专利名称：由丹参、牡丹皮组成的双丹制剂防治骨质疏松症的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及由丹参、牡丹皮两药组成的中成药复方双丹制剂防治骨质疏松症的新用途。
背景技术：
骨质疏松症是一个世界范围的、越来越引起人们重视的健康问题。目前全世界约2亿人患有骨质疏松，其发病率已跃居常见病、多发病的第七位。估计患病总人数已超过2亿。骨质疏松是老年人最常见的疾病。在美国和西方国家中，在年龄超过55岁绝经后的女性中，有一半的人患程度不同的骨质疏松症，而在65岁以上的老年人中患骨质疏松者高达95％以上。随着科学的发展和人类的进步，人均寿命不断延长，老年人口迅速增加，骨质疏松的发病率也随着出现迅速的增加。预计至2050年全世界65岁以上的老年人将由目前3.23亿增加到15.55亿，届时骨质疏松导致髋骨骨折发生人数也将由目前的166万增加到626万，其中亚洲、拉丁美洲、中东和非洲国家的患者将占70％以上。根据官方统计，美国每年用于骨质疏松方面的直接和间接耗资达100亿美元；英国的健康与社会保险机构每年为骨质疏松提供的资金超过5亿英镑；法国仅支付平均每年3万股骨颈骨折的患者的住院费用约13.5亿法郎。骨质疏松所造成的如此巨大的社会和经济负担，构成了一个严重的全球性问题，已经引起世界各国的极大关注。老龄化社会的到来使骨质疏松的发生率日趋增高，严重威胁人们的生活质量。WHO已将2000-2010年确定为“骨关节病十年”。
我国是世界上人口最多的国家，其中老年人口占亚洲老年人口的1/2和世界人口的1/5。北京、上海和成都3市的骨质疏松流行病学调查结果显示，60-69岁年龄段骨质疏松的发生率女性与男性分别为60％和30％左右。我国人口基数大，骨质疏松患者已达6000万～8000万例，这给家庭和社会带来严重的负担[2]。另据统计2000年全国65岁以上的人有1.3亿，占全国人口的10.7％，已成为典型的老年型国家。而患有骨质疏松症的患者在这些人群中约占90％，而髋骨骨折的病人在1年内将有12％～40％死于各种合并症。在存活者中也有50％的人行动不便。这不但给病人造成了严重的身心摧残，同时也给家庭和社会增加了巨大的人力及财力负担。因此，防治骨质疏松是抗衰老，延长寿命，保证人民的生活质量的一个十分迫切的研究课题。
目前国内外防治骨质疏松症药物非常有限，常用的骨矿化促进剂，如钙剂、维生素D疗效有限；骨吸收抑制剂如雌激素、降钙素、二磷酸盐、异丙氧黄酮等虽有一定的作用，但不良反应也多，影响临床应用，骨形成促进剂如氟化物的疗效一直受争议，美国至今还没有上市[2-5]。在临床治疗方面，从雌激素替代疗法，至二磷酸盐类，降钙素等药物的防治已走过了几个重要的发展阶段，目前正转入对骨形态蛋白及白细胞介素等细胞因子的治疗研究，但是，至目前为止，这些用于防治骨质疏松的药物，均有不少副作用，有些疗效一般，有些价格昂贵，目前尚没有一种公认的理想药物，因此，寻找高效低毒防治骨质疏松的药物仍然是药理学工作者迫切的任务。
双丹制剂主要由丹参、牡丹皮组成，其中丹参具有活血化瘀、安神宁心之功效，现代医学研究证实丹参能扩张冠状动脉，改善心肌缺血，改善微循环.抗凝、抗血小板聚集，降低血脂、血压，减慢心率，增强心肌收缩力，对中枢神经系统有抑制作用。牡丹皮能清热、凉血、祛瘀，现代医学研究证实该药具有一定降压和中枢镇痛作用。二者伍用，疗效互补，对冠心病具有良好活血化瘀、理气止痛、镇静之功效，对中枢神经系统的抑制作用是治疗心绞痛产生速效的原因。有研究证明由丹参、牡丹皮组成的双丹口服液能缓解心绞痛，能明显提高患者体力和精神状态；尚有一定降压、减慢心率的作用，能明显降低心肌耗氧量，对劳力型心绞痛和慢性冠状动脉供血不足有明显的改善作用，而对不稳定型心绞痛和陈旧性心肌梗死的改善作用较差。对其防治骨质疏松作用没有研究。本课题组研究发现该由丹参、牡丹皮组成的制剂对环磷酰胺等药物造成的骨质疏松也有具有较好的预防及治疗作用。对绝经期后骨质疏松和老年性骨质疏松具有较好的预防及治疗作用，对肾上腺糖皮质激素导致的骨质疏松也有良好的预防作用。
发明内容
用于防治骨质疏松的双丹制剂是通过下述工艺制备的，取丹参、牡丹皮两味中药，分别按下述工艺制备成可供临床应用的制剂，供临床和实验应用双丹口服液的制备工艺取丹参600g，牡丹皮300g，牡丹皮蒸馏，收集蒸馏液。药渣和丹参加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15的清膏，加乙醇使含醇量达60％，冷藏24小时，滤过，滤液回收乙醇至相对密度1.15的清膏，加入牡丹皮蒸馏液，最后将提取液浓缩至每100ml含生药191.7g，密封消毒，4℃冰箱保存备用。
本项目双丹制剂还可取丹参、牡丹皮两药，分别按上述工艺制备成可制成片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂，口服液，外用制剂，注射剂和任何可供临床应用的的药物制剂。供临床和实验应用。
双丹制剂，用本研究室建立成骨细胞体外培养法，小白鼠骨质疏松模型及大白鼠骨质疏松模型分别进行研究，证明了这些中药有促进骨形成的作用，对小白鼠骨质疏松动物模型及大白鼠骨质疏松动物模型也有较好的预防与治疗作用。
具体实施例方式为观察双丹制剂的抗骨质疏松作用，我们选择环磷酰胺做为工具药，建立大鼠骨质疏松模型，并同时给予双丹水提液，观察它对环磷酰胺致大鼠骨质疏松是否有防治作用。现报道如下1材料与方法1.1药品与仪器1.1.1药品 丹参、牡丹皮等中药材购自本地药房，产地为四川。环磷酰胺江苏恒瑞医药股份有限公司，批号403501。
1.1.2实验仪器 AE240电子天平(梅特勒-托利多仪器公司上海分公司生产)，XSZ-0800生物显微镜(广西梧州市光学仪器厂)，低速锯(Buehler LTD USA)，Leica组织切片机(德国)，LEICA QWN半自动图象分析仪(德国莱卡).
1.2实验方法1.2.1实验药物制备双丹提取液的制备工艺取丹参600g，牡丹皮300g，牡丹皮蒸馏，收集蒸馏液。药渣和丹参加水煎煮二次，第一次2小时，第二次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.15的清膏，加乙醇使含醇量达60％，冷藏24小时，滤过，滤液回收乙醇至相对密度1.15的清膏，加入牡丹皮蒸馏液，最后将提取液浓缩至每100ml含生药191.7g，密封消毒，4℃冰箱保存备用。
1.2.2实验动物与分组3月龄大鼠30只，雌雄各半，体重(208±28)g，由广东医学院实验动物中心提供，SPF级，动物合格证号2005A023。按体重对等原则随即分成3组，每组10只。正常对照组灌胃给予5ml·kg-1·d-1生理盐水。环磷酰胺组灌胃给予环磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1。双丹提取液组环磷酰胺4.5mg·kg-1·d-1及双丹提取液5ml·kg-1·d-1。3组动物均自由饮水和进食标准饲料。实验共给药15天，实验结束时，取左侧胫骨进行骨组织形态计量学测量。取股骨和腰椎骨进行生物力学检测及骨有机质和矿物含量检测。
1.2.3骨组织形态计量学测量 大鼠在处死前11、10d和4、3d分别给予四环素(30mg·kg-1)和calcein(8mg·kg-1)标记各2次，以在骨组织形成双荧光标记。大鼠给药15d后测定体重，处死并取左侧胫骨，除尽肌肉与组织，用低速锯将其分为2段，取上段曝露骨髓腔，固定于10％PBS福尔马林液24h，按硬组织切片法用甲基丙烯酸甲酯包埋不脱钙骨，切取两张4μm薄片及一张9μm厚片，薄片分别进行Masson-Coldner染色和AgNO3染色后封片，厚骨片则直接封片，厚、薄片皆在距骺线1mm处至远端3mm范围内进行松质骨的骨形态计量学参数测量。骨组织形态计量学静态参数包括骨小梁面积百分数(％Tb.Ar)，骨小梁厚度(Tb.Th)，骨小梁数量(Tb.N)，骨小粱分离度(Tb.SP)，动态参数包括荧光标志周长百分数(％L.Pm)，矿化沉积率(MAR)，骨小粱周长形成率(BFR/BS)，骨小粱面积形成率(BFR/BV)，骨小粱体积形成率(BFR/TV)，每毫米破骨细胞数量(Oc.N/mm)，破骨细胞贴壁长度(Oc.S.Pm)。
1.2.3骨生物力学检测 检测时，将-20℃保存的股骨和腰椎常温解冻，生理盐水复湿。用858Mini Bionix型材料测试系统监测和分析大鼠第五腰椎和右侧股骨的生物力学性能。将右侧股骨和去除软组织和脊突、关节突的第五腰椎置于流变仪上分别进行三点弯曲和压缩实验，加载速度为0.01mm/s，跨距为15mm。记录载荷-变形曲线，从曲线上计算最大载荷、最大桡度、刚性系数等。
1.2.4骨有机质和矿物含量检测 将生物力学检测后的骨材料80℃烘干至恒重，用AE240电子天平称重；然后，每份骨样本加6mol/LHCl在108℃温度下消化16h后，把消化液分成两份。一份稀释后用ICP测定骨Ca、P、微量元素的含量，与骨干重进行比较，用骨矿物元素量(mg)/骨干重(g)的比值来作为骨矿物质含量的指标，骨骨矿物元素量/骨干重的比值越大，说明骨矿物质在骨中所占的比例越大。另一份消化液过滤后调pH值至6，然后，经典法测定羟脯氨酸吸光度，在标准曲线中读出其含量。由于骨有机质中骨胶原占90％以上；骨胶原中羟脯氨酸含量比较稳定，约占12.5％。因此，根据骨羟脯氨酸的含量可推算出骨有机质的相对含量。即骨有机质＝骨羟脯氨酸/12.5％/90％。用骨有机质/骨干重的比值作为骨有机质含量的指标。其比值越大，说明骨有机质含量越高。
1.2.5数据处理 参数值用(X±S)表示，用SPSS11.0进行统计分析。用变化率表示各实验组大鼠相对参数的变化〔如变化率A＝(待比较组/A组-1)×100％〕。
2.结果2.1双丹提取液对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态学的影响正常对照组动物骨小梁呈现结构紧密、粗细均匀、连续性好；环磷酰胺模型组动物骨小梁结构明显稀疏，细小，个别呈结节或钮扣状，出现大片无骨小梁骨髓区；双丹防治组动物的骨小梁结构紧密，连续性好，相对于模型组小梁骨明显增多增粗。
2.2双丹提取液对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响双丹提取液对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响见表1表1双丹提取液对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学静态参数的影响
注n＝10；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表1结果可见，环磷酰胺使大鼠胫骨上段松质骨小梁面积百分数、厚度和数量三个指标下降，骨小粱分离度上升，且差别均具有显著性；提示环磷酰胺致使大鼠骨量减少，骨微观结构退化。双丹预防组的上述四项指标均较环磷酰胺组呈反趋势改变，且差别有显著性；提示双丹预防组可有效对抗环磷酰胺所介导大鼠的骨质疏松，明显增加骨量，改善骨微观结构，与正常对照组大鼠相当。
2.3双丹提取液对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响双丹提取液对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响见表2表2 双丹提取液对环磷酰胺大鼠胫骨骨组织形态计量学动态参数的影响
注n＝10；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表2结果可见，环磷酰胺对大鼠胫骨上段松质骨表示骨形成的％L.Pm，MAR，BFR/BS，BFR/BV，BFR/TV五项指标均明显下降，且差别具有显著性；而表示骨吸收的0c.N/mm，Oc.S.Pm两项指标均有一定下降趋势，但差别无显著性；提示环磷酰胺可降低成骨细胞的数量与活性，抑制骨的形成、矿化，而对骨吸收没有明显影响。双丹预防组的五项骨形成指标较环磷酰胺组均明显上升，而骨吸收的两项指标较正常大鼠明显下降，且差别均有显著性；提示双丹提取液可提高成骨细胞活性，促进胶原矿化和刺激骨形成，有效对抗环磷酰胺的骨形成抑制作用，同时其破骨细胞数量和活性较正常大鼠受到一定抑制。
2.4双丹提取液对环磷酰胺大鼠股骨骨生物力学指标的影响双丹提取液对环磷酰胺大鼠股骨骨生物力学的影响见表3表3 双丹提取液对环磷酰胺大鼠股骨骨生物力学的影响
注n＝10；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表3可见，环磷酰胺使大鼠的股骨的最大载荷、断裂载荷及刚性系数三项生物力学指标均明显下降(P＜0.05)，且斜型断裂面明显多于正常和药物组大鼠。提示环磷酰胺可是大鼠股骨的生物力学性能明显减退，易粉碎断裂。而双丹预防组的上述三项指标较环磷酰胺组均明显上升，且差别均有统计意义。提示双丹提取液可有效对抗环磷酰胺对股骨生物力学的影响。
2.5双丹提取液对环磷酰胺大鼠股骨骨代谢生化指标的影响双丹提取液对环磷酰胺大鼠股骨骨矿含量的影响见表4表4双丹提取液对环磷酰胺大鼠股骨有机质和骨矿含量的影响
注n＝10；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表4可见，环磷酰胺使大鼠的股骨的骨有机质/骨干重以及钙、磷、镁三项骨矿物指数均显著下降，且差别均有统计学意义(P＜0.05)。提示环磷酰胺可是大鼠股骨的骨有机质和骨矿物明显丢失。而双丹预防组的上述四项指标较环磷酰胺组均显著上升，且差别均有统计意义。提示双丹提取液可有效对抗环磷酰胺使股骨有机质和矿物质丢失的影响。
2.6双丹提取液对环磷酰胺大鼠腰椎骨生物力学的影响双丹提取液对环磷酰胺大鼠腰椎骨生物力学的影响见表5表5双丹提取液对环磷酰胺大鼠腰椎骨生物力学的影响
注n＝10；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表5可见，环磷酰胺使大鼠的腰椎的最大载荷和刚性系数两项生物力学指标明显下降，且差别均有显著性(P＜0.05)。提示环磷酰胺可导致大鼠腰椎的骨生物力学性能明显减退。而双丹预防组的上述两项指标均较环磷酰胺组虽有一定的上升，但差别均无统计意义(P＞0.05)。提示双丹提取液不能有效对抗环磷酰胺对大鼠腰椎骨生物力学的影响。
2.7双丹提取液对环磷酰胺大鼠腰椎骨有机质和骨矿含量的影响双丹提取液对环磷酰胺大鼠腰椎骨有机质和骨矿含量的影响见表6表6双丹提取液对环磷酰胺大鼠腰椎骨有机质和骨矿含量的影响
注n＝10；A、B为变化率A是与对照组比较，B是与环磷酰胺模型组比较；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001由表6可见，环磷酰胺使大鼠的腰椎的钙、磷、镁三项骨矿物指数明显降低(P＜0.05)；而骨有机质/骨干重无明显改变。提示环磷酰胺可导致大鼠腰椎的骨矿物丢失，骨有机质不改变的矿化障碍表征。而双丹预防组的上述三项矿物指数均较环磷酰胺组明显增加，且差别均有统计意义。提示双丹提取液可有效对抗环磷酰胺使腰椎矿物质丢失的影响。
3.5结论环磷酰胺临床应用广泛，副作用多，对骨质疏松没有受到应有的重视，本研究观察到环磷酰胺可通过抑制骨形成而诱导骨丢失。因此，及时寻找有效药物进行预防非常重要。
双丹提取液可激活成骨细胞活性，促进胶原矿化和刺激骨形成等作用，有效地对抗了环磷酰胺所导致的大鼠骨丢失。双丹提取液还可以预防环磷酰胺致大鼠的骨矿物质丢失，对其骨生物力学性能下降的拮抗作用股骨优于腰椎。环磷酰胺致大鼠骨质疏松主要通过抑制骨形成的作用，该模型的特点是骨矿物的丢失，骨质变得薄而易碎，锥体易压缩变形，骨折风险率显著增高，对骨的病理改变类似于老年性骨质疏松的特点。双丹提取液可有效地对抗了环磷酰胺对大鼠股骨的这些作用，而对腰椎骨未能表现出良好地预防作用。提示双丹提取液可能成为临床抗骨质疏松的骨形成促进剂和用于治疗老年性骨质疏松的有效药物，但其对于不同部位骨骼的影响机制以及使用的最佳剂量还有待进一步研究。
由丹参、牡丹皮两药组成的双丹制剂，还可取分别按已公开的其他中药制备方法，制备成片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂，口服液，外用制剂，注射剂和任何可供临床应用的的药物制剂，供临床和实验应用。
权利要求
1.由丹参、牡丹皮两药组成的双丹制剂在制备防治骨质疏松症药物的用途。
2.如权利要求1所述的丹参、牡丹皮两药组成的双丹制剂，可制成片剂，胶囊剂，颗粒剂，冲剂，口服液，外用制剂，注射剂和任何可供临床应用的的药物制剂。
全文摘要
本发明公开了由丹参和牡丹皮两味中药组成的双丹制剂防治骨质疏松症的新用途，该复方制剂对绝经期后骨质疏松和老年性骨质疏松具有较好的预防及治疗作用，对肾上腺糖皮质激素，环磷酰胺等药物造成的骨质疏松也有具有较好的预防及治疗作用。本复方制剂，可制成临床可接受的丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂、皮肤外用制剂中的任何一种。
文档编号A61K9/20GK101032556SQ200710135668
公开日2007年9月12日 申请日期2007年3月12日 优先权日2007年3月12日
发明者吴铁, 崔燎, 于琼, 林坚涛, 陈志东 申请人:广东医学院