专利名称：草花有效部位及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种草花(棉花花)有效部位及其制备方法和用途，尤其是该有效部位在制备预防或治疗老年期痴呆药物中的用途。
背景技术：
老年期痴呆是危害老年人身心健康的常见病，多发病。目前全世界65岁以上人群中老年期痴呆患病率约为10％，85岁以上可达47％，在发达国家中，该病在死亡原因中名列第4位，仅次于心脏病，癌和中风。我国的老年期痴呆患病率略低于发达国家，但随着我国经济、文化事业的发展，寿命延长，老年人口占总人口的比例将加大。随着老年人口增加，老年期痴呆患者急剧地增多。老年期痴呆患者的症状主要表现为进行性认知功能减退，并伴有行为障碍及情绪异常波动等，直至生活不能自理，给家庭和社会造成了巨大的压力。因此开发治疗老年期痴呆药物是当务之急。在国外开发治疗老年期痴呆药物的焦点主要集中在乙酰胆碱酯酶抑制剂，如1996年首次上市的乙酰胆碱酯酶抑制剂一他可林(Tacrine)，1997年上市的多奈哌齐以及正在进行的乙酰胆碱酶抑制剂有Metrifonate，Velnacrine maleate等。由于乙酰胆碱酯酶全身分布，其副作用较大，限制了它们的治疗效果。
草花(又称棉花花)为锦葵科锦属植物草棉或陆地棉的花瓣。维吾尔医用于治疗益心补脑，安神养神，消肿祛炎。用于脑弱神疲，心悸心烦，机体炎肿，皮肤瘙痒，烧伤热痛等。草花的天然资源丰富，未见有毒性报告，迄今为止，从草花中提取有效部位用于预防或治疗老年期痴呆症未见报道。
发明内容
本发明目的在于，提供一种草花有效部位及其制备方法和用途，是在中国专利031591949基础上的进一步研究。本发明采用溶剂提取或大孔吸附树脂法或溶剂提取和大孔吸附树脂组合集成法制备的草花有效部位，该有效部位按常规制药方法制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂；或将有效部位与中、西药配伍制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂用于治疗老年期痴呆的药物。
本发明所述的采用溶剂提取或大孔吸附树脂法或溶剂提取和大孔吸附树脂组合集成法制备的草花有效部位，该有效部位含有50-90％重量的总黄酮成分，制备方法按下列步骤进行a、将草花原药材加6-10倍量的溶剂水或醇或水与醇的混合物，浸泡提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；b、将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇进行萃取；c、将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为50-90％有效部位；d、或将步骤a的浓缩物过滤并稀释后通过大孔树脂，用水或5-10％乙醇洗脱除掉杂质后，再用浓度为15-95％乙醇洗脱，蒸干，得到含有50-90％草花总黄酮的有效部位。
步骤a的醇为甲醇或乙醇或异丙醇或丁醇，其浓度为45-95％。
步骤b中所述大孔树脂是D101型或具有苯乙烯骨架的大孔树脂。
将提取有效部位按常规制药方法制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂；或将有效部位与中、西药配伍制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂。
一种草花有效部位的制备方法，按下列步骤进行a、将草花原药材加6-10倍量的溶剂水或醇或水与醇的混合物，其中醇为甲醇或乙醇或异丙醇或丁醇，浓度为15-95％，浸泡提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；b、将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇进行萃取；c、将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为50-90％有效部位；d、或将步骤a的浓缩物过滤并稀释后通过D101型或具有苯乙烯骨架大孔树脂，用水或5-10％乙醇洗脱除掉杂质后，再用浓度为15-95％乙醇洗脱，蒸干，得到含量为50-90％草花总黄酮有效部位。
一种草花有效部位作为制备预防和治疗老年期痴呆的药物的用途。
本发明草花(棉花花)原药材经干燥并粉碎，以利增大与溶剂的接触面积，提高效率。
原药材的提取溶剂使用水、醇类、或水与醇类的混合物，优选的醇类包括甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等或水与醇类的混合物，例如浓度为20-99％(体积比)的醇；提取时溶剂浸过药材为宜，溶剂量为原药重量的2-14倍；提取可以在静态或动态下，优选在动态条件下；为了提高提取的效率，可以使用超声波等；提取的温度是从室温(例如20℃)到溶剂回流温度的范围内，优选在回流的温度下；提取可连续或间歇进行，间歇提取时可重复1-4次，优选2-3次。
合并滤液，滤去药渣，浓缩至无醇味，合并浓缩液过滤并稀释后通过大孔树脂，用水或5-10％乙醇洗脱除掉杂质后，用30-80％乙醇洗脱，优选是50-70％的乙醇洗脱，蒸干，得到含有50％-90％草花总黄酮的有效部位。
草花，加6-10倍量40-95％乙醇浸泡24h后渗漉，合并渗漉液，提取液减压浓缩至无醇味，用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇翠取，优选使用正丁醇翠取，减压蒸干，得到草花总黄酮含量为50％-90％有效部位。
本发明以草花有效部位作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将草花有效部位与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。草花有效部位在其药物组合物中的含量通常为0.1-95％重量。
草花有效部位或含有它的药物组合物以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。
给药剂型为液体剂型或固体剂型或半固体剂型。液体剂型为溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型为片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂和喷雾剂等；半固体剂型为软膏剂、凝胶剂和糊剂等。
草花有效部位制成普通制剂或缓释制剂或控释制剂或靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将草花有效部位制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和助流剂；稀释剂包括淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和碳酸钙等；湿润剂包括水、乙醇和异丙醇等；粘合剂包括淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇等；崩解剂包括干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯和十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂包括滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡和聚乙二醇等。
还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
为了将给药单元制成胶囊剂，将有效成分草花有效部位与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中；也可将有效成分草花有效部位先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中；用于制备草花有效部位片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备草花有效部位的胶囊剂。
为将草花有效部位制成注射剂，用水或乙醇或异丙醇或丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂；增溶剂或助溶剂为泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂为磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂为氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。
此外，如需要向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
草花有效部位可增强环己酰亚胺、东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的记忆能力。明显提高Aβ脑室注射所致痴呆小鼠记忆能力作用。草花总黄酮以140mg/kg剂量连续给药14天对Aβ侧脑室注射所致大鼠学习记忆障碍有明显影响。
草花总黄酮35mg/kg和140mg/kg剂量连续给药14天对IBO基底前脑Meynert核注射所致大鼠学习记忆障碍有明显改善作用。
本实验室大鼠预实验给药，给药剂量为5.4g·kg-1，一次给药后动物未见明显异常，犬灌胃单次给药毒性试验，最大给药剂量为5g·kg-1，药后动物未见异常。说明草花有效部位毒副作用低。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
草花有效部位药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，草花有效部位的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
本发明的草花有效部位或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的草花有效部位与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
具体实施例方式
实施例1(溶剂法制备有效部位)将草花1公斤加10倍量55％乙醇浸泡24h后渗漉提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；将浓缩提取物用石油醚脱脂，溶于水后，用乙酸乙酯萃取进行萃取；将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量过50％有效部位；实施例2(大孔树脂法制备有效部位)将草花1公斤加6倍量水浸泡24h后渗漉提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩；将步骤a的1公斤用水提取3遍，每遍1小时，合并提取液，减压浓缩，浓缩液稀释10倍后，缓慢通过预先处理好的2kg大孔树脂柱，药液全部通过D101大孔树脂柱后用蒸馏水洗涤，再用5％乙醇洗脱，除掉杂质，再用5倍柱体积20％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，得到草花总黄酮含量为60％有效部位。
实施例3(溶剂法制备有效部位)将草花1公斤加8倍量95％乙醇浸泡24h后渗漉提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用正丁醇进行萃取；将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为70％有效部位；实施例4(溶剂法制备有效部位)将草花1公斤加8倍量95％乙醇浸泡24h后渗漉提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯、正丁醇混合液进行萃取；将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为65％有效部位；实施例5(溶剂法和大孔树脂组合集成制备有效部位)将草花草花1公斤加7倍量15％甲醇浸泡24h后渗漉提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯进行萃取；将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为60％有效部位；将步骤c中的有效部位溶解、过滤并稀释后，缓慢通过预先处理好的2kg大孔树脂柱D101，药液全部通过大孔树脂柱后用蒸馏水洗涤，再用5％乙醇洗脱，除掉杂质，再用5倍柱体积20％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，得到草花总黄酮含量过90％有效部位。
实施例6(溶剂法和大孔树脂组合集成制备有效部位)将草花1公斤加8倍量95％乙醇浸泡24h后渗漉提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用正丁醇进行萃取；将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为70％有效部位；将步骤c中的有效部位溶解，过滤并稀释倍后，缓慢通过预先处理好的2kg大孔树脂柱，药液全部通过具有苯乙烯骨架大孔树脂柱后用蒸馏水洗涤，再用5％乙醇洗脱，除掉杂质，再用5倍柱体积20％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，得到草花总黄酮含量90％有效部位。
实施例7(药物制剂)取0.5-2份微晶纤维素，与1份草花有效部位混匀，以水为粘合剂，14目筛制粒，18目筛整粒，常规压片，然后包衣即得。
实施例8(药物制剂)取0.5-2份淀粉，与1份草花有效部位混匀，以水为粘合剂，14目筛制粒，18目筛整粒，装入胶囊，即得。
实施例9(药物制剂)取1-3份聚乙二醇7000，加热溶化，加入草花有效部位1份，搅拌均匀，然后倒入滴丸机，90℃保温，常规滴制，硅油冷却，即得。
实验例10(药理实验)本发明草花有效部位作为制备预防和治疗老年期痴呆的药物的用途的药理试验。
受试品草花总黄酮对环己酰亚胺致小鼠记忆获得障碍动物记忆能力的影响目的观察受试品草花有效部位对记忆获得障碍动物记忆能力的影响。
材料及方法材料受试品草花总黄酮，黄色粉末，使用时用蒸馏水配制成均匀混悬液。
试剂环己酰亚胺，Sigma公司，批号091001；阳性对照药多奈派齐(安理申)，英国Boots公司制造，卫材(中国)药业有限公司分装，批号5817182。
动物昆明种小鼠，雄性，体重20-24克，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK(京)2004-0001。仪器Passive Avoidance Control，大正制药株式会社赠送。
方法小鼠随机分为六组正常对照组、模型组、多奈派齐(0.75mg/kg)组、草花总黄酮低剂量(25mg/kg)组、草花总黄酮中剂量(50mg/kg)、草花总黄酮高剂量(100mg/kg)组。灌胃给药，正常对照组和模型组给予同体积蒸馏水。连续给药三天，每天给药一次，末次给药后1小时(h)，模型组和给药组腹腔注射(i.p.)环己酰亚胺(120mg/kg)一次，正常对照组i.p.同体积生理盐水。注射后10分钟，进行避暗训练，记录小鼠从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间，24h后重新测试，记录进入暗室的潜伏期和5min内的电击次数。
结果与正常组小鼠第一次触电潜伏期(285±34s)和5min内触电次数(0.2±0.4次/5min)比较，模型组第一次触电潜伏期(36±24s)和5min内触电次数(3.4±2.2次/5min)有极显著性差异(P＜0.01)，说明造模成功。草花总黄酮高、中、低三个剂量组第一次触电潜伏期分别为162±109s、133±128s和126±121s，与模型组比较均有显著性差异，而多奈派齐为111±121s，与模型组比较有所升高，但没有统计学差异。
草花总黄酮高剂量组、中剂量组以及多奈哌齐组小鼠5min内触电次数为1.3±1.7次/5min、1.5±1.5次/5min和1.5±1.0次/5min，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)，而草花总黄酮低剂量(1.8±1.8次/5min)对小鼠5min内触电次数没有影响。(见表1)表1.受试品草花总黄酮对环己酰亚胺所致学习记忆障碍小鼠记忆能力的影响
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01结论受试品草花总黄酮口服给药(25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg)可明显增强环己酰亚胺所致学习记忆障碍小鼠的记忆能力。
受试品草花对对东莨菪碱致小鼠记忆获得障碍动物记忆能力的影响目的观察受试品草花总黄酮对M受体阻断剂东莨菪碱所致记忆获得障碍小鼠记忆能力的影响。
材料及方法材料受试品草花总黄酮，黄色粉末，使用时用蒸馏水配制成均匀混悬液。
试剂东莨菪碱，Merck公司，批号K29367747。
阳性对照药多奈派齐(安理申)，英国Boots公司制造，卫材(中国)药业有限公司分装，批号5817182。
动物昆明种小鼠，雄性，体重20-24克，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK(京)2004-0001。
仪器Passive Avoidance Control，日本大正制药株式会社赠送。
方法小鼠随机分为六组正常对照组、模型组、多奈派齐(0.75mg/kg)组、草花总黄酮低剂量(25mg/kg)组、草花总黄酮中剂量(50mg/kg)、草花总黄酮高剂量(100mg/kg)组。灌胃给药，正常对照组和模型组给予同体积蒸馏水。连续给药三天，每天给药一次，末次给药后1小时(h)，模型组和给药组腹腔注射(i.p.)东莨菪碱(5mg/kg)一次，正常对照组i.p.生理盐水。注射后10min，进行避暗训练，记录小鼠从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间(s)。24h后重新测试，记录进入暗室的潜伏期和3min内的电击次数。
结果与正常组小鼠第一次触电潜伏期(223±114s)和5min内触电次数(0.6±0.9次/5min)比较，模型组第一次触电潜伏期(26±19s)和5min内触电次数(3.4±1.8次/5min)有极显著性差异(P＜0.01)，说明造模成功。草花总黄酮高、中、低三个剂量组第一次触电潜伏期分别为127±134s、109±132s和96±112s，而多奈派齐为108±118s，与模型组比较均有显著性差异。
草花总黄酮高剂量组小鼠5min内触电次数为0.9±0.8次/5min，与模型组比较有极显著差异(P＜0.01)，多奈派齐组为1.3±1.0次/5min，与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，而AB-8-2中剂量组(2.0±1.7次/5min)和低剂量组(2.2±1.6次/5min)对小鼠5min内触电次数没有影响。(见表1)表1.受试品AB-8-2对东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠记忆能力的影响
与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01与空白组比较，#P＜0.05，##P＜0.01结论受试品草花总黄酮口服给药在25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg剂量下可明显增强东莨菪碱所致学习记忆障碍小鼠的记忆能力。
草花总黄酮对Aβ脑室注射致痴呆小鼠记忆能力的影响目的观察受试品草花总黄酮对痴呆小鼠记忆能力的影响。
材料及方法材料受试品草花总黄酮，黄色粉末，使用时用蒸馏水配制成均匀混悬液。
试剂Aβ25-35，Sigma公司产品，货号A-4559，批号114K4773。多奈派齐(安理申)，法国PFIZER PGM公司生产，卫材(中国)药业有限公司分装，批号4221903。水合三氯乙醛，北京市旭东化工厂产品，批号020327。
动物昆明种小鼠，雄性，体重20-24克。由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号SCXK(京)2004-0001。
仪器小鼠水迷宫中国医学科学院药物研究所制作。SR-6N脑立体定位仪日本成茂公司(NARISHIGE)生产。
方法聚集态老化Aβ25-35制备1mg Aβ25-35肽段溶于500μl灭菌生理盐水中，浓度为10μg/μl。封口膜封好后，置于37℃孵育7天，使其聚集、老化。
Aβ25-35脑室注射所致小鼠痴呆模型制备小鼠用10％水合氯醛(450mg/kg)麻醉，75％酒精局部消毒，以微量注射器于单侧侧脑室(AP1.0mm，L 4.5mm，H 3.0mm)缓慢注入3μl已老化的凝聚态Aβ25-35，注射时间为30s，留针30s，缓慢起针。局部消毒后缝合皮肤，肌注抗生素抗感染。假手术组的小鼠同侧脑室注射等量的灭菌生理盐水。
分组及给药小鼠随机分为四组假手术组、模型组、多奈派齐(0.75mg/kg)组、受试品草花总黄酮(100mg/kg)组。按上述剂量灌胃给药，假手术和模型组给予同体积蒸馏水。连续给药十二天，从第七天开始，于给药后1h，进行水迷宫训练，第一天设置一个盲端，第二、三天设置三个盲端，第四天设置四个盲端，并在此条件下于第五天(给药第十二天)进行正式实验，记录小鼠从放入至爬上台阶所需的时间(s)及进入盲端次数。每次实验均重复两次，每次间隔2-3分钟。
数据分析数据以平均值±标准差表示，数据分析采取t检验。
结果模型组小鼠爬上台阶所需时间(55.9±47.4s)和进入盲端次数(6.2±6.4次)与假手术组小鼠(15.1±9.9s和1.4±1.0次)比较有显著性差异(P＜0.05)，阳性对照药多奈派齐组小鼠(0.75mg/kg)的爬上台阶所需时间(19.9±8.6s)和进入盲端次数(1.7±1.3次)与模型组小鼠比较有显著性差异(P＜0.05)，说明本实验造模是成功的。与模型组相比，草花总黄酮(100mg/kg)组小鼠爬上台阶所需时间(21.3±12.4s)和进入盲端次数(0.9±1.1次)明显减少，统计学显示有显著性差异(P＜0.05)(见表1)。
表1.草花总黄酮对Aβ脑室注射所致痴呆小鼠记忆能力的影响
N＝12，与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01结论受试品草花总黄酮口服给药在100mg/kg剂量下具有明显提高Aβ脑室注射所致痴呆小鼠记忆能力作用。
草花总黄酮对脑室注射Aβ致大鼠记忆获得障碍学习记忆能力的影响
材料及方法材料受试品草花总黄酮，黄色粉末，由中国科学院理化技术研究所提供，以蒸馏水配制成浓度分别为14mg/mL，7mg/mL，3.5mg/mL和1.75mg/mL的均匀混悬液备用。
阳性对照药盐酸多奈哌齐片剂(商品名安理申)，法国PFIZER PGM公司制造，卫材药业有限公司分装，产品批号4222403，分装批号4222403A，有效期2005年1月7日至2007年12月。以生理盐水配制成浓度为0.06mg/mL的均匀混悬液备用。
造模试剂Aβ25-35(Amyloid β-Protein Fragment 25-35)，Sigma公司产品，货号A-4559，批号115K4778。麻醉剂戊巴比妥钠，北京化学试剂公司，批号020919；将200mg的戊巴比妥钠溶于20mL的生理盐水中，配成1％的溶液。
其他药品和试剂注射用青霉素粉针，华北制药股份有限公司，批号E0503315，80万单位/支，有效期至2007年2月，临用前无菌生理盐水配成80万单位/4mL的注射液。5％H2O2(天津市东方化工厂生产)取25mL的30％H2O2，加蒸馏水125mL至150mL。
0.2 M磷酸盐缓冲液(PBS溶液)配制试剂 质量(g)NaH2PO4·2H2O 23.712Na2HPO4·12H2O 231.984NaCl 64ddH2O 4000mL0.1M PBS溶液(pH7.4)将0.2M PBS溶液(pH7.4)稀释二倍即得，4℃保存。
4％多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)多聚甲醛160g溶于0.1M PBS溶液2000mL，混合加热至60℃，冷却后调pH为7.4，加0.1M PBS至2000mL，4℃保存。
仪器SR-6N脑立体定位仪日本成茂公司(NARISHIGE)生产。STRON6-90型牙科钻，韩国SAESHIN公司生产。大鼠Morris水迷宫北京新天地科技公司生产。大鼠避暗箱中国医学科学院药物所研制。
动物SD大鼠，雄性，体重240±20g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2002-0003。
实验方法Aβ25-35的聚集老化无菌条件下在Aβ25-35玻璃瓶中加入高压灭菌的双蒸水50μ L，制成20μg/μL的储备液，再加入450μL的无菌生理盐水，配成2μg/μL的工作液。37℃孵育聚集老化4天。
实验分组将84只大鼠随机分为7组假手术组、模型组、多奈哌齐阳性药物(0.6mg/kg)组，草花总黄酮217.5mg/kg体重治疗组，草花总黄酮35mg/kg体重治疗组，草花总黄酮70mg/kg体重治疗组，草花总黄酮140mg/kg体重治疗组，每组12只，灌胃给药(1mL/100g)，假手术组和模型组大鼠灌胃给予与药物组同等容量的蒸馏水。
模型制备动物戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉(0.5mL/100g)，固定于脑立体定位仪上，纵向切开头顶部皮肤，分离皮下组织，以5％H2O2适当处理颅骨使骨缝清晰。大鼠侧脑室立体定位仪坐标为前囟后1.0mm，矢状缝旁2.0mm，硬脑膜下4.0mm，以骨钻打开颅骨后，微量进样器自脑表面垂直进针进行注射，Aβ浓度2μg/μL，总体积5μL，2min内注射完毕，停针5min，退针1min。注射后粘合皮肤，肌肉注射青霉素预防感染。假手术组侧脑室相同坐标位点注射等容量的生理盐水。
给药各组动物于手术后第二天开始进行灌胃给药，假手术组和模型组给予等体积的蒸馏水，连续给药14天，每天给药一次。2.5Morris水迷宫，动物于给药第10天开始进行水迷宫训练，每天训练两次，每次每只2min，于给药第12天进行水迷宫测试。Morris水迷宫主要由一不锈钢制成的园柱形黑色水池和一可移动位置的平台组成。预先在水池里注入清水，使水面高出平台2cm，水温控制在20±0.5℃，水中加入黑色墨水，成黑水白鼠对比。平台置于某一象限的中间，大鼠入池位置为站台所在位置的对象限，于象限边1/2弧度处头朝池壁入水，每次训练2min。水池上空通过一摄像机与监视电视和计算机相连接。当设定的训练时间已到或动物已爬上平台，计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹和自动计算出动物在水池中所游过的路程，找到平台所需的时间(即潜伏期)等指标。若动物在2min之内尚未找到平台，则将动物拿到平台上并使它在上面停留20s，若大鼠在2min内找到平台，记录自动停止，也让其在平台上停留20s(大鼠找到平台后，记录自动停止，然后大鼠基本上就停留在台子上不再跳下来。如果跳下平台，就将其重新放回台子。然后用秒表计时20s)，方结束一次训练。于给药第12天进行测试。设定实验时间为60s。
避暗箱于给药第13天进行避暗箱训练，24h后进行避暗箱测试。避暗箱是由一个明室和一个暗室组成的装置。两个室之间有一个圆形洞口连接。暗室通以40V电压，并与一记时器相连，记时器可以自动记录潜伏期时间。将大鼠面部背向洞口放置入明室，同时启记时器，动物穿过洞口进入暗室受到电击，即可取出大鼠。24h后正式测验，记录每只动物从放入明室至首次进入暗室遇到电击所需的时间(潜伏期)，并记录每只动物3min内受到电击的次数。
数据处理与分析实验结果以(均值±标准差)表示，各组间结果进行单因素方差分析和均数间的多重比较分析(α＝0.05)。
实验结果Morris水迷宫实验结果由表1所示，造模13天后，模型组大鼠寻找平台的潜伏期明显延长，表明Aβ(10μg/只)脑室注射可造成大鼠空间学习记忆障碍。与模型组相比，阳性对照药多奈哌齐组大鼠寻找平台潜伏期时间明显缩短(P＜0.05)，表明本试验体系的建立是成功的。与模型组大鼠相比，受试品各给药组大鼠寻找平台的潜伏期均有所缩短，其中AB-8-270mg/kg及140mg/kg两个剂量组大鼠寻找平台潜伏期的缩短有显著性差异(P＜0.05)，且与阳性对照药多奈哌齐组动物相比无显著性差异。
表1.草花总黄酮对Aβ脑室注射所致痴呆大鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力的影响
每组n＝12；与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05避暗箱结果由表2所示，与假手术组相比，造模15天后模型组大鼠受到避暗箱内电击潜伏期有所缩短，3min内受到电击次数明显增多，表明Aβ脑室注射可造成大鼠学习记忆障碍。
与模型组相比，连续给药14天后各给药组大鼠受到避暗箱内电击的潜伏期均有所延长，3min内受到电击的次数均有所减少。多奈哌齐组和AB-8-2(70mg/kg)组大鼠3min内受到电击的次数有明显减少(P＜0.05)。
表2草花总黄酮对Aβ脑室注射所致痴呆大鼠避暗箱学习记忆能力的影响
每组n＝12；与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05结论草花总黄酮在70mg/kg和140mg/kg剂量下连续给药14天对Aβ侧脑室注射所致大鼠学习记忆障碍有明显改善作用。
草花总黄酮对基底前脑Meynert核注射IBO致大鼠记忆获得障碍的影响材料药品及试剂受试品草花总黄酮，黄色粉末，由中国科学院理化技术研究所教授提供，批号04-1，以蒸馏水配制成浓度分别为14mg/mL，7mg/mL和3.5mg/mL的均匀混悬液备用。
阳性对照药盐酸多奈哌齐原料药，重庆桑田药业有限公司生产，产品批号20060401。以生理盐水配制成浓度为0.06mg/mL的均匀混悬液备用。
造模试剂鹅膏蕈氨酸(Ibotenic acid，IBO)1mg包装，Sigma公司产品，货号I2765，批号066K3775，将1mg IBO溶于250μL的无菌生理盐水中，配成4μg/μL溶液备用。
麻醉剂戊巴比妥钠，北京化学试剂公司，批号020919；将200mg的戊巴比妥钠溶于20mL的生理盐水中，配成1％的溶液。
其他药品和试剂注射用青霉素粉针，华北制药股份有限公司，批号E0503315，80万单位/支，有效期至2007年2月，临用前无菌生理盐水配成80万单位/4mL的注射液。5％H2O2(天津市东方化工厂生产)，取25mL的30％H2O2，加蒸馏水125mL至150mL。
0.2M磷酸盐缓冲液(PBS溶液)配制试剂 质量(g)NaH2PO4·2H2O 23.712Na2HPO4·12H2O231.984NaCl 64ddH2O 4000mL0.1M PBS溶液(pH7.4)将0.2M PBS溶液(pH7.4)稀释二倍即得，4℃保存。4％多聚甲醛磷酸缓冲液(pH7.4)多聚甲醛160g溶于0.1MPBS溶液2000mL，混合加热至60℃，冷却后调pH为7.4，加0.1M PBS至2000mL，4℃保存。
仪器SR-6N脑立体定位仪日本成茂公司(NARISHIGE)生产。STRONG-90型牙科钻，韩国SAESHIN公司生产。大鼠Morris水迷宫北京新天地科技公司生产。大鼠避暗箱中国医学科学院药物所研制。
动物SD大鼠，雄性，体重210±10g，北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2002-0003。
方法实验分组将72只大鼠随机分为6组假手术组，模型组，多奈哌齐阳性药物(0.6mg/kg)组，草花总黄酮低剂量(35mg/kg)组，草花总黄酮中剂量(70mg/kg)组，草花总黄酮高剂量(140mg/kg)组，每组12只。灌胃给药(1mL/100g)，假手术组和模型组大鼠灌胃给予与药物组同等容量的蒸馏水。
模型制备对动物腹腔注射戊巴比妥钠麻醉(50mg/kg)，固定于脑立体定位仪上，纵向切开头顶部皮肤，分离皮下组织，以5％H2O2适当处理颅骨使骨缝清晰。大鼠基底前脑Meynert核立体定位仪坐标为前囟后0.9mm，矢状缝旁2.6mm，硬脑膜下6.9mm，以骨钻打开颅骨后，微量进样器自脑表面垂直进针，进行双侧注射，IBO浓度4μg/μL，每侧1μL，2min内注射完毕，停针5min，退针1min。注射后粘合皮肤，肌肉注射青霉素预防感染。假手术组基底前脑相同坐标注射等容量的生理盐水。
给药各组动物于手术后第二天开始进行灌胃给药(1mL/100g体重)，假手术和模型对照组灌胃给予等体积的蒸馏水，连续给药14天，每天给药一次。
Morris水迷宫动物于给药第10天开始进行水迷宫训练，每天训练两次，每次每只120s，于给药第12天进行水迷宫测试。
Morris水迷宫主要由一不锈钢制成的园柱形黑色水池和一可移动位置的平台组成。预先在水池里注入清水，使水面高出平台2cm，水温控制在20±0.5℃，水中加入黑色墨水，成黑水白鼠对比。平台置于某一象限的中间，大鼠入池位置为站台所在位置的对象限，于象限边1/2弧度处头朝池壁入水，每次训练120s。水池上空通过一摄像机与监视电视和计算机相连接。当设定的训练时间已到或动物已爬上平台，计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹和自动计算出动物在水池中所游过的路程，找到平台所需的时间(即潜伏期)等指标。若动物在120s之内尚未找到平台，则将动物拿到平台上并使它在上面停留20s，若大鼠在120s内找到平台，记录自动停止，也让其在平台上停留20s，方结束一次训练。于给药第12天进行测试。设定实验时间为60s。
避暗箱于给药第13天进行避暗箱训练，24h后进行避暗箱测试。避暗箱是由一个明室和一个暗室组成的装置。两个室之间有一个圆形洞口连接。暗室通以40V电压，并与一记时器相连，记时器可以自动记录潜伏期时间。将大鼠面部背向洞口放置入明室，同时启记时器，动物穿过洞口进入暗室受到电击，即可取出大鼠。24h后正式测验，记录每只动物从放入明室至进入暗室遇到电击所需的时间(潜伏期)，并记录每只动物3min内受到电击的次数。
数据处理与分析实验结果以(均值±标准差)表示，各组间结果进行单因素方差分析和均数间的多重比较分析(α＝0.05)。
结果Morris水迷宫实验结果由表1所示，造模第13天，模型组大鼠寻找平台的潜伏期明显延长，表明IBO(8μg/只)基底前脑Meynert核注射可造成大鼠空间学习记忆障碍。与模型组相比，阳性对照药多奈哌齐组大鼠寻找平台潜伏期明显缩短(P＜0.05)，表明本试验体系的建立是成功的。与模型组大鼠相比，受试品各给药组大鼠寻找平台的潜伏期均有所缩短，其中AB-8-235mg/kg及140mg/kg两个剂量组大鼠寻找平台潜伏期有显著性差异(P＜0.05)，且与阳性对照药多奈哌齐组动物相比无显著性差异。
表1.草花总黄酮对IBO基底前脑Meynert核注射所致痴呆大鼠Morris水迷宫空间学习记忆能力的影响
每组n＝12，*P＜0.05，与假手术组比较；#P＜0.05，与模型组比较避暗箱结果由表2所示，与假手术组相比，造模第15天模型组大鼠受到避暗箱内电击的潜伏期有所缩短，3min内受到电击的次数增多。与模型组相比，连续给药14天各给药组大鼠受到避暗箱内电击的潜伏期均有所延长，3min内受到电击的次数均有所减少，但没有明显差异。
表2.草花总黄酮对IBO基底前脑Meynert核注射所致痴呆大鼠避暗箱学习记忆能力的影响
每组n＝12结论草花总黄酮在35mg/kg和140mg/kg剂量下连续给药14天对IBO基底前脑Meynert核注射所致大鼠学习记忆障碍有明显改善作用。
权利要求
1.一种采用溶剂提取或大孔吸附树脂法或溶剂提取和大孔吸附树脂组合集成法制备的草花有效部位，其特征在于该有效部位含有50-90％重量的总黄酮成分，制备方法按下列步骤进行a、将草花原药材加6-10倍量的溶剂水或醇或水与醇的混合物，浸泡提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；b、将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇进行萃取；c、将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为50-90％有效部位；d、或将步骤a的浓缩物过滤并稀释后通过大孔树脂，用水或5-10％乙醇洗脱除掉杂质后，再用浓度为15-95％乙醇洗脱，蒸干，得到含有50-90％草花总黄酮的有效部位。
2.根据权利要求1所述的草花有效部位，其特征在于步骤a的醇为甲醇或乙醇或异丙醇或丁醇，其浓度为45-95％。
3.根据权利要求1所述的草花有效部位，其特征在于步骤b中所述大孔树脂是D101型或具有苯乙烯骨架的大孔树脂。
4.根据权利要求1所述的草花有效部位，其特征在于将提取有效部位按常规制药方法制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂；或将有效部位与中、西药配伍制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂。
5.一种草花有效部位的制备方法，其特征在于按下列步骤进行a、将草花原药材加6-10倍量的溶剂水或醇或水与醇的混合物，其中醇为甲醇或乙醇或异丙醇或丁醇，浓度为15-95％，浸泡提取，合并滤液，滤去药渣，减压浓缩至无醇味；b、将浓缩提取物用石油醚脱脂，再用乙酸乙酯和/或正丁醇进行萃取；c、将萃取物减压蒸干，即可得到草花总黄酮含量为50-90％有效部位；d、或将步骤a的浓缩物过滤并稀释后通过D101型或具有苯乙烯骨架大孔树脂，用水或5-10％乙醇洗脱除掉杂质后，再用浓度为15-95％乙醇洗脱，蒸干，得到含量为50-90％草花总黄酮有效部位。
6.一种草花有效部位作为制备预防和治疗老年期痴呆的药物的用途。
全文摘要
本发明涉及一种草花有效部位及其制备方法和用途，是在中国专利031591949基础上的进一步研究。本发明采用溶剂法或大孔吸附树脂法或溶剂法和大孔吸附树脂组合集成法制备草花有效部位，该有效部位按常规制药方法制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂；或将有效部位与中、西药配伍制成胶囊或片剂或口服液或冲剂或注射液或缓释制剂或控释制剂用于治疗老年期痴呆的药物。
文档编号A61P25/28GK101084946SQ20071012653
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月20日 优先权日2007年6月20日
发明者阿吉艾克拜尔·艾萨, 再帕尔·阿不力孜, 朱海波, 帕尔哈提·克热木, 吴韬, 热依木古丽, 赵永昕, 杨义 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所