专利名称：：B7-1、cd40l质粒混合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肿瘤免疫
技术领域：
，具体地说，是一种由质粒B7-l和质粒CD40L联合组成的质粒混合物。
背景技术：
：目前，肿瘤免疫治疗是近年来淋巴瘤治疗的一个重要方向，肿瘤免疫治疗主要包括四方面①免疫基因治疗②肿瘤细胞疫苗③基于抗体的免疫治疗④重组细胞因子的联合治疗。目前临床试验应用较多的为细胞疫苗治疗，即通过对肿瘤细胞的体外修饰、培养将其制作为瘤苗回输患者体内，但是因为体外修饰及培养需要条件较高，存在易污染等原因，临床推广应用受到一定限制，而免疫基因治疗因其简单易行，越来越多的研究针对此方法进行。免疫基因治疗即体外重组基因，通过重组病毒、脂质体、基因枪等将其直接导入体内的肿瘤组织中进行表达，本质是原位诱导抗肿瘤免疫。用来携带目的基因的载体有病毒载体和非病毒载体。病毒载体有引起潜在感染或导致基因突变的危险，且在体内仅有少量进入肿瘤细胞，免疫效果较差。非病毒载体特别是质粒载体的应用则非常广泛。以质粒为载体的免疫基因治疗主要通过质粒肌肉注射、质粒瘤内注射、基因枪轰击技术实现。质粒经肌肉注射后，可直接被肌肉细胞摄取，也可被肌肉组织中的专职抗原提呈细胞摄取，通过抗原的加工、递呈而激活细胞免疫和体液免疫。质粒直接瘤内注射，可使肿瘤细胞表达导入的基因序列编码的蛋白分子。基因枪轰击技术将目的基因包裹在金颗粒上，使金颗粒以很高的速度轰击靶细胞，从而将外源基因转入细胞。共刺激途径作为第二信号通路的重要作用使其成为肿瘤基因治疗新的有效介入点。多基因联合治疗是目前基因治疗领域研究的热点:也是未来基因治疗的模式。目前对B7-1介导的免疫治疗研究集中在与GM-CSF、IL-2、IL-12等细胞因子联合治疗中，国内外尚未见B7-l和CD40L混合质粒施用于小鼠瘤内的相关报道。
发明内容本发明克服了上述缺点，提出了一种用于治疗肿瘤的B7-l、CD40L质粒混合物。本发明解决其技术问题所采取的技术方案是一种B7-l、CD40L质粒混合物，按体积百分比计，B7-l占4060%，CD40L占6040%。上述的混合物中，优选B7-l和CD40L各占总体积的50%这一比发明人发现了上述的B7-l、CD40L质粒混合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。当肿瘤的直径大于或等于0.8cm时，效果尤其明显。本发明的B7-l、CD40L质粒混合物尤其适用于制备治疗淋巴瘤药物。当淋巴瘤的直径大于或等于0.8cm，效果尤其明显。B7-l是目前共刺激分子中研究最深入、应用最成熟的分子。B7-1是CD28和CTLA-4的配体，表达于多种抗原提呈细胞表面。通过与T淋巴细胞表面的CD28和CTLA—4分子结合而上调机体的免疫应答，并可通过打破肿瘤免疫耐受，诱导T细胞活化，协助T淋巴细胞发挥抗肿瘤作用。CD40L可上调B7-l分子的表达，增加IL-12的分泌。同时它们各自都可以激活T细胞的免疫应答，打破肿瘤的免疫耐受状态。故两者的混合物在淋巴瘤免疫基因治疗中具有广阔的前景。本发明的优点在于本发明使用时质粒瘤内注射，使用方法简单，干扰因素少，适合大规模推广。特别适用于尺寸直径大于或等于0.8cm肿瘤特别是淋巴瘤。具体实施例方式(1)材料动物雄性BALB/c小鼠，6—8周龄。细胞株淋巴瘤细胞株A20源自BALB/c小鼠。37T培养于含10%胎牛血清的1640培养基中。质粒与菌株小鼠B7-1全长质粒，质粒载体为pCDM8，扩增菌株为P3E.coli，小鼠CD40L全长质粒，质粒载体为pCDNA3.1，扩增菌株为DH5aE.coli。RPM1640培养液由RPMI1640粉配制，美国Gibco公司出品。胎牛血清(FBS):天津产，-2(TC保存。(2)方法质粒DNA的扩增、提纯和鉴定E.coli菌扩增质粒并用QingenPlasmidMaxi试剂盒提取及纯化质粒，具体步骤见试剂盒说明。紫外分光光度计测质粒DNA浓度取2ul质粒稀释100倍，测OD值估计DNA浓度。质粒DNA保存于-80。C。质粒mB7-l用XhoI限制性内切酶切鉴定，质粒mCD40L用EcoRI限制性内切酶和NheI限制性内切酶切鉴定。构建荷瘤小鼠模型取对数生长的2*106八20细胞在BALB/c小鼠右侧背部皮下注射，构建荷瘤小鼠模型。(3)B7-l和CD40L表达载体用于治疗淋巴瘤的实验如下。3丄实施例1和对比例14用于小肿瘤小肿瘤组待小鼠肿瘤长至直径3-4mm，按如下方式随机分组，每组取三只进行瘤内注射，7天后以同样剂量第二次注射，每2天测一次肿瘤生长情况。肿瘤大小按公式a*b2/2计算，(a为肿瘤最大直径，b为与它垂直的直径)。第二次注射后5天取小鼠脾作CTL杀伤实验。对比例1(空白对照)每只注射PBS100ul。对比例2(空质粒对照)以PBS调空质粒浓度为1ug/ul，每只注射100ul。对比例3、B7-l(质粒单独注射)以PBS调质粒浓度为1ug/ul，每只注射100ul。对比例4、CD40L质粒(单独注射)以PBS调质粒浓度为1ug/ul，每只注射100ul。实施例1(B7-l、CD40L质粒混合物)以PBS调质粒浓度为1ug/ul，质粒混合物由50ulB7-l质粒和50ulCD40L质粒组成。将该混合物注射入小鼠体内。3.2.实施例1和对比例14用于大肿瘤大肿瘤组待小鼠肿瘤长到直径7-8mm时，同样按小肿瘤组方式随机分组，每组取三只进行瘤内注射，7天后以同样剂量第二次注射，第二次注射后4天取小鼠脾作CTL杀伤实验，并取瘤组织制作病理切片进行形态学观察。对比例l(空白对照)每只注射PBS100ul。对比例2(空质粒对照)以PBS调空质粒浓度为1ug/ul，每只注射100ul。对比例3、B7-l(质粒单独注射)以PBS调质粒浓度为1ug/ul，每只注射100ul。对比例4、CD40L质粒(单独注射)以PBS调质粒浓度为1ug/ul，每只注射100ul。实施例1(B7-l、CD40L质粒混合物)以PBS调质粒浓度为1ug/ul，质粒混合物由50ulB7-l质粒和50ulCD40L质粒组成。将该混合物注射入小鼠体内。(4)结论1、对于直径0.3cm以内的小肿瘤，单独作用B7-1、CD40L基因可以使其减小，实施例1在13天内肿瘤完全消失，而PBS和空质粒对照组肿瘤生长迅速，13天内直径达10cm。统计分析显示，对于小肿瘤，对比例3、对比例4与实施例1均有明显抑瘤作用，但实施例1并无显著的进步。表1小肿瘤组体积(mm3)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、对于直径0.8cm的肿瘤，实施例1在13天内肿瘤基本消退，瘤体直径达3cm以下。对比例3和对比例4肿瘤生长得到抑制，对照组肿瘤生长迅速。统计分析显示，实施例1效果优于对比例3和对比例4。表2大肿瘤组体积(mm3)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>。表3小肿瘤脾CTL杀伤率<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以上对本发明所提供的B7-l、CD40L质粒混合物进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。权利要求1.一种B7-1、CD40L质粒混合物，其特征在于按体积百分比计，B7-1占40～60％，CD40L占60～40％。2.根据权利要求1所述的B7-1、CD40L质粒混合物，其特征在于所述的B7-l和CD40L各占总体积的50y。。3.权利要求1或2所述的B7-l、CD40L质粒混合物在制备治疗肿瘤药物中的用途。4.权利要求3所述的B7-1、CD40L质粒混合物在制备治疗肿瘤药物中的用途，其特征在于所述的肿瘤的直径大于或等于0.8cm。5.权利要求1或2所述的B7-1、CD40L质粒混合物在制备治疗淋巴瘤药物中的用途。6.权利要求5所述的B7-1、CD40L质粒混合物在制备治疗淋巴瘤药物中的用途，其特征在于所述的淋巴瘤的直径大于或等于0.8cm。全文摘要本发明公开了一种B7-1、CD40L质粒混合物。该混合物按体积百分比计，B7-1占40～60％，CD40L占60～40％。该混合物对抑制和消除直径大于或等于0.8cm的大肿瘤特别是淋巴瘤，效果特别显著。本发明使用时质粒瘤内注射，使用方法简单，干扰因素少，适合大规模推广。文档编号A61K48/00GK101199862SQ200710179849公开日2008年6月18日申请日期2007年12月19日优先权日2007年12月19日发明者克晓燕,晶王,赵灵芝申请人:北京大学第三医院