专利名称：西罗莫司脂质体冻干粉针及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及西罗莫司的制剂，也就是说涉及一种含西罗莫司的注射用脂质体冻 干粉针剂与制备方法，具体说是西罗莫司脂质体冻干粉针及其制备工艺。
背景技术：
西罗莫司(Sirdimus， Rapamune,又名雷帕霉素)是二十世纪七十年代初，由加 拿大Ayerst研究所科学家从太平洋Easter山岛的土壤中分离出来的吸水性链霉菌 AYBP44的代谢产物，其相对分子质量为914.2，最初作为低毒性抗真菌的抗生素。 1978年报道它在大鼠佐剂性关节炎和实验性过敏性脑Wit膜炎模型中的免疫抑制 活性，并开始进行相关基础与临床实验。实验表明它不但对于多种自身免疫性异常 有显著疗效，而且在不同种类的器官移植动物模型上显示出显著性抗排斥反应活 性。1989年开始作为治疗器官移植的排斥反应的新药进行i細，1999年美国FDA 批准将该药作为肾器官移植免疫抑制剂在临床应用，至今已在20多个国家获得批 准或注册，用于预防器官移植患者的急性排斥反应。研究发现，西罗莫司作为免疫 抑制剂的作用主要表现为抑制T细胞和T细胞依赖性B细W抑制物抗原的反应， 作用机制为西罗莫司与FK506蛋白(FKBP"—12)结合形成西罗莫司FKBP—12复合 物，后者再与哺乳类西罗莫司耙分子(mTOR， 一种关键的调节激酶)结合，阻断T 淋巴细胞及其他细胞由Gl期至S期的进程，从而产生抑制效应。目前药理实验结 果表明，西罗莫司的免疫抑制效果明显优于同类药物他克莫司，是环孢霉素的ioo 倍。西罗莫司是一种难溶于水的固体物质，在自然条件下易受光和热的影响而发生 糊军，所以其制剂需要避光冷藏，而且制齐啲生产过程需要在避光斜牛下进行。国外上市西罗莫司剂型主要为口服液，含本品浓度为lmg/ml，规格有60mL, 150mL两种，生物利用度才约为15%。西罗莫司口服溶液需遮光，密封，4-8t:冷 藏，有效期一年，患者服用时定量也非常不便。2001年Elan公司利用纳米技术开 发了西罗莫司的纳米晶体片。与口服溶液相比，纳米晶体片虽服用方便，生物利用 度提高了不过1倍左右，而且纳米结晶片生产周期较长，并且生产过程中所{顿介 质高强度长时间碾磨也容易影响西罗莫司的质量。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术的不^t处，为解决西罗莫司生物禾拥衝氐 的问题，提供一种稳定性好、包封率高、成本低以及毒副作用小的西罗莫司注射用 脂质体冻干粉针，同时提供一种该注射用脂质体冻干粉针的制备工艺。本发明所述 的一种西罗莫司脂质体冻干粉针，这是一种可供注射应用的新型制剂。脂质体(liposomes)的概念最早由Bingham于1965年提出，20世纪60年代末Rahman等人首先将其作为药物载体使用。脂质体是将药物包裹在磷脂双分子层内形成的微 型囊泡结构。月旨质体作为一种优良的药物载体具有提高难溶性药物的溶解度，提高 被包封药物的稳定性，降低药物毒隨延长药物作用时间靴点。月旨质体的载体材 料有很好的组织细胞相容性，可以安全的用于注射给药，这就大大提高了药物的生 物利用度。本发明所述的西罗莫司脂质体，期旨质体膜有一定的鹏性，在液微态下， 包封的药物易渗透至鹏外。另外，在液皿态下，月旨质体的材料磷脂、胆固醇易发 生氧化、水解、霉变等，而且粒子易发生粘连聚集，这些都影响了脂质体的质量， 限制了脂质体的工业化生产及在临床上的应用。本发明所述的西罗莫司脂质体冻干 粉针及其制备工艺，本制剂魏用脂质体成分、缓冲液、有机溶剂、抗氧化剂和冻 干保护剂，采用薄膜分散法，经高压乳匀鋼声波分散法处理制成均匀的包裹西罗 莫司的脂质体混悬液。西罗莫司脂质体经冷冻^P燥制成冻干粉针，显著提高了贮存 稳定性。冻干粉可用任意比例注射用7K均匀分散，不产生任何沉淀及杂质，经分散 后，月旨质体包封率达96%，粒径为50"250nm。药效学实验表明，与口月艮注射液相 比，月旨质敝射剂大大提高了药物的疗效。药物动力学实验表明，与口服注射液相 比，月旨质^ft射剂显著延长了药物在血液循环的时间，并大大提高了药物的生物利 用度。为解决脂质体的稳定性问题，本发明采用冷冻:^燥技术，把脂质体制备成冷冻 千燥粉末，发明了一种稳定的西罗莫司脂质,射用固体冻干粉针。把西罗莫司脂 质体制成固体冻干粉针后，稳定性大大提高，贮存简单，4OT前用适M^I寸用水稀 释分散即可，提高了被包封西罗莫司的稳定性，可以安全的注射给药。特另嚅要指 出的是，月旨质体经注射进Ajfll液循环后，可选择性集中于单核巨噬细胞系统丰富的 器官，如肝脏，脾脏等，这就大大减少了西罗莫司的心脏毒性，并可以在肝脏、脾 脏内缓優释药，显著延长了药物作用时间。
本发明的技术方案是根据脂质体的特性，选用薄膜分散纟去制备包裹了西罗莫斯的脂质体。本发明在配方中加A^量的维生素E作为抗氧化剂，防止脂质成分的氧 化变质，增强脂质体的化学稳定性。维生素E与磷脂的重量比为0.001 : 1~0.1 : 1。 得到的西罗莫司脂质体水性混悬液属于高度分散的亚微粒系统，具有较高的表面 能，液体状劍呆存下易发生粒子间的粘连、聚集，本发明在脂质体水性混悬液内加 入冻干傲户剂，采用冷冻千燥技术，制备了西罗莫司脂质体冻干粉针。所得到的西罗莫司脂质体冻干粉针，既能显著提高帝跻肥存稳定性，又能保证 西罗莫司脂质体冻干粉针能以任意比例加入注射用水重新稀释分散，并且不产生任 何不溶性物质或沉淀。另外，由于戶腿脂质材料的高度细胞相容性，经稀释得到的 脂质体混悬液可以安全的注射给药，iSA血液循环后，可选择性集中于单核巨噬细 胞系统丰富的器官，如肝脏，脾脏等，这就大大减少了西罗莫司的心脏毒性，并可 以在肝脏、脾脏内缓慢释药，显著延长了药物作用时间，提高了药物在体内的生物 利用度。
本发明所说的西罗莫司脂质体冻干粉针,其特征在于由以下重量比的原料组成: 西罗莫司 500m^"5g磷脂 lg"廳g 胆闺醇 100 mr~50 g抗氧化剂 lmg"10g 冻干保护剂 30gr^00g 氯化钠 9 g同时满足西罗莫司和磷脂的重量比为0.05 : 1~0.5 : 1，胆固醇和磷脂的重量 比为O.l :l—l:l。戶，的西罗莫司脂质体冻干粉^十，其中磷脂可以是国产注射用大豆磷脂、蛋黄 卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂,旦碱、二棕榈酰磷脂醐旦碱、二 肉豆蔻酰磷脂翻旦碱，也可以是泊洛沙姆、神经StB安、汴泽类非离子型表面活性剂; 胆固醇为国产注射用胆固醇。
所述的西罗莫司脂质体冻干粉针，其中抗氧化剂可以是维生素E，其与磷脂的重量比为o.ooi : l~o.l : l。所述的西罗莫司脂质体冻干粉针，其中冻干保护剂是甘露醇、山梨醇、蔗糖、学L糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮或它们的混合物，其含量为3"40%。
所述的西罗莫司脂质体冻干粉针，其剂型是冻干粉。所述的西罗莫司脂质体冻干粉针,其特征在于制备脂质体的方纟跑含以下步骤1) 备置下述重量或体积的原料西罗莫司 500mg^5g 磷脂 lgT""100g 胆固醇 100mgr~50g 维生素E lmg^lOg 缓冲液 100ml^500ml 冻干保护剂 30gr"400g 有机翻 400 ml—800ml氯化钠 9 g注射用水 1000 ml2) 将西罗莫司、磷脂、胆固醇、维生素E溶于氯仿或氯仿一乙醇的混合、MU 中并混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中的有机、，IJ减压除去，在玻璃瓶壁上形成月旨3) 加入等渗的磷酸盐缓冲液(pH6—7.4， 0.01mol/L)，搅拌30min，在室温下 放置2h，使薄膜吸胀；再在室温下搅拌2h，得到脂质体水混悬液。得到的脂质体 水混悬液经过高压乳匀或者超声波分散处理，均化脂质体。4) 加入冻干保护剂，用等渗注射用水定容至1000 ml、经过微孔滤膜过滤除菌、 分装于西林瓶中。5) 冷冻干燥，得到西罗莫司脂质体的冻干粉，在(M °C贮存。 所述的西罗莫司脂质体冻干粉针制备方法，其特征在于制备脂质体的缓冲液系统是磷酸盐缓冲液，pH为6—7.4。所述的西罗莫司脂质体冻干粉针制备方法，其特征在于制备脂质体的有机溶剂 是氯仿、乙醇或它们的混合物。所述的西罗莫司脂质体冻干粉针制备方法，其特征在于均化脂质体采用高压乳 匀法，^f牛为500bar， 2—5次；或者采用超声波分飮法处理2min (每处理0.5min 间歇0.5min)。所述的西罗莫司脂质体冻干粉针制备方法，其特征在于制备脂质体的灭菌方法 是微孔滤膜过滤。
所述的西罗莫司脂质体冻干粉针制备方法，其特征在于冷冻干燥是首先将西罗莫司月旨质体混悬液于-80 。C下冷冻24"48h，然后在-40 — -60 。C， 0.5~0.1 mPa的^(牛下进行的。所述的西罗莫司脂质体冻干粉针制备方法，其特征在于所有的操作都是在避光 环境下进行的。本发明的有益效果在于，本发明制得的西罗莫司脂质体冻干粉针，夕卜观是一种 淡黄色疏松海绵状纤细粉末，力队注射用水轻轻振摇即刻稀释分散呈均匀混悬液， 粒径在100"-200nm之间，包封率可达96%，游离的西罗莫司很少， 一般小于4%。 本发明配方中磷脂、胆固醇载体材料使用国产注射用磷脂、胆固醇，大大降低了产 品成本，制得條中国国情的制剂。本发明在配方中加入维生素E作为抗氧化剂， 大大提高了西罗莫司脂质体的化学稳定性。另外，本发明采用高压乳匀法或者超声 波分散法进一步均匀了脂质体粒子的大小，并且得到的均匀脂质体 ^悬、 用冷冻 千燥技术制成固体冻干粉末，低温保存，魏一步提高了西罗莫司脂质体的物理稳 定性。本发明所得冻干粉末产品在0^TC下避光保存一年稳定性试验结果表明其平 均粒纟狄包封率的变化率均小于3%。本发明制得的西罗莫司脂质体冻干粉针4細 简单，注射前用适量注射用水稀释分散均匀即可，用魏医嘱。
附图1是西罗莫司口服液单剂量给药大鼠血浆中药时曲线；附图2是西罗莫司 脂质体冻干粉大鼠尾静脉注射血浆中药时曲线。M实施方式现参照附图1和附图2，结合实施例说明如下 本发明的药效学实验-将60只经肾移植后的小鼠随机分为两组， 一组灌胃给予西罗莫司口服液 (Rapamune , Wyeth公司，批号08587),另一组尾静脉注射经注射用水稀释后的 西罗莫司脂质体冻干粉针，结果表明，口服液ED50为15mg'kg-l，月旨质体的ED50 则为2mg'kg-l，可见与口服ftl寸液相比，月旨质体注射剂大大提高了药物的疗效。本发明药物动力学实验取体重为(200i2)g的健康雄性大鼠10只，随机均分为两组，一组灌胃给 药西罗莫司口服液(Rapamune , Wyeth公司，批号08587)， 一组尾静脉注射经 注射用水稀释后的西罗莫司脂质体冻干粉针，均按25mg，kg-l的剂量给药。分别于0.25， 0.5,1， 2, 6， 12,24, 36和48 h眼眶取血1,5 — 2.0 mL，加入1 g/ml的内标溶液 20^1(内标物为32—去甲氧基西罗莫司)旋涡混匀，加5%硫酸锌溶液和丙酮各lml， 旋涡混匀后离心(3000r/min)10min，取上清液lml，吹干后加入流动相0.5ml溶解， 过滤后进样10pl测定。HPLC色谱^f牛色谱柱为C8柱(250mmX4.6mm，5.6nm)，流动相为甲醇一 水一乙腈(30 : 30 : 40， V/V) ，^t显40。C，流速1.5ml/min，检测波长为277nm。表1 西罗莫司大鼠药物动力学参数比较Cmax(ug.ml-l) Tmax(h) AUC(h'ug.ml-l) MRT(h) 口月艮液 0.73 1.4 10.6 12.34注射剂 一 一 99.7 23.68由表1可知，与口服液相比，月旨质体显著延长了药物在体内的平均滞留时间， 由12.34h提高到了 23.68h。 AUC也增加了近10倍。以下通过实施例对本发明作进一步阐逸但所作实施例并不顿本发明柳艮制。实施例l:备置下述重量或体积的原料西罗莫司 500 mg大豆磷脂 2.3 g胆固醇 1 g维生素E 21 mg磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.01mol/L) 300 ml甘露醇 100 g氯仿 400 ml氯化钠 9 g注射用水 1000 ml根据配方中原料的重量比将西罗莫司、磷脂、胆固醇、维生素E溶于氯仿中并 混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中的有机溶剂减压除去(温度不高于4(TC)，在玻 璃瓶壁上形成脂质薄膜；加入等渗的磷酸盐缓冲液(pH6—7.4， 0.01mol/L，含0.9% Nacl) 300 ml，搅拌30min，在室温下放置2h，使薄膜吸胀；再在室温下搅拌2h， 得至鹏质体水混悬液；得到的脂质体7jC混悬液经过高压乳匀机处理(高压乳匀机配 有冷凝管，管内循环(TC的冷水)，压力500bar，乳匀5次，均化脂质体；所得均匀 脂质体混悬液中加入配方量的甘露醇，用等渗注射用水定容至1000ml，搅拌均匀， 经过0.22pm微孔滤膜过滤除菌、分装于200只10ml规格的西林瓶(已灭菌消毒) 中；将西罗莫司脂质体混悬液于-80 'C下冷冻48h,然后在-4(TC， 0.5~0.1 mPa的条 件下进行冷冻千燥，得到西罗莫司脂质体的冻干粉，在0~4 "C避光贮存；上述所 有操作步骤均在避光下进行；产品经任意比的注射用水稀释后，轻轻振摇即可分散 为均匀的混悬液；经激光粒子粒度分析仪测定，平均粒径为105nm，低温超速离心法测得敏率为96%。 实施例2:备置下述重量或体积的原料西罗莫司 1000 mg蛋黄卵磷脂 7g二硬脂酰磷脂醐旦碱 5 g胆固醇 7g维生素E 100 mg磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.01mol/L) 300ml甘露醇 150 g氯仿 500 ml氯化钠 9g注射用水 藤ml根据配方中原料的重量比将西罗莫司、磷脂、胆固醇、维生素E溶于2 : 1的 氯仿一乙醇混合溶剂中并混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中的有机溶剂减压除去 (温度不高于40。C)，在玻璃瓶壁上形成脂质薄膜；加入等渗的磷酸盐缓冲液(pH6 —7.4， 0.01mol/L，含0.9。/。Nacl) 300 ml，搅拌30min，在室温下放置2h，使薄膜 吸胀；再在室温下搅拌2h，得至鹏质体水混悬液；得到柳旨质体水混悬液经过高压 乳匀机处理(高压乳匀机配有冷凝管，管内循环(TC的冷水)，压力500bar,乳匀5 次，均化脂质体；所得均匀脂质体混悬液中加入配方量的甘露醇，用等渗^l寸用水 定容至1000 ml搅拌均匀，经过0.22pm微孔滤膜过滤除菌、，于200只10ml规 格的西林瓶(已灭菌消毒)中；将西罗莫司脂质体混悬液于-80 。C下冷冻48h，然后 在4(TC， 0.5"0.1mPa的条件下进行冷冻千燥，得到西罗莫司脂质体的冻干粉，在 H 'C避光IC存；上述所有操作步骤均在避光下进行；产品经任意比的注射用水
稀释后，轻轻振摇即可分散为均匀的混悬液；经激光粒子粒度分析仪测定，平均粒 径为80nm，低^g速离心法测得包封率为96%。实施例3:备置下述重量或体积的原料西罗莫司 1000 mg旭磷脂 3 g二硬脂酰磷脂,碱 5 g胆固醇 7 g维生素E 100 mg磷酸盐缓冲液(pH7.4,0.01mol/L) 300ml甘露醇 150g氯仿 500 ml氯化钠 9 g注射用水 1000 ml根据配方中原料的重量比将西罗莫司、磷脂、胆固醇、维生素E溶于2 : 1的 氯仿一乙醇混合溶剂中并混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中的有机溶剂减压除去 (温度不高于40。C)，在玻璃瓶壁上形劍旨质薄膜；加入等渗的磷酸盐缓冲液(pH6 _7.4, 0.01mo]/L，含0.9。/。Nacl) 300 ml，搅拌30min，在室温下放置2h，使薄膜 吸胀；再在室温下搅拌2h，得至鹏质体水混悬液；得到的脂质体水混悬液经过超声 波分散2min(每超声处理0.5min，就浸在(TC冷水中间歇0.5min)，均化脂质体；所 得均匀脂质体混悬液中加入配方量的甘露醇，用等渗注射用水定容至1000 ml搅拌 均匀，经过a22阿微 L滤膜过滤除菌、分装于200只10ml规格的西林瓶(已灭菌 消毒)中；将西罗莫司脂质体、 昆悬液于-80 'C下冷冻48h,然后在-40'C， 0.5~0.1mPa 的条件下进行冷冻千燥，得到西罗莫司脂质体的冻干粉，在0"4 。C避光贮存；上 述所有操作步骤均在避光下进行；产品经任意比的,用水稀释后，轻轻振摇即可 分散为均匀的混悬液；经激光粒子粒度分析仪测定，平均粒径为80nm， fffl^M 离心法测得包封率为96%。
权利要求
1.一种西罗莫司脂质体冻干粉针，其特征在于有以下重量比的原料组成西罗莫司 500mg-5g磷脂 1g-100g胆固醇100mg-50g抗氧化剂 1mg-10g冻干保护剂30g-400g氯化钠9g同时满足西罗莫司和磷脂的重量比为0.05∶1-0.5∶1，胆固醇和磷脂的重量比为0.1∶1-1∶1。
2. 根据权利要求1所述的西罗莫司脂质体冻干粉针，其特征在于制备脂质体的 脂质成分可以是国产注射用大豆磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸、二硬 脂酰磷脂,旦碱、二棕榈酰磷脂醐旦碱、二肉豆蔻酰磷脂醐旦碱、泊洛沙姆、神经 醐安、汴泽类非离子型表面活性剂、胆固醇。
3. 根据权利要求1戶脱的西罗莫司脂质体冻干粉针，其特征在于制备脂质体的 抗氧化剂是维生素E，其与磷脂的重量比为0.001 : l"O.l : 1。
4. 根据权利要求1所述的西罗莫司脂质体冻干粉针，其特征在于制备脂质体的 冻干保护剂可以是甘露醇、山梨醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷 酮或它们的混合物，其含量为340%。
5. 根据权利要求1所述的西罗莫司脂质体冻干粉针，其特征在于帝恪脂质体的 方^^含以下步骤1)备置下述重量或体积的原料 西罗莫司 500mgr^g 磷脂 lg"100g 胆固醇 10Om0Og 维生素E lmg""10g 缓冲液 100ml~500ml 冻干保护剂 30 gr~400 g西罗莫司500mgr~5glg""100g100m广50g1 mg^10 g30g~^00g9g胆固醇 抗氧化剂冻干保护剂 氯化钠有机溶剂 氯化钠400 ml—800ml2) 将西罗莫司、磷脂、胆固醇、维生素E溶于氯仿或氯仿一乙醇的混合溶剂 中并混合均匀；用旋转蒸发仪将溶液中的有机、凝lMil除去，在玻璃瓶壁上形劍旨 质薄膜；3) 加入等渗的磷酸盐缓冲液(pH6~7.4， 0.01mol/L)，搅拌30min，在室温 下放置2h，使薄膜吸胀；再在室温下搅拌2h，得到脂质体7jC混悬液；得到的脂质 体水混悬液经过高压乳匀或者超声波分散处理，均化脂质体；4) 加入冻干保护剂，并搅拌均匀，用等渗注射用7jC定容至1000 ml、经过微 孑L滤膜过滤除菌、分装于西林瓶中；5) 冷冻T^燥，得到西罗莫司脂质体的冻干粉，在0~4 °C忙存。
6. 根据权利要求5戶脱的西罗莫司脂质体冻干粉针帝IJ备方法，其特征在于制备 脂质体的缓冲液系统是磷酸盐缓冲液，P H为6—7.4。
7. 根据权利要求5所述的西罗莫司脂质体冻干粉针制备方法，其特征在于制备 脂质体的有机辭IJ是氯仿、乙醇或它们的混合物。
全文摘要
西罗莫司脂质体冻干粉针及其制备工艺，本制剂是选用脂质体成分、缓冲液、有机溶剂、抗氧化剂和冻干保护剂，采用薄膜分散法，经高压乳匀或超声波分散法处理制成均匀的包裹西罗莫司的脂质体混悬液。西罗莫司脂质体可经冷冻干燥制成冻干粉针，显著提高了贮存稳定性。冻干粉可用任意比例注射用水均匀分散，不产生任何沉淀及杂质，经分散后，脂质体包封率达96％，粒径为50-250nm。药效学实验表明，与口服注射液相比，脂质体注射剂大大提高了药物的疗效。药物动力学实验表明，与口服注射液相比，脂质体注射剂显著延长了药物在血液循环的时间，并大大提高了药物的生物利用度。
文档编号A61K47/28GK101129361SQ20071001631
公开日2008年2月27日 申请日期2007年7月17日 优先权日2007年7月17日
发明者许振华 申请人:山东华诺生物科技有限公司