专利名称：用于治疗小儿外感咳嗽的药物及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于治疗外感咳嗽、特别是小儿外感咳嗽的药物，以及制备其的方法。
背景技术：
外感咳嗽是中医儿科常见、多发病证。外感咳嗽，以风寒、风热证候最为常见。由于小儿生理病理特点，外感风寒之证，易转化为成风寒化热即风寒束肺兼肺经郁热之证。目前治疗此证的中药复方制剂尚不多见。目前上市治疗小儿外感咳嗽的中药复方制剂中，以风热犯肺证为适应证候者居多，风寒束肺者次之，而明确以风寒化热为适应证候者尚不多见。
因此，市场对治疗外感咳嗽、尤其小儿外感咳嗽(急性支气管炎)风寒化热证的中药复方制剂存在着需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种药物，主要用于治疗外感咳嗽、尤其小儿外感咳嗽。
本发明提供的药物由以下重量配比的原料制成 荆芥 5～15份，优选8～13份； 矮地茶 10～20份，优选14～22份； 麻黄(蜜炙) 5～15份，优选7～12份； 苦杏仁1～10份，优选3～8份； 黄芩 1～10份，优选3～8份； 前胡 5～15份，优选7～12份； 法半夏5～15份，优选7～12份； 浮石 5～15份，优选7～14份； 蝉蜕 1～10份，优选3～8份； 陈皮 1～10份，优选3～8份； 紫草 1～10份，优选3～8份； 甘草 1～10份，优选3～8份。
本发明提供的药物可以制成多种制剂片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、凝胶剂、糊剂中的任意一种。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述药物的方法。
制备上述药物的制备方法包括以下步骤 (1)按重量份称取矮地茶、炙麻黄、法半夏、苦杏仁、前胡、紫草，进行渗漉，收集漉液，加入包合剂，真空浓缩得第一浓缩液； (2)按重量份称取荆芥、陈皮，用水蒸馏提取，收集挥发油及滤液； (3)按重量份称黄芩、浮石、蝉蜕、甘草与步骤(1)和(2)所得的药渣合并，加热水煎提合适的次数和时间，收集水提液，过滤，滤液与步骤(2)中荆芥、陈皮提取后所得的滤液合并，浓缩，得第二浓缩液，然后静置一段时间，过滤，向所得滤液中加入包合剂，再浓缩，得第三浓缩液； (4)取所述第一浓缩液和所述第三浓缩液，混合，浓缩，干燥，粉碎成细粉； (5)按适当比例制备由所述挥发油与包合剂组成的包合物； (6)取步骤(4)得到的细粉(干浸膏粉)与步骤(5)得到的包合物，制成适宜的剂型。
临床试验表明，本发明提供的药物对临床常见的小儿外感风寒咳嗽，或有风寒未解，有化热之势，以致寒包热郁而症见咳嗽，鼻流清涕，咽痒，或咽红咽痛，口渴等症有较好疗效。
具体实施例方式 本发明提供的用于治疗外感咳嗽、尤其用于治疗小儿外感咳嗽的药物主要由荆芥、矮地茶、麻黄(蜜炙)、苦杏仁、黄芩、前胡、法半夏、浮石、蝉蜕、陈皮、紫草、甘草组成。该配方是本发明人根据多年的中医从业经验和对中医理论的深入理解而提出。配方中各主要成分的功用如下 荆芥性味辛、微温。归肺、肝经。功能祛风解表，透疹消疮，炒炭止血。用于外感表证，感冒发热，头痛，咳嗽，咽喉肿痛，麻疹不透，风疹瘙痒，疮疡初起有表证，吐衄下血。
矮地茶又名紫金牛(《中药大辞典》)、平地木(《中华本草》)。味辛、微苦，性平。归肺、肝经。功能化痰止咳，利湿活血。主治新久咳嗽，痰多，痰中带血，风湿痹证，肿毒、痢疾、咯血、吐血、劳伤等。
麻黄味辛、微苦，性温，入肺、膀胱经。功能散寒解表，宣肺平喘，利水。主治伤寒表实，头痛身痛，咳嗽气喘，风水浮肿，风邪顽痹等。《本经》“发表出汗，去邪热气，主咳逆上气”。
杏仁味苦，性微温，有小毒，入肺、大肠经。功能降气化痰，止咳平喘，润肠通便。可用于多种咳嗽气喘病证。。
黄芩性味苦、寒。归肺、胃、胆、大肠经。功能清热燥湿，泻火解毒，凉血止血，除热安胎。用于湿温暑湿，湿热痞闷，黄疸泻痢，肺热咳嗽，热病烦渴，痈肿疮毒，咽喉肿痛，血热吐衄，胎热不安。
前胡味苦、辛，性微寒。归肺经。功能散风清热，降气化痰。用于风热咳嗽，痰热喘满，咯痰黄稠。。
法半夏味辛，性温，入脾、胃、肺经。功能燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结。主治湿痰冷饮，咳喘痰多，胸膈胀满，呕吐反胃，痰厥头痛等。
海浮石味咸，性寒。归肺、肾经。功能清肺化痰，软坚散结。主治痰热咳嗽，癭瘤，疮肿。
蝉蜕味甘、咸，性凉，入肺、肝经。功能散风热，宣肺，定痉。主治外感风热，咳嗽音哑，麻疹透发不畅，风疹瘙痒，小儿惊痫，破伤风等。。
陈皮味辛、苦，性温，入脾、肺经。功能理气降逆，调中开胃，燥湿化痰。治疗胸腹胀满，不思饮食，呕吐哕逆，咳嗽痰多等。现代药理研究表明，陈皮所含挥发油有刺激性祛痰作用，陈皮醇提取物对豚鼠离体气管有较强松弛作用。
紫草味苦，性寒。归心、肝经。功能解毒透疹，凉血活血。
甘草味甘，性平，入心、肺、脾、胃经。功能和中缓急，润肺止咳，解毒，调和诸药。
以上诸药配合，共同达到疏风散寒、宣肺清热、祛痰止咳的功效，与主治病证病因病机切合。且本品择药用量，处处考虑适应病证及小儿生理病理特点。证属风寒束表，则以辛温表散为主，但注意小儿为稚阴之体，不可表散太过，以免伤津生变；证兼郁热，仍当以宣开为主，虽助以苦寒清泄但用量较轻，主次分明且没有伤脾胃的副作用。本组合符合主治病证病因病机，兼顾小儿生理病理特点。其立法、择药、组方，符合中医药理论及适应病症的病因病机。
根据本发明的用于治疗外感咳嗽、尤其用于治疗小儿外感咳嗽的药物是由下述重量配比的原料制成 荆芥 5～15份，优选8～13份； 矮地茶 10～20份，优选14～22份； 麻黄(蜜炙) 5～15份，优选7～12份； 苦杏仁 1～10份，优选3～8份； 黄芩 1～10份，优选3～8份； 前胡 5～15份，优选7～12份； 法半夏 5～15份，优选7～12份； 浮石 5～15份，优选7～14份； 蝉蜕 1～10份，优选3～8份； 陈皮 1～10份，优选3～8份； 紫草 1～10份，优选3～8份； 甘草 1～10份，优选3～8份。
在本发明的一种更优选实施方式中，该用于外感咳嗽的药物是由下述重量配比的原料制成 荆芥 10.9份 法半夏9份 矮地茶 18份 浮石 10.9份 麻黄(蜜炙) 9份 蝉蜕 5.5份 苦杏仁 5.5份陈皮 5.5份 黄芩 5.5份紫草 5.5份 前胡 9份 甘草 5.5份 上述药物配方中的原料皆为草药，其可以是在药店出售的草药成品，也可以是新收获的草药，对于后者的情况，一般要将新草药进行烘干或晒干，以基本除去水份。
本发明的药物可以单独使用，或者在适当情况下，与其他药物结合使用。
本发明的药物可以含有一种或多种药用赋形剂(载体)。赋形剂出于多种目的被加入到药物成分中。该药物成分可以方便地以单位剂量形式提供，并且由本领域已知的方法制备。这样的方法包括将提取物成分与载体相组合的步骤，其中载体本身可以包括一种或多种辅助成分。一般地，该剂型的制备是通过均匀而密切地使提取物成分与液体载体、或者粉末固体载体或者二者的结合相混合，然后必要时成形该产物。
药用赋形剂是指对于制备药物组合物有用的赋形剂，通常它是安全、无毒并合乎需要的，且包括可应用于兽医学和人类药物学的赋形剂。这类赋形剂可以是固体、液体、半固体，或在气溶胶组成的情况下是气体。
本发明的药物可以以干的口服制剂形式经口给予。本发明的药物可以以片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、凝胶剂、糊剂等经口给予。口服组合物可以包括常用载体、赋形剂和稀释剂。本发明药物组合物的口服剂型可以用本领域已知技术制备，并含有治疗上有效量的药物成分。对于本发明制剂的治疗有效的口服剂量根据从业医生的判断通过标准临床技术来确定。例如，除医学参考书和药物学文献提供的信息外，可以用熟知的体外或者体内化验来帮助确定最佳剂量。
优选地，该药物制剂是干的口服剂型。优选地，该药物制剂是固体剂型。优选地，该药物制剂是片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂和颗粒剂。在本发明的一个具体实施例中，该药物制剂为颗粒剂。干的剂型可以包括药学可接受的添加剂，如包合剂、赋形剂、载体、稀释剂、稳定剂、增塑剂、粘结剂、助流剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、塑化剂，着色剂、成膜剂、增味剂、甜味剂、防腐剂、给药载体(dosing vehicle)以及前述中的任意结合。这些皆是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。
包合剂的实例包括α-环糊精(α-CD)、β-环糊精(β-CD)和N-LOK变性淀粉，优选β-环糊精。包合剂加入量约为全方药材总量的1％～10％。
甜味剂的实例包括甜菊素、甜菊糖、蛋白糖、木糖醇、高果糖、甜蜜素等。这些甜味剂可以单独使用或以它们的两种或多种的混合物形式使用。在本发明中优选蔗糖或甜菊糖，更优选二者的混合物。可以根据剂型和相应甜味剂的甜度来确定选择甜味剂的用量，通常在0.01％～0.6％，例如当甜度是蔗糖的200～300倍时，溶液制剂用量一般为0.07％。
粘结剂的实例包括羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、低取代羟丙基纤维素(L-HPC)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30，优选聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30。
赋形剂和用量的选择由制剂设计师根据经验并考虑标准工序和本领域参考资料很容易确定。本发明的固体药物包括粉末、颗粒、聚集体和压实组分。本发明的优选给药途径是口服。该剂量可以以单位剂型方便地提供，并用药学领域的任何熟知方法制备。剂型包括固体剂型，如片剂、丸剂、粉剂、胶囊、颗粒剂、囊片剂、小袋剂、药片和锭剂。本发明特别优选的剂型为颗粒。
糊剂溶液或冻干粉末的形式用于胃肠道外给药。使用前可向粉末中加入合适的稀释剂或其它药用载体而进行重配。液体配方通常是缓冲、等渗、水溶液。合适的稀释剂的例子有标准等渗盐水溶液、5％的葡萄糖水溶液。这类配方尤其适合胃肠道外给药，但也可口服。最好添加赋形剂，如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、氧化纤维素、阿拉伯胶、聚乙二醇、甘露醇、氯化钠、或柠檬酸钠。
可替换地，这些药物可以是胶囊包被的、片剂的、或在乳剂或糖浆剂中配制，用于口服。为了加强或稳定药物、或有利于组合物的制备，可以加入药用固体或液体载体。液体载体包括糖浆、花生油、橄榄油、甘油、盐水、醇类、或水。固体载体包括淀粉、乳糖、硫酸钙、二水合物、石膏粉、硬脂酸镁、或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯胶、琼脂、或明胶。载体也可包括缓释物质，诸如甘油单硬脂酸或甘油二硬脂酸，单独或与蜡一起。固体载体的量各不相同， 本发明还提供制备前述药物的方法，包括以下步骤 (1)按重量份称取矮地茶、炙麻黄、法半夏、苦杏仁、前胡、紫草，进行渗漉，收集漉液，加入适量包合剂，真空浓缩得第一浓缩液； (2)按重量份称取荆芥、陈皮，用水蒸馏提取适当时间，收集挥发油及滤液； (3)按重量份称黄芩、浮石、蝉蜕、甘草与步骤(1)和(2)所得的药渣合并，加热水煎提合适的次数和时间，收集水提液，过滤并与荆芥、陈皮提取后的滤液合并，浓缩，得第二浓缩液，然后静置一段时间，过滤，于滤液中加入包合剂，再浓缩，得第三浓缩液； (4)取上述第一浓缩液和第三浓缩液，混合，浓缩，干燥，粉碎成细粉； (5)按适当比例制备由上述挥发油与包含剂组成的包合物； (6)取步骤(4)得到的细粉(干浸膏粉)与步骤(5)得到的包合物，制成适宜的剂型。
在提取工艺研究中，分别进行了荆芥、陈皮挥发油的提取及其包合工艺条件，矮地茶等六味药材提取工艺条件的优选，黄芩、浮石、蝉蜕等药材水提工艺条件的优选研究；在浓缩与干燥工艺研究中，进行了不同浓缩、干燥方式对干膏粉溶化性的研究；在制剂成型研究中，制剂处方、成型工艺等进行了研究。通过上述研究，确定了本品的如下制备工艺条件。
步骤(1)中，最优选的渗漉操作可以按照中国药典2000年版一部附录IO流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法进行，即，用75％乙醇作溶剂，浸渍24小时，然后以每分钟3～5ml的流速(以1000g药材计)渗漉。然而，本领域技术人员容易理解，对以上条件作些调整，同样可以实施本发明。例如对溶剂作些变化，例如采用其他百分含量的乙醇水溶液。我们在试验中发现，用60～90％的乙醇是可用的。此外，采用适宜浓度的甲醇水溶液、或丙酮水溶液也可以实施本发明。另外，还可以对浸渍的时间和流速加以调整。在步骤(1)中，浓缩适宜在减压下进行，适宜的温度为40～75℃，优选50～65℃。浓缩工艺研究中，多次试验表明在60℃以下、-0.08MPa真空度和浓缩至例如相对密度为1.15～1.20(60℃热测)的操作条件是优选的。该步骤中，包合剂加入量可以为全方药材总量的1～10％的范围，优选在1.5～7％的范围，更优选在2～5％的范围，例如为2.5％。
步骤(2)中，优选在蒸馏提取前用水浸泡一段时间，例如0.5小时。水的加入量是为荆芥、陈皮重量的4～12倍，优选6～10倍例如8倍。加热蒸馏提取4～10小时，优选6～8小时，例如6小时。
步骤(3)中，加热水煎提数次，通过实验发现，加热水煎提三次即可充分提取，加水量分别为药材量的8倍、6倍、6倍，提取时间分别为1.5小时、1小时、1小时。与荆芥、陈皮蒸馏后的滤液合并后浓缩，得到的第二浓缩液的相对密度优选1.04～1.06(60℃热测)。静置时间为数小时，优选12小时以上。该步骤中，包合剂加入量优选约为全方药材总量的2.5％。第三浓缩液的相对密度优选为1.23～1.25(60℃热测)。在一个具体实施例中，上述包含剂为β-环糊精。
步骤(4)中，浓缩条件可以为在60℃浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃热测)。真空干燥条件例如为60℃、-0.08MPa。
步骤(5)中，可以先将包合剂用适宜的溶剂如水调成糊状，然后加入适宜比例的步骤(2)中得到的挥发油，混合均匀。作为优选，可以将挥发油先配成溶液，如50％的乙醇溶液，然后使该溶液与上述包合剂糊装物合并，研磨合适的时间。最后干燥得到挥发油包合物。在一个具体实施方式
中，可以用水将β-环糊精调成糊状，在研钵中研磨均匀。按照包含剂∶挥发油比例为(5～15)∶1，优选8∶1称取挥发油，用乙醇稀释。然后将该稀释液与前述糊装物合并研磨。最后干燥、粉碎。干燥温度为40～60℃，优选50℃。
在步骤(6)中，可以将药物制成片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、凝胶剂、糊剂中的任意一种。对于本发明而言，优选制成片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂，更优选粉剂、颗粒剂，最优选颗粒剂。
在本发明的一些具体实施例中，该药物被制成颗粒剂。在制备中，按所需比例取步骤(4)得到的细粉与步骤(5)得到的包合物，加入适量甜味剂混匀，以粘结剂溶液制软材，过筛，在一定温度下干燥，整粒，即得药物颗粒。粘结剂溶液可是乙醇溶液形式，浓度例如为3％。筛孔大小例如为10～12目。
在本发明的一些具体实施例中，该药物被制成片剂。在制备中，按所需比例取步骤(4)得到的细粉与步骤(5)得到的包含物，加入适量微晶纤维素和3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成片，包薄膜衣，即得片剂。
药物配制遵循传统的药物制备方法，就制备片剂而言，涉及研磨、混合、成粒、和压缩(当必要时)；或就制备硬胶囊而言，涉及研磨、混合、和填充。当使用液体载体时，药物制剂为糖浆、酏剂、乳剂、或水性或非水性混悬液形式。对于这种液体剂型可直接口服(p.o.)给药或装填入软胶囊剂中。
制备实施例 实施例1 取矮地茶10份、炙麻黄5份、法半夏5.2份、苦杏仁1.1份、前胡5份、紫草1.1份(均为重量份，下同)，照中国药典2000年版一部附录IO流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用65％乙醇作溶剂，浸渍36小时，然后以每分钟3～5ml的流速(以1000g药材计)渗漉，收集漉液，加入一定量β-CD(约为全方药材总量的1.5％)，在40～75℃和减压下浓缩至相对密度为1.15～1.20(60℃热测)，备用。取荆芥5份、陈皮1.1份，加5倍量水浸泡0.5小时，加热蒸馏提取5小时，收集挥发油及滤液，备用。取黄芩1.1份、浮石5份、蝉蜕1.1份、甘草1.1份与上述醇提及蒸馏后的药渣合并，加热水煎提三次，加水量分别为药材量的8倍、6倍、6倍，提取时间分别为1.5小时、1小时、1小时，收集三次水提液，过滤并与荆芥、陈皮蒸馏后的滤液合并，浓缩至相对密度约为1.04～1.06(60℃热测)，静置过夜(12小时以上)，取上清液过滤，于滤液中加入一定量β-CD(约为全方药材总量的5％)，浓缩至相对密度为1.23～1.25(60℃热测)，备用。取上述醇提与水提浓缩液，混合，继续浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃热测)，真空干燥(60℃，-0.08MPa)，粉碎成细粉，备用。另取β-环糊精适量置于研钵中，加4倍量水研磨均匀，按8∶1(β-环糊精∶挥发油)的比例取挥发油适量，先配成50％挥发油乙醇液，然后缓缓加入到研钵中，研磨2小时，于50℃干燥，粉碎，备用。取上述干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物，加入适量蔗糖、甜菊素混匀，以3％聚维酮K30乙醇溶液制软材，过10～12目筛，40℃干燥，整粒，得颗粒剂。
实施例2 取矮地茶20份、炙麻黄14.7份、法半夏14.7份、苦杏仁10份、前胡14.7份、紫草10份，照中国药典2000年版一部附录I O流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用90％乙醇作溶剂，浸渍16小时，然后以每分钟2～7ml的流速(以1000g药材计)渗漉，收集漉液，加入约为全方药材总量的2.5％的β-CD，真空浓缩(60℃以下，-0.08MPa)至相对密度为1.15～1.20(60℃热测)，备用。取荆芥14.7份、陈皮10份，加12倍量水浸泡3小时，加热蒸馏提取4小时，收集挥发油及滤液，备用。取黄芩10份、浮石14.7份、蝉蜕10份、甘草10份与上述醇提及蒸馏后的药渣合并，加热水煎提三次，加水量分别为药材量的8倍、6倍、6倍，提取时间分别为2小时、1.5小时、1小时，收集三次水提液，过滤并与荆芥、陈皮蒸馏后的滤液合并，浓缩至相对密度约为1.04～1.06(60℃热测)，静置过夜(12小时以上)，取上清液过滤，于滤液中加入一定量β-CD(约为全方药材总量的2.5％)，浓缩至相对密度为1.23～1.25(60℃热测)，备用。取上述醇提与水提浓缩液，混合，于50-70℃继续浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃热测)，真空干燥(60℃，-0.08MPa)，粉碎成细粉，备用。另取β-环糊精适量置于研钵中，加4倍量水研磨均匀，按8∶1(β-环糊精∶挥发油)的比例取挥发油适量，先配成50％挥发油乙醇液，然后缓缓加入到研钵中，研磨2小时，于50℃干燥，粉碎，备用。取上述干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物，加入适量蔗糖、甜菊素混匀，以3％聚维酮K30乙醇溶液制软材，过10～12目筛，40℃干燥，整粒，得颗粒剂。
实施例3 取矮地茶14份、炙麻黄7.1份、法半夏7.1份、苦杏仁3份、前胡7.1份、紫草3份，照中国药典2000年版一部附录IO流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用75％乙醇作溶剂，浸渍24小时，然后以每分钟3～5ml的流速(以1000g药材计)渗漉，收集漉液，加入一定量β-CD(约为全方药材总量的5％)，真空浓缩(60℃以下，-0.08MPa)至相对密度为1.10～1.25(60℃热测)，备用。取荆芥8份、陈皮3份，加8倍量水浸泡3小时，加热蒸馏提取4小时，收集挥发油及滤液，备用。取黄芩3份、浮石7.1份、蝉蜕3份、甘草3份与上述醇提及蒸馏后的药渣合并，加热水煎提三次，加水量分别为药材量的10倍、6倍、6倍，提取时间分别为1.5小时、1小时、1小时，收集三次水提液，过滤并与荆芥、陈皮蒸馏后的滤液合并，浓缩至相对密度约为1.04～1.06(60℃热测)，静置过夜(12小时以上)，取上清液过滤，于滤液中加入一定量β-CD(约为全方药材总量的2.5％)，浓缩至相对密度为1.23～1.25(60℃热测)，备用。取上述醇提与水提浓缩液，混合，于60℃继续浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃热测)，真空干燥(60℃，-0.08MPa)，粉碎成细粉，备用。另取β-环糊精适量置于研钵中，加4倍量水研磨均匀，按8∶1(β-环糊精∶挥发油)的比例取挥发油适量，先配成50％挥发油乙醇液，然后缓缓加入到研钵中，研磨2小时，于50℃干燥，粉碎，备用。取上述干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物，加入适量蔗糖、甜菊素混匀，以3％聚维酮K30乙醇溶液制软材，过10～12目筛，40℃干燥，整粒，得颗粒剂。
实施例4 取矮地茶19份、炙麻黄12份、法半夏12份、苦杏仁7.9份、前胡12份、紫草7.9份，照中国药典2000年版一部附录IO流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用75％乙醇作溶剂，浸渍24小时，然后以每分钟3～5ml的流速(以1000g药材计)渗漉，收集漉液，加入一定量β-CD(约为全方药材总量的2.5％)，真空浓缩(60℃以下，-0.08MPa)至相对密度为1.15～1.20(60℃热测)，备用。取荆芥8份、陈皮7.9份，加8倍量水浸泡0.5小时，加热蒸馏提取6小时，收集挥发油及滤液，备用。取黄芩7.9份、浮石12份、蝉蜕7.9份、甘草7.9份与上述醇提及蒸馏后的药渣合并，加热水煎提三次，加水量分别为药材量的8倍、6倍、6倍，提取时间分别为1.5小时、1小时、1小时，收集三次水提液，过滤并与荆芥、陈皮蒸馏后的滤液合并，浓缩至相对密度约为1.04～1.06(60℃热测)，静置过夜(12小时以上)，取上清液过滤，于滤液中加入一定量β-CD(约为全方药材总量的2.5％)，浓缩至相对密度为1.23～1.25(60℃热测)，备用。取上述醇提与水提浓缩液，混合，于60℃继续浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃热测)，真空干燥(60℃，-0.08MPa)，粉碎成细粉，备用。另取β-环糊精适量置于研钵中，加4倍量水研磨均匀，按8∶1(β-环糊精∶挥发油)的比例取挥发油适量，先配成50％挥发油乙醇液，然后缓缓加入到研钵中，研磨2小时，于50℃干燥，粉碎，备用。取上述干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物，加入适量蔗糖、甜菊素混匀，以3％聚维酮K30乙醇溶液制软材，过10～12目筛，40℃干燥，整粒，得颗粒剂。
实施例5 取矮地茶18份、炙麻黄9份、法半夏9份、苦杏仁5.5份、前胡9份、紫草5.5份，照中国药典2000年版一部附录IO流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法，用75％乙醇作溶剂，浸渍24小时，然后以每分钟3～5ml的流速(以1000g药材计)渗漉，收集漉液，加入一定量β-CD(约为全方药材总量的2.5％)，真空浓缩(60℃以下，-0.08MPa)至相对密度为1.15～1.20(60℃热测)，备用。取荆芥10.9份、陈皮5.5份，加8倍量水浸泡0.5小时，加热蒸馏提取6小时，收集挥发油及滤液，备用。取黄芩5.5份、浮石10.9份、蝉蜕5.5份、甘草5.5份与上述醇提及蒸馏后的药渣合并，加热水煎提三次，加水量分别为药材量的8倍、6倍、6倍，提取时间分别为1.5小时、1小时、1小时，收集三次水提液，过滤并与荆芥、陈皮蒸馏后的滤液合并，浓缩至相对密度约为1.04～1.06(60℃热测)，静置过夜(12小时以上)，取上清液过滤，于滤液中加入一定量β-CD(约为全方药材总量的2.5％)，浓缩至相对密度为1.23～1.25(60℃热测)，备用。取上述醇提与水提浓缩液，混合，于60℃继续浓缩至相对密度为1.30～1.32(60℃热测)，真空干燥(60℃，-0.08MPa)，粉碎成细粉，备用。另取β-环糊精适量置于研钵中，加4倍量水研磨均匀，按8∶1(β-环糊精∶挥发油)的比例取挥发油适量，先配成50％挥发油乙醇液，然后缓缓加入到研钵中，研磨2小时，于50℃干燥，粉碎，备用。取上述干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物，加入适量蔗糖、甜菊素混匀，以3％聚维酮K30乙醇溶液制软材，过10～12目筛，40℃干燥，整粒，得颗粒剂。
实施例6 干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物的制备步骤与实施例1完全相同。只不过通过以下方法制备成片剂取干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物，加入细粉重量3倍量微晶纤维素和3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成1000片(0.40g/片)，包薄膜衣，即得片剂。
实施例7 干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物的制备步骤与实施例2完全相同。只不过通过以下方法制备成片剂取干浸膏粉与挥发油的β-环糊精包合物，加入细粉重量2倍量微晶纤维素和3％的交联聚维酮(PVPP)，混匀，用2％聚维酮K30(PVP)的95％乙醇溶液制软材，挤压过16目筛网，40～50℃干燥，整粒，加入3％的羧甲基淀粉钠(CMS-Na)和0.3％的硬脂酸镁混匀，压制成片(0.40g/片)，包薄膜衣，即得片剂。
实施例8 步骤和配方与实施例1相同，只不过用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)代替聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30，用α-环糊精(α-CD)代替β-环糊精，用木糖醇代替蔗糖、甜菊素。
实施例9 步骤和配方与实施例2相同，只不过用低取代羟丙基纤维素(L-HPC)代替聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30，用N-LOK变性淀粉代替β-环糊精，用蛋白糖代替蔗糖、甜菊素。
实施例10 步骤和配方与实施例5相同，只不过用聚乙二醇(PEG)代替聚乙烯吡咯烷酮(PVP)K-30，用α-环糊精(α-CD)代替β-环糊精，用高果糖代替蔗糖、甜菊素。
药效学试验 试验材料 1.药物与试剂 1.1受试药物 荆杏止咳颗粒其为本发明的一种产品，其制备方法如实施例5所披露。规格浸膏每1ml含4.25g生药。临床拟用量55g生药/日。
1.2对照药物 风寒咳嗽冲剂主要成分有陈皮、生姜、法半夏、青皮、杏仁等。功能温肺散寒、祛痰止咳。用于外感风寒、头痛鼻塞、咳嗽痰多、胸闷气喘等。含量5g(成药)/袋，临床用量为1袋/次，2次/日，由太极集团·四川省绵阳制药厂生产，批准文号ZZ-3282-川卫药准字(1994)010286号，批号0100105001。
阿司匹林肠溶片长春长庆药业(集团)有限公司生产 批号20000104规格25mg/片。
安比先胶囊海南三叶制药厂 批号010822规格2.5g/粒。
庆大霉素8万u/ml，批号2001080 鄂北制药厂。
氨苄西林钠1g/支，批号10012205 华北制药股份有限公司。
1.3试验试剂 磷酸组胺上海丽珠东风生物技术有限公司 批号020106。
氯化乙酰胆碱上海试剂三厂 批号960508。
百白破三联疫苗湖南省卫生防疫站提供 批号010719。
环磷酰胺规格20mg/支，上海华联制药有限公司 批号20010713。
氢化可的松规格25mg/瓶，上海信谊药厂 批号20001011。
肝素钠注射液规格2ml/支，徐州万邦生化制药有限公司 批号0103103。
1.4实验用病毒株 流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1，购自中国预防医学科学院病毒研究所。
流感病毒甲3型、柯萨奇B族病毒4型(CoxB4)副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(Ad3)和鼻病毒14型。分别购自中国预防医学科学院病毒学研究所及儿科研究所。
1.5试验用菌株 标准株金黄色葡萄球菌(25923)，肺炎双球菌(31002)，溶血性链球菌(32213)，流感杆菌(58529)，流感嗜血杆菌(58601)，莫拉卡他菌(29103)，以上菌株由湖南省卫生防疫站提供。
临床株金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌，均由湖南中医学院微生物教研室提供。
2.实验动物 2.1来源及种属 昆明种小鼠，清洁级，体重13～17g，雌雄兼用，合格证号湘医动字20-011号。
Wistar大鼠，符合清洁级标准，体重45～85g，雌雄兼用，合格证号湘医动字20-022号，以上动物由湖南医科大学实验动物学部提供。
抗病毒实验所用动物昆明种小鼠，体重14±1g，雌雄兼用。由北京生物制品研究所实验动物室提供，合格证号京动许字(1999)第012号。
3.试验仪器 TP-1000型电子天平湘仪天平仪器厂，SE2020型电子天平上海奥豪公司，L80-2离心沉淀机上海跃进医疗器械厂，721型分光光度计上海分析仪器三厂，超声雾化器，S-888E型，中外合资南京道芬电子有限公司生产。
4.统计方法 计量资料以X±SD表示，方差齐者以方差分析和成组t检验分析方差不齐者以秩和检验分析。计数资料以X2检验分析。
5.剂量设置 荆杏止咳颗粒临床小儿用法用量温开水冲服，每日3次，每次4g，合生药55g。小儿体重以35kg计算，小儿每日用量为1.57g生药/kg。按实验动物与人临床用药剂量的体型系数换算法计算，(R小鼠＝0.06，R大鼠＝0.09，R家兔＝0.093，R豚鼠＝0.099R人＝0.11)。根据实验结果，以动物等效量的0.5、1、2倍量作为大、小鼠、豚鼠的低、中、高剂量；以动物等效量的1，2，4倍量作为家兔的低、中、高剂量。则实验动物的低剂量、中剂量、高剂量为
6.给药途径 灌胃给药，与拟推荐的临床用药途径一致。
方法与结果 [主症研究] 一、对急性支气管炎模型大鼠的影响 (一)造模实验方法 1.造模与分组 选体重55～85g的幼年Wistar大鼠60只♀
各半，随机分成6组，(1)正常组；(2)模型组；(3)，(4)，(5)为荆杏止咳颗粒高、中、低剂量组；(6)风寒咳嗽冲剂组，将(2)、(3)、(4)、(5)、(6)组大鼠放入500ml密闭的玻璃容器内，50g卷烟末燃烧烟熏，同时通入O2(含5％CO2)，持续1h，每天1次，连续烟熏21天，同时鼻滴奈氏卡他菌(3亿/ml)5滴，每周1次，共3次。
2.给药方法 与造模同时给药。模型组、正常对照组分别灌服生理盐水0.5ml/天，连续21天。
(二)检测指标及结果 1.病理学检查 造模21天后，于最后1次给药后1h，处死大鼠，断头取血加肝素抗凝备用，用于细胞内杀菌试验和白细胞趋向化功能试验。将大白鼠处死后，立即把各组动物的气管、支气管、连带肺组织一并固定于10％福尔马林溶液中，72h后，取出气管、支气管组织块，包埋切片，HE染色，于显微镜下观察。结果见表1、2及病理检验报告。
表1 荆杏止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠病理损伤的修复结果
经X2比较；与正常对照组比较***P＜0.01；与模型组比较△△P＜0.05 表2 荆杏止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠病理损伤的积分结果
与正常对照组比较***P＜0.01；与模型组比较△△P＜0.05，△△△P＜0.01 结果由表1、表2可见，荆杏止咳颗粒高、中、低剂量组与模型组比较有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠的病理损伤有修复作用和减轻其损伤作用。
2.细胞内杀菌试验 实验方法 (1)将实验造模的大鼠处死，断头取血并加肝素抗凝血，分离出白细胞用Hank’s液配制成5×106/ml细胞悬液。
(2)调理素用8ml Hank’s液加2ml新鲜鼠血清配成20％新鲜血清调理素。
(3)细菌金黄色葡萄球菌，本院微生物教研室保留菌株，取金黄色葡萄球菌将其配制成1×108/ml细菌悬液。
(4)按如下操作
(5)计算
结果见表3。
表3 荆杏止咳颗粒白细胞杀菌试验结果
与正常空白对照组比较*P＞0.05；**P＜0.05；***P＜0.01 与模型对照组比较△P＞0.05；△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果由表3可见，在60min与90min时，荆杏止咳颗粒高、中、低剂量，与模型对照组比较有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒能增强造模大鼠细胞内杀菌作用。
3.白细胞趋向化功能试验(琼脂糖平皿法) 方法将实验造模后大鼠处死，断头取血并加肝素抗凝。分离出白细胞，用RPMI-1640液配制成2.5×107/ml细胞悬液。按琼脂糖平皿法制备琼脂糖平皿，每平皿打24孔，孔距为2.4mm，每行3孔测定一个样本。中间孔加白细胞悬液5μl，外孔加大肠杆菌24h液体培养物过滤液5μl，同孔加RPMI-1640培养液5μl作对照。将上述平皿加盖后，放入温盒内，置37℃温育3h。取出后每皿加3ml甲醇30min处理，继续加47％中性福尔马林溶液3ml固定，取出完整的琼脂层，粘附固定在平皿底层的细胞用瑞氏染液染色，水洗，待干。用400倍生物显微镜测微尺测量中间孔向两侧移行的距离。以中间孔细胞向外孔(趋化因子)移行的距离为A，向内孔(培养液对照)移行的距离为B，按下式计算移动指数，结果见表4。
表4 荆杏止咳颗粒白细胞趋向化功能试验结果
与正常空白对照组比较，***P＜0.01 与模型组比较，△P＞0.05，△△P＜0.05，△△△P＜0.01 结果由表4可见，荆杏止咳高、中剂量组与模型对照组比较有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒能增加造模大鼠的白细胞移动指数，提高白细胞趋向化功能。
二、抗炎实验 (一)对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 方法取体重13～17g雄性昆明种小鼠70只，随机分为7组，正常空白对照组，模型组，荆杏止咳高、中、低剂量组，阿司匹林组，风寒咳嗽冲剂组，每组10只，其中正常空白对照组，模型组给予蒸馏水，灌胃给药组分别按表5灌胃给药，每日1次，连续6d，未次给药1h后，每只小鼠左耳前后面涂0.05ml二甲苯致肿，右耳不涂以作对照，30min后，处死动物，剪下左、右耳，用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，用天平称量，以左右耳差值作为肿胀度，数据经成组t检验，结果见表5。
表5 荆杏止咳颗粒对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响(n＝10，χ±SD)
注与模型对照组比较△P＞0.05，△△P＜0.05，△△△P＜0.01；与空白对照组比较***P＜0.01 结果荆杏止咳颗粒各剂量组与模型组比较均有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒对二甲苯致小鼠耳廓肿胀具有明显抑制作用。
(二)对大鼠皮下注射琼脂致肉芽肿增生影响。
方法取体重55～85g雄性Wistar大鼠60只，随机分为6组，每组10只，于乙醚麻醉状态下，在鼠背中线下注射2％琼脂溶液，每只1ml，按表6剂量每天给药或蒸馏水，给药15天后，颈静脉放血处死解剖，剥离出肉芽肿琼脂块，称取湿重，数据经成组t检验，结果见表6。
表6 荆杏止咳颗粒对大鼠皮下注射琼脂致肉芽肿增生的影响(n＝10，χ±SD)
注与模型对照组比较△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果荆杏止咳高、中、低剂量组与模型对照组比较有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒对皮下注射琼脂所致肉芽肿增生具有明显抑制作用。
三、镇咳实验 (一)对浓氨水致小鼠咳嗽的影响。
方法通过预试，找出氨水引起小鼠100％咳嗽的最小喷雾时间(采用超声雾化法)取体重13～17g昆明种小鼠50只，♀
各半。按体重与性别随机分成模型对照组。荆杏止咳高、中、低剂量组，风寒咳嗽冲剂组，每组10只，分别按表7剂量灌胃给药或蒸馏水，每天给药1次，连续3d，末次给药后1h，分别将小鼠放入体积4L的钟罩内，喷入27％氨水8秒刺激小鼠致咳(以收腹、仰头、张口或咳嗽为咳嗽指标)，观察小鼠咳嗽潜伏期及3min内的咳嗽次数，数据经成组t检验，结果见表7。
表7 荆杏止咳颗粒对浓氨水致小鼠咳嗽的影响(n＝10，χ±SD)
注与模型对照组比较△P＞0.05；△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果荆杏止咳颗粒高、中二个剂量组与对照组比较，咳嗽次数和潜伏期均有非常显著性差异，低剂量组在咳嗽次数方面有显著差异，提示荆杏止咳颗粒对浓氨水致小鼠咳嗽具有明显抑制作用。
(二)对SO2所致小鼠咳嗽的影响 方法取体重13～17g昆明种小鼠50只。按体重与性别随机分为模型对照组，荆杏止咳高、中、低剂量组，风寒咳嗽冲剂组，每组10只，对照组灌服蒸馏水，其它各组按表8剂量灌胃给药，每天1次，连续给药3d，末次给药后1h，将小鼠放入500ml的广口瓶中，通入SO26ml引咳，观察并记录小鼠的咳嗽潜伏期和3min内咳嗽次数，数据经成组t检验。结果见表8。
表8 荆杏止咳颗粒对SO2所致小鼠咳嗽的影响(n＝10，χ±SD)
注与对照组比较△P＞0.05；△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果荆杏止咳颗粒高、中剂量组与对照组比较咳嗽次数与潜伏期均有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒对SO2致咳有明显抑制作用。
[次症研究] 一、化痰实验 (一)对小鼠气管排泌酚红的影响 方法1.取体重13～17g昆明种小鼠60只，♀
各半，按体重与性别随机分为空白对照组、荆杏止咳高、中、低剂量组、风寒咳嗽冲剂组，每组10只，按表9剂量分别给药或蒸馏水，连续给药3天，末次给药1h后，按0.1mg/10g的剂量，给每鼠ip0.5％的酚红溶液，30min后，处死动物，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨至气管分支处一段气管，放入盛有2ml生理盐水的试管中，再加入0.1mllNaOH溶液(1mol/L)，用721型分光光度计于546nm处测OD值。
2.用分析纯酚红配制浓度为100μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、3μg/ml、1μg/ml、0.7μg/ml、0.5μg/ml、0.3μg/ml、0.1μg/ml的溶液，测定其OD值，计算其标准曲线回归方程为y＝0.1368+7.4673X(r＝0.9988)。
3.据标准曲线将测得的OD值换算成酚红含量，数据经成组t检验，结果见表9。
表9 荆杏止咳颗粒对小鼠气管排泌酚红的影响(n＝10，χ±SD)
注与模型对照组比较△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果荆杏止咳颗粒高、中剂量组与空白对照组比较有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒能够促进小鼠气管排泌酚红作用。
(二)对大鼠毛细玻管排痰量的影响 方法取体重55～85gWistar大鼠60只，♀
各半，按体重和性别随机分为空白对照组，荆杏止咳高、中、低剂量组，风寒咳嗽冲剂组，每组10只，实验前先禁食不禁水10h，用乌拉坦铵1g/kg腹腔注射麻醉后，仰位固定，剪开颈中部皮肤分离出气管，在甲状软骨下缘上中两软骨环之间用尖锐的注射针尖扎一小孔，然后插入玻璃毛细管一根，使毛细管刚好接触气管底部表面，使之吸取气管后部之痰液，记录给药前2h的正常分泌量，按表10剂量灌胃给药后，再观察2h分泌量。数据经成组t检验，结果见表10。
表10 荆杏止咳颗粒对大鼠毛细玻管排痰量的影响(n＝10，χ±SD)
注与模型对照组比较△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果荆杏止咳颗粒三个剂量组与空白对照组比较，其差异有显著性意义，且高、中、低三个剂量组给药后平均每小时分泌量为给药前的200％以上，说明荆杏止咳颗粒有增加大鼠毛细玻管排痰量作用。
二、平喘实验 对磷酸组织胺哮喘模型豚鼠的影响 方法取体重为120～180g幼年豚鼠若干只，放入喷雾箱内，用超声雾化器喷入2％乙酰胆碱和0.4％组胺的等量混合液，每次喷10～15s，观察豚鼠的哮喘反应，选出合格者(哮喘潜伏期不超过150s为合格)50只，雌雄不拘，随机分成5组，分别为①模型空白对照组；②风寒咳嗽冲剂组；③～⑤荆杏止咳高、中、低剂量组。按随机原则将各组动物按表11剂量灌胃给药15min后，再重复给药一次，给药30min后，放入喷雾箱内，选用预选时的同样条件喷入磷酸组胺混合液，记录豚鼠的哮喘潜伏期(从开始喷雾至出现抽搐，跌倒为止的时间即为豚鼠的哮喘潜伏期)。
表11荆杏止咳颗粒对磷酸组胺致哮喘豚鼠的影响(χ±SD)
注与对照组比较*P＜0.05；**P＜0.01 结果表11表明荆杏止咳中、低剂量与空白对照组比较，能使豚鼠诱喘潜伏期显著延长，表明荆杏止咳颗粒能抑制磷酸组胺导致豚鼠的哮喘。
[病因研究] 一、抗病毒实验 (一)材料与试剂 受试药物荆杏止咳颗粒，批号200110901，由湖南省中医药研究院提供。
阳性对照药病毒唑湖北省医药工业研究所出品，为原料药，批号950708，实验时小鼠按临床等效剂量(0.07g/kg/d)灌喂给药。
风寒咳嗽冲剂太极集团四川省绵羊制药厂生产，批号0100105001。实验时小鼠按临床等效剂量(2.10g/kg/d)灌喂给药。
病毒流感病毒亚甲型鼠肺适应株FM1，用于体内抗病毒实验，购自中国预防医学科学院病毒研究所，-60℃低温冰箱保存备用。
流感病毒甲3型、柯萨奇B族病毒4型(CoxB4、)副流感病毒1型(HVJ)、呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒3型(Ad3)和鼻病毒14型。分别购自中国预防医学科学院病毒学研究所及儿科研究所，本实验室传代后使用。
细胞人喉癌传代细胞HEP-2株，购自卫生部药品生物制品检定所。本实验室传代后使用。
细胞培养液含10％小牛血清、0.29mg谷氨酰胺/ml、100u/ml青、链霉素的Eagle’s MEM(日本日水制药株式会社出品)。
细胞维持液除所含小牛血清为2％外，其他含量均同培养液。
动物昆明种小鼠，体重14±1g，雌雄兼用。由北京生物制品研究所实验动物室，合格证号京动许字(1999)第012号。
主要仪器CO2培养箱，日本Yamato松株式会社产品。倒置显微镜，日本Olympus产品。
(二)方法与结果 1.体内抗病毒实验 (1)对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用 方法取小鼠70只，按体重随机分成7组、分别为正常动物对照组、病毒感染对照组、给药三个剂量组、病毒唑组、风寒咳嗽冲剂组。除正常对照组外，将小鼠用乙醚轻度麻醉，以15个LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.05ml。从感染前一天开始灌喂给药，每天2次，每次0.5ml，连续5天，对照组在同等条件下蒸馏水灌喂。第6天称取小鼠体重后解剖，肉眼观察肺部病变，记录肺部肝样实变的程度，摘取全肺称重，逐个计算肺指数值，并求出肺指数抑制率。
肺指数＝[肺重(g)/体重(g)]×100％
结果采用组间t检验进行统计学处理。见表12 表12 药物对小鼠流感病毒性肺炎的抑制作用
与正常对照组比较##P＜0.01 与病毒对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05 结果表12结果显示受试药物的高、中剂量组动物的肺指数值明显低于病毒对照组，与病毒对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，表明药物在此剂量时对流感病毒引起的小鼠肺炎均有明显的抑制作用，抑制率均为18.08％。
(2)对流感病毒所致小鼠死亡的保护作用 方法取小鼠120只，按体重随机分成6组。分别为荆杏止咳颗粒三个剂量组、病毒唑(0.07g/kg/d)组、风寒咳嗽冲剂组(2.10g/kg/d)及病毒感染对照组。各组小鼠用乙醚轻度麻醉后，以2个LD50流感病毒液滴鼻感染，每只0.05ml。从感染前一天开始灌胃给药，每天2次，每次0.5ml，连续7天。累计感染后小鼠的死亡数，计算死亡率、保护率及生命延长率。结果采用卡方及T检验进行统计学处理。
表13 荆杏止咳颗粒对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
与感染对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05 表14 荆杏止咳颗粒对流感病毒致小鼠死亡的保护作用
与感染对照组比较**P＜0.01，*P＜0.05 结果表13、14结果显示小鼠感染病毒后14天内，荆杏止咳颗粒22.8、11.4g/kg/d剂量组小鼠的死亡数较感染对照组明显减少，11.4g/kg/d剂量组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，保护率为38.89％。小鼠的平均存活天数较感染对照组明显延长，与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)，延长率为15％和16.5％。表明荆杏止咳颗粒在此剂量时对流感病毒感染致小鼠死亡有一定的保护作用。
2.荆杏止咳颗粒的体外抗病毒实验 (1)对Hep-2培养细胞的毒性试验 方法将药液用Eagle’s培养液作1∶20-1∶1280倍比稀释，加到巳长成单层的HEP-2细胞培养板中，100ul/孔，每个稀释度药液做3个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃5％CO2培养箱中培养四天，每天倒置显微镜下观察细胞生长情况，确定细胞不出现明显退变的最低稀释倍数，实验时顺延做到最小有效浓度(即最大稀释倍数)。按Reed-Muench法计算50％毒性浓度(TC50)和最大无毒浓度(TC0)。
表15 荆杏止咳颗粒对培养细胞的TC0TC50(mg生药/ml)
(2)对病毒致细胞病变作用的影响 取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种100TCID50的不同病毒液50ul，置37℃5％CO2培养箱中吸附1小时后，倒掉病毒液，用不含小牛血清的Eagle’s维持液洗细胞面2次后，加入相应稀释度的药液100ul/孔。同时设病毒对照、阳性对照药及正常细胞对照。病毒唑的终浓度采用TC50的1/4。置37℃5％CO2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变，当病毒对照组细胞变为++++时记录实验结果。细胞病变按六级标准判断，并按Reed-Muench计算50％有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。
一细胞生长正常，无病变出现； ±细胞病变少于整个单层的10％； 1细胞病变约占整个单层细胞的25％以下； 2细胞病变约占整个单层细胞的50％以下； 3细胞病变约占整个单层细胞的75％以下； 4细胞病变约占整个单层细胞的75％以上； 治疗指数(TI)＝TC50/EC50 (3)结果 表16 荆杏颗粒对病毒致细胞病变的影响
注“-”表示无细胞病变。
表中结果显示荆杏止咳颗粒在体外实验时，流感病毒、HVJ、RSV、CoxB4、Ad3及鼻病毒的细胞病变较病毒对照组均有所减轻，其中HVJ、RSV、CoxB4及鼻病毒有显著性差异(P＜0.05)，EC50和IT均为0.4mg/ml和3.4。其他病毒无统计学意义。
二、抑菌实验 (一)试验材料 1.菌株 标准株金黄色葡萄球菌(25923)，肺炎双球菌(31002)，乙型溶血性链球菌(32213)，流感杆菌(58529)，流感嗜血杆菌(58601)，莫拉卡他菌(29103)，以上菌株由湖南省卫生防疫站提供。
临床株金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌，流感嗜血杆菌均由湖南中医学院微生物教研室提供。
2.培养基牛肉膏汤琼脂培养基；5％兔血琼脂培养基。
3.试药荆杏止咳浸膏4.25g生药/ml。批号200110901，提供单位湖南省中医药研究院。
4.对照药物 庆大霉素8万u/ml，批号2001080，鄂北制药厂。
氨苄西林钠1g/支，批号10012205，华北制药股份有限公司。
(二)方法与结果 1.体内抑菌试验——对细菌感染所致小鼠死亡的保护作用 方法将金黄色葡萄球菌，肺炎双球菌，流感嗜血杆菌临床株接种于牛肉膏汤液体培养基中，置37℃温箱培养8小时，用生理盐水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4浓度的菌液，将不同浓度的菌液分别腹腔注射感染小鼠，每鼠1ml，每组10只，观察动物在5天内的死亡情况，测出试验菌株引起小鼠90％-100％死亡的MLD，菌株的MLD分别为金葡菌为1×108cfu/ml，肺炎双球菌为1.5×108cfu/ml，流感嗜血杆菌为1.0×109cfu/ml。取体重13～17g昆明种小鼠360只，雌雄各半，随机分成18组，每组20只，按表17剂量灌胃给药，对照组给等容积生理盐水，给药3天后，于第4天腹腔注射感染小鼠的MLD1ml，再继续给药3天，观察记录感染后一周内各组小鼠的死亡数，计算死亡率，以死亡率通过X2进行统计比较。
表17 荆杏止咳颗粒对金葡菌及肺炎双球菌感染所致小鼠死亡的保护作用
注与对照组比较△△P＜0.05 △△△P＜0.01 结果试验结果表明，荆杏止咳高剂量组对金葡菌、流感嗜血杆菌临床株感染后小鼠的死亡率与对照组比较有显著性差异，荆杏止咳中、低剂量对肺炎双球菌临床株感染后小鼠的死亡率与对照组比较有显著性差异。
2.平板打孔法 取平板(普通琼脂平板/血平板)，用接种环挑取各菌种标准株，用划线法将菌液均匀涂布各培养基表面，然后用直径6mm的打孔器打孔(等距离4孔/平板)培养24h，观察是否有抑菌圈出现，通过量化抑菌圈直径以此初步判断试验药物抑菌作用的强弱，结果如下表 表18 荆杏止咳颗粒抑菌试验结果
(金葡菌、肺炎双球菌、乙型链球菌、莫拉卡他菌用氨苄西林钠作阳性对照药、流感杆菌、流感嗜血杆菌用庆大霉素作阳性对照药)。
3.试管法测药物的MIC及MBC 按试管稀释法用培养基将药物稀释成1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128，每管1ml，向每管加入3×10-3cfu/ml稀释的新鲜菌液0.1ml，同时设立菌株对照，培养基对照。金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、乙型链球菌以氨苄西林钠作阳性对照药，流感杆菌、流感嗜血杆菌以庆大霉素作阳性对照组。置37℃培养24h，观察细菌生长情况。以不显示混浊，完全无菌生长的试药浓度为药物对该菌株的最低抑菌浓度，选出MIC试验中无菌生长的培养基管用接种环取-环接种于不含试药的琼脂培养基上，置37℃温箱培养18小时，观察细菌生长情况，完全无菌生长的浓度为药物对该菌株的最低杀菌浓度(MBC)。
结果见表19、20。
表19 荆杏止咳颗粒的抑菌试验(MIC)结果
表20 荆杏止咳颗粒的抑菌试验(MBC)结果
结果试验结果表明，荆杏止咳颗粒对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎双球菌、莫拉卡他菌均有不同程度的体外抑菌作用，其中对乙型溶血性链球菌及肺炎双球菌作用较弱。
[辅助研究] 一、免疫功能试验 (一)对免疫功能低下小鼠碳粒廓清的影响 方法取幼年雄性昆明种小鼠60只，随机分为6组，正常对照组每天灌胃蒸馏水，其它各组每日SC氢化可的松50mg/kg一次，造成免疫功能低下，并分别给予荆杏止咳高、中、低剂量，风寒咳嗽冲剂或蒸馏水，连续7天，于末次给药1h后，每鼠尾静脉注射印度墨汁10ml/kg，于2min、12min时，分别从眼底静脉丛取血20ul，加到2ml0.1％Na2CO3溶液中摇匀，于721型分光光度计在680nm处测定吸光度，将取完血后的小鼠断头处死，将其肝脏和脾脏取出称重，计算廓清指数及校正廓清指数。
表21 荆杏止咳颗粒对免疫功能低下小鼠碳粒廓清的影响(χ±SD)
注与空白对照组比较***P＜0.01 与模型组比较△P＞0.05；△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果表21表明，荆杏止咳颗粒高、中、低剂量组与模型对照组比较，其差异有非常显著性意义，提示荆杏止咳颗粒对氢化可的松所致免疫功能低下小鼠有明显提高特异性免疫的作用。
(二)对免疫功能低下小鼠血清溶血素的影响 方法取幼年昆明种小鼠60只，♀
各半，按体重与性别随机分为6组，每组10只，空白对照组和模型组灌胃蒸馏水，其余各组按容量0.2ml/10g灌胃荆杏止咳高、中、低剂量，风寒咳嗽冲剂等相应药液，连续7天，除空白对照组外，其余各组小鼠按40mg/kgSC环磷酰胺连续3天，造成免疫功能低下模型，第1日每鼠腹腔注射5％鸡红细胞悬液0.2ml，末次给药1h后，于眼底静脉丛取血，分离血清，用生理盐水将血清稀释100倍，取稀释血清1ml，与5％鸡红细胞悬液0.5ml、10％豚鼠血清0.5ml混合，在37℃恒温箱中温育30min，置0℃冰箱中中止反应，离心，取上清液于721型分光光度计540nm处比色，测定吸光度，另设不加小鼠血清的空白对照管调零，数据经成组t检验。
表22 荆杏止咳颗粒对免疫功能低下小鼠血清溶血素的影响(χ±SD )
与正常空白组比较***P＜0.01；与模型对照组比较△P＞0.05；△△P＜0.05；△△△P＜0.01 结果表22表明，荆杏止咳颗粒各剂量组与模型对照组比较，其差别具有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒能显著提高环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠诱生溶血素能力。
二、解热实验 对三联疫菌引起家兔发热的解热作用 方法取体重1～1.5kg健康家兔若干只，实验室温度控制在25℃左右，于试验前3日，每日测正常肛温2次，选取体温变动不高于0.3℃的家兔40余只，耳静脉注射三联疫苗2ml/kg体重，造成高热病理模型。1h后测体温，以升高0.5℃以上者作为实验动物，选取40只实验家兔随机分为对照组，荆杏止咳高、中、低剂量组，风寒咳嗽冲剂组。分别予受试药物灌胃，其中对照组ig蒸馏水，药后1h、2h、3h、4h测定体温。结果见表23。
表23 荆杏止咳颗粒对三联疫苗所致家兔发热体温的影响(n＝10，χ±SD)
注与对照组比较△△△P＜0.01；△△P＜0.05 结果荆杏止咳颗粒各剂量组与对照组比较有显著性差异，提示荆杏止咳颗粒能抑制三联疫苗所致家兔体温的升高，具有一定地清热解表作用。
荆杏止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠的实验研究结果显示荆杏止咳颗粒对急性支气管炎模型大鼠的病理损伤有修复作用，并能增强造模大鼠细胞内杀菌作用，能增加造模大鼠的白细胞移动指数，提高白细胞趋向化功能。
由抗炎实验可见，荆杏止咳颗粒对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，大鼠皮下注射琼脂肉芽肿形成有较强的抑制作用，具有一定的抗炎作用。
由镇咳实验可见，荆杏止咳颗粒对浓氨水和SO2引咳均能延长咳嗽潜伏期和减少3min内咳嗽次数，具有一定的止咳作用。
由化痰实验可见，荆杏止咳颗粒能够促进小鼠气管酚红排泌及增加大鼠毛细玻管排痰量，有一定的化痰作用。
由平喘实验可见，荆杏止咳颗粒能使豚鼠诱喘潜伏期显著延长，表明荆杏止咳颗粒能抑制磷酸组胺导致豚鼠的哮喘。
荆杏止咳颗粒体内抗流感病毒实验结果显示药物在22.8、11.4g/kg/d剂量时对小鼠流感性肺炎有明显的抑制作用；在11.4g/kg/d剂量时对流感病毒致小鼠死亡有明显的保护作用，保护率为38.89％，生命延长率为16.5％％。
荆杏止咳颗粒体外抗病毒实验显示荆杏止咳颗粒对流感病毒、HVJ、RSV、CoxB4、Ad3及鼻病毒有一定的抑制作用。荆杏止咳颗粒在体外实验时，对流感病毒、HVJ、RSV、CoxB4、Ad3及鼻病毒的细胞病变较病毒对照组均有所减轻，其中HVJ、RSV、CoxB4及鼻病毒与病毒对照组比较，有显著性差异(P＜0.05)，EC50和TI均为0.4mg/ml和3.4。
由抑菌实验可见荆杏止咳颗粒对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、莫拉卡他菌、溶血性链球菌等有不同程度的体外抑菌作用，对金葡菌、肺炎双球菌、流感嗜血杆菌感染小鼠死亡有不同程度的保护作用。荆杏止咳颗粒具有一定的抑菌作用。
由免疫实验可见，荆杏止咳颗粒能提高免疫功能低下小鼠的碳粒廓清指数及诱生溶血素能力，具有一定的提高免疫力的作用。
由解热实验可见，荆杏止咳颗粒能明显抑制三联疫苗所致家兔体温的升高，具有一定的解热作用。
总之，通过对急性支气管炎模型大鼠影响的研究及抗炎、止咳、化痰、平喘、抗病毒、抗菌、免疫、解热等试验，结果表明本发明提供的药物对急性支气管炎模型大鼠的气管病理损伤有修复作用，并能增强模型大鼠细胞内杀菌作用，增强模型大鼠白细胞趋化功能；对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，大鼠皮下注射琼脂所致的肉芽肿形成有较强的抑制作用，具有一定的抗炎作用；对浓氨水和SO2引咳均能延长咳嗽潜伏期和减少3min内咳嗽的次数，具有一定的止咳作用；能够促进小鼠气管酚红排泌量及增加大鼠毛细玻管排痰量，具有一定的化痰作用；能抑制由磷酸组织胺引起的豚鼠哮喘，具有较好的平喘作用；本发明提供的药物体外对副流感病毒I型(HVT)、呼吸道合胞病毒、柯萨奇B族病毒4型(CoxB4)及鼻病毒14型均显示出一定的抑制作用；本发明提供的药物体内在所试剂量范围内对小鼠流感性肺炎有明显抑制作用，中剂量对流感病毒致小鼠死亡有明显的保护作用；对金黄色葡萄球菌，肺炎球菌、莫拉卡他菌、溶血性链球菌等有一定的体外抑菌作用，对金葡菌，肺炎双球菌、流感嗜血杆菌感染小鼠死亡有不同程度的保护作用，具有一定的抑菌作用；能提高免疫功能低下小鼠的碳粒廓清指数及诱生溶血素能力，具有一定的提高免疫作用；对三联疫苗所致的家兔发热有明显的解热作用。结果表明本发明提供的药物具有改善急性支气管炎症状及抗炎、止咳、祛痰、平喘、抗病毒、抗菌、增强免疫、解热作用。
毒理研究 1.急性毒性试验 小儿荆杏止咳颗粒最大浓度为4.25g/ml，当以最大浓度、最大灌胃体积给予小鼠3次/24h，此时最大累积给药剂量达510.0g/Kg，相当于临床用量的324.84倍，动物未见明显毒性作用，结果表明该药一次性用药是较安全的。
2.长期毒性试验 小儿荆杏止咳颗粒20g/kg，40g/kg，80g/kg三个剂量连续灌胃大鼠8周，此时低、中、高剂量分别相当于临床剂量的12.75、25.5、51倍，结果给药期及恢复性观察期(2周)与空白对照组比较，大鼠一般状况、体重增长、血液学及血液生化指标、主要脏器系数、肉眼观察及镜下组织形态学观察均无明显差异或异常，表明小儿荆杏止咳颗粒临床用药范围内应用是较安全的。
本发明提供的药物处方中无法定毒性中药材及配伍禁忌，临床前毒理研究证明本品用药安全性较好。
本领域技术人员将会认识到，或者根据常规经验就可以确定很多本文所描述的本发明具体实施方式
的等效替换。本申请引用的出版物的披露内容也以引用形式全部并入本文中，以作为参考。然而应该明白，本发明的范围不限于上述具体实施方式
。在此特别指出，尽管在具体实施例中只列出了本发明药物的两种制剂(颗粒剂和片剂)，但是本领域技术人员应该明白，本发明并不局限于此，本文中提到的其他剂型完全可以实施。因此本发明不按照这些具体描述也可以实施，并且仍然在所附的权利要求的范围之内。
权利要求
1. 一种药物组合物，其为由下述重量配比的原料制成的药剂
荆芥 5～15份
矮地茶10～20份
麻黄(蜜炙)5～15份
苦杏仁1～10份
黄芩 1～10份
前胡 5～15份
法半夏5～15份
浮石 5～15份
蝉蜕 1～10份
陈皮 1～10份
紫草 1～10份
甘草 1～10份。
2. 根据权利要求1所述的药物组合物，其为由下述重量配比的原料制成的药剂
荆芥 8～13份
矮地茶15～22份
麻黄(蜜炙)7～12份
苦杏仁3～8份
黄芩 3～8份
前胡 7～12份
法半夏7～12份
浮石 7～14份
蝉蜕 3～8份
陈皮 3～8份
紫草 3～8份
甘草 3～8份。
3. 根据权利要求2所述的药物组合物，其为由下述重量配比的原
料制成的药剂
荆芥 10.9份
矮地茶 18份
麻黄(蜜炙) 9份
苦杏仁 5.5份
黄芩 5.5份
前胡 9份
法半夏 9份
浮石 10.9份
蝉蜕 5.5份
陈皮 5.5份
紫草 5.5份
甘草 5.5份。
4. 含有权利要求1所述药物组合物的药物，其为片剂、丸剂、胶囊剂、囊片剂、粉剂、颗粒剂、悬浮剂、凝胶剂、糊剂中的任意一种。
5. 根据权利要求4所述的药物，其为片剂或颗粒剂。
6. 根据权利要求4所述的药物，其进一步含有选自赋形剂、包合剂、载体、稀释剂、稳定剂、增塑剂、粘结剂、助流剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、塑化剂，着色剂、成膜剂、增味剂、甜味剂、防腐剂中的一种或多种辅料和/或添加剂。
7. 根据权利要求4所述药物的制备方法，包括(该权项是方法权利要求中的最宽权项，请认真研究，其中的哪些步骤或操作是可省的，或者可由其他方法代替，总之，尽量将能制成此药的所有方法囊括其中，以免以后其他人绕开权利要求而实施该产品)
(1)按重量份称取矮地茶、炙麻黄、法半夏、苦杏仁、前胡、紫草，进行渗漉，收集漉液，加入包合剂，真空浓缩得第一浓缩液；
(2)按重量份称取荆芥、陈皮，用水蒸馏提取，收集挥发油及滤液；
(3)按重量份称黄芩、浮石、蝉蜕、甘草与步骤(1)和(2)所得的药渣合并，加热水煎提，收集水提液，过滤，滤液与步骤(2)中荆芥、陈皮提取后所得的滤液合并，浓缩，得第二浓缩液，然后静置，取上清液过滤，向所得滤液中加入包合剂，再浓缩，得第三浓缩液；
(4)取所述第一浓缩液和所述第三浓缩液，混合，浓缩，干燥，粉碎成细粉；
(5)按适当比例制备由所述挥发油与包合剂组成的包合物；
(6)取步骤(4)得到的细粉与步骤(5)得到的包合物，制成适宜的剂型。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤(1)按如下方法进行
用60～90％乙醇作溶剂，浸渍16-36小时，然后以每分钟2～7ml的流速(以1000g药材计)渗漉，收集漉液，加入全方药材总量的1～5％的所述包合剂，在40～75℃和减压下部分浓缩得所述第一浓缩液。
9. 根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤(2)按如下方法进行
按重量份称取荆芥、陈皮，用4-12倍量的水浸泡0.5-3小时，蒸馏提取4～10小时，收集所述挥发油及滤液。
10. 根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤(3)按如下方法进行
按重量份称黄芩、浮石、蝉蜕、甘草与步骤(1)和(2)所得的药渣合并，加药材量4-10倍量的热水煎提1-3次，时间为1-5小时，收集水提液，过滤并与步骤(2)中荆芥、陈皮蒸馏后的滤液合并，部分浓缩，得到所述第二浓缩液，然后静置，过滤，向所得滤液中加入适量β-环糊精，再浓缩，得所述第三浓缩液。
11. 根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤(4)按如下方法进行
取所述第一浓缩液和第三浓缩液，混合，在50-70℃浓缩，干燥，粉碎成细粉。
12. 根据权利要求7所述的方法，其中所述步骤(5)按如下方法进行
先将所述包合剂用适宜的溶剂如水调成包合剂糊状物，然后加入适宜比例的步骤(2)中得到的所述挥发油，混合均匀，作为优选，将所述挥发油用乙醇稀释，然后使所得溶液与所述包合剂糊装物合并，研磨合适的时间，最后干燥得到挥发油包合物。
13. 根据权利要求1所述的药物组合物在制备用于治疗小儿外感咳嗽的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗外感咳嗽、特别是小儿外感咳嗽的药物、含有其的药物组合物，及其制备方法。本发明提供的药物由以下重量配比的原料制成荆芥5～15份；矮地茶10～20份；麻黄(蜜炙)5～15份；苦杏仁1～10份；黄芩1～10份；前胡5～15份；法半夏5～15份；浮石5～15份；蝉蜕1～10份；陈皮1～10份；紫草1～10份；甘草1～10份。
文档编号A61K36/8888GK101244170SQ20071011156
公开日2008年8月20日 申请日期2007年6月19日 优先权日2007年6月19日
发明者张庆华 申请人:张庆华