，scFv fcUBS-TAP不延长通过断尾检测的出血时间。本发明还提供了药学组合物和治疗或预防凝血障碍的方法，所述 的方法包括给予需要这种方法的哺乳动物以有效量的如本文所述的化 合物的步骤。本发明还包括筛选用作抗凝剂的化合物的诊断方法，以 及使用针对活化血小板的探针鉴别血栓形成、血栓性栓子、不稳定斑 块存在的方法。


图1显示ScFv-K.UBS-TAP:细菌果胶酸裂解酶(pelB)的信号肽序列 包括40到105位的核苷酸，重链可变区包括106至483位的核苷酸， 接头(YOL抗原决定簇)包括484至510位的核苷酸；轻链可变区包括 511至861位的核苷酸；TAP区包括862至1041位的核苷酸，His6-tag 始于1069位止于1086位。图2显示pHOG21 -scFv抗-固s -TAP的图谱。RAMP:氨苄青霉素 抗性基因；ColElORI:大肠杆菌复制起始点；fl IG，丝状基因间区； pe旧果胶酸裂解酶pe旧的引导肽序列；VH/VL:重/轻链；TAP:壁虱 抗凝肽；His6:6个组氨酸重复。图3显示IgG抗-LIBS、 scFv抗-LIBS和scFv抗-LIBS-TAP与活 化的人血小板特异性结合，但不与非活化血小板结合的流式细胞计数 直方图。与ADP-活化的血小板的结合用空白的直方图表示；与非活化 血小板的结合用阴影的直方图表示。与IgG抗体的结合用DTAF交联 的羊抗鼠抗体检测，与scFv的结合用AlexaFluor488交联的抗-His-tag 抗体检测。图4显示Ni 2+-纯化的scFv抗-LIBS、 scFv抗-LIBS-TAP和非革巴 向的mut-scFv-TAP的Western印迹分析。MW:分子量标记(6xHis蛋 白梯)，1: scFv抗-LIBS， 2: scFv抗-LIBS-TAP， 3:非耙向的scFv-TAP。图5显示rTAP、 scFv抗-LIBS-TAP和非革巴向的mut-scFv-TAP，而 不是scFv抗-LIBS对因子Xa活性的抑制作用。因子Xa (500 pM)对生 色底物(spectrozyme FXa #222)的裂解在405 nm处检测。标记条显示对 代表性试验的三次重复测量的光密度(OD)的平均值和标准差。图6显示IgG抗-LIBS、 scFv抗-LIBS禾n scFv抗-LIBS-TAP与活化的鼠血小板特异性结合，但不与非活化血小板结合的流式细胞计数 直方图。与凝血酶活化的血小板的结合用空白的直方图表示；与非活 化血小板的结合用阴影的直方图表示。与IgG抗体的结合用DTAF交 联的羊抗鼠抗体检测，与scFv的结合用Alexa Fluor 488交联的抗 -His-tag抗体检测。图7显示三氯化铁诱导的颈动脉血栓形成小鼠模型中高、低剂量 的scFv抗-LIBS-TAP的抗凝效果。用纳米多普勒流量探头在颈动脉处 通过流量测量测定闭塞时间来评价血栓的发生。生理盐水(0.9% NaCl) 和单链抗体scFv抗-LIBS被用作阴性对照。临床使用的药物依诺肝素 被用作阳性对照。rTAP、 scFv抗-LIBS-TAP和非靶向的mut-scFv-TAP 以较高的等摩尔剂量使用，scFv抗-LIBS-TAP和非靶向的scFv-TAP 以较低的等摩尔剂量使用。给出了每组4只小鼠的均数和标准差(SD)。图8显示同依诺肝素、rTAP和非靶向的mut-scFv-TAP相比，靶 向血凝块的抗凝剂scFv抗-LIBS-TAP不引起出血时间延长。通过小鼠 断尾法检测出血时间。生理盐水(0.9。/。NaCl)和单链抗体scFv抗-LIBS 被用作阴性对照。同scFv抗-LIBS-TAP相比，rTAP和非靶向的 mut-scFv-TAP显示出血时间明显延长。给出了每组4只小鼠的均数和 标准差(SD)。图9显示血栓粘附试验的概况。固定在纤维蛋白原上的血小板用 抗-LIBS珠对比剂经活化的GPIIb/IIIa受体靶向。用P-选择素抗体和荧 光素-亲和素对血小板进行共染色以证明对比剂仅对血小板的选择性结合。图10左屏粘附试验的共聚焦显微镜图像。P-选择素和荧光素亲 和素染色的血小板显示为绿色的聚集体，被抗-LIBS珠对比剂的红色荧 光珠围绕。右屏来自60个共聚焦显微镜图像的Z堆栈的3D重建。图11显示人血栓的磁共振像，与纵轴垂直重建的3D FLASH-图像。 暴露于不同浓度抗-LIBS珠对比剂的血栓显示阴性对照(围绕血栓的黑 圈)，如SPI0珠在T2^中所致的那样。在珠上无关抗体接触的血栓不显 示此阴性对照。图12显示用鼠抗人P-选择素和Nova Red(棕色)染色的血小板的免 疫组织化学。抗-LIBS珠对比剂显示为黄色，且仅出现于血栓表面上的 血小板聚集体区。图13显示纤维蛋白原固定的人血小板用CD62P抗体进行亲合素-荧光素染色的免疫荧光。(A)用红色自荧光LIBS-MPIO对比剂孵育的 血小板显示与呈现绿色亲和素-荧光素诱导信号的血小板特异地结合, 而用对照MPIO对比剂孵育的血小板显示没有结合(B)。 (C)代表来自用 LIBS-MPIO孵育并用P-选择素染色的血小板的z-堆桟的3D重建，证 明在活化的GPIIb/IIIa受体上靶向LIBS的原理。图14显示11.7 T离体MRI， 3D梯度回波序列(TE = 4 ms / TR= 90 ms,视野13 x 13 x 19.5 mm,矩阵大小256 x 256 x 384)，各向同性解析 度25 jim3。(A)显示用LIBS- MPIO灌注的鼠受损股动脉。在LIBS-MPIO 鼠以及对照MPIO鼠(B)中可以观察到黑色固有血管壁信号，但可观察 到附着在股动脉腔侧的信号缺损，其作为LIBS-MPIO鼠中MPIO结合 的指征(A，箭头)。MPIO诱导的MRI信号缺损的定量显示了 LIBS-MPIO 和对照-MPIO灌注小鼠间的显著差异(p0.05)。图15显示代表性的受损股动脉节段的组织学。(A)显示用 LIBS-MPIO (箭头)灌注后多个珠子结合到受损的管壁上，而对照 MPIO灌注后没有观察到结合(B)。尽管珠的聚苯乙烯包衣使铁核心呈 现典型的蓝染，但组织(A)和(B)是铁染色的。但是，依靠显微镜的焦距 可观察到铁核的蓝色固有信号。(C)用CD61和NovaRed染色的免疫 组织化学证实了 LIBS-MPIO对比剂与血小板的结合，(a)代表管壁附着 的血小板和(b)直接与血小板结合的MPIO。 (D) LIBS-MPIO和对照 -MPIO灌注小鼠的每个代表性组织学切片上结合的MPIO的量化，显 示了 LIBS靶向对比剂的高度特异性结合(pO.Ol )。图16显示了 MRI中每只受损腿的MPIO信号和组织学中每张切 片结合的MPIO之间的相关性分析，显示两者显著相关(112=0.72)。图17显示采用ImagePro Plus的3D构建器插件制作的LIBS-MPIO 动物股动脉的三维重建图。(A)显示股动脉腔表现为绿色管。(B)单独显 示红色MPIO信号，和(C)显示带有解剖学图片的合并信息。
具体实施方式
在第一个方面，本发明提供了一种抗凝剂，其包括能抑制凝血的 第一种组分和能靶向活化血小板的第二种组分，其中当将该药剂给予 受试者时，第二种组分将第一种组分引向活化的血小板。本申请人发 现通过靶向抗凝剂到活化的血小板上增强了抗凝效果并去除了出血并 发症，从而解决了本领域中突出的问题。本申请人发现活化的血小板 可以作为有效靶向血凝块的有效靶标。血小板在动脉系统特别是血栓 中非常丰富，像动脉硬化症引起的血栓症如在心肌梗塞中。活化血小板对血凝块是高度特异的，且一般在循环中不能发现。因此，有效靶 向血凝块、丰度和特异性的要求都可满足。除这些有利特性外，用活 化血小板作为耙向血凝块的抗原表位较纤维蛋白更有优势，因为血小 板激活可能先于纤维蛋白形成。上述抗凝剂可采用任何形式，只要两种组分能够完成上述其所需 的功能。上述抗凝剂组分可以是任意大小，只要该药剂能有效地定位在血 凝块部位。但是，该抗凝剂组分优选很小，因为可改善血栓的进入和渗透性。在本发明的优选形式中，第一种组分的分子量大约为7,000 Da 或更少。虽然现有技术公开了一些小的抗凝剂，但那些强力抑制关键 和重要凝血因子者是优选的。在本发明的一个形式中，第一种组分是 来自软蜱毛白钝缘蜱(Omithodoros moubata)的肽抗凝剂，它使用抗Xa 因子抑制剂来帮助从其宿主中提取血液。此抗凝剂最初在1990年 (Waxman等人.Science 1990; 248: 2473)被描述并命名为TAP(壁虱抗凝 肽)。重组TAP被描述为选择性Xa因子抑制剂，由于Xa因子在凝血 级联反应中关键的、上游的和速率决定性地位，使之具有有效的抗凝 作用(Neeper等人.JBiol Chem 19卯；265: 17746)。 TAP自然界中发现的 最有力的抗凝剂之一，且其是仅有60个氨基酸的小分子。合适的TAP 序列可以从Genbank数据库中获取，登录号为M60480。第一种组分可作用于外源或内源性凝血途径的任何成分。在本发 明的优选形式中，第一种组分作用在Xa因子酶上。直接抑制汉a已被建议优于间接的、抗凝血酶-m-介导的抑制作用，如肝素所介导的，因为血凝块结合的仅a和凝血酶原酶相关的仅a看起来显然能被DCa直接抑制剂更好地抑制。在研究抗血栓形成能力和防止重闭合的对比研 究中，TAP已显示优于间接汉a抑制剂以及凝血酶抑制剂。尽管有这 些优势，但与水蛭素相似，在用于人的治疗中，预期有较高的出血率，之前尚未用于开发人用药物。不希望受理论约束，靶向TAP到形成中的血凝块上可减少全身性抗凝血作用，从而减少出血并发症，并由于将抗仅a活性稳定地固定在血凝块部位而可获得长期的局部抗凝作用。 于是，作为小分子、显示有直接抑制作用而不需要辅因子且靶向于凝 血途径的早期中心的TAP成为靶向用药的优选候选者。虽然TAP被用在本发明的一个实施例中，许多其它抗凝剂也是适 合的，包括凝血因子的其它抑制剂如水蛭素。此外，对纤维蛋白溶解 的靶向也预期有高效的血栓溶解作用而出血并发症很少。如本文所用的术语"抑制凝血"不仅仅指完全抑制，也包括部分 抑制血凝块的形成。不希望受理论约束，我们认为部分抑制是优选的， 因为完全抑制可引起不受控制的出血。第二种组分的作用是将第 一 种组分带到活化血/」、板的生理学近 处u通过具冇与活化血小板结合，或与其关联的分子结合能力的第二 种组分可实现此作用。典型地，通过能与活化血小板表面上的标志物 结合的第二种组分来实现此作用。为赋予该药剂以最可能高的特异性， 该标志物应当仅在活化的血小板表面上表达。然而要理解的是这种绝 对的需求并非严格必要的，且只要第二种组分能主要地靶向活化血小 板，那么本发明就能提供本文所公开的这些优势。在活化的血小板上有大量的标志物，包括活化的GPIIb/IIIa。该标 志物可以采取无活性和活性形式，与凝血系统的其他组分相比发现在 活化的血小板上一种形式所占的比例比另一种高得多。在血小板表面 上表达丰度最高的一种分子是糖蛋白受体(GP)nb/IIIa(CD41/CD61)。该受体属于整合素的粘附分子家族，也称为0CubP3。整合素由两个非共价连接的亚单位组成，其与GPIIb/IIIa配体纤维蛋白原的结合会经历从低 亲和力至高亲和力受体的构象变化。除了配体结合袋的暴露以外，这 种构象变化也诱导了 GPIIb/IIIa上所谓配体诱导结合位点(LIBS)的暴 露。这些结合位点对于活化的和/或配体结合的GPIIb/IIIa受体是特异的。GPIIb/IIIa是高度富集的，在每个血小板表面上有大约60 000~80 000个分子。在血小板活化过程中此受体从无活性状态转化为活性状态，其机 制是受体的构象改变从而暴露出了新的抗原表位。因此，在本发明的 一个形式中，第二种组分能与在GPIIb/nia受体活化过程中形成的新抗原表位结合。专业技术人员要理解的是对于要被物理性连接的第一种和第二种 组分并不需要太严格。例如，第一种和第二种组分可以是物理分离的， 第一种组分包括与第二种组分结合的工具。在这种方案下，第一种组 分可首先给予受试者，并运输到新的血凝块以结合活化血小板。然后 可给予第二种组分并与第一种组分结合。因此，两种组分是物理分离 的直至功能抗凝剂到达了活化血小板的部位。在本发明的一个优选形式中，抗凝剂是单个分子的形式，且典型 地是单个蛋白分子。用于将两个组分包含在单个分子中的常规手段是 将两种组分包括在单链抗体分子的框架结构中。这些分子特别适合用 于特异性地靶向其可变区的包含体所指定的抗原表位。可变区可如下 设计其与被靶向的抗原表位有亲和力。单链抗体是设计重组治疗药 剂的有前途的形式。它们仅由经短接头分子在单条肽链上融合在一起 的抗体重链和轻链的可变区组成。因此，单链抗体(scFv)包括含有完整 的抗体结合位点的最小片段。由于大小是免疫原性的决定因素，因此 期望scFv仅有最小的免疫原性(如果有的话)。单链抗体的另一个优势是第一种和第二种组分的偶联使两种组分 的生物学功能丢失很少。但要理解的是化学偶联一般会引起抗体结合 功能以及偶联的效应器分子活性的明显丧失，可使用分子生物学技术 来偶联scFv而没有功能性丧失。最后，可在短时间内以很低的成本在 细菌中大量的生产scFv，且可通过亲和色谱将其高度纯化。产生单链抗体的手段是本领域技术人员所熟知的，关于该课题的综述可见 Recombinant Antibodies (Breitling & Duebel, 1999, Publisher: Wiley & sons, ISBN 0471 178470)，该文的内容引入本文作为参考文献。优选，抗-LIBS单链抗体(scFv)的克隆基于表达IgG抗-LIBS 145的杂交瘤细胞系。选择针对LIBS(配体诱导结合位点)抗原表位的抗体用于抗凝剂对血凝块的靶向。如以前所证明的，mAb抗-LIBS 145(IgG 抗.UBS)证明在血小板与RGD-肽、阿昔单抗(abdximab)、替罗非班 (tirofiban)和依替巴肽(eptifibatide)孵育后有与GPIIb/IIIa的配体诱导结 合(Schwarz等人，JPET 2004, 308: 1002)。而且，IgG抗七iBs证明在纤维 蛋白原的存在下与ADP-活化的血小板有强力的结合(图2)。因此，该 抗体提供的靶向倾向性是有很高的丰度和特异性的。表达mAb抗-LIBS 145的杂交瘤细胞用作克隆抗-LIBS单链抗体 (scFv)的基础。制备此杂交瘤细胞系的mRNA，并使用寡聚-dT引物逆 转录。通过PCR使用复性为保守区的引物在可变区的5'和3'端扩增抗 体重链和轻链的可变区(其细节见本文中其他地方所述的方法)。将PCR 产物克隆进能允许在细菌中高水平表达的pHOG21表达载体中。在转 化TG1大肠杆菌CE. co")后，评价单个克隆的LIBS与GPIIb/nia的典 型结合。选择在流式细胞仪中与初始的IgG抗-LIBS ]45 mAb相比显 示较强结合的一个克隆(图2)以备进一步使用。对该克隆进行测序，其 显示了单链抗体的所有典型特征(图1)。而且Western印迹分析显示了 正确的大小，为大约32kDa(图3)。优选，单链抗体表达为scFv融合蛋白。基于以前的结果，即显示 可融合TAP而没有功能丧失(TH)，选择这种高度有效的因子Xa直接 抑制剂来与克隆的单链抗体偶联。根据已发表的序列信息初歩合成 TAP(Genbank数据库，登录号M60480),并将其在轻链可变区的C端 处直接克隆进pHOG21表达载体中(见图1A、 B)。 pHOG21含有pdB-引导子-序列以经包含体促进纯化，含有His(6)-tag用于N产-纯化以及 检观U(图1A、 B)。纯化的scFv抗.uBs-TAP的产量为1L细菌培养物中大 约0.4至0.8 mg。表达和纯化后，单链抗体构建物的大小通过Western 印迹分析来进行评价(图3)。 scFv抗.uBs单独的分子量为 32kDa，整个 融合蛋白scFv抗-ubs-TAP的分子量为 39 kDa，非靶向的mut-scFv-TAP 的分子量为 42 kDa(图3)。在本发明的一个高度优选的形式中，单链抗体基本上如图1中所 示。专业技术人员要理解的是遗传代码的兼并性和将氨基酸替代为其 他类似氨基酸的能力意味着可很容易地产生图1所指定的分子的衍生 物和等价物。这些衍生物和等价物包括在本申请的范围之内。在另一个方面，本发明提供了包括如本文中所述的抗凝剂的药学 组合物。专业技术人员将能够设计适合用于通过常规方法递送本文中 所述的抗凝剂的组合物。当抗凝剂是蛋白质时，该组合物可简单地含 有等渗浓度的NaCl。可需要加入载体蛋白、稳定剂、缓冲液、非水溶 剂、盐类、防腐剂和类似物。在另一个方面，本发明提供了治疗或预防凝血障碍的方法，所述 方法包括给予需要这种方法的哺乳动物以有效量的如本文中所述的组 合物的步骤。
一般，该组合物将通过静脉内或动脉内推注或输注而全身给药。就用药量而言，当抗凝剂是蛋白质时，用药量为大约30mg/kg 至大约300mg/kg。对于任何指定的受试者，或对于任何指定的凝血障 碍，将用药量向上递增或向下递减以达到所需的临床效果是临床医生 所力所能及的。凝血障碍可以是需要抑制凝血的任何障碍。这些障碍包括与血栓 形成相关的所有临床情况，如冠状动脉疾病、急性冠状动脉综合征包 括心肌梗塞、中风、颈动脉或主动脉的动脉粥样硬化、深部静脉血栓 形成、肺栓塞、和器官的动脉粥样硬化或血栓形成。本申请人已经评价了优选的双功能融合分子scFv抗.lbs-TAP。融合 分子scFv ffl.UBS-TAP的单链抗体部分的功能通过流式细胞仪来评价。 scFv抗七旧s-TAP和scFVffuLIBS证明与纤维蛋白原结合的活化血小板具有 相似的结合特性(图2)。因此，遗传融合并不会显著地改变单链抗体的 结合特性。通过生色测定法来评价融合构建物的因子Xa抑制活性。在 scFv抗-l鹏-TAP、非靶向的mut-scFv-TAP、 scFv ^LIBS和重组TAP的存 在下将因子Xa与特异的生色底物孵育(图4)。与rTAP相比，在融合构 建物中TAP活性稍有下降，但还是清楚地存在的(图4)。因此，抗体结 合和因子Xa抑制作用两种功能仍然保留。为了显示与传统的非靶向抗凝剂的应用相比抗凝剂对GPIIb/IIIa 的LIBS抗原表位的靶向作用较佳，选择了已建立的小鼠血栓形成模型 (Farrehi等人，1998; 97:1002)。但，其首次证明了抗-LIBS抗能能用于 靶向纤维蛋白原结合的活化小鼠血小板。本申请人获取了小鼠血液并 通过流式细胞仪评价了初始IgGms、 scFvtt.UBS、和融合构建物scFv 抗-l鹏-TAP与小鼠血小板的结合。与人血小板的结果类似，可见IgG抗丄旧s的特异性结合，但单独使用scFv抗-l旧s抗体以及其融合蛋白scFv抗-ubs -TAP与纤维蛋白原结合的活化小鼠血小板的结合具有更强的特异性 结合(图5)。因此，建议对小鼠血小板的耙向作用要使用所产生的抗 -LIBS融合构建物。使用三氯化铁在小鼠的颈动脉中诱发血栓。通过纳米流量探头测 量到的血流终止用作血管内闭塞性血栓的指标。氯化钠溶液和单链抗 体抗-LIBS用作阴性对照，用作阳性对照的依诺肝素代表目前的临床标 准。依诺肝素的闭塞时间几乎增加了 1倍(图8)。等摩尔量的重组TAP、 非靶向的mut-scFv-TAP和scFv ffi-UBS -TAP使闭塞时间显著延长，其 效应接近于依诺肝素。使用scFv ffi.UBS-TAP递送的初始剂量减少至1/10 (0.03 pg/g体重)仍能引起闭塞时间显著的延长(p=0.002)，而在相同的 剂量下非靶向的mut-scFv-TAP不引起闭塞时间的显著延长。因此，scFv ft.UBS -TAP能显示很强的抗凝效应，甚至在直接对照组和非靶向 mut-scFv-TAP不产生显著抗凝作用的剂量下仍显示很强的抗凝效应。耙向活化血小板抗凝作用的主要优势是减少出血并发症。通过标 准化地手术切断小鼠尾部来测定出血时间。如所期望的那样，盐水和 scFVffi-UBS不引起出血时间延长，而依诺肝素，且尤其是重组TAP产 生了相当长的延长。在0.3 )ig/gBW的剂量下，非靶向mut-scFv-TAP 和scFv抗.jJBS-TAP都证明有很强的抗凝效应(图6)，仅非耙向的mut scFv-TAP使出血时间显著延长(pO.OOl，图7)。靶向血凝块的scFvfiUJBS -TAP根本不引起出血时间的延长。较低剂量的scFv K-L1BS -TAP证明 在小鼠的颈动脉处有明显的抗凝效应，也不引起出血时间延长。因此， 通过新产生的TAP与抗-LIBS单链抗体的融合体能达到高效的抗凝效 应而不延长出血时间。要理解的是，尽管避免出血时间的延长是本发明的一个优势，但 在一些实施方案中如本文所述的抗凝剂会增加出血时间。在另一个方面，本发明提供了如本文所述的抗凝剂在制备用于预 防或治疗凝血障碍的药物中的应用。在另一个方面，本发明提供了一种筛选用于将抗凝剂靶向血凝块 的化合物的方法，所述方法包括以下的歩骤提供候选化合物，将该 化合物与活化血小板和血凝块的至少一种其他成分接触，评价该化合物是否与活化血小板结合，并评价该化合物是否与血凝块的至少一种 其他成分结合，其中如果与血凝块的至少一种其他成分相比，该化合 物与活化血小板具有较高的亲和力，则该化合物是可用的。因此，基于本申请人的发现(即活化血小板是抗凝治疗的有益靶标) 根据本发明的上下文有可能鉴定用作第二种组分的化合物。专业技术 人员对于用于测定一种分子与另一种分子结合的大量方法是很熟悉 的，这些方法包括免疫吸附法、色谱法、质子表面共振法和类似方法。在另一个方面，本发明提供了通过如本文中所述的筛选方法鉴定 的化合物。本发明的另一个方面提供了对受试者的凝血障碍诊断或预后的方 法，该方法包括检测受试者血管中的活化血小板。就本申请人所知，现有技术没有公开活化血小板用于诊断或预后。 活化血小板的检测将为临床医生提供以能用于大量医学应用中的相关 标志物。 一个应用是将在破裂的冠状动脉斑或易于发生破裂的那些斑 块上发现的活化血小板成像。这种方法能对心肌梗塞综合征进行早期 非侵入性诊断，使随后预防性地将支架植入至相关的病变部位成为可 能。这具有特殊的临床意义，因为冠状动脉造影术(如现有技术中所述) 仅能提供关于血管腔的信息，但不能提供关于血管壁本身形态学的信 息。因此，使用冠状动脉造影术不能检测到可能已经破裂的或有破裂 倾向的斑块。考虑到活化血小板能用作诊断标志物，本发明也提供了用于检测 血管异常的探针，其包括(a)能靶向活化血小板的结合组分和Cb)标记 物。专业技术人员要理解的是在本发明上下文中使用的探针一般是以 含水组合物提供的，并在诊断方法之前或期间被注射入受试者的动脉 或静脉中。然后该探针通过血液被运输至机体内的目标部位，如果有 活化血小板存在的话则与其结合。然后通过合适的手段如MRI检测结 合的探针。结合组分可以是能够与活化血小板表面上的标志物结合。合适的标志物的一个非限制性实例是活化的GPIIb/IIIa受体分子。也可考虑其 他的标志物如PAC-1和CD62-P。在本发明的一种形式中，结合组分和 标记物在单链抗体分子的框架结构内。探针和使用本文中所述的探针的方法可用来检测活化血小板的任 何积聚，例如在肺栓塞或周围血管栓塞中，或在周围或脑动脉中破裂 的粥样硬化斑上。这些病变能在疾病过程中的早期被检测到和选择性 地进行治疗。专业技术人员要理解的是本文中所述的探针和方法可用于鉴定对 凝血障碍有易感性的个体，而不需要证明凝血障碍的临床上可识别的 指征或症状。在上述方法的一个优选形式中，用于检测活化血小板的歩骤的探 针是如本文中所述的单链抗体。优选该单链抗体与如本文中所述的抗 -LIBS抗体相同或相似。要理解的是对于诊断目的，单链抗体不需要包 括抗凝组分。实际上，专业技术人员要理解的是有可能使用单链抗体 的片段，只要该片段包括用于与活化血小板结合的位点。不希望受限于理论，在本申请中单链抗体的紧凑尺寸(compact dimension)具有特殊 的优势。建议抗体能够穿透血栓表面进入存在大量活化血小板的区域 中。这样就能更有效地检测到结合的抗体，从而获得更高的成像灵敏 度。抗体探针也可附着在有活化血小板沉积的血管表面上。上述方法可用来诊断和鉴定血栓(例如，深部静脉血栓形成)、血栓 性栓子(例如，肺栓塞)和活化血小板的沉积(例如，在不稳定粥样硬化 斑的部位:i。早期检测将是非常有益的，能进行血凝块溶解剂的给药和/ 或抗凝治疗和/或介入操作。专业技术人员要理解的是用于诊断和预后方法的探针可通过本领 域任何已知的方法进行标记。根据微粒的官能性不同，对于此目的可 使用不同的策略。 一种方式是在羧基官能化的SPIO和单链抗体的游离 氨基之间建立肽键。可用于这种化学交联方法的各种市售偶联剂和试 剂盒对于专业技术人员来说是很熟悉的。另一种方式将是使用抗体的 组氨酸-标记与市售的钴官能化1 pmSPIO-珠结合，从而通过组氨酸与 钴的结合获得了单链抗体/珠复合体。简言之，采取这种方式，单链抗 体和SPIO-珠在室温下孵育10分钟，此后通过磁铁分离悬液并冲洗数 次。通过采用相同的方案将无关单链抗体与SPIO交联产生合适的对 照。专业技术人员将要理解的是在X-线成像法中使用的任何标记物都 可加入至探针中。作为上述方法的一个非限制性实例，顺磁性标记物 可与靶向活化血小板的探针偶联。在给予探针的过程中，顺磁性标记 物将定位在血凝块、栓子或不稳定粥样硬化斑的部位，然后可通过磁 共振成像技术来显影。可选的是，上述探针可被放射标记(例如，用锝-99m、铷-82、铊 201、 F-18、镓-67或铟-111标记)，使用Y照相机来显影活化的血小板。 也可考虑使用所述的抗体采用计算机体层扫描术和超声法来标记活化 的血小板(例如，微泡的靶向作用)。本申请人在此公开了探针在体内情况下的应用，该探针能耙向活 化的血小板，并能使用MRI来对对比结合进行定量。在本发明的一种 形式中，使用了仅能识别GPIIb/nia的活性构象的单链抗体，该抗体与 微米尺寸的顺磁性氧化铁微粒偶联。微米尺寸的微粒比本领域中通常 使用的氧化铁纳米微粒大几个数量级，其能进入血管内结构。就本申 请人所知，本文第一次描述了使用单链抗体来对活化血小板进行功能 性成像。为了证明靶向活化血小板的标记探针在体内情况下的应用，使用 了小鼠股骨金属丝损伤模型(Roque, M.等人，Mouse model of femoralmolecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vase Biol, 2000. 20(2): p.335-42)，损伤后24小时获取血小板单层。小鼠股骨金属丝损伤后细胞事件的时间过程得到了很 好地描述，且如图15C中所证明，同样显示了在24小时后在裸露的内 皮上沉积的汇合血小板。这被用作使用针对活化GPIIb/nia受体上配体 诱导结合位点的单链抗体靶向活化血小板的基础。该抗体赋予了功能 特异性，因为其结合取决于纤维蛋白原或其类似物的存在。这些特性 使该抗体被作为MPIO的配体以介导血小板血栓的成像。使用11.7 T MRI和丁2*-加权MRI，在有很强的珠结合的区域检测到了信号缺损 (signal void)。组织学确认的MPIO与血管壁的结合量与由MPIO在T2*-加权MRI中产生的信号衰减程度显著相关。这种MRI法对于直径仅有 200 (im的小血管成像具有足够的解析度。MPIO-诱导的信号缺损的敏感性足以能检测到甚至延伸至由动脉血管壁在丁2*-加权MRI中产生的 阴性内对比的信号缺损。以前的靶向对比剂方法包括富含整合素交联钆的全氟碳纳米微 粒、氧化铁的肽交联纳米微粒和用钆标记的纤维蛋白特异性环肽。但， 能被递送的对比剂的数量和因此能达到的对比效应的强度相当有限， 尤其是对于低丰度的耙标。本申请人已经发现MPIO携带了很高有效负荷的对比剂，其不容易被分散，在MRI上很明显，并建议使用MPIO来用于分子成像。这种方法的通用性能够对血管受体进行一般的血管内成像，甚至用于不同的受体构象。散在的抗原表位可被MPIO有效地靶向，尽管如本文 中所证明的那样，其大小与配体本身相当，同时很高的铁有效负荷能 根据MPIO-大小检测甚至单个珠子，并因此能检测单个受体。而且， 本文中所述的噬菌体展示法对散在或功能性抗原表位提供了构建选择 性配体的可能性，因此能够更深入地了解各种疾病中的病理生理学过 程。其他的重要问题是单链抗体最低限度的免疫原性，因为它们仅由 可变区组成，且其大小能促进其接触隐秘的抗原表位。要理解的是本文中所述的探针可用于通过检测血管中的活化血小 板而对受试者的血管异常成像的方法中。在上述方法的一种形式中， 检测包括使用如本文中所述的探针。可考虑的是，可使用在标准心导 管实验室中可见的X-线和CT装置来探测该探针。建议64-层CT或128-层CT适合于本文中所述的成像法。也建议通过使用导管导入上述探针 而将该探针用于近红外光谱成像(热敏成像)的情况。可检测的异常情况包括破裂的粥样硬化斑或易于破裂的粥样硬化 斑、血栓、栓子和活化血小板的积聚。本发明将参照下面的非限制性实施例来进行进一歩地描述。实施例实施例1:产生单链抗体scFv M^和融合构建物scFv s，-TAP 过去的文献已经描述了表达针对GPIIb/IIIa上LIBS抗原表位的单 克隆抗体的杂交瘤细胞系的产生及其功能特征(Schwarz等人，JPET 2004; 308: 1002)。简言之，用RGD肽类纯化和洗脱的GPIIb/IIIa用作生产杂交瘤的免疫原。用活化的血小板以及用RGD肽类饱和的固化GPIIb/IIIa筛选克隆。这些克隆之一，单克隆抗体(mAb)克隆145证明 与ADP-活化的血小板以及用RGD肽类(GRGDSP， BIOMOL Research Laboratories, Plymouth Meeting, PA)、依替巴月太(eptifibatide) (Integrilin , Essex Pharma， Muenchen， Germany)、 替罗非班(tirofiban) (Aggrastat , MSD, Whitehouse Station, NJ)和阿昔单抗(abciximab) (ReoPro , Eli Lilly & Co, Indianapolis, IN)预孵育的血小板的结合增加。杂交瘤培养在 RPMI、 10%胎牛血清、lmM丙酮酸钠、IOjiM巯基乙醇、100单位/ml 青霉素、100g/ml链霉素(均购自Gibco)和1 x HAT添加齐!j(H0262， Sigma)。 使用ImmunoPure IgG Protein G purification (Pierce, Rockford, IL, USA)通过亲和纯化杂交瘤上清液制备IgG K.UBS mAb。对于单链抗体克隆，使用mRNA纯化柱(oligo-dT)和M-MuLV (均 贝勾自Amersham-Pharmacia, Freiburg, Germany)制备杂交瘤的cDNA。使 用/y^聚合酶(Strategene, La Jolla, CA, USA)通过聚合酶链式反应 (PCR)完成抗体可变区的扩增。使用下面的基于来自重链(VH)和轻链(VO 可变区的保守序列的引物(Welschof等人，J Immunol Methods 1995; 179: 203): VH正义5-CCG GCC ATG GCG CAG GTG CAG CTG CAG CAG-3'， VH反义5'-CC AGG GGC CAG TGG ATA GAC AAG CTT GGG TGT CGT TTT -3'， VL,正义5'- AA TTT TCA GAA GCA CGC GTAGATATCG/TTGA/CTG/CACCCAAT/ACTCC， VL反义5'-GAA GAT GGA TCC AGC GGC CGC AGC ATC AGC -3'。对VH亍吏用限希U性 位点Nco I和Hind III，对于VL使用限制性位点MIu I和Not I将PCR 构建物克隆进pHOG21载体系统中(Kipriyanov等人，J Immunol Methods. 1997; 200: 69, Schwarz等人，FASEB J 2004: 18: 1704)。生成 的单链抗体命名为scFv抗-ljbs。以前已经克隆了 TAP(Hagemeyer等人， Thromb Haemost. 2004; 92: 47)并被转移到已经使用限制性位点Not I 和Xbal包含了 scFv抗—應的pHOG21中，从而形成了 scFv K-LIBS-TAP (图1A)。生成了非靶向的mut-scFv-TAP作为没有scFv部分的结合功 能的对照，其含有单链抗体，原来与GPIIb/IIIa结合，但其重链CDR3 (互补决定区，complexity determining region)发生突变(RND突变为 AND),因此其结合活性丧失。所有构建物都进行测序(图IB)。实施例2: seFv构建物在大肠杆菌中的表达和纯化大肠杆菌(TGl)细胞用上述的pHOG21质粒转化，来自划线琼脂平 板的单个集落在37°C下生长在500mL瓶中的含有100pg/mL氨苄青 霉素和100 mM葡萄糖的LB培养基中。培养物在200 rpm下振摇大约 4-6小时直至达到 0.8的OD (600nm)。细菌在4°C下以5000 rpm离心 10 min成团，用含有100|ig/ml氨苄青霉素和0.4 M蔗糖的LB培养基 重新悬浮。加入IPTG至0.25 mM的终浓度以诱导scFv产生，并在室 温下(22-24。C)在200 rpm下孵育16-20小时。对于来自全细胞提取物的 可溶性蛋白质的纯化，通过在4°C下以5000 rpm离心10 min收获细菌。 团状的细菌重新悬浮在5 mL IX BugBuster (Novagen, Madison, USA) 溶液/g细菌团中，并在室温下孵育15 min并轻轻震荡。在4°C下以15 000 rpm另外离心20 min后，将含有可溶性蛋白质的上清液保持在冰 上，力卩入1:50稀释的蛋白酶抑制剂(complete Roche， Basel, Switzerland)。含有可溶性蛋白提取物的上清液与500 Ni2+-Agarose (QIAGEN, Hilden, Germany)混合，并在4°C下孵育1小时，并以150 rpm 持续震荡。现在结合了 His(6)-tag蛋白的Ni2+-Agarose沉降30 min，然 后用缓冲液(50 mM NaH2P04、 300 mM NaCl、 20 mM咪唑、pH 8)冲洗。 该冲洗步骤重复两次。最后，在高浓度咪唑(250 mM)下洗脱scFv融 合蛋白，并通过梯度SDS-PAGE分析，在还原条件下进行Western印 迹。将蛋白转禾多至 Immobilon P membrane (Millipore Corporation, Bedford, USA)上用于免疫印迹。在用含有0.2 % Tween20 (PBS-Tween) 和1% BSA的磷酸盐缓冲盐水对膜封闭过夜后，加入HRP-标记的抗 -扭3(6)-抗体(110(^6, Mannheim, Germany)(稀释度1:500)，并在室温下 孵育2小时。该膜用PBS-Tween缓冲液冲洗数次，然后加入SuperSignal 化学发光底物(Pierce, Rockford, USA)在ChemiDoc XRS (BioRad, Regents Park, NSW, Australia)上对过氧化物酶活性进行显色。使用 6xHis protein ladder (QIAGEN)用作大小标志物和His(6)-tag阳性对照。 实施例3: scFv抗-LIBS- TAP的体外功能特性血液制品使用21号蝶式针头从健康志愿者通过静脉穿刺采集人血，并用枸 橼酸抗凝。通过在室温下在塑料管中在离心机(GS-6R centrifuge,Beckmann Coulter, Gladesville, NSW， Australia)中以lOOxg离心10 min 获得富含血小板的血浆。使用27号针头从C57BL/6小鼠通过心内穿刺采集小鼠血液，并用 未分馏的肝素(20 U/mL)抗凝。50 |J的体积用1 mL改良Tyrode氏缓 冲液(150 mM NaCl、 2.5 mM KCl、 1.2 mM NaHC03、 2 mM MgCl2、 2 mM CaCl2、 0.1 %BSA、 0.1 %葡萄糖)重新悬浮，并以1300 xg离心5 min。 弃去上清液，沉淀团用1 mL改良Tyrode氏缓冲液重新悬浮。流式细胞术含枸橼酸的人全血以1/50在改良Tyrode氏缓冲液中稀释，或加入 20 ADP活化或不活化，然后与10吗/mL IgGffi—LIBS、 scFv抗-L鹏禾口 scFv ffi-IJBS-TAP预孵育10 min。通过针对scFv的Histidin(6)-tag的二抗 (Penta His Alexa Fluor 488 Conjugat , QIAGEN)检测ScFv。通过DTAF-交联的羊抗鼠igG + IgM (H + L) (Jackson Immuno Research, West Grove, PA， USA)检测IgG抗丄鹏。小鼠血小板通过力卩入0.1 U/mL凝血酶(Enzyme Research Laboratories, South Bend， IN, USA)被活化或不活化，然后与10 pg/mL IgG杭丄旧s、 scFv抗-ubs禾卩scFv杭-libs-TAP孵育10min。如上所述进行荧 光检测。在用CellFIX⑧(BectonDickinson)固定后，在FACSCalibur 流 式细胞仪(Becton Dickinson, San Jose, CA， USA)上对标本进行测定。实施例4:抗-因子Xa活性测定 通过显色底物spectrozyme fXa #222 (American Diagnostica Inc., Greenwich, Connecticut, USA)的降解测定仅a的抑制。探针在改良 Tyrode氏缓冲液(150mMNaCl、 2.5mMKCl、 12mMNaHC03、 2 mM MgCl2、 2mMCaCl2、 pH7.4)中透析，并进行调整得到终体积为165 ^ 的100 nM scFv K-LIBS、 scFv ffi-LIBS-TAP和非靶向的mut-scFv-TAP或游 离的重组TAP。在加入10 pi 0.1 %人白蛋白后，探针与10 500 pM fXa (Haemochrom, Enzyme Research Laboratories)，昆合，,，与j乍为阳个生X寸 照的单独使用的汉a进行比较。在室温下孵育10 min后，加入15 显色底物溶液(5mM)，将各板在室温下孵育15分钟。最后，加入50pl终止溶液终止反应，在ELISA读数仪(Victor3⑧，Perkin Elmer， Melbourne, Australia)上在405腿测量吸收度。实施例5:在小鼠模型中抗凝血功效和防止出血的体外功能评价本研究使用体重为22-38 g的C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA)。实验室动物的管理和使用遵循国 家指导原则，并经Freiburg大学和Baker心脏研究所的动物管理和道德 委员会(institutional animal care and ethics committee)矛比7佳。使用吹气禾几 用异氟烷麻醉小鼠几秒钟，并腹腔内注射氯胺酮(Ketanes^ 100 mg/kg BW)禾卩甲苯噻嗪(Rompun⑧5 mg/kg BW)，并置于解剖显微镜下。在没 有任何反射后，在右颈总动脉区的上部直接做皮肤切口。钝性剥离筋 膜，暴露一段右颈总动脉。然后在动脉上放置纳米多普勒流量探头(nano doppler flow probe) (Model 0.5 VB, Transonic Systems, Ithaca， NY, USA)，通过流量计(model T106， Transonic Systems, Ithaca， NY, USA)测 量颈动脉血流量。通过在右颈动脉下使用一片用三氯化铁(10%溶液) (Sigma, St. Louis, MO， USA)饱和的滤纸(l x 2 mm) (Gel Blot Paper, GB003, Schleicher and Schuell, Keene， NH， USA)， 3分钟后去除而诱发 血栓形成。当流量降低至0.0士0.2mL/min(与系统的精度相对应，由生 产厂商规定)时，考虑发生了血栓性闭塞。在三氯化铁处理前1分钟，通过尾静脉向小鼠输注盐水(阴性对照) (0.9%氯化钠)100 (il、以1 mg/kg BW用盐水稀释至100 pi体积的的依 诺肝素(阳性对照)(Clexane Sanofi Aventis， Paris, France)和各种剂量的 纯化重组scFv抗-ubs-TAP、scFv抗丄鹏、非靶向的mut-scFv-TAP和rTAP。 所使用的scFv和rTAP的所有剂量溶解至100 ^的体积。为了保证所 有药物都输注至小鼠体内，入口处用iooy盐水冲洗。小鼠出血时间如前面Xinkang所述进行测定。麻醉的小鼠置于解 剖显微镜下。离鼠尾尖端大约1-2 mm处(大约1 mm直径)用一次性手 术刀将其切断。以秒记录尾部第一次停止出血超过30秒的时间。统计学分析对于指定数目(N)的小鼠，数据表示为均数士标准差。通过方差分析(ANOVA，然后进行Newmann-Keuls-检验)进行统计学比较，p < 0.05时认为差异是显著的。实施例6:使用标记的单链抗体用于诊断性影像学如实施例1中所述的单链抗体抗-LIBS与超顺磁性氧化铁微粒 (SPIO)混合，它们被官能化能与包括His-tag (Dynabeads TALON ; Dynal Biotech)的蛋白相互作用。也可使用将抗体与顺磁性珠偶联的其 他方法(例如，化学偶联)。通过粘附测定证明对比剂与活化血小板(其 是血栓和栓子的主要和基本成分)的结合。在本测定中使用的血小板的 活化的监测是通过荧光显微镜证明血小板表面上P-选择素表达的上调 以及荧光检测细胞内Ca2+水平的增加。该测定包括将血小板在37°C 下孵育30分钟而将活化的血小板固定在覆盖纤维蛋白原的盖玻片上。 冲洗盖玻片后，纤维蛋白原-血小板基质与对比剂接触30分钟。为了排 除非特异性的结合，并证明对比剂仅与血小板结合，使用P-选择素抗 体和荧光素-亲和素的二次染色来对血小板进行共染色(图9)。使用共聚 焦显微镜，通过同时出现的P-选择素染色的血小板的绿色荧光来证明 显示红色自荧光的对比剂与血小板的结合。来自共聚焦显微镜使用z-堆栈的3D-重建显示在图10中。而且，为了评价体外成像法的合适性，进行磁共振实验来显示单 链抗体与活化血小板在血栓表面上的结合。对于这些实验，通过向富 含人血小板的血浆中加入肌动蛋白、二磷酸腺苷和氯化钙，并将混合 物在37°C下孵育15-30分钟人工生成人血栓。血栓与不同浓度的对比 剂接触，并在37。C下另外孵育30分钟。最后，血栓在PBS缓冲液中 冲洗两次，并用4%多聚甲醛固定。固定4小时后，血栓包埋入24孔 培养板的孔中，被钆-针刺状(gadolinium-spiked)2。/。琼脂糖所包绕。在 3德斯拉的临床扫描仪上进行核磁共振成像(MRI)，采用标准腕部线圈。 运行3D FLASH序歹U， TE/TR为9.3ms/700ms，解析度为130 x 130 x 200 (im，垂直于血凝块的纵轴对图像进行一整夜的重建。阴性对比剂与 LIBS耙向抗体以剂量依赖的方式孵育(如由T2*-加权MRI中SPIO所产 生)观察为血栓周围的黑环(图11)。而且，使用与抗P-选择素抗体进行免疫组织化学并用NovaRed在石蜡包埋切片中染色证实珠子的结合 图4显示了血小板的聚集体(褐色)，珠子(黄色)结合到有血小板的区域。这些结果表明设计的对比剂成功地在体外与活化血小板结合，其可通过MRI以临床上相关的场强检测到。实施例7:使用标记的单链抗体用于小鼠模型中的诊断成像 单链抗体生成和交联至1 Jim氧化铁微粒GPIIb/IIIa上的LIBS抗原表位是活化血小板的丰富的和高度特异 的靶标。mAb抗-LIBS 145仅其活性构象能与GPIIb/IIIa结合，且证明 其与ADP-活化的血小板在纤维蛋白原的存在下有很强的结合 (Schwarz JPET 2004)。表达mAb抗-LIBS 145的杂交瘤细胞用作克隆 抗-LIBS单链抗体(scFv)的基础。制备该杂交瘤细胞系的mRNA并使用 寡聚-dT引物进行逆转录。通过PCR使用复性为保守区的引物在可变 区的5'和3'端扩增抗体重链和轻链的可变区。将PCR产物克隆进 pHOG21载体中。在转化TG1大肠杆菌后，在流式细胞仪中使用活化 血小板评价单个克隆的LIBS与GPIIb/IIIa的典型结合。最后在500 mL 瓶中在37°C下在含有100 (ig/mL氨苄青霉素和100 mM葡萄糖的LB 培养基中产生最佳结合的SCFVUBS。培养物以200 rpm振摇大约4-6 小时直至达到 0.8的OD (600nm)。细菌在4°C下以5000 rpm离心10 min成团，用含有lOOpg/ml氨苄青霉素和0.4 M蔗糖的LB培养基重 新悬浮。加入IPTG至0.25 mM的终浓度以诱导scFv产生，并在室温 下(22-24。C)在200 rpm下孵育16-20小时。通过在4°C下以5000 rpm 离心10 min收获细菌，团状的细菌重新悬浮在5 mL IX BugBuster (Novagen)溶液/g细菌团中，并在室温下孵育15 min并轻轻震荡。在4°C 下以15 000 rpm另外离心20 min后，将含有可溶性蛋白质的上清液保 持在冰上，加入1:50稀释的蛋白酶抑制剂(complete②Roche)。上清液 与500 jiL Ni2+-Agarose (Qiagen)混合，并在4°C下孵育1小时，并以150 rpm持续震荡。现在结合了 His(6)-tag蛋白的N产-Agarose沉降30 min， 然后用缓冲液(50 mM NaH2P04、 300 mM NaCl、 20 mM咪唑、pH 8) 冲洗。该冲洗步骤重复两次。最后，在高浓度咪唑(250mM)下洗脱scFv 融合蛋白并透析。在流式细胞仪中评价scFv制剂的功能性。自荧光钴-官能化的MPIO (1 pm)与LIBS单链抗体的组氨酸-标记 根据生产厂商(Dynal Biotech, Oslo, Norway)的方法进行交联。简言之， 冲洗后，1 mg珠与LIBS抗体在室温下(RT)孵育10min以结合大约IO吗 组氨酸-标记抗体。然后包含悬液的试管置于磁铁上直至珠子移动至试 管一侧，并弃去上清液。使用含有50mMNaP(pH8)、 300mMNaCl和 0.01 %Tween-20的结合和冲洗缓冲液重复冲洗四次。LIBS-MPIO与活化血小板的结合进行粘附试验来证明LIBS-MIPO与活化血小板的结合。来自未使 用药物的健康志愿者的血液用枸橼酸抗凝并以1000rpm离心10min。 得到的富含血小板的血浆用PBS(1:10)稀释，并将100 ^加入至覆盖纤 维蛋白原的盖玻片上，该盖玻片已用20pg/ml纤维蛋白原在38°C预 孵育1小时并用1 % BSA在室温下封闭1小时。在38°C孵育30 min 后，盖玻片用PBS冲洗，并在连续旋转条件下或与0.5吗LIBS-MPIO (LIBS-MPIO)或与等量的交联的无关单链抗体对照(对照-MPIO)在 38。C下另外孵育30 min。然后用PBS冲洗盖玻片两次，并用10%羊 血清(Vector, Burlingame, CA/USA)在室温下封闭1小时。为了证明对比 剂的特异性结合，使用单克隆鼠抗人CD62抗体(1:100, R&D Systems, Abingdon, LJK)，以生物素化的羊抗鼠IgG(Vector， Burlingame, CA/USA) 作为二抗对血小板进行P-选择素共染色。最后，加入1:200稀释的荧 光素亲和素D (Vector, Burlingame, CA/USA)，在室温下孵育1小时。 使用CellFix (BD Biosciences, Heidelberg, Germany)固定盖玻片并通过 共聚焦显微镜进行评价。小鼠在平均年龄为10±0.8周的雄性C57BL/6小鼠(Jackson Laboratories, UK)进行金属丝损伤。小鼠随意饮水和进食标准饲料。所有操作步骤均 遵循1986年的英国(科学实验)动物法(UK Home Office Animals (Scientific Procedures) Act 1986》股骨金属丝损伤、珠子灌注和标本制备如以前的记载(Roque, M.等人，Mouse model of femoral artery denudation injury associated with the rapid accumulation of adhesion molecules on the luminal surface and recruitment of neutrophils. Arterioscler Thromb Vase Biol， 2000. 20(2): p.335-42)，使用芬太尼 (Hypnorm) (25 mg/kg, Bayer, Germany)禾口环巴比妥(Hypnova1)(25 mg/kg, Bayer， Germany)的组合皮下给药施以全身麻醉，进行单侧股骨金属丝 损伤。在手术显微镜下做腹股沟切口。暴露股动脉，使用30G注射套 管(BD, Erembodegem, Belgium)从远端至上腹部分支做动脉切开。插入 一根0.010"导丝(Boston Scientific, Natick, USA)，推进至主动脉杈处并 将其拉回。去除金属丝后，结扎动脉切开部位，使用缝合丝线闭合皮 肤。24小时后，小鼠通过吸入异氟烷进行终末麻醉。采用胸廓切开术 开胸，暴露心脏，并切开右心房。经左心室尖插入30G针头并用10ml PBS对动物进行灌注以排除血液。用5 mL含有LIBS-MPIO或对照 -MPIO(每种含1.5x10s珠子/ml)的PBS继续灌注。30分钟后，在生理 学压力下用10 mL PBS然后用5 ml含有2mM加多利道(gadotehdiol) (Prohance, Bracco, UK)的4%多聚甲醛(PFA)再次对小鼠进行灌注。去 掉皮肤，切除有损伤区域的腿，置于4% PFA/2mM加多利道中24小时， 然后包埋在含有2%高级别低熔点的琼脂糖(Cambrex， Rockland， ME/USA)的玻璃MR试管中。离体(Ex vivo)MRI"(吏用 13 mm H 鸟笼身寸步员线圈(birdcage radiofrequency coil) (RAPID Biomedical, Wiirzburg, Germany)以11.7T进行离体MRI 。在自 动过夜操作中使用3D梯度回波序列(TE = 4 ms / TR= 90 ms，视野13 x 13xl9.5mm，矩阵大小256 x 256 x 384，两次平均，每个序列的显像 时间 7 h)。脱机进行数据重建，最终的各向同性解析度为25 pm3。股动脉损伤中MPIO结合的组织学和定量在MRI后，标本在10%甲酸中脱钙过夜，通过梯度乙醇溶液和 Neo-clear (VMR, UK)脱水，石蜡包埋和连续切片(8 厚)。根据生产 厂商的方法对标本进行铁染色(Accustain, Sigma, Germany)。对与损伤血管壁结合的交联MPIO的数量进行定量，并使用光学显微镜对来自 每只动物损伤血管部位的20-25张切片进行平均。为了用免疫组织化学显示血小板，将去石蜡和再水化的切片在1%H202中饱和20min，加入至慢沸的柠檬酸盐缓冲液中，并在高压锅内 煮沸4 min进行抗原修复。标本在PBS Tween冲洗，与蛋白质封闭溶 液(DakoCytomation, Hamburg, Germany)孵育4小时，并在4°C下与大 鼠抗小鼠CD61抗体(1:8000, InterCell Technologies, FI/USA)孵育过夜。 用PBS冲洗后，加入生物素化羊抗仓鼠IgG (1:200， Vector, Burlingame, CA/USA)二抗。载玻片用PBS冲洗，并使用VectastainRTU Elite ABC-试剂和Vector NovaRed (均来自Vector, Burlingame, CA/USA)进行过氧 化物酶反应。最后，切片脱水，用Permount (Biomeda, Foster City, CA/USA)封片，在光学显微镜上评价珠子与血小板的结合。通过离体MRI检测股动脉中的MPIO结合设盲进行MPIO结合的定量。抗体-交联的MPIO结合定义为在22 个连续的层中股动脉的腔面上清晰的环状信号缺损。在多块切片.卜rh 现的MPIO仅计数一次。使用ImagePro Plus的3D构建器插件对分段 图像进行三维重建以显示在股动脉上MPIO结合的分布情况。统计学方法数据表示为均数i标准差。使用f-检验比较参数数据。统计学显著 性指定为P0.05。结果LIBS-MPIO能检测血小板上活化的糖蛋白Ilb/IIIa受体在图13中，用抗P-选择素受体标记的人血小板血栓的荧光呈现亮 绿色。在血小板血栓上重叠的是红色区域，对应于LIBS-MPIO (A屏) 的自荧光。MPIO被限制在血小板血栓中，没有非特异性的背景滞留。 相反，在B屏中，对照-MPIO与无关单链抗体完全没有交联结合。在 共聚焦显微镜中的3D z-堆栈重建显示了 LIBS-MPIO与P-选择素染色 的血小板(绿色)的结合(红色)，着重显示了其相对大小和空间关系。通过离体MRI检测到的LIBS-MPIO与粘附于血管壁的血小板的结合在13只小鼠中进行单侧股动脉金属丝损伤试验，没有发生并发症。 7只小鼠经左心室灌注以LIBS-MPIO， 6只灌注对照-MPIO。因为在 MPIO定量过程中两名观察者对一只对照动物的观察结果有显著的差 异，因此将该动物从定量分析中排除。损伤动脉段的离体丁2*-加权MRI也证明在动脉壁内有固有的低信 号区(图14B)。与此不同的是在血管腔内但靠近血管壁处出现了环状的 信号缺损。在用LIBS-MPIO注射的所有小鼠的金属丝损伤动脉中都观 察到了这种特征(图14A)。在定量分析中，在LIBS-MPIO注射的动物 中，表明有MPIO积累的低信号的管腔面积明显高亍对照-MPIO灌注 的动物(23.72比6.2; P<0.01，图14C)。在组织学中证实MPIO的结合(图15)，在LIBS-MPIO注射的动物 中MPIO-结合明显较高(每张切片9.98比0.5个珠子，PO.01;图15D)。 通过免疫组织化学证实了 MPIO和血小板与动脉壁的粘附是共存的。 在图15C中，证明了 MPIO的存在与血小板标志物CD61的免疫染色 阳性是有关联的。组织学中对珠子定量的分析与离体MRI定量的比较表明两者有很 强相关性(112=0.7219， PO.001;图17)。因此，通过MRI测定的MPIO 信号强度直接反映了与损伤血管壁结合的MPIO的数量。最后，要理解的是在不背离如本文所概括的本发明的精神的前提 下，可做出各种其他的修改和/或变化。
权利要求
1.一种抗凝剂，其包括能抑制凝血的第一种组分和能靶向活化血小板的第二种组分，其中在对受试者给予所述抗凝剂时，第二种组分将第一种组分引向活化的血小板。
2. 根据权利要求1所述的抗凝剂，其中所述的第二种组分能与活化血小板表面上的标志物结合。
3. 根据权利要求2所述的抗凝剂，其中所述的标志物仅在或主要 在活化血小板的表面上表达。
4. 根据权利要求2或3所述的抗凝剂，其中所述的标志物是配体 诱导结合位点(LIBS)。
5. 根据权利要求2至4任意一项所述的抗凝剂，其中所述的标志 物是GPIIb/IIIa。
6. 根据权利要求2至5任意一项所述的抗凝剂，其中所述的标志 物是GPIIb/IIIa的活化形式。
7. 根据权利要求2至6任意一项所述的抗凝剂，其中在每个血小 板的表面上发现有大约60000至80000的标志物分子。
8. 根据权利要求1至7任意一项所述的抗凝剂，其中所述的第二 种组分能与GP Hb/IIIa受体活化过程中形成的新抗原表位结合。
9. 根据权利要求1至8任意一项所述的抗凝剂，其中当给予受试 者时基本上不增加出血时间，或引起受试者的出血并发症。
10. 根据权利要求9所述的抗凝剂，其中出血时间通过手术切断小 鼠尾部来确定。
11. 根据权利要求1至10任意一项所述的抗凝剂，其中当给予受 试者时延长了受试者的闭塞时间。
12. 根据权利要求11所述的抗凝剂，其中使用小鼠血栓模型来确 定闭塞时间。
13. 根据权利要求11或12所述的抗凝剂，其中当给予受试者时， 与阴性对照的给药相比闭塞时间为至少大约两倍。
14. 根据权利要求11至13任意一项所述的抗凝剂，其中闭塞时间 的延长类似于或超过依诺肝素的效果。
15. 根据权利要求1至14任意一项所述的抗凝剂，其中所述的第 一种组分具有很低的分子量，这样第一种组分能够有效地集中在活化 血小板的部位处。
16. 根据权利要求15所述的抗凝剂，其中所述的第一种组分的分 子量为大约7,000道尔顿或更小。
17. 根据权利要求1至16任意一项所述的抗凝剂，其中所述的第 一种组分是肽抗凝剂。
18. 根据权利要求17所述的抗凝剂，其中所述的肽抗凝剂由大约 60个或更少的氨基酸残基组成。
19. 根据权利要求17或18所述的抗凝剂，其中所述的肽抗凝剂来 源于蜱。
20. 根据权利要求19所述的抗凝剂，其中所述的蜱是毛白钝缘蜱。
21. 根据权利要求1至20任意一项所述的抗凝剂，其中所述的第一种组分作用于酶Xa因子。
22. 根据权利要求21所述的抗凝剂，其中所述的第一种组分在缺 少辅因子时直接抑制Xa因子。
23. 根据权利要求1至22任意一项所述的抗凝剂，其中所述的第 一种和第二种组分物理性地连接成为单分子的形式。
24. 根据权利要求23所述的抗凝剂，其中所述的单分子是蛋白质 分子。
25. 根据权利要求至24任意一项所述的抗凝剂，其中所述的第 一种和第二种组分在单链抗体分子的框架结构中。
26. 根据权利要求25所述的抗凝剂，其中所述的单链抗体基本上 如本文中的图1所示，或其衍生物或等价物。
27. —种药学组合物，其包括根据权利要求1至26任意一项所述 的抗凝剂和药学可接受的盐。
28. -—种治疗或预防凝血障碍的方法，其包括给予需要所述方法的 哺乳动物以有效量的根据权利要求27所述的组合物的步骤。
29. 根据权利要求24所述的方法，其中所述的组合物经静脉内途 径或动脉内推注或输注给药。
30. 根据权利要求28或29所述的方法，其中当抗凝剂是蛋白质时， 给药剂量为大约30 mg/kg至大约300 mg/kg。
31. 根据权利要求28至30任意一项所述的方法，其中所述的凝血 障碍选自冠状动脉疾病、急性冠状动脉综合征包括心肌梗塞、中风、 颈动脉或主动脉的动脉粥样硬化、深部静脉血栓形成、肺栓塞、和器官的动脉粥样硬化或血栓形成。
32. 根据权利要求1至26任意一项所述的抗凝剂在制备用于预防 或治疗凝血障碍的药物中的应用。
33. 根据权利要求32所述的应用，其中所述的凝血障碍选自冠状 动脉疾病、冠状动脉梗塞、急性冠状动脉综合征包括心肌梗塞、中风、 颈动脉或主动脉的动脉粥样硬化、深部静脉血栓形成、肺栓塞、和器 官的动脉粥样硬化或血栓形成。
34. —种用于检测血管异常的探针，其包括(a)能靶向活化血小板 的结合组分和(b)标记物。
35. 根据权利要求34所述的探针，其中所述的结合组分能与活化 血小板表面上的标志物结合。
36. 根据权利要求35所述的探针，其中所述的标志物仅在或主要 在活化血小板的表面上表达。
37. 根据权利要求35至36任意一项所述的探针，其中在每个血小 板的表面上发现有大约60000至80000的所述标志物分子。
38. 根据权利要求34至37任意一项所述的探针，其中所述的结合 组分针对的是血小板上的配体诱导结合位点(LIBS)。
39. 根据权利要求35或36所述的探针，其中所述的标志物是 GP謹IIa。
40. 根据权利要求37至40任意一项所述的探针，其中所述的标志 物是GPIIb/IIIa的活化形式。
41. 根据权利要求34至40任意一项所述的探针，其中所述的结合组分能与GPIIb/IIIa受体活化过程中形成的新抗原表位结合。
42. 根据权利要求34至41任意一项所述的探针，其中所述的结合 组分和标记物在单链抗体分子的框架结构中。
43. 根据权利要求34至42任意一项所述的探针，其中所述的标记 物是顺磁性的、放射性的，或用X-线成像法可检测到的。
44. 根据权利要求43或44所述的探针，其中所述的标记物包括锝 -99m 、铷-82、铊201、 F-18、镓-67或铟-111。
45. 根据权利要求34至44任意一项所述的探针，其中所述的标记 物包括超顺磁性氧化铁或gandolinium。
46. 根据权利要求34至45任意一项所述的探针，其中所述的标记 物包括微米尺寸的顺磁性氧化铁。
47. 根据权利要求34至46任意一项所述的探针，其中所述的探针 能渗透至异常血管的表面之外和/或附着在血管的表面上。
48. —种在受试者内对血管异常成像的方法，其包括检测受试者血 管中的活化血小板。
49. 根据权利要求47所述的方法，其包括将根据权利要求34至 47任意一项所述的探针与受试者的血管接触的步骤。
50. 根据权利要求48或49所述的方法，其中所述的异常选自破裂 的粥样硬化斑或易于破裂的粥样硬化斑、血栓、栓子和活化血小板的 积聚。
全文摘要
本发明提供了一种抗凝剂，其包括能抑制凝血的第一种组分和靶向活化血小板的第二种组分，其中在对受试者给予该药剂时，第二种组分将第一种组分引向活化的血小板。本发明还提供了用于检测血管异常的探针，其包括(a)能靶向活化的血小板的结合组分和(b)标记物。本申请人已证明上述针对活化血小板的药剂和探针能用于诊断和治疗凝血障碍。
文档编号A61K39/395GK101237879SQ200680024609
公开日2008年8月6日 申请日期2006年7月5日 优先权日2005年7月5日
发明者K·彼得 申请人:贝克医药研究所