专利名称：：植物血凝素提高动物免疫力的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物血凝素提高动物免疫力的应用，为植物血凝素新的应用功效一注射用于提高动物免疫机能，属于兽医药品领域。技术背景目前国内许多流行病的频频发生，传染病病种日益增多，病情日趋复杂。动物免疫力低下是根本原因。而动物的免疫抑制现象使得动物疾病日趋复杂且难以控制净化，一直是近年来困扰养殖户的现实问题。相反，动物免疫力提高可以较好的预防疾病，减少传染病的发生率。动物医学上具有增强免疫功能的物质称免疫增强剂。免疫增强剂也称免疫佐剂，是一种通过非特异性途径提高机体对抗原或微生物特异反应的物质。免疫增强剂的研究已有近百年历史，近10年来，由于科技进步和科学水平的提高，免疫增强剂研究不断拓宽，兽医临床应用范围越来越广，对动物的免疫和保健作用越来越明显。植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)是从豆科云实属植物中提取得到的植物蛋白。其主要成分为D—甘露糖、氨基葡糖醛酸衍生物所构成的低聚糖辅基与蛋白质复合物。最先它是由Nowell在1960年发现的一种强效的非特异性有丝分裂原，具有刺激淋巴细胞形态转化和细胞分裂以及凝集红细胞、淋巴细胞，抑制肿瘤生长，检测及增强机体免疫功能等作用。为了维持其有效成分的稳定性，植物血凝素常用其冻干制剂。目前它已应用于人的临床诊断或协同放疗、化疗治疗免疫功能低下疾病及肿瘤患者，但它仍然主要作为生物学及医学研究中的丝裂原使用。
发明内容技术问題本发明的目的是提供植物血凝素在提高动物免疫力方面的应用，提供了一种新的、毒副作用较低的、有效提髙动物免疫力的药物，它提高鸡、猪、犬的体液免疫和细胞免疫。技术方案本发明提供了植物血凝素在提高动物免疫力方面的应用，包括用植物血凝素提高动物的细胞免疫和体液免疫。使用剂量为2.4~9.6mg/kg.bw，即每公斤动物一次使用2.49.6mg植物血凝素冻干粉制剂，注射给药，每日1次，连用3天。所用的植物血凝素冻干粉制剂是从菜豆中提取的有效成分制成的冻干制剂。有益效果本发明首次将植物血凝素应用于提高动物的免疫机能。植物血凝素作为一种新的、毒副作用较低的、有效提高动物免疫力的药物，通过植物血凝素对鸡、猪、犬的血液生化指标影响试验、淋巴细胞转化率试验、免疫器官指数影响试验、对抗体滴度影响试验，得出试验研究结果如下-1、植物血凝素可以提高鸡的血液生化指标、抗体滴度，对鸡的淋巴细胞转化率有促进作用，并存在量效依赖关系(表5、6、8);植物血凝素对鸡的免疫器官指数有促进作用，但无量效依赖关系(表7)。2、植物血凝素可以提高猪的血液生化指标、抗体滴度，对猪的淋巴细胞转化率和免疫器官指数有促进作用，并存在量效依赖关系(表9^表12)。3、植物血凝素可以提高狗的血液生化指标、对狗的淋转率和免疫器官指数有一定的促进作用，并存在量效依赖关系(表13~>表16)。以上试验证明了植物血凝素可以用于提高动物的免疫力。但它不抑制动物的免疫系统，对动物的增重、活动、毛色、摄食等体况无明显不良影响。本发明为我国目前广泛用作的淋巴细胞转化的试剂——植物血凝素提供了新的应用范围，用植物血凝素注射给药，提高动物的免疫力，防止动物疾病，为养殖业提供优良的免疫增强剂。为我国养殖业提供了优良的提高免疫的药品，间接推动了我国养殖业的发展。具体实施方式数据处理数据用mean土SD表示。t检验应用SPSS11.0forWindows软件。尸<0.05认为具有差异显著性。1、植物血凝素对鸡的免疫功能影响试验试验材料植物血凝素上海伊华医学科技有限公司生产，批号20050705。淋巴细胞分离液上海华精生物高科技有限公司，批号030728。鸡肝素抗凝血首次用药后第4天、第10天每组随机抽取10只供试鸡心脏采血1~1.5mL，加入O.1mL1%肝素抗凝。试验动物与分组引进刚出壳M肉鸡，按要求规范化饲养，伺喂未添加任何药物的全价配合饲料，自由饮水。21日龄时选取120羽体重均匀的健康仔鸡，随机分组，试验前称重。分组及处理情况如表1所示表1试验鸡的分组及处理组别处理鸡数用量(mg/kg.bw)APHA低剂量组300.4BPHA中剂量组300.8CPHA高剂量组301.6D生理盐水对照组301.4各药物均肌肉注射，连用三日，每日一次。试验方法1血液生化指标的测定首次用药后，分别在第4天、10天清晨8:00(此前停词12h)每组随机取10只鸡，心脏采血。每份血样都分别放入EDTA抗凝管和无抗凝剂的试管中。血样采集后立即送至省中医院用血液生化自动分析仪检测，抗凝血测定白细胞总数、淋巴细胞数；非抗凝血，测定血清中血清蛋白(球蛋白、清蛋白)含量。2淋巴细胞形态学观察取抗凝血1小滴推片，瑞氏一姬姆萨染色，油镜下计数100个淋巴细胞，按以下标准观察淋巴母细胞及过渡型细胞所占的百分率。过渡型+母细胞转化率=_X100%淋巴细胞总数表2淋巴细胞转化的形态特征<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>染色质疏松网状，有时呈分裂相粗松致密、团聚核仁清晰，13个可见核仁样结构无丰富，嗜碱性较强，核周有透胞浆稍多，中度嗜碱性，可胞浆少，轻度嗜碱性，胞浆明区，胞浆有小空泡有少量空泡无空泡3免疫器官指数第10天采血前每组随机抽出8只鸡称重，采血后全部放血宰杀，小心取出胸腺、脾脏和法氏囊，剔除附着脂肪组织，用滤纸吸干血水后进行准确称重，记录重量，计算免疫器官指数。免疫器官重量(mg)免疫器官(胸腺、脾脏和法氏囊)指数=_试鸡活重(g)4抗体滴度影响试验试验组免疫新城疫疫苗，同时注射给药，剂量参照表l，给药l次，对照组免疫新城疫疫苗，同时注射生理盐水。于给药后第10天，采血分离血清，用血凝抑制法测定抗体滴度。试验结果(1)不同天数植物血凝素对鸡血液生化指标的影响见于(表5、6):植物血凝素对鸡的各项血液生化指标均有不同程度的提高作用，而且在试验所用剂量范围内，呈正相关性。(2)不同剂量的植物血凝素对鸡的免疫器官指数影响见于(表7):免疫器官指数均不同程度的提高，高中剂量组(1.6和0.8mg/kg.bw)与对照组相比，差异显著(尸<0.05),两者不存在量效依赖关系。(3)不同剂量的植物血凝素对鸡的新城疫疫苗的抗体滴度均有提高(表8),两者存在量效依赖关系。2、植物血凝素对猪的免疫功能影响试验试验材料植物血凝素上海伊华医学科技有限公司生产，批号20050705。淋巴细胞分离液上海华精生物高科技有限公司，批号030728。猪肝素抗凝血首次用药后第4天、第10天每组随机抽取3头猪颈静脉采血11.5mL，加入0.1mL1%肝素抗凝。试验动物与分组引进28日龄类三元仔猪，按要求规范化饲养，饲喂未添加任何药物的全价配合饲料。饲养1周后，随机分组，试验前称重。分组及处理情况如表3所示表3试验猪的分组及处理<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>各药物均肌肉注射，连用三日，每日一次。试验方法1血液生化指标的测定首次用药后，分别在第4天、10天清晨8:00(此前停饲12h)每组随机取3头猪，颈静脉采血。每份血样都分别放入EDTA抗凝管和无抗凝剂的试管中。血样采集后立即送至省中医院用血液生化自动分析仪检测，抗凝血测定白细胞总数、淋巴细胞数；非抗凝血，测定血清中血清蛋白(球蛋白、清蛋白)含量。2淋巴细胞形态学观察方法同上3免疫器官指数第10天采血前每组5头猪称重，采血后全部放血宰杀，小心取出胸腺、脾脏，剔除附着脂肪组织，用滤纸吸干血水后进行准确称重，记录重量，计算免疫器官指数。免疫器官重量(mg)免疫器官(胸腺、脾脏)指数=_试验猪活重(g)4抗体滴度影响试验试验组免疫猪瘟疫苗，同时注射给药，剂量参照表3，给药1次，对照组免疫猪瘟疫苗，同时注射生理盐水。于给药后第10天，采血分离血清，用间接血凝抑制法测定抗体滴度。试验结果(1)不同天数植物血凝素对猪血液生化指标的影响见于(表9、10):植物血凝素对猪的各项血液生化指标均有不同程度的提高作用，而且在试验所用剂量范围内，呈正相关性。(2)不同剂量的植物血凝素对猪的免疫器官指数影响见于(表11):免疫器官指数均不同程度的提高，高中剂量组(0.8和0.4mg/kg.bw)与对照组相比，差异显著(PO.05),两者存在量效依赖关系。(3)不同剂量的植物血凝素对猪的猪瘟疫苗的抗体滴度均有提高(表12)，高中剂量组(0.8和0.4mg/kg.bw)与对照组相比，差异显著(尸<0.05)，两者存在量效依赖关系。3、植物血凝素对犬的免疫功能影响试验试验材料植物血凝素上海伊华医学科技有限公司生产，批号20050705。淋巴细胞分离液:上海华精生物高科技有限公司，批号030728。犬肝素抗凝血首次用药后第4天、第10天每组随机抽取3只犬颈静脉采血11.5rnL,加入0.1niL1%肝素抗凝。试验动物与分组健康成年犬24只，体重10kg左右，由江苏南京江浦实验动物养殖场提供。试验动物按要求规范化饲养，饲喂未添加任何药物的全价配合饲料。饲养1周后，随机分组，试验前称重。分组及处理情况如表4所示表4试验犬的分组及处理<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>各药物均皮下注射，连用三日，每日一次。试验方法1血液生化指标的测定首次用药后，分别在第4天、10天清晨8:00(此前停饲12h)每组随机取3只犬，颈静脉采血。每份血样都分别放入EDTA抗凝管和无抗凝剂的试管中。血样采集后立即送至省中医院用血液生化自动分析仪检测，抗凝血测定白细胞总数、淋巴细胞数；非抗凝血，测定血清中血清蛋白(球蛋白、清蛋白)含量。2淋巴细胞形态学观察方法同上3免疫器官指数第10天采血前每组5只犬称重，采血后全部放血宰杀，小心取出胸腺、脾脏，剔除附着脂肪组织，用滤纸吸干血水后进行准确称重，记录重量，计算免疫器官指数。免疫器官重量(mg)免疫器官(胸腺、脾脏)指数=试验猪活重(g)试验结果(1)不同天数植物血凝素对犬血液生化指标的影响见于(表13、14):植物血凝素对犬的各项血液生化指标均有不同程度的提高作用，高中剂量(0.8和0.4mg/kg.bw)效果尤为明显(P<0.05)，而且在试验所用剂量范围内，呈正相关性。(2)不同剂量的植物血凝素对犬的免疫器官指数(表15),免疫器官指数均不同程度的提高，高中剂量(0.8和0.4mg/kg.bw)与对照组相比，差异显著(P<0.05),两者存在量效依赖关系。以上实验高中剂量组剂量0.8mg/kg.bw和1.6mg/kg.bw剂量参照文献中在家兔、人、大鼠等的应用剂量换算而来(换算方法见参考文献张廷华，陈平，蒋中华，等。植物血凝素对家兔抗伤寒"0"抗原特异性免疫的影响[J]。华西医大学报，1987,18(2):122-12)。表5第4天血液生化指标<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注表格中数据以mean土SD表示，同列比较，肩标不同表示差异显著(p<0.05),肩标相同表示差异不显著(p>0.05)。下同》表6第10天血液生化指标<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表7<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表8免疫后10d时各组抗体滴度比较处理抗体滴度(log2)低剂量组5.61±0.29^中剂量组6.19±0.18B高剂量组6.30±0.26B对照组5.24±0.18A表9第4天血液生化指标<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表ll免疫器官指数处<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表12免疫后10d时各组抗体滴度比较处理_抗体滴度(log2)低剂量组5.36±0.63ab中剂量组5.57±1.09a高剂量组5.71±1.07a对照组5.14±0.66b表13第4天血液生化指标<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表14第10天血液生化指标<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2.19±0.14b9权利要求1、植物血凝素在提高动物免疫力方面的应用，包括用植物血凝素提高动物的细胞免疫和体液免疫。2、根据权利要求1所述植物血凝素在提高动物免疫力方面的应用，其特征在于，采用植物血凝素冻干粉制剂，使用剂量为2.49.6mg/kg.bw，即每公斤动物一次使用2.49.6mg植物血凝素冻干粉制剂，每日1次，连用3天。3、根据权利要求1或2所述植物血凝素在提高动物免疫力方面的应用，其特征在于，植物血凝素冻干粉制剂采用注射给药方式。全文摘要本发明涉及植物血球凝集素在动物中提高免疫力的应用，属于兽用药品领域。包括采用植物血凝素冻干粉制剂，使用剂量2.4～9.6mg/kg.b.w，每日1次，连用3天。使用本发明可以提高鸡、猪、犬的免疫功能，而且疗效显著、无明显毒副作用。通过植物血凝素对鸡、猪、犬的血液生化指标影响试验、淋巴细胞转化率试验、免疫器官指数影响试验、对抗体滴度影响试验，证明了植物血凝素可以用于提高动物的免疫力。本发明为我国目前广泛用作的淋巴细胞转化的试剂——植物血凝素提供了新的应用范围，用植物血凝素注射给药，提高动物的免疫力，防止动物疾病，为养殖业提供优良的免疫增强剂，为我国养殖业提供了优良的提高免疫的药品。文档编号A61K38/16GK101164614SQ20071013331公开日2008年4月23日申请日期2007年10月17日优先权日2007年10月17日发明者万荣峰,余祖功,张军忍,张立波,江善祥,王丽平,王清运,胡大坤,菲莫,许巧丽,高国锋申请人:南京农业大学;南京仕必得生物技术有限公司