专利名称：：含有带正电荷部分的聚合物的缀合物的制作方法合物相关申请的交叉引用本申请要求以下美国临时专利申请序列号的优先权2006年9月15日提交的60/844,944，2006年9月15日提交的60/844,945，2006年11月27日提交的60/861,349,2006年11月27日提交的60/861,350，2007年4月13曰提交的60/911,734和2007年8月20日提交的60/956,814，上述每一个的内容在此引入作为参考。
背景技术：
：过去，已确定在递送生物活性部分(如蛋白质、肽等)中使用时增加聚合物或包含其的缀合物(conjugates)的正电荷是有益的。例如，共同转让的美国专利号5,730,990描述了PEG和相关的聚环氧烷(polyalkyleneoxide),在其上连接有单一的仲胺或叔胺基团。这种组合的目的是使胺衍生的聚合物向缀合物传递pi和/或pH调节作用。因此，缀合物中包含的生物活性物质的等电点可被调节为所需的点。前述'990专利提供了一种溶液以抵抗在常规活化的聚合物(其中观察到等电点的移动)中观察到的作用，通常针对对最佳活性的危害。在这几年中，一些基于寡核苷酸的治疗法受益于一些进展，例如RNA干扰和微RNA的发现和发展，以及在组成设计(compositionaldesign)的改进，如锁核酸(lockednucleicacid)(LNA)结构骨架的使用。在最近几年内短干扰RNA(siRNA)已经从研究工具演变为临床试验中的治疗剂。然而，体内递送仍然是完全实现寡核苷酸-基治疗法的治疗潜能的主要障碍。目前，直接区室内(intra-compartmental)注射和连续输注仍然是给药的主要途径。结果，药物递送技术的改进已在用于治疗目的的寡核苷酸领域寻找。由于寡核苷酸骨架高度带负电荷，其经常难以穿过细胞膜并显示它们的生物活性。该负电荷防止寡核苷酸接近带负电荷的细胞膜从而减少内吞作用。在过去，将寡核苷酸与带正电荷的肽、阳离子脂质或阳离子聚合物连接或与它们复合以解决该问题。该结果不能完全令人满意。因此，需要进一步的改进。本发明解决了这个需求以及其它问题。发明概述为克服上述问题并改进药物递送技术，提供包含带正电荷的骨架(backbone)的新的聚合物递送体系。在本发明一个方面，提供式(I)的化合物{Z2}b—R，——其中每个ZJ虫立地为-(L"A——(B"c(Ll)d—(L"2)e..—(R'2)g.—(L2)e—R4每个Z2是独立选择的封端基团，-(L"、)i.一(B、)c.^j(L'^——(LA.—(R3)f—(R2)g—(R'3)f.j——(L"'、)i"一(B'、)c,.R,是基本上非抗原性的聚合物；R2和R，2是独立选择的含正电荷的肽或含氮的环烃部分；R3和R，3是独立选择的靶向剂；R4为生物活性部分；B!、B，,和B，、是独立选择的支链基团；L,、LVL"、Lr"和Lr"，是独立选择的双官能连接基(biflmctionallinker);L2、L，2和L"2是独立选择的可释放的(releaseable)连接基；(a)为正整数，优选从1至约31，更优选约3至约8，且最优选为1;(b)为零或正整数，优选约0至约31，更优选约3至约7;(c)、(c，)和(c")独立地为零或正整数，优选0、1、2或3，且更优选0或1;(d)、(d，)、(i)、(i，)和(i")独立地为零或正整数，优选0、1、2或3,且更优选零或1;(e)为正整^:，优选l、2或3,且更优选l或2;(e，)和(e")独立地为零或正整数，优选0、1、2或3,且更优选0、l或2:(f)和(f，)独立地为零或正整数，优选O、l或2，且更优选0或1;(g)为正整数，优选约1至约5，且更优选1或2;(g，)为零或正整数，优选0或约1至约5的整数，且更优选0、1或2;和(h)和(h，)是独立选择的正整数，优选约1至约8，更优选1、2、3或4，且最优选为1或2;条件是当(b)不为零且所有Z2为封端基团、—^'"""B"i^或其组合时，(g，)为正整数。在所述聚合物的一个优选方面，(a)和(b)的和等于约1至约32。在一些优选实施方案中，所述聚合的化合物可包括4臂、8臂、16臂和32臂聚合物，其将在以下描述和解释。更优选，可使用在聚合物臂的每个末端具有支链部分的四臂的聚合物。含四臂和在其上的支链部分的聚合物可具有高达8个功能位点以负载带正电荷部分(moieties)和/或生物活性部分。在另一优选实施方案中，本文所述的多臂聚合物包含一个连接至生物活性部分的聚合物末端，并且该聚合物的其它各末端连接至含正电荷的部分。在另一方面，例如，本文所述的聚合物包含带正电荷的肽和基于哌。秦的部分。所述含正电荷的部分能将另外的正电荷给予基本上非抗原性的聚合物。在另一方面，所述带正电荷的肽可帮助聚合物穿透细胞膜。该优选的带正电荷的肽可为穿透细胞膜的肽(CPPs)，例如TAT。在本发明另一方面，提供含带正电荷的骨架的聚合物的缀合物(polymericconjugate)以中和带负电荷的生物活性的分子并改善生物活性部分的细胞摄取，该生物活性部分如寡核苦酸、锁核酸(LNA)、短干扰RNA(siRNA)、适体、核酶、诱捕性DNA(DNAdecoy)等。在本发明另一方面，所述生物活性部分通过可释放的连接基连接至本文所述化合物的聚合部分。所述可释放的连接基可为基于千基消除的连接基(benzylelimination-basedlinker)、基于三》克基锁定的连4妄基(trialkyllock-basedlinker)、基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的连接基(bicine-basedlinker)、二硫键、含腙的连接基和含巯基丙酸的(thiopropionate-containing)连接基。或者，所述可释放的连接基为细胞内不稳定的连接基、细胞外连接基和酸不稳定的连接基.在本发明另一方面，所述带正电荷部分和靶向剂可通过单独的固定(permanent)连接基和可释放连接基或其组合连接至本文所述化合物的聚合部分。优选地，所述带正电荷的肽和靶向剂通过固定的连接基连接。耙向剂如RGD肽、叶酸、单链抗体(SCA)等可连接至本文所述的聚合物以引导所述缀合物至体内感兴趣的组织。该设计提供了用于在体内把向递送带负电荷的分子如寡核苷酸的新的方法，并增强这些分子的细胞摄取以具有更好的治疗效果。在本发明一些优选的方面，所述带正电荷的肽还可为对靶向的、受影响区域(如NGR,TNFa和TAT)特异的治疗肽。普通技术人员可使用各种含正电荷能特异递送于靶向的区域的治疗肽。在其它方面，所述细胞穿透肽(cellpenetratingpeptides)可被多种带正电荷的靶向肽(targetingpeptide)之一如TAT、RGD-TAT和NGR所替代，例如用于靶向递送至肿瘤位点。当具有带正电荷的骨架的PEG连接基与带负电荷的治疗分子如寡核苷酸结合时，寡核苷酸的负电荷可被中和且该缀合物的净电荷可为正的。当使用多臂PEG时，PEG缀合物的总形状可为球状的。由于PEG在水性溶液中高度水合的性质，该具有带正电荷的骨架的多臂PEG缀合物表现为球状的"微型-纳米颗粒(mini-nanoparticles)"，并且在中心包埋有寡核苷酸。能中和带负电荷的寡核苷酸的带正电荷部分可减少毒性且还促进其穿透细胞膜从而改进寡核苷酸的递送。因此，高度带负电荷的寡核苷酸可在体内递送而几乎没有毒性。本发明的聚合物缀合物的一个优点为通过将高度带正电荷的肽和细胞穿透肽如TAT连接而改进细胞摄取。而且，技术人员可通过连接耙向肽、适体和叶酸盐等而实现靶向功能。另一优点为带负电荷的分子从前体药物的释放速率/位点可进行调整(modified)。连接至本文所述的聚合物的药物可以以调整的速率释放，从而使技术人员得到所需的治疗肽和寡核苷酸的生物利用度。带负电荷的治疗剂的释放位点也可被调整，即在不同的细胞区域释放。因此，本文所述的聚合物递送体系可使足够量的带负电荷的治疗剂在所需的靶区域(即巨胞饮体(macropinosome)和核内体(endosome))选择性获得。该治疗剂释i文的单独的时间和空间上的修饰和其组合对治疗疾病是有利的。该具有正电荷骨架的聚合物在緩冲液条件下是稳定的，且寡核苷酸或其它治疗剂不会从主体过早释放。本发明另一优点为本文所述的缀合物在不存在转染试剂的情况下明显改进的细胞摄取和下调癌细胞中特异的mRNA。该技术可用于寡核普酸药物的体内给药。例如，在没有转染试剂的情况下，人肺癌细胞对本文所述的PEG-寡核苷酸(包括反义Bcl2寡核苦酸、Bcl2siRNA或反义存活蛋白(antisurvivin)LNA)的细胞摄取大于天然的反义Bcl2寡核苷酸或Bcl2si脂A的细胞摄取。而且，与由转染试剂辅助的细胞摄取相比，本文所述的缀合物在不存在转染试剂的情况下提供更高的细胞摄取。其它和进一步的优点根据以下描述将会明显的。出于本发明的目的，术语"残基"应理解为化合物(即PEG、寡核香酸等)的部分，指在该化合物与其它化合物进行取代反应后保留的部分。出于本发明的目的，术语"聚合物残基"或"PEG残基"每个应理解为聚合物或PEG的部分，在该聚合物或PEG与其它化合物、部分等反应后保留的部分。出于本发明的目的，术语"烷基"应理解为包括直链、支链、取代的例如，卣素-、烷氧基-、硝基-取代的Cw2烷基但优选d4烷基、<:3.8环烷基或取代的环烷基等。出于本发明的目的，术语"取代的"应理解为包括用一个或多个不同原子加入或替代官能团或化合物中含有的一个或多个原子。出于本发明的目的，取代的烷基包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基和疏基烷基；取代的烯基包括羧基烯基、氨基烯基、二烯基氨基、羟基烯基和疏基烯基；取代的炔基包括羧基炔基、氨基炔基、二炔基氨基、羟基炔基和疏基炔基；取代的环烷基包括如4-氯环已基的部分；芳基包括如萘基的部分；取代的芳基包括如3-溴苯基的部分；芳烷基包括如曱苯基的部分；杂烷基包括如乙基噻吩的部分；取代的杂烷基包括如3-曱氧基-遙吩的部分；烷氧基包括如曱氧基的部分；且苯氧基包括如3-硝基苯氧基的部分。卣素应理解为包括氟、氯、碘和溴。出于本发明的目的，除非另有所述，"核酸"、"核苷酸，，或"寡核苷酸"应理解为包括脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，可为单链或双链，以及其任何化学修饰物。出于本发明的目的，"正整数，，应理解为包括本领域技术人员所认为的合理范围内的整数。出于本发明的目的，术语"有效量"和"足够量"应理解为达到如本领域技术人员所理解的所需效果或治疗效果的量，。图1示例性阐述实施例1-3所述的合成方法。图2示例性阐述实施例4-13所述的合成方法。图3示例性阐述实施例14-20所述的合成方法。图4示例性阐述实施例21-26所述的合成方法。图5示例性阐述实施例27-31所述的合成方法。图6示例性阐述实施例32-34所述的合成方法。图7示例性阐述实施例35-38所述的合成方法。图8示例性阐述实施例39-41所述的合成方法。图9示例性阐述实施例42-49所述的合成方法。图10示例性阐述实施例50-53所述的合成方法。图11示例性阐述实施例54-58所述的合成方法。图12示例性阐述实施例59-62所述的合成方法。图13显示实施例63所述的荧光显微镜的图像。图14显示实施例63所述的共聚焦显微镜的图像。图15显示实施例64所述的细胞摄取。图16显示实施例65所述的细胞摄取。图17显示实施例66所述的Bcl2mRNA的下调。图18显示实施例67所述的存活蛋白(survivin)的下调。图19显示实施例68所述的存活蛋白的下调。图20显示实施例69所述的存活蛋白的下调。图21显示实施例70所述的存活蛋白的下调。图22显示实施例71所述的存活蛋白的下调。图23显示实施例72所述的存活蛋白的下调。图24显示实施例73所述的体内存活蛋白的下调发明详述A.概述在本发明一个方面，提供聚合式(I)的化合物:{Z2}b—R，——(Z山其中每个Z,独立地为-(L'、),——(B，)(L山一(L"2)e'.—(R'2)g.—(L2)e_R4h,每个Z2是独立选择的封端基团，-(L"、)i.一(B、)c.~~j(L、)d曙——(LA.—(R3)f—(R2)g-(R'3)fj-(L"",)i..一(B"丄..&是基本上非抗原性的聚合物；R2和R，2是独立选择的含正电荷的肽或含氮的环烃；R3和R，3是独立选择的靶向剂；Rt为生物活性部分；B,、B、和B，、是独立选择的支链基团；L"LVL广、Lr，，和Lr"，是独立选择的双官能连接基；L2、L，2和L"2是独立选择的可释放的连接基；(a)为正整数，优选从1至约31，更优选约3至约8，且最优选为1;(b)为零或正整数，优选约0至约31,更优选约3至约7;(c)、(c，)和(c")独立地为零或正整数，优选0、1、2或3,且更优选零或1;(d)、(d，)、(i)、(i，)和(i")独立地为零或正整数，优选0、1、2或3,且更优选零或1;(e)为正整数，优选1、2或3，且更优选1或2;(e，)和(e")独立地为零或正整数，优选0、1、2或3,且更优选0、l或2;(f)和(f，)独立地为零或正整数，优选0、1或2，且更优选0或1;(g)为正整数，优选约1至约5，且更优选1或2;(g，)为零或正整数，优选0或约1至约5的整数，且更优选0、1或2;23和(h)和(h，)是独立选择的正整数，优选约1至约8,更优选1、2、3或4,且最优选为1或2;条件是当(b)不为零且所有Z2为封端基团、一(8"丄'或其组合时，(g，)为正整数。出于本发明的目的，临近括号的重复单元(a)和(b)可表示连接至括号内所述基团的聚合物臂的总数，除了当使用U-PEG或(PEG)2-Lys类型的PEG，s作为本文所述的聚合物的部分时。(a)和(b)的和对于所用的U-PEG可为l或3,尽管存在两个聚合物臂。当(a)为1且(b)为0时，本文所述的聚合物可包括mPEG。mPEG的聚合物末端可与带正电荷的部分和生物活性物质两者均相连。当在本文所述的聚合物中使用bisPEG时，(a)和(b)的和为2，其中当(b)为1,Z2不为封端基团或——(L，i^B""c"。在本发明一个优选的方面，(a)和(b)的和等于1至32,因此该聚合物可优选包含高达32个聚合物臂，即l、2、3、4、8、16或32。在该实施方案中，所述聚合物可优选包括一至八个聚合物臂，其中(a)和(b)的和可为1至8。更优选，所述聚合部分包括四个聚合物臂，其中(a)和(b)的和为4。在另一优选的方面，本文所述的聚合物包含连接至生物活性部分的一个聚合物末端，且剩余聚合物末端的每一个连接至含正电荷的部分和耙向剂。或者，连接至带正电荷部分的聚合部分的聚合物臂比连接至生物活性部分的多。这种特征可给予足够的正电荷以中和生物活性部分(如寡核苷酸)的负电荷。出于本发明的目的，当在本文所述的化合物中存在支链基团时，从支链部分至各聚合物臂的远端处的任何部分以支化程度成倍增加，即，x2。(h)和(h)，表示根据支化形成的末端数。在一个实施方案中，当使用支链基团如天冬氨酸时，(h)和(h，)每个可为2。在另一实施方案包括一个或多个支链基团，(h)和(h)，可为2、3、4、6、8、12、16、18、32或更多。所述支链部分可包括至少三个官能团。当具有三个官能团的支链部分如天冬氨酸连接至聚合物臂的末端时，每个聚合物臂可提供数量为聚合物臂数至少两倍的功能位点。多重支链部分可包含在本文所述的化合物中。在另一实施方案中，当不使用支链基团时，(h)和(h，)可为1。在另一优选的实施方案中，四臂的聚合物可在聚合物臂的每个末端连接至支链部分。含四臂和在其上具有的支链部分如天冬氨酸的聚合物可具有8个功能位点以用于负载带正电荷部分和/或生物活性部分。所述封端基团可选自H、NH2、OH、C02H、d-6烷氧基和d-6烷基。优选地，当在本文所述的化合物中使用直链聚合物如mPEG时，所述封端基团可包括曱氧基。当(b)不为零且所有Z2部分为封端基团、——(L""0i"-(B"0c"或其组合时，(g，)至少为1，以使带正电荷部分和生物活性部分可施用在同一聚合物臂上。在本发明一个优选的方面，当(b)不为零，每个Z2包括所有聚合物末端可被活化并连接至带正电荷部分、耙向剂和/或生物活性部分，而不包括封端基团或一(L"'^-(B"丄'。因此该方面聚合物可包括bis-PEGs、U-PEG和多臂PEGs。在另一优选实施方案中，(a)为1。(a)和(b)的和可为1至31的正整数，优选1至7，且最优选为《四臂聚合物)。在另一优选的方面，(b)大于(a)，使得与生物活性部分相比更多的聚合物末端可具有带正电荷部分以充分中和生物活性部分如寡核苷酸的负电荷。出于本发明的目的，当双官能连接基、支链基团、可释放的连接基、含正电荷的部分和靶向剂的值为等于或大于2的正整数时，可施用相同或不同的部分。在一个含两个或更多个可释放的连接基的实施方案中，其中(e)等于或大于2，所述可释放的连接基可相同或不同。在一个具体的实施方案中，在本文所述的化合物中，基于千基消除的连接基相邻于含腙的连接基。在另一实施方案中，在相同聚合物末端可使用相同或不同的带正电荷的肽。在一个优选的实施方案中，本文所述化合物具有下式且因此本文所述化合物具有式(II):(CH2CH20)n——z(卿广(IIIC)(CH2CH20)n(OCH2CH2)n、0Z、(OCH2CH2)n、0'和Z-(OCH2CH2)n-0-(CH2CH20)n~~~~__;(CH2CH20)n-Z(nid)-(OCH2CH2)n'-(OCH2CH2)n(CH2CH20)n-Z(CH2CH20)n-ZZ-(OCH2CH2)n-00-(CH2CH20)n-Z(IIIe)其中(n)为约10至约2300的整数，其中聚合部分的总分子量为约2,000至约IOO，OOO道尔顿；每个Z为或Z2每个z，独立地为-(L'、)i——(B,)c(L山一(L"2)e"—(R'2)g.—(L2)e—R4每个Z2是独立选择的封端基团、-(L"、)i.一(B、)c,~~j(L、)d.——(LA.—(R3)f—(R2)g-(R'3)fj-(L"'、)i',一(B'、)c.,.，或L2、L，2和L"2独立地为可释放的连接基，其选自二硫基(disulfide)，含腙的连接基，含硫代丙酸的连接基，基于节基消除的连接基，基于三烷基锁定的连接基和基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的连接基，溶酶体可切割的肽和组织蛋白酶B可切割的肽；(c)、(c，)和(c")独立地为零或正整数，优选0、1、2或3，且更优ooylz26选O或1;(d)、(d，)、(i)、(i，)和(i，，)独立地为零或正整数，优选O、l或2;(e)为正整凄史，优选1或2;(e，)和(e")独立地为零或正整^:，优选O、l或2;(f)和(f")独立地为零或正整数，优选O、l或2;(g)为正整数，优选1或2,更优选1;(g，)为零或正整数，优选O、l或2;(h)和(h，)独立地为正整数，优选约1至约8，更优选1、2、3或4，且最优选为1或2;和所有其它变量如前所定义，条件是当所有Z2为封端基团、一(8"丄'或其组合时，(g，)为正整数。当该聚合物四个聚合物臂时，(n)可为4至约455。本领域技术人员可理解其它多臂聚合物的任选(n)值。优选地，所有Z2部分为-(L'"Oi.—(B、)c.~~j(L、)d.——(LA,—(R3)f—(R2)g-(R'3)f在本发明一个优选方面，所述多臂聚合物缀合物包含连接至生物活性部分的一个聚合物臂末端，且其它聚合物臂末端的每一个连接至含正电荷的基团。在本发明另一方面，所述多臂聚合物缀合物包含连接至生物活性部分的一个聚合物臂末端，且其它聚合物臂末端的每一个连接至含正电荷的基团和草巴向剂。B.基本上非抗原性的聚合物本文所述化合物中使用的聚合物优选为水溶性的聚合物且为基本上非抗原性的如聚环氧烷(polyalkyleneoxides)(PAO，s)。包括支链部分的活化的四臂聚合物如下式(IIIc，)所示在本发明一个方面，本文所述化合物包括直链的、末端支链的或多臂的聚环氧烷。在本发明一些优选的实施方案中，所述聚环氧烷包括聚乙二醇和聚丙二醇。该聚环氧烷的平均分子量为约2,000至约100,000道尔顿，优选约2,000至约60,000道尔顿。当连接有蛋白质或寡核苷酸时该聚环氧烷可更优选5，000至约25,000，优选约12,000至约20,000道尔顿，或当药物活性化合物(平均分子量小于1,500道尔顿的小分子)用于本文所述的化合物时为约20,000至约45,000道尔顿，优选约30,000至约40,000道尔顿。所述聚环氧烷包括聚乙二醇和聚丙二醇。更优选，所述聚环氧烷包括聚乙二醇(PEG)。PEG通常由以下结构所表示-0-(CH2CH20)n-其中(n)为约10至约2,300的整数，且当使用多臂聚合物时，(n)取决于聚合物臂的数量。或者，本发明的聚乙二醇(PEG)残基部分可由以下结构所表示-Y71-(CH2CH20)n-CH2CH2Y71-,-Y71-(CH2CH20)n-CH2C(=Y22)-Y71-，-Y71-C(=Y72)-(CH2)a2画Y73-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a2-C^Y72)-Y7广和-Y7广(CR"R72)a2-Y7r(CH2)b2-0-(CH2CH20)n-(CH2)b2-Y73-(CR71R72)a2-Y71-,其中Y7i和Y"独立地为O、S、SO、S02、NR"或化学键；Y"为O、S或NR74;R7W4独立地选自氢、C!-6烷基、C2-6烯基，(:2.6炔基、Cw9支链烷基、C3-8环烷基、d—6取代的烷基、(32.6取代的烯基、C2—6取代的炔基、C3—8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、c,—6杂烷基、取代的C,_6杂烷基、Cw烷氧基、芳氧基、d.6杂烷氧基、杂芳氧基、C2，6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2.6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；(a2)和(b2)独立地为零或正整数，优选零或约l至约6的整数，且更优选1;和(n)为约10至约2300的整数.支链的或U-PEG衍生物描述于美国专利5,643,575，5,919,455，6,113,906和6,566,506中，其每一个的公开在此引入作为参考。相应于聚合物体系(i)-(vii)的这些聚合物的非限制性实例具有以下结构o<formula>formulaseeoriginaldocumentpage29</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>(vi)，其中丫61.62独立地为O、S或NR^;丫63为O、NR^、S、SO或S02(w62)、(w63)和(w64)独立地为0或正整数，优选零或约1至约3的整数；(w61)为0或1;mPEG为曱氧基PEG其中PEG如上定义且聚合物部分的总分子量为约2,000至约100,000道尔顿；和R6,和R62独立地为与可用于R73的部分相同的部分。在另一方面，所述聚合物包括多臂PEG-OH或"星状-PEG"("star-PEG")产物，如描述于NOFCorp.Drugdeliverysystemcatalog,Ver.8,April2006中，其公开在此引入作为参考。所述多臂聚合物缀合物包含四个或更多个聚合物臂且优选四个或八个聚合物臂。为了解释而不是限制的目的，所述多臂聚乙二醇(PEG)残基可为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>其中(x)为零和正整数，即约0至约28;和(n)为聚合度。在本发明一个具体实施方案中，所述多臂PEG具有以下结构:w_「-n—/。u。un、uHC——0—(CH2CH2Q)nHICH2HC——O—(CH2CH20)nHCH2oCH2HC—O—(CH2CH20)nHH2C——O—(CH2CH20)nH其中(n)为正整数。在本发明一个优选实施方案中，所述聚合物的总分子量为约5,000Da至约60,000Da，且优选12,000Da至40,000Da。在另一具体实施方案中，所述多臂PEG具有以下结构或其中(n)为正整数。在本发明一个优选实施方案中，多臂聚合物的聚合度(n)为约28至约350以提供总分子量为约5,000Da至约60,000Da的聚合物，且优选为约65至约270以提供总分子量为12,000Da至45,000Da的聚合物。这代表聚合物链中重复单元的数量且取决于聚合物的分子量。该聚合物可转化为适当活化的聚合物，使用美国专利5,122,614或5,808,096中描述的活化技术。具体地，这种PEG可为下式31-0、CH2CHr(OCH2CH2)u.\'0、0、CH2Ch—0CH2CH2)u<。,(CH萍),、cH2CH2o、(CH2CH20)u.、■CH2CH2、Qit星状或-0、CH2CH2-(OCH2CH2)u.—Oh0、CH2CH2-(OCH2CH2)u,0一O一多臂0—(CH2CH20)u.-CH2CH2-OJ、(CH2CH20)u.—CH2CH2-CT^其中(u，)为约4至约455的整数；且该残基的高达3个末端部分被曱基或其它低级烷基封端。在一些优选实施方案中，所有四个PEG臂可转化为合适的活化基团，以促进与芳族基的连接。转化之前的这些化合物包括,(CH2CH20)u,.H3C(OCH2CH2)u.\aH3C、(OCH2CH2)u<O.0O、CH2CH2、OH、(CH2CH20)u,-H3C、(OCH2CH2)u,\■aH3C、(OCH2CH2)u<a(CH2CH20)u.、OLH2LH2、OH\(CH2CH20)u、chch22\qh"(OCH2CH2)u,、QHO、CH2CH2、(OCH2cH2)u,O.(CH2CH20)U、CH2CH2、O、(CH2CH20)u,.CH2CH2、HO--CH2CH2、(OCH2cH2)u,\■aHO、CH2CH2、(OCH2cH2)u,0.(CH2C、ch2ch2、'OHO、(CH2CH20)u..CH2CH2、、OHH3C-(OCH2CH2)u.—OH3C-(0CH2CH2)u.zO0—(CH2CH20)u.-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u._CH332H3C-(OCH2CH2)u,—0H3C-(OCH2CH2)u.,G0—(CH2CH20)u'-CH3(CH2CH20)u.—CH2CH2—OHH3C-(OCH2CH2)u,—0H3C-(OCH2CH2)u,0O—(CH2CH20)u.-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u,—CH2CH2—OHHO-CH2CH2-(OCH2CH2)u'—00—(CH2CH20)u,-CH2CH2_OH、(CH2CH20)u,—CH3H3C-(OCH2CH2)u.—0HO-CH2CH2-(OCH2CH2)ulz00—(CH2CH20)u'-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u'—CH3H3C-(OCH2CH2)u「0HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u'z00—(CH2CH20)u.-CH2CH2_OH、(CH2CH20)u'—CH2CH2—OHHO-CH2CH2-(OCH2CH2)u,—0H3C-(OCH2CH2)u'z0HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u,—0HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u'z0和0—(CH2CH20)u,-CH2CH2—OH、(CH2CH20)u.—CH2CH2—OH0—(CH2CH20)u,-CH2CH2—OH0\(CH2CH20)u._CH2CH2—OH本文包括的聚合物优选在室温为水溶性的。这些聚合物的非限制性实例包括聚环氧烷均聚物，如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylenatedpolyols)、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。在另一实施方案中，作为基于PAO的聚合物的替代物，可使用一种或多种有效地非抗原性物质，如葡聚糖、聚乙烯醇、基于碳水化物的聚合物、羟丙基曱基丙歸酰胺(HPMA)、聚环氧烷、和/或其共聚物。还参见共同转让(commonly-assigned)的美国专利6,153,655,其内容在此引入作为参考。本领域技术人员应理解采用与对在此所述的PAO's如PEG相同的活化类型。本领域技术人员将进一步认识到上述实例仅是解释性的，所有具有本文所述性质的聚合物质都在考虑范围内。出于本发明的目的，"基本上或有效地非抗原性的"是指本领域技术人员理解的所有物质，其为无毒的且在哺乳动物中不引发可观察到的免疫源应答。在一些方面，可使用具有末端氨基的聚合物以制备本文所述的化合物。以高纯度制备含末端胺的聚合物的方法描述于美国专利申请11/508,507和11/537,172,其每一个的内容在此引入作为参考。例如，具有叠氮基(azides)的聚合物与基于膦的还原剂如三苯基膦或碱金属硼氢化物还原剂如NaBH4反应。或者，包括离去基团的聚合物与保护的胺盐如曱基-叔丁基亚氨基二碳酸酯的钾盐(KNMeBoc)或二-叔丁基亚氨基二碳酸酯(di-tert-butylimidodicarbonate)的钾盐(KNBoc2)反应，然后M/f呆护该脱4呆护的胺基。由这些方法形成的含末端胺的聚合物的纯度大于约95%且优选大于99%。在其它方面，具有末端羧基的聚合物可在本文所述的聚合物递送体系中使用。以高纯度制备具有末端羧酸的聚合物的方法公开于美国专利申请11/328,662，其内容在此引入作为参考。该方法包括首先制备聚环氧烷的叔烷基酯，然后转化至其羧酸衍生物。制备PAO羧酸的方法的第一步骤包括形成中间体如聚环氧烷羧酸的叔丁基酯。该中间体通过PAO与卣代乙酸叔丁基酯在碱如叔丁醇钾的存在下反应而形成。一旦叔丁基酯中间体形成，该聚环氧烷的羧酸衍生物就容易以超过92%,优选超过97%,更优选超过99%且最优选超过99.5%的纯度而提供。的部分妙'比C.含正电荷的部分本文所述的聚合物可包含带正电荷的肽或含氮的环烃。所述含正电荷.--j》一、/卜AAZnJ丄'+"nnl、工rb;^々入工t'亡it士口t)t4二店，W"AA取入仏H匕^r力y「曰3(adclitiona"at^^5]"多兮丁1夏丞不上3(^^^乂眾'|"生白"豕6、《匆。该带正电荷的肽可帮助聚合物穿透细胞膜。细胞穿透肽(CPPs)包括带正电荷的氨基酸如精氨酸和赖氨酸。CPPs还促进本文所述的聚合物的靶向递送。34在本发明一个方面，可在本文所述的化合物中使用一个或多个肽。所述带正电荷的肽可在化合物中以多种不同组合使用。为了解释而不是限制的目的，提供任选的组合。在一个实施方案中，肽如两个TAT序列的多个单元可线性连接。TAT-TAT-C—S-T、丄PEC^TOw^^Q—寡核普酸oJy其中(w)为约1至约10的正整数，优选约3至约7;且(y)为约1至约7的整数。在另一实施方案中，两个或更多个肽的每一个可通过支链基团连接至各聚合物臂末端以增强细胞摄取。o、OO肽々IILys—CNH.-NH-(CH2:〇Q"寡核苷酸其中(w)为约1至约10的整数且(y)为约1至约7的整数。所述肽可包含约1至约50个带正电荷的氨基酸，优选约2至约20，且更优选3至10。在一个优选的实施方案中，所述带正电荷的肽包括细胞穿透肽(CPPs)如TAT、穿膜肽(penetratin)和(Arg)9。参见CwrQp/"尸/zarmaco/.2006Oct;6(5):509-14,"Cell-penetratingpeptideas.vectorsforpeptide,proteinandoligonucleotidedelivery",其内容在jt匕j入作为参考。在一方面，所述带正电荷的肽可包括天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。优选地，所述肽包括精氨酸、赖氨酸和相关类似物。所述肽可为氨基酸的随机序列或天然存在的细胞穿透肽的部分或它们的衍生物。出于本发明的目的，本文所述的聚合物涉及的肽在肽的末端或在肽中包含半胱氨酸以进一步结合或引入二硫键。本发明一个优选实施方案包括转录反式激活因子蛋白(trans-activatoroftranscriptionprotein)(TAT)的带正电荷的肽。出于本发明的目的，所述术语(trans-activatoroftranscriptionactivationprotein)的部分,例如,HS-CYGRKKRRQRRR-CONH2。C-TAT:CYGRKKRRQRRR(SEQIDNO:1)在另一优选实施方案中，所述带正电荷的肽可为聚精氨酸如(Arg)s或NH(Me)-Sar-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-CONH2("Sar-(Arg)5")。C-(Arg)9:CRRRRRRRRR(SEQIDNO:2)适合在此包含的其它肽基团对本领域技术人员将是明显的，条件是它们包含足够数量的带正电荷的基团。肽的长度还将根据技术人员的需要和所需的正电荷基团(由氨基酸提供)数量而改变。在一些优选实施方案中，所述肽中将包含约1至约50，优选约2至约20和更优选约3至约10个带正电荷的氨基酸。还参见Zhao，H.，等人祝ocwy'MgafeC/^w.，2005,16:758-766，其内容在此引入作为参考。当带正电荷的肽连接至靶向部分如SCA时，可插入连接基将SCA结合至带正电荷的肽。本领域技术人员已知的连接基也在本文所述的化合物考虑范围内。在另一方面，该含正电荷的部分包括含氮的环烃。该含氮的部分相应于下式其中(aa)为约2至约10的正整数，优选2或3,且更优选2;(bb)为1、2或3;(cc)为1或2;(dd)为约1至约5的正整数，优选1;11101独立地选自氢、d—6烷基、C2.6烯基,(:2.6炔基、Cw9支链烷基、C3-8环烷基、d—6取代的烷基、<:2.6取代的烯基、C2—6取代的炔基、C3—8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、d.6杂烷基、取代的C,-6杂烷基、d—6烷氧基、芳氧基、d—6杂烷氧基、杂芳氧基、C2—6烷酰基、芳基羰基、C2—6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2.6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2—6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧36基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳基羰基氧基；和(q)为约2至约30的正整数.在一个优选的实施方案中，(q)为约3至约18，因此聚合物臂的每个末端包含3至高达18个环烃单元。更优选，(q)为约3至9。在一个优选的实施方案中，该含氮的环烃可选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage37</formula>所述含氮的环烃部分优选包含哌。秦。D.生物活性部分本文所述化合物可用于递送各种带负电荷的分子。所述聚合物化合物促进带负电荷的分子的细胞摄取和生物分布。所述带负电荷的分子可包括药物活性化合物(平均分子量小于1，500道尔顿的小分子量化合物)、酶、蛋白质、寡核普酸、抗体、单克隆抗体、单链抗体和肽。所述生物活性部分可为含-NH2的部分、含-OH的部分和含-SH的部分。在一个优选的实施方案中，所述生物活性部分包括寡核苷酸。为了更全面理解本发明范围，将以下术语进行了定义。技术人员将理解，除非另有所述，术语"核酸"或"核苷酸"是指脱氧核糖核酸("DNA")、核糖核酸、("RNA),无论单链或双链，以及其任何化学修饰物。"寡核苷酸，，通常为相对较短的多核苷酸，例如，长度为约2至约200个核香酸，或更优选约10至约30个核普酸。除非另有所述，根据本发明的寡核芬酸通常为合成的核酸，且为单链的。术语"多核苷酸"和"多核酸(polynucleic)"也可在此同义使用。本文使用的术语"反义"是指与特定DNA或RNA序列互补的核苷酸序列，该DNA或RNA序列编码基因产物或编码控制序列。本文使用的术语"反义链"是指"有义"链的互补核酸链。在细胞代谢的正常过程中，DNA分子的有义链为编码多肽和/或其它基因产物的链。该有义链作为模板用于合成信使RNA("mRNA")转录物(反义链)，该转录物又指导任何编码的基因产物的合成。反义核酸分子可通过任何本
技术领域：
已知的方法制备，包括将感兴趣的基因以反方向连接至病毒启动子而合成，其允许合成互补链。一旦引入细胞，进一步的转录或翻译。以此方式可产生突变表型。符号"负，，或(-)也是现有技术已知的，是指反义链，而"正"或(+)也是现有技术已知的，是指有义链。在一个优选的实施方案中，选择用来缀合的是寡核普酸(或"多核普酸")，且缀合后，该靶标涉及寡核苷酸残基。该寡核苷酸可选自任何已知的具有磷酸二酯(phosphorodiester)骨架或硫代磷酸酯(phosphorothioate)骨架的寡核普酸和寡脱氧核苷酸。该寡核普酸(类似物)不限于单一种的寡核苷酸，而是经设计以包括很多种类的这种部分，应理解连接基可连接至3'-或5'-末端的一个或多个，通常为核苷酸的P04或S04基团。所述寡核苷酸包括反义寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、适体等。该寡核苷酸或寡核苷酸衍生物可包括约IO至约1000个核酸，且优选相对较短的多核苦酸，例如，长度为约2至约200个核苷酸、或更优选约IO至约30个核苷酸。此外，所述寡核香酸可包含天然磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架或任何其它修饰的骨架类似物如LNA(锁核酸)、PNA(具有肽骨架的核酸)、三环-DNA;诱捕性(decoy)ODN(双链寡核苷酸)、RNA(催化性RNA序列)、核酶；镜相异构物(spiegelmers)(L-构象的寡核苷酸)、CpG寡聚物等，如那些公开于Tides2002,OligonucleotideandPeptideTechnologyConferences,May6-8，2002,LasVegas,NV和Oligonucleotide&PeptideTechnologies,18th&19th11月2003,Hamburg,德国，其内容在此引入作为参考。根据本发明的寡核苷酸还可任选包括任何合适的现有技术已知的核香酸类似物和衍生物，包括列于下表l中的那些。表l代表性的核苷酸类似物和衍生物4-乙酰基胞普5-曱氧基氨基曱基-2-硫尿苷(thiouridine)5-(羧基羟基曱基)尿苷(3，D-甘露糖基Q核香(mannosylqueuosine)38<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>本发明预期的对寡核苷酸的》f饰包括，例如，用官能团或部分来添加至所选的核苷酸或取代所选的核苷酸，其使得寡核苷酸共价连接至所需的聚合物，和/或添加或取代官能部分(flmctionalmoieties)(其引入另外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和功能性(fiinctionality))至寡核普酸。这些修饰包括，但不限于，2'-位糖修饰、5-位嘧口定修饰、8-位。票呤修饰、在环外胺(exocyclicamine)的修饰、4-硫尿普的取代、5-溴或5-碘尿嘧口定的取代、骨架修饰、曱基化、碱基配对组合如异碱基(isobases)异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)，及类似组合。寡核苷酸修饰还可包括3'和5'修饰如加帽。示例性核苷类似物的结构如下提供。硫代磷酸酯2'-0-曱基2，-MOE2'-氟<formula>formulaseeoriginaldocumentpage40</formula>硼烷磷酸酯核香类似物的更多实例描述于Freier&Altmann;Wwc/.1997:25,4429-4443和Uhlma皿；C匿C>//m'OMi>"gZ)eve/op歴W，2000,3(2)293-213，其每一个的内容在此引入作为参考。在本发明一个优选方面，所述寡核苷酸涉及靶向的肿瘤细胞或下调抗肿瘤细胞相关蛋白以进行抗癌治疗。例如，任何本
技术领域：
已知的用于癌症治疗的细胞蛋白，如用于通过反义寡核普酸下调的bcl-2，可用于本发明。参见美国专利申请10/822,205，2004年4月9日提交，其内容在此引入作为参考。优选的治疗性寡核苷酸的非限制性实例包括反义HIF-la寡核苷酸和反义存活蛋白寡核苷酸(antisenseSurvivinoligonucleotide)。该寡核苦酸可为例如，具有与Genasense(a/k/a奥利默森钠(oblimersensodium),由GentaInc.,BerkeleyHeights,NJ制备)相同或基本类似核苷酸序列的寡核苷酸。Genasense为18-聚硫代磷酸酯反义寡核苷酸，TCTCCCAGCGTGCGCCAT(SEQIDNO:6)，其与人bcl-2mRNA的起始序列的最初六个密码子互补(人bcl-2mRNA为本纟支术领域已知的，且例如以SEQIDNO:19描述于美国专利6,414,134，在此引入作为参考)。美国食品与药物管理局(FDA)在2000年8月给予Genasense罕用药(OrphanDrug)状态。优选的实施方案包括(i)反义存活蛋白LNA(SEQIDNO:3)mCs-Ts-mcs-As_as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c^其中大写字母代表LNA,"s"代表硫代磷酸酯骨架；(ii)反义Bcl2siRNA:正义5'画GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3'(SEQIDNO:4)反义3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5'(SEQIDNO:5)其中dT代表DNA;(iii)Genasense(硫代磷酸酯反义寡核芬酸)(SEQIDNO:6)其中小写字母代表DNA且"s"代表硫代磷酸酯骨架;(iv)反义HIFlaLNA(SEQID:7)5，-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3，(SEQIDNO:7)其中大写字母代表LNA且"s"代表硫代磷酸酯骨架。LNA包括如下所示的2，-0,4，-C亚曱基双环核苦酸IBLNA单体ts-cs-ts-cs-Cs-cs-as-gs-cs-gs—ts-gs-cs-gs-cs-cs-cs-as-t对存活蛋白LNA的详细描述公开于美国专利系列申请11/272,124，名称为"LNAOligonucleotideandtheTreatmemtofCancer，，和10/776,934,名称为"OligomericCompoundfortheModulationSurvivinExpression",其每一个的内容在此引入作为参考。还参见美国专利系列申请10/407,807，名称为"OligomericCompoundfortheModulationHIF-1AlphaExpression"和11/271,686,名称为"PotentLNAOligonucleotideforInhibitionofHIF-1AExpression",其内容也在此引入作为参考。本文所述化合物中使用的寡核脊酸可在寡核苷酸的5，或3，端用(CH2Xv氨基连接基修饰，其中(w)在该方面为优选约1至约10的正整数，优选6。该修饰的寡核苷酸可为如下所示的NH-(CH2、-寡核苷酸I++++月；fc]~^^^"^^3-NH-(CH2^"寡核苷酸RL二可释放的连接基其中(y)为约1至约7的整数。在一个优选的实施方案中，修饰siRNA的有义链的5'端。例如，聚合缀合物中使用的siRNA用5'-C6-NH2修饰。本发明一个具体实施方案使用具有以下序列的Bd2-siRNA正义5'-(NH2-C6)GCAUGCGGCCUCUGUUUGAdTdT-3'反义3'-dTdTCGUACGCCGGAGACAAACU-5'。在另一方面，本文所述化合物可包括用含有受阻的酯(hinderedester)的(CH2)w氨基连接基修饰的寡核苷酸。参见美国临时申请60/844,942名称为"PolyalkyleneOxidesHavingHinderedEster-BasedBiodegradableLinkers，，和60/845,028名称为"HinderedEster-BasedBiodegradableLinkersforOligonucleotideDelivery",其每一个的内容在此引入作为参考。所述聚合化合物可释放不含氨基尾的寡核苷酸。例如，所述寡核苷酸可具有以下结构NH-(CH2),O—寡核苷酸肽~NH-(CH2)0——寡核苷酸在另一方面，寡核苷酸可用(CH2)W巯基连接基修饰(巯基寡核香酸(thiooligonucleotides^该巯基寡核苷酸可用于直接缀合至带正电荷肽的半胱氨酸或通过马来酰亚胺基缀合。该巯基寡核普酸可具有SH-(CH2)w-寡核普酸结构。所述琉基寡核苷酸还可包括具有以下结构的受阻的酯SH-(CH2>NH2-(R)q-(R)9肽=NHr(Arg)9-CONH2O—寡核苦酸0SH-(CH2)W-Oo—寡核苷酸H2NOC-(R9)-Cys-HN-RL-"PEG-RLNH-Cys-(R9)-CONH20~寡核苦酸所述寡核苷酸可用CVNH2尾、CVSH尾或受阻的酯尾修饰。修饰的寡核苷酸的实例包括(i)用CVNH2尾修饰的Genasense:5,-NH2-C6-stscstscscscsasgscsgstsgscsgscscsast-3，s,0—P—T-sC-sT-sC-sC-sC-sA-sG-sC-sG-sT-sG匿sC-sG-sC-sC-sA-sT6-H7N'(iii)由C6-NH2尾修饰的反义HIF1aLNA:(iv)5'-NH2-C6-sTsGsGscsasasgscsastscscsTsGsTsa-3，；(iii)由Q-NH2尾修饰的反义存活蛋白LNA:5，-丽2-C6-smCsTsmCsAsastscscsastsgsgsmCsAsGsc-3，；(iv)由C6-SH尾修饰的反义存活蛋白LNA5-HS画C6-sCSTSCsAsastsCsCsastsgsgsCsAsGsc-3;(v)由受阻的酯尾{奮饰的GenasenseoH,N、aJ^~0—T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-TE.耙向剂靶向剂可连接至本文所述的聚合化合物以在体内指引缀合物至耙区域。所述靶向剂使得带负电荷的生物活性部分如寡核苷酸在靶区域(即肿瘤位点)具有治疗效力。带负电荷的分子如寡核苷酸在体内的耙向递送增强这些分子的细胞摄取以具有更好的治疗效力。在某些方面，一些细胞穿透肽可由多种耙向肽替换以耙向递送至肺瘤位点。在本发明一个优选的方面，该靶向部分，如单链抗体(SCA)或单链抗原结合抗体、单克隆抗体、细胞粘附肽如RGD肽和选择蛋白、细胞穿透肽(CPPs)如TAT、穿膜肽和(Arg)9、受体配体、靶向碳水化物分子(targetingcarbohydratemolecules)或凝集素、寡核苷酸、寡核苷酸衍生物如锁核酸(LNA)和适体等，使得细胞毒性药物特异定向于把向的区域。参见JP/^w75W.2006Sep;95(9):1856-72Celladhesionmoleculesfortargeteddrugdelivery,其内容在jt匕引入作为参考。优选的耙向部分包括单链抗体(SCA，s)或抗体的单链可变片段(sFv)。该SCA包含抗体域，其可结合或识别靶向肿瘤细胞的特异分子。除了保持抗原结合位点，聚乙二醇化的(PEGylated)SCA通过连接基可减少抗原性和增加SCA在血流中的半衰期。术语"单链抗体，，(SCA)、"单链抗原结合分子或抗体，，或"单链Fv"(sFv)可互换使用。该单链抗体对抗原具有结合亲合力。单链抗体(SCA)或单链Fvs可以几种方式构建。对单链抗原结合蛋白质的理论和制备的描述可见于共同转让的美国专利申请10/915,069和美国专利6,824,782,其每一个的内容在此引入作为参考。通常，SCA或Fv域可选自由其在文献中的缩写已知的单克隆抗体，如26-10,MOPC315,741F8,520C9,McPC603，D1.3,鼠phOx,人phOx,RFL3.8sTCR,1A6,Sel55-4,18-2-3，4-4-20，7A4-l,B6.2,CC49,3C2,2c,MA-15C5/K12G0,Ox等(参见Huston,J.S.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988);Huston,J,S.等人，SIMNews38(4)(Supp):ll(1988);McCartney,J.等人，ICSUShortReports10:114(1990);McCartney,J.E,等人,未公开的结果(1990);Nedelman,M.A.等人，J.NuclearMed.32(Supp.):1005(1991);Huston,J.S.等人,In:MolecularDesignandModeling:ConceptsandApplications,PartB,由J.J.Langone《扁專專，MethodsinEnzymology203:46-88(1991);Huston,J.S.等人，In:AdvancesintheApplicationsofMonoclonalAntibodiesinClinicalOncology,Epenetos,A.A.(编辑),London,Chapman&Hall(1993);Bird,R.E.等人，Science242:423-426(1988);Bedzyk，W.D.等人,J.Biol.Chem.265:18615-18620(1990);Colcher，D.等人，J.Nat.CancerInst.82:1191-1197(1990);Gibbs,R.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:4001-4004(1991);Milenic，D.E.等人,CancerResearch51:6363-6371(1991);Pantoliano,M.W.等人，Biochemistry30:10117-10125(1991);Chaudhary,V.K.等人，Nature339:394-397(1989);Chaudhary，V,K.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1066-1070(1990);Batra，J.K.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.171:1-6(1990);Batra，J.K.等人,J.Biol.Chem.265:15198-15202(1990);Chaudhary,V.K.等人，Proc.Natl.AcadSci.USA87:9491-9494(1990);Batra,J.K.等人,Mol.Cell.Biol.11:2200-2205(1991);Brinkmann,U.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8616-8620(1991);Seetharam,S.等人，J.Biol.Chem.266:17376-17381(1991);Brinkmann,U.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:3075-3079(1992);Glockshuber,R.等人，Biochemistry29:1362-1367(1990);Skerra，A.等人，Bio/Technol.9:273-278(1991);Pack,R等人，Biochemistry31:1579-1534(1992);Clackson,T.等人,Nature352:624-628(1991);Marks,J.D.等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991);Iverson，B.L.等人，Science249:659-662(1990);Roberts,V.A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6654-6658(1990);Condra，J.H.等人，J.Biol.Chem.265:2292-2295(1990);Laroche,Y.等人，J.Biol.Chem.266:16343-16349(1991);Holvoet,P.等人，J.Biol.Chem.266:19717-19724(1991);Anand，N.N.等人,J.Biol.Chem.266:21874-21879(1991);Fuchs,P.等人，BiolTechnol.9:1369-1372(1991);Breitling，F.等人，Gene104:104-153(1991);Seehaus，T.等人，Gene114:235-237(1992);Takkinen,K.等人，ProteinEngng.4:837-841(1991);Dreher，M.L.等人，J.Immunol.Methods139:197-205(簡)；Mottez,E.等人，Eur.J.Immunol.21:467-471(1991);Traunecker,A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8646-8650(1991);Traunecker,A.等人，EMBOJ,10:3655-3659(1991);Hoo,W.F.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4759-4763(1993))。上述公开物的每一个在此引入作为参考.靶向基团的非限制性实例包括血管内皮细胞生长因子、FGF2、促生长素抑制素和和促生长素抑制素类似物、转铁蛋白、促黑素、ApoE和ApoE肽、维勒布兰德氏因子(vonWillebrand'sFactor)和维勒布兰德氏因子肽、腺病毒纤维蛋白和腺病毒纤维蛋白肽、PD1和PD1肽、EGF和EGF肽、RGD肽、叶酸(folate)等。本领域技术人员所知的其它任选把向剂还可在本文所述的化合物中使用。优选地，所述耙向剂包括单链抗体(SCA)、RGD肽、选择蛋白、TAT、穿膜肽、(Arg)9、叶酸等，且这些试剂的一些优选结构为C-TAT:(SEQIDNO:1)CYGRKKRRQRRR;C-(Arg)9:(SEQIDNO:2)CRRRRRRRRR;RGD可为直链或环状Arg9可包括用于缀合的半胱氨酸如CRRRRRRRRR，而TAT可将额外的半胱氨酸并添加在肽的末端，如CYGRKKRRQRRRC。出于本发明的目的，本说明书和附图中使用的缩写表示以下结构(i)C-diTAT=CYGRKKRRQRRRYGRKKRRQRRR-NH2;(ii)直链RGD=RGDC;十酸为下式的残基(iii)环状RGD=c-RGDfC;(iv)RGD-TAT=CYGRKKRRQRRRGGGRGDS-NH2;和(v)Arg9。R33c-R34F.可释放的连接基在本发明一个优选的方面，本文所述化合物包含连接至可释放的连接基的生物活性部分。本发明一个优点是所述生物活性部分可以以可控的方式释放。所述可释放的连接基可为基于千基消除的连接基、基于三烷基锁定的连接基(或三烷基锁定内酯化基)、基于N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸的连接基、酸不稳定的连接基、溶酶体可切割的肽(lysosomallycleavablepeptide)和组织蛋白酶B可切割的肽(capthepsinBcleavablepeptide)。所述酸不稳定的连接基可为二硫键、含腙的连接基和含巯基丙酸的连接基。或者，所述可释放的连接基为细胞内不稳定的连接基、细胞外连接基和酸不稳定的连接基。所述可释放的连接基具有下式al丫11IIcY12—Ar~hJbllR31C_R32LJellY13—-C—>——~>h11v/wvpY4injrl、=0n-31<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>烷基、CL6取代的烷基、(:3.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、Cw杂烷基、取代的Cw杂烷基、d，6烷氧基、苯氧基和C,.6杂烷氧基；Ar为芳基或杂芳基部分；L1M5是独立选择的双官能间隔基(biftmctionalspacer);J和J，独立;也选自主动转运(activelytransported)至革巴细月包的部分，疏水部分，双官能连接部分和它们的组合；(cll)、(hll)、(kll)、(111)、(mll)和(nll)是独立选择的正整数，优选1;(all)、(ell)、(gll)、(jll)、(oll)和(qll)独立地为零或正整数，优选1;和(bll)、(xll)、(x，ll)、(fll)、(ill)和(pll)独立地为0或1.在共同转让的美国专利6,180,095,6,720,306,5,965,119,6624,142和6,303,569中描述了各种可释放的连接基，例如，基于千基消除(benzyleliminationbased)的连接基或基于三烷基锁定(trialkyllockbased)的连接基，其中的内容在此引入作为参考。在共同转让的美国专利7,122,189和7087,229和美国专利申请10/557,522,11/502,108和11/011,818中还描述了基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的连接基，其中的内容在此引入作为参考。优选地，所述寡核苷酸通过酸不稳定的连接基连接至本文所述化合物的聚合部分。不限于任何理论，所述酸不稳定的连接基在细胞中、特别是在溶酶体、核内体或巨胞饮体中促进寡核芬酸从母体聚合物释放。在本发明另一方面，所述带正电荷的肽和靶向剂还可通过可释放的连接基如酸不稳定的连接基，连接至本文所述化合物的聚合部分。G.双官能连接基在本发明另一方面，所述带正电荷的肽和靶向剂可通过固定的(permanent)连接基和可释放的连接基单独或其组合连接至本文所述化合物的聚合部分。优选地，所述带正电荷的肽和靶向剂通过固定的连接基连接。所述双官能连接基包括氨基酸或氨基酸衍生物。所述氨基酸可为天然存在的和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸的衍生物和类似物，以及各种现有技术已知的非天然存在的氨基酸(D或L)、疏水的或非疏水的，也包括在本发明的范围内。合适的非天然存在的氨基酸的非限制性实例包括，2-氨基已二酸、3-氨基已二酸、P-丙氨酸、(3-氨基-丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸(piperidinicacid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-氨基丁酸、锁链素、2，2-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-曱基甘氨酸、肌氨酸、N-曱基-异亮氨酸、6-N-曱基-赖氨酸、N-曱基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。一些优选的氨基酸残基包括甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸和肌氨酸。或者，所述双官能连接基可选自-[c(=0〕]v(CR22R23)t[C(=0)]v,-,-[c(=0〕>]v(CR22R23)t-0[C(=0)]v'-，-[c(=0〕]v(CR22R23)t-NR26[C(=0)]v'-，-[c(=0〕]vO(CR22R23)t[C(=0)]v，-，-[c(=0〕]vO(CR22R23)tO[C(=0)]v-，-[c(=0〕]vO(CR22R23)tNR26[C(=0)]v'-，-[c(=0〕]vNR21(CR22R23)t[C(=0)]v，-，-[c(=0〕]vNR21(CR22R23)tO[C(=0)]v，-,-[c(=0〕]vNR21(CR22R23)tNR26[C(=0)]v,-，-[c(=0〕]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=0)]v，-，-[c(=0〕]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29》[C(=0)]v'-,-[c(=0〕]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=0)]v'-,-[c(=0〕]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=0)]v，-，-[c(=0〕]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'[C(=0)]v'-，-[c(=0〕>]vO(CR22R23)tS-(CR28R29)t,[C(=0)]v，-，-[c(=o;>]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)t,[C(=0)]v'-，-[c(=o:>]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'[C(=0)]v-[c(=o:|]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t，[C(=0)]v'-,-[c(>]v(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v'-,-[c(=o:>]v(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v，-，-[c(=o:>]vO(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v'-，-[c(=o:>]vO(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v,-，-[c(=o:>]vNR21(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v'--[c(=o:>]vNR21(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v'-,)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,[C(=0)]v,-,)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,[C(=0)]v,-，)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,[C(=0)]v'-，)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'0[C(=0)]v'-,)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'[C(=0)]v,-,)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t，NR26[C(=0)]v,-,)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'0[C(=0)]v,-，)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t，[C(=0)]v,-，)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R290)t，NR26[C(=0)]v,-，)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t，0[C(=0)]v'-,)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t,[C(=0)]v,-,)]具,(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t，NR26[C(=0)]v'陽o、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>其中1121.29独立地选自氢、Cw烷基、C3—12支链烷基、C^环烷基、Cw取代的烷基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、cl6杂烷基、取代的Cw杂烷基、d-6烷氧基、苯氧基和Cl6杂烷氧基；(t)和(t，)独立地为零或正整数，优选零或约1至约12的整数，更优选约1至约8的整数，且最优选为1或2;和(V)和(V，)独立地为零或1。优选地，所述双官能连接基可选自-[C(=0)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=0)-(CH2)r,-[C(=0)]rNH(CH2)2(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)]r，-，-[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)2NH[C(=0)]r'-，-[C(=0)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s'[C(=0)]r'-，-[C(=0)]rNH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s'[C(=0)]r-,-[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)[C(=0)]r，-，-[C(0)]rNH(CH2CH2)sO(CH2CH2)s'[C(=0)]r'-，-[C(=0)]rNH(CH2CH20)(CH2)NH[C(=0)]r'-，-[C(=0)]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r,-，-[C(=0)]rNH(CH2CH20)s(CH2)s,[C(=0)]r，-，-[C(=0)]rNHCH2CH2NH[C(=0)]r-，-[C(=0)]rNH(CH2CH2)20[C(=0)]r'-,-[C(=0)]rNH(CH2CH20)[C(=0)]r-，-[C(=0)]rNH(CH2CH20)2[C(=0)]r'-，-[C(O)]rNH(CH2)3[C(=0)]r,-，-[C(=0)]rO(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r,-，-[C(=0)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=0)]r'-，-[C(=0)]rO(CH2CH20)2NH[C(=0)]r-,-[C(=0)]rO(CH2)20(CH2)2[C(=0)]r'-，-[C(=0)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(=0)]r'-，-[C(=0)]rO(CH2CH2)NH[C(=0)]r，-，-[C(=0)]rO(CH2CH2)0[C(=0)]r-，-[C(=0)]rO(CH2)3NH[C(=0)]r-,-[C(=0)]rO(CH2)30[C(=0)]r,-，-[C(=0)]rO(CH2)3[C(=0)]r，-,-[C(=0)]rCH2NHCH2[C(=0)]r'_,-[C(=0)]rCH2OCH2[C(=0)]r，-，-[C(=0)]rCH2SCH2[C(=0)]r，-,-[C(=0)]rS(CH2)3[C(=0)]r，-，-[C(=0)]r(CH2)3[￡(=0)]r-，—[C(=0)rOCH2"^~CH2NH[C(=0)]r'--[C(=0)rOCH2CH20[C(=0)r,——CH2NH[C(=0)]r.-和—[C(=0)]rNHCH2_-[C(=0)]rNHCH2、/HCH20[C(:0)]r.——其中(r)和(r，)独立地为零或1，条件是(r)和(r，)两者不同时为零,在本发明另一方面，所述双官能连接基包括oSoCT,和这些双官能团使得第二试剂直接结合，因此不再需要连接一种官能团以用于结合至第二试剂。在另一实施方案，所述双官能连接基包括相应于如上所示的结构，但除了马来酰亚胺基外具有以下基团如乙烯基、砜残基、氨基、羧基、疏基、巯基丙酸基(thiopropionate)、酰肼、肼基曱酸基(carbazate)等。H.支链基团本文所述化合物的聚合物臂末端可为支链的，用于多重负载生物活性部分、带正电荷部分和/或耙向剂。优选地，所述支链基团提供更多的聚合物臂末端用于带正电荷部分。所述支链基团可具有至少三个功能位点。聚合物臂末端数根据支化程度倍增。当具有三个功能位点的支链基团连接至聚合物时，其提供两个末端用于结合。所述支链基团可选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage54</formula>和R5独立地选自氢、C,-6烷基、C2—6烯基、C2-6炔基、Cw9支链烷基、C3—8环烷基、d—6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3，8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C,.6杂烷基、取代的C,—6杂烷基、d—6烷氧基、芳氧基、C,-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2—6烷酰基、芳基羰基、C2.6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2.6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2—6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；(cl)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c'6)、(c"6)、(c7)和(c8)独立地为零或正整数，优选0或约1至10的整数，且更优选0、1或2;和(dl)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)和(d7)独立地为零或正整数，优选0或约1至约10的整数，且更优选零或约1至约4的整数。各种支链基团还描述于共同拥有(commonlyowned)的美国专利6,153,655、6，395，266和6,638,499,其每一个的内容在此引入作为参考。本领域技术人员已知的所有其它任选支链基团也在本文所述的化合物的考虑范围内。优选地，所述支链基团包括0,HN-:0,0々--NH--01-和更优选，所述支链基团包括天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸和半胱氨酸,在另一方面，可在聚合物臂的每个末端使用一个或多个支链基团。一R广甸c一bI.相应于式I的优选的实施方案在一个优选的实施方案中，所述聚合物具有下式:(la)其中(e)为1或2;(e，)为0、1或2;和(f')为0或1,)e—R4(lb)FV.亂-(Li)d—(L"2)e.'—(R'2)g，(L2)e—R4其中(g，)为正整数.例如，根据本发明制备的缀合物为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage55</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage56</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage57</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage58</formula>其中C-TAT为-S-CYGRKKRRQRRR-CONH2的残基；NH-5，-C6-GS为Genasense，即18-聚硫代磷酸酯(18-merphosphorothioate)反义寡核苦酸TCTCCCAGCGTGCGCCAT(SEQIDNO:l)的衍生物S5'3'—拿一NH——(CH2)6—0—3—T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-TS-5，-CVLNA-存活蛋白为S5'3'—養—NH-(CH2)6-0-^—mCs-Ts-mCs-As.as-ts-cs-cs-as-ts-gs-gs-mCs-As-Gs-c6e;和RGD为HS在本发明一个优选实施方案中，所述聚合物包括将siRNA双链体有义链的5，-端修饰为C6-氨基尾，以结合至PEG连接基。J.聚合物递送体系的合成通常，所述缀合物可通过顺序连接聚合物、细胞毒剂、含正电荷的部分和靶向部分至多功能的连接基而制备。该实际的加成顺序不限于该顺序，这对于普通技术人员将是显然的，在某些方面其中首先将PEG加成至多功能连接基，然后加成可释放连接的细胞毒药物，然后加成含正电荷的部分和耙、"。HN-5'-C6-GSS、。z5'-C6-LMAGEp3向剂如单克隆抗体。关于该实施方案的一些优选的方面在以下实施例中提供。在本发明一个方面，含OH或离去基团的聚合物可首先与含可释放的连接基部分的亲核试剂反应，然后与另一在远端含官能团的亲核试剂反应。所述可释放的连接基可与生物活性的化合物结合且官能团可连接至含正电荷的部分。或者，所述结合至生物活性部分和含正电荷的部分的聚合物可进一步与靶向部分反应以制备本发明的含所有三种成分的最终的聚合物缀合物。例如，与聚合物上的离去基团数相比，技术人员可使用较少当量的亲核试剂以形成含连接基和离去基团两者的聚合物中间体。该中间体可进一步与含正电荷的部分反应，或者，进一步与靶向部分反应以形成被生物活性的化合物、含正电荷的部分和耙向剂多重取代的聚合物缀合物。反应性。例如，不同的保护基团如羧酸末端的叔丁酯和曱酯可选择性和分步脱保护以提供不同程度的活性基团，来与不同的生物活性剂如细胞毒剂和靶向剂结合。如图l所示，马来酰亚胺基和琥珀酰亚胺基的酯可分别选"^性地与含SH或NH2的部分反应。本文所述的所有反应为具有普通技术人员已知的所需步骤和条件的标准化学反应。因此本文所述的合成反应不需要多余(undue)实验。亲核化合物与PEG或其它聚合物的连接可使用普通技术人员已知的标准化学合成技术进行。活化的聚合物部分如SC-PEG、PEG-胺、PEG酸等可通过商业来源或由技术人员合成而获得，不需要多余实验。联剂的非限制性实例包括1,3-二异丙基碳二亚胺(DIPC)、任何合适的二烷基碳二亚胺、2-卣代-l-烷基-p比咬错卣化物(Mukaiyama试剂)、l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)、丙烷膦酸环酐(PPACA)和二氯磷酸苯酯等，其可从例如商业来源如Sigma-AldrichChemical获得或4吏用已知技术合成。优选地，所述反应在惰性溶剂如二氯曱烷、氯仿、DMF或其混合物中进行。该反应可优选在石咸的存在下进行，所述4^如二曱基氨基吡啶(DMAP)、二异丙基乙基胺、吡啶、三乙胺等，以中和任何产生的酸。该反应可在约0。C至约22。C(室温)进行。一些由本文所述方法制备的具体实施方案包括在一方面，所述具有带正电荷部分以中和负电荷并改善生物活性部分(如寡核苷酸)的细胞摄取的聚合物可具有以下可选方面(i)在寡核苷酸的5-，或3'-端用(CH2)w氨基连接基修饰的寡核苦酸；(ii)在寡核苷酸的5-，或3'-端用(CH2)w巯基连接基修饰的寡核苷酸；(iii，(CH2)w氨基连接基或(CH2;Kv巯基连接基修饰的含受阻酯(hinderedester)的寡核苷酸，其可释放没有氨基尾或巯基尾(thiotail)的寡核苷酸；(iv)可连接一个或多个带正电荷的肽，例如，两个带正电荷的肽如TAT序列以用于增强细胞摄取；(v)可连接一个或多个可释放的连接基关于受阻的含酯寡核苷酸的形成描述于共同转让的美国专利申请60/845,028,名称为"HinderedEster-BasedBiodegradableLinkersForOligonucleotideDelivery",其内容在此引入作为参考。参见图2的反应流程反应。K.治疗方法由上所述，还提供治疗哺乳动物的方法，包括向需要的患者给药有效量的含本发明式(i)化合物的药物组合物。，在本发明一个具体方面，还提供治疗患有恶性肿瘤或癌症的患者的方法，包括向需要的患者给药有效量的含式(I)的化合物的药物组合物。在其它方面，该治疗的癌症可为以下的一种或多种实体肿瘤、淋巴瘤、小细胞肺癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、胰腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、胃癌等。该组合物用于治疗哺乳动物中瘤形成疾病、减少肿瘤负荷、防止赘生物转移和防止肿瘤/赘生性生长复发。本发明另一方面提供用于在哺乳动物中不同医学病症的治疗方法。简言之，任何可连接至带正电荷的PEG聚合物的生物活性部分可给药至需要这种治疗的哺乳动物。任何在未缀合状态具有治疗作用的寡核苷酸等可以以如上述制备的其缀合形式使用，。给药的组合物的量，例如用作前体药物，将取决于其中包含的母体分子。通常，治疗方法中使用的前体药物的量是在哺乳动物中有效达到所需治疗结果的量。通常，不同前体药物化合物的剂量将依据母体化合物、体内水解速率、聚合物分子量等而稍有改变。在本发明另一方面，提供给药多核苷酸(寡核苷酸)，优选反义寡核苷酸至哺乳动物细胞的方法。该方法包括给药如本文制备的有效量的缀合物至待治疗的病症，这将取决于多核香酸对该病症的效力。例如，如果未缀合的寡核苷酸(例如反义BCL2寡核苷酸，反义存活蛋白寡核苷酸)具有对抗某些癌症或赘生性细胞的效力，该方法将包括递送含有所述寡核芬酸的聚合物缀合物至对天然寡核芬酸具有易感性的细胞。该递送可以以合适的药物组合物的部分在体内进行或在体外环境直接递送至细胞。在一种具体治疗中，可使用包括寡核香酸(SEQIDNO.3,SEQIDNOs:4和5，和SEQIDNO:6,和SEQIDNO:7)的聚合缀合物。实施例提供以下实施例以进一步理解本发明，但不是以任何方式限制本发明的范围。实施例中的黑体数字相应于图1中所示的那些。整个实施例中使用缩写，例如DCM(二氯曱烷)、DIEA(二异丙基乙基胺)、DMAP(1二曱基氨基吡啶)、DMF(N,N，-二曱基曱酰胺)、DSC(二琥珀酰亚胺基碳酸酯)、EDC(1-(3-二曱基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、IPA(异丙醇)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、PEG(聚乙二醇)、SCA-SH(单链抗体)、SN38(7-乙基-10-羟基喜树碱)、TBDPS(叔丁基-二丙基娃烷基(tert-butyl-dipropylsilyl)))和TEA(三乙胺)。通常方法所有反应在干燥氮气或氩气的气氛中进行。使用商业试剂而没有进一步纯化。所有PEG化合物在使用前真空或通过从曱苯共沸蒸馏而干燥。除非另有所述，使用VarianMercury300NMR光谱仪，在300MHz获得'HNMR谱，在75.46MHz获得13CNMR谱，并使用氘代氯仿作为溶剂。化学位移(S)以距四曱基硅烷(TMS)的低场百万分率(ppm)记录。HPLC方法。反应混合物和中间体的纯度和最终产物通过BeckmanCoulterSystemGoldHPLC仪器监测。其使用ZORBAX300SBC8反相柱(150x4.6mm)或PhenomenexJupiter300AC18反相柱(150x4.6mm)，并具有168DiodeArrayUVDetector,使用梯度为10-90%的乙腈在0.05%三氟乙酸(TFA)中的溶液，流速为lmL/分钟。)实施例1.化合物3:向化合物2(10mg，1.7nmol)在PBS緩冲液(5mL,pH7.8)中的溶液中添加NOF公司的Mal-PEG5k-NHS(100mg,17iamol)并在室温搅拌2小时。将该反应混合物用水稀释至20mL并将其装载在PorosHQ、强阴离子交换柱(10mmx1.5mm，柱床体积(bedvolume)~16mL)上，该柱用20mMTris画HCl緩冲液，pH7.0(緩冲液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的緩冲液A洗涤以去除过量PEG连接基。然后该产物以流速10mL/分钟用梯度为0至100%的1MNaCl在20mMTris-HCl緩冲液(pH7.0,緩冲液B)中的溶液洗脱10分钟，然后以100%緩冲液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干得到化合物3。产量6mg(寡聚物等价物(oligo叫uivalent》60%)。实施例2.化合物4:向化合物3在PBS緩冲液(6mL，pH7.0)中的溶液中，添加肽C-Tat(5mg:3]umol)并在室温搅拌2小时。将该反应混合物用水稀释至20mL并装载在ResourceS、强阳离子交换柱(IOmmx1.5mm,柱床体积16mL)上，该柱用100mMK2HP04，5M脲緩冲液，pH6.5(緩沖液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的緩沖液A洗涤以去除未反应的PEG-寡聚化合物(PEG-oligocompound)。然后该产物以流速为10mL/分钟用梯度为0至100%的2MKBr(緩沖液B)洗脱10分钟，接着用100。/。緩冲液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干得到化合物4。产量2mg(寡聚物等价物，30%)。实施例3.化合物5:向化合物3在PBS緩沖液(6mL,pH7.0)中的溶液中，添加肽C-diTat(10mg,3inmol)并在室温搅拌2小时。将该反应混合物用水稀释至20mL并装载在ResourceS、强阳离子交换柱(10mmx1.5mm，柱床体积~16mL)上，该柱用100mMK2HP04，5M脲緩冲液，pH6.5(緩冲液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的緩冲液A洗涤以去除未反应的PEG-oligo化合物。然后该产物以流速为10mL/分钟用梯度为0至100%的2MKBr(緩冲液B)洗脱10分钟，接着用100%緩冲液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干得到化合物5。产量2mg(寡聚物等价物，30%)。实施例4.化合物6:在-78。C将丁基锂(1.6M，200mL)添加至异丁酸乙酯(35g)在THF(500mL)中的溶液中，并将该溶液在相同温度搅拌1小时。添加1，5-二溴戊烷(100g)并将混合物温热至室温。将该混合物在室温搅拌l小时并将其倒入碳酸氢钠水溶液(500mL)中。蒸发有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用10%乙@臾乙酯的己烷溶液洗脱得到液体状化合物6(29.2g,产率36.7%)。实施例5.化合物7:在100。C,在DMF(500mL)中将7-溴-2，2-二曱基庚酸乙酯(化合物6,26.5g)与叠氮化钠(13g)—起加热2小时。浓缩混合物且残余物通过硅胶柱纯化，用10%乙酸乙酯的己烷溶液洗脱得到液体状化合物7(20.5g,产率卯.3%)。实施例6.化合物8:在乙醇(500mL)中将7-叠氮基-2,2-二曱基庚酸乙酉旨(化合物7，20.5g)与氢氧化钠(10g,85%)加热回流2小时。浓缩混合物并添加水(400mL)。用浓盐酸将该混合物酸化至pH为2并用乙酸乙酯(500mL)萃取。浓缩有机层且残余物通过硅胶柱纯化，用50%乙酸乙酯的己烷溶液洗脱得到液体状化合物8(17.1g,产率95%)。实施例7.化合物9:将7-叠氮基-2，2-二甲基庚酸(化合物8，8g)溶于二氯曱烷(200mL)中。添加草酰氯且混合物回流2小时并蒸发。将残余物溶于二氯曱烷(100mL)中并添加至3，-乙酰基胸香(5.85g)在吡啶(100mL)中的溶液中。将该溶液在室温搅拌24小时并将其倒入碳酸氢钠水溶液(500mL)。将该混合物用二氯曱烷(500mL)萃取并浓缩有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用5%曱醇的二氯曱烷溶液洗脱得到无色固体的化合物9(5.6g,产率61%)。实施例8.化合物10:在30psi下，在Pd/C(10%,0.5g)的存在下将5，-(7-叠氮基-2，2-二曱基庚酰基)-3，-乙酰基胸苷(化合物9,4.65g)在曱醇(200mL)中氢化1小时。过滤混合物并蒸发滤液得到固体化合物10(4.4g,产率100%)。实施例9.化合物11:将5，-(7-氨基-2,2-二曱基庚酰基)3，-乙酰基胸苷(化合物10,4.4g)、三乙胺(4mL)和4-曱氧基三苯曱基氯(7.5g)在吡啶(100mL)中搅拌10小时。添加甲胺(40%,10mL)并将溶液搅拌2小时。将该混合物倒入碳酸氢钠水溶液(500mL)中并用二氯曱烷(500ml)萃取。浓缩有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用5%曱醇的二氯曱烷溶液洗脱得到无色固体化合物11(4.9g，产率71%)。实施例10.化合物12:将5'-(7-[(MMT-氨基)-2,2-二曱基庚酰基]胸苷(thymidine)(化合物11,4.9g)、N，N-四异丙基-氰基乙基亚磷酰胺(3g)和四唑(0.5g)在乙腈(50mL)中搅拌过夜。将该混合物倒入碳酸氢钠水溶液(500ml)中并用二氯曱烷(500ml)萃取。浓缩有机层。残余物通过硅胶柱纯化，用50%乙酸乙酯的己烷溶液洗脱得到无色固体化合物12(4.5g，产率71%)。实施例11.化合物14:将化合物12转移至TrilinkBiotechnologies,CA以用作寡聚物合成(oligosynthesis)中最后的单体。合成后将Mmt基团脱保护并将寡聚物通过RP-HPLC纯化，且化合物14作为游离胺获得以用于PEG缀合(conjugation)。实施例12.化合物15:向化合物14(10mg,1.7pmol)在PBS緩冲液(5mL,pH7.8)中的溶液中添加m30kSCPEG(520mg,17pmol)并在室温搅拌5小时。将反应混合物用水稀释至50mL并将其装载在PorosHQ、强阴离子交换柱(IOmmx1.5mm,柱床体积16mL)上，该柱用20mMTris-HCl緩冲液，pH7.4(緩沖液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的緩沖液A洗涤以去除过量PEG连接基。然后该产物以流速为10mL/分钟用梯度为0至100%的1MNaCl在20mMTris-HCl緩冲液，pH7.4(緩沖液B)中的溶液洗脱IO分钟，接着以100%緩冲65液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干得到化合物15。产量6mg(寡聚物等价物，60%)。实施例13.化合物16:向化合物14(10mg,1.7pmol)在PBS緩冲液(5mL,pH7.8)中的溶液中添加m30PEG-RNL8a-NHS(520mg,17pmol)并在室温搅拌5小时。将反应混合物用水稀释至50mL并将其装载在PorosHQ、强阴离子交换柱(IOmmx1.5mm，柱床体积~16mL)上，该柱用20mMTris-HCl緩沖液，pH7.4(緩冲液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的緩冲液A洗涤以去除过量PEG连接基。然后该产物以流速为10mL/分钟用梯度为0至100%的1MNaCl在20mMTris-HCl缓冲液，pH7.4(緩冲液B)中的溶液洗脱10分钟，接着以100%缓沖液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干至固体。产量5mg(寡聚物等价物，50。/。)。实施例14.化合物17:将Boc-ext-胺(1.7g,6.4mmol,1当量)溶于4mLDMF。将该溶液添加至15mL饱和NaHC03水溶液中然后冷却至0。C。然后添加马来酰亚胺(lg,6.4mmol,1当量)并将反应混合物搅拌15分钟，然后加入30mL水。将反应在0。C持续搅拌20分钟。通过加入H2S04将pH调节至3.5然后用二氯曱烷萃取三次。合并的有机层用0.1NHC1洗涤一次，然后用盐水洗涤一次，干燥并在真空蒸发。粗产物通过柱色谱用乙酸乙酯/己烷(8:2，v/v)纯化13CNMR528.28,36.86，40.19,67.58,69.67,70.00，78.86，133.89,155.63，170.31。实施例15.化合物18:在室温向Boc-ext-马来酰亚胺(O.lg)在5mL无水DCM的溶液中添加TFA(2.5mL)。反应通过TLC监测且测定在1.5小时后完成。真空蒸发溶剂得到化合物18:13CNMRS37.26，39.98,66.12,68.36，69.77，69.83,134.11,160.44,171.01。实施例16.化合物19:向Bsmoc-Gly(0.5g,1.7mmol，1当量)和3,5-二曱基-4-羟基-千基-OTBS(0.448g,1.7mol,1当量)在50mL无水DCM中的溶液中添加DMAP(0.042g,0.34mol,5当量)。将该混合物冷却至0°C然后添加EDC(0.408g，0.002125mmol,0.8当量)。所得混浊溶液温热至室温并搅拌过夜。澄清的反应溶液用O.lNHCl和水洗涤。合并的有机层用MgS04干燥，过滤并真空蒸发得到化合物19:13C画R(CDC13-CD30D，1:1，v/v)S42.10,56.49,120.93，125.21,129.66,130.00,130.18，133.60,136.37,138.63,155.74,171.31。实施例17.化合物20:在室温向化合物19(0.089g,0.163mmol，1.2当量)在5mL无水DCM中的溶液中添加4-哌咬子基-。底咬(0.0247g，0.147mmol,0.9当量)。反应通过TLC监测且在4小时后完成，此时添加20KS臂-SCPEG(2,72g,0.136mmol)。将反应在室温搅拌过夜。真空蒸发部分溶剂且所得残余物从乙醚中沉淀，然后从DMF/IPA重结晶该固体得到化合物20:13CNMR5-5.53，16.02，18.05，25.04,25.62,42.01,63.87,63.95，67.31-72.85(PEG),125.66，129.14,138.36,146.02,151.00,155.96,167.65,168.112。实施例18.化合物21:将化合物20(1.07g,0.05mmol,1当量)和氨基-3,6-二氧杂辛酸马来酰亚胺(amino-3,6-dioxaoctanoicmaleimide)(0.60g,1.75mmol,35当量)溶于20mLDCM，然后在冰浴中冷却。添加DIPEA(0.609mL，5.5mmol,70当量)直到达到pH为7-8。该反应在室温进行6.5小时，然后在真空部分去除溶剂。然后将该固体通过乙醚沉淀并用烧瓶在水箱中储存过夜。然后将固体过滤并从DMF/IPA重结晶得到化合物21:13CNMRS-5.30,16.28，18.32,25.86,36.90，40.67，42.30,63.72,64.27,67.64,69.23-71.28(PEG),125.98,129.39,133.92,138.76，146.24,156.08,167.79,170.34。实施例19.化合物22:将化合物21(0.95g)溶于4mLCH3CN和2mL水中，然后加入10mL乙酸。将该混合物在室温搅拌过夜然后真空去除溶剂。将该固体用乙醚沉淀然后从DMF/IPA重结晶得到所述醇13CNMR515.93，36.58,40.35，41.98，63.37,63.60，67.31,68.21-70.88(PEG),126.46，129.31,133.69,138.67,146.27，155.79,167.58，170.05。将脱保护的千基醇(lg,0.05mmol，1当量)溶于2mLDMF和20mLDCM中，然后将溶液冷却至0°C。添加DSC(0.1024g,0.4mmol:8当量)和吡咬(0.029ml,0.36mmol，7.2当量)。将反应混合物逐渐温热至室温过夜。真空部分去除溶剂然后用乙醚沉淀该固体。然后粗产物从DMF/IPA中重结晶13CNMR516.13，25.24，36.79,40.56，42.21,63.61,64.16，67.54,69.52-71.29(PEG),126.76,128.56,130.42,133.86，148.01,155.99,167.56，168.20,170.26。实施例20.化合物23a-I-Rl(n=8，寡聚物I(oligoI)=siRNA，Rl=画C隱TAT):将化合物22a(737mg,0.0369mmol)与siRNA(50mg，0.00368mmol)在30mLpH7.4的10xPBS緩冲液中反应。反应在室温进行4小时。使用流动相A:20mmolTris，pH7.0和B:20mmolTris,2MNaCl，pH7.0将4l物质在Poros上纯化，然后用pH7.0磷酸盐缓沖液脱盐。产量16.6mg(寡聚物等价物(oligoeq》。然后，将15mg(寡聚物等价物)该物质溶于7mLpH7.0磷酸盐緩沖液。在氮气下加入SH-TAT(64mg,0.039mmol)。该反应进行1.5小时，然后在Source15S树脂上纯化。该柱用緩冲液A(5M脲，lOOmMKH2P04,25%CH3CN,pH6.5)平衡。将该产物用緩冲液B(2MKBr)洗脱。收集的产物用水在HiPrep除盐柱上脱盐并冻干。产量2.4mg(寡聚物等价物)。实施例20A.化合物23a-II-Rl(n=8，寡聚物II(oligoII)=FITC-Genasense，Rl=-C-TAT):将化合物22a与FITC-Genasense反应，然后在与实施例20所述相同的反应条件下与HS-C-TAT反应得到所述产物。实施例20B.化合物23a-II-R2(n=8，寡聚物II=FITC-Genasense，Rl=-C-Arg9):化合物22a与FITC-Genasense反应，然后在与实施例20所述相同的反应条件下与HS-C-Arg9反应得到所述产物。实施例21.化合物24.将8-氨基-3,6-二氧杂辛酸三氟乙酸盐(0.50g,0.18mmol)溶于12mL乙腈/水(l/l)中。该溶液的pH为4。添加TEA以调节pH介于8-9。pH保持在8-9。加入Bsmoc-OSu(0.61g,0.18mmol)后pH降至6。添加更多TEAe以使pH回到8-9。将该反应混合物在室温搅拌45分钟，且在反应结束时pH保持在8-9。将该反应混合物用水(5mL)稀释并用DCM萃取以去除任何剩余起始物质。水层用O.lNHCl酸化并用乙酸乙酯萃取。分离有机层并用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并真空蒸发得到淡黄色油状的化合物24(0.45g，65%产率)13CNMR5173.3，156.1，139.5,137.2，134.1，130.8，130.7,134.1,130.8,130.4,130.3,125.8,121.7,71.4，70.4，70.3,68.8,57.1,41.3，25.8。实施例22.化合物25:向化合物24(0.41g,0.107mmol)和3，5-二曱基-4-羟基-千基-OTBS(0.283g,0.107mmol)在40mL无水DCM(40mL)中的溶液中添加DMAP(26mg，0.021mmol)。将反应混合物冷却至0°C然后添加EDC(0.245g,0.128mmol)。将反应温热至室温并搅拌20小时。将该混合物用水稀释并用DCM萃取，用碌u酸钠干燥。真空蒸发溶剂得到0.65g粗产物。在硅胶柱上纯化，用乙酸乙酯/己烷(l:l，v/v)洗脱得到化合物25(0.59g，88%产率)"CNMRS168.2,155.4,146.2,139.5，138.9,136.9,129.4,126.2,125.2,121.3，70.2,69.9,68.1，64.4，56.4,41.1,26.1,25.9,18.5,16.6，16.5。实施例23.化合物26:在室温向化合物25(363mg，0.6mmol，1.2当量(eq))在200mL无水DCM中的溶液中加入4-哌啶子基-哌啶(90.9mg，0.54mmol,0.9当量)。反应通过TLC监测且在4小时后完成，此时加入20K-8臂-SCPEG(10g，0.5mmol,1当量)。将反应在室温搅拌过夜。部分真空蒸发溶剂并将所得残余物从乙醚中沉淀，然后从DMF/IPA重结晶该固体得到化合物26(9.1g):13CNMR(75.4MHz,CDC13):5-5.35,16.28，18.26,25.25，25.80,40.56,61.40，63.66,64.16,(68.05-73.64,PEG),125.92，129.26,138.64,145.99,151.21，156.01，167.88，168.20实施例24.化合物27:69在0。C将DIEA胺(5.6mL,32.2mmol,70当量)添加至化合物26(9.2g，0.46mmo1,1当量)和氨基-3,6-二氧杂辛酸马来酰亚胺(5.5g，16.1mmol，35当量)在200mL无水DCM中的溶液中直到达到pH为7-8。该反应在室温进行5小时然后在真空部分去除溶剂。然后残余物通过加入乙醚沉淀并用烧瓶在冰箱中储存过夜。将固体过滤并从DMF/IPA重结晶得到化合物27(7g):13CNMR5-5.69,15.90,17.87,25.45,36.44,40.20,42.30,63.19，64.36,67.14,68.05-72.68(PEG),125.51,128.88，133.57，138.19，145.64，155.64，167.45，169.90。实施例25.化合物28:将化合物27(7g)溶于50mL乙腈和11mL水中，然后加入22mL乙酸。将溶液在室温搅拌过夜然后在真空去除溶剂。将残余物用乙醚沉淀然后从DMF/IPA重结晶13C画RS15.97，36.58,40.33，63.35，63.60,67.29,69.08-71.06(PEG),126.50,129.20,133.68,138.73，146.27，155.76,167.55，170.03。将脱保护的化合物(7g,0.35mmol,1当量)溶于14mLDMF和140mL二氯曱烷中，然后将溶液冷却至0。C。加入DSC(717mg，2.8mmo1，8当量)和吡咬(0.204mL,2.52mmol,7.2当量)。将反应混合物逐渐温热至室温过夜。在真空部分去除溶剂然后用乙醚沉淀固体。粗固体从DMF/IPA重结晶。13CNMR516.13,22.40,25.18,36.73,40.50，42.32，63.54,67.47,69.24-71.20(PEG),126.70，128.53,130.27，133.81,148.01，155.93，167.55，168.17，170.20。实施例26.化合物29:将化合物28(1.5g,0.075mmol)与HIFl-a(20mg，0.0036mmol)在8mLpH7.8磷酸盐緩冲液中反应。反应在室温进行2小时。粗物质在Source15Q树脂上纯化。柱用緩冲液A(5M脲，100mMKH2P04，25%CH3CN，pH6.5)平衡。产物用緩沖液B(2MKBr)洗脱。收集的产物用水在HiPrep除盐柱上脱盐并冻干。产物产量17.7mg(寡聚物等价物)。将8.85mg(寡聚物等价物)这种产物与93mgHS-TAT在5mLPH7.0磷酸盐緩沖液中反应。产物在Source15S树脂上纯化并脱盐。产量1.7mg(寡聚物等价物)。实施例27.化合物30:将4NHC1的二,烷(70mL)的溶液添加至BocCys(Npys)-OH(1,5g,13.32mmol)。将该悬浮液在室温搅拌3小时，然后将其倒入700mL乙醚中。将固体通过普通石少芯漏斗(coursefrittedfimnel)过滤而不施加真空，直到结束。该滤饼用乙醚(3x50mL)洗涤然后在真空室温干燥过夜。'HNMR(CD30D)58.93(1H,dd，J=1.5,4.7Hz)，8.66(1H，dd，J=1.5,8.20Hz),7.59(1H，dd，J=4.7,8.2Hz),4.24(1H，dd，J=4.1，9.4Hz)，3.58(1H,dd,J=4.1,14.9Hz),3.36(1H,dd,J=9.4，15.2Hz)。13C丽R(75.4MHz,CDC13):d169.40，156.27，154.64，144.13,135.246，123.10，52.77,39.27。实施例28.化合物31a:向化合物30(1.82g,5.55mmol)在DMF/DCM(25mL/45mL)中的溶液中添加皿8臂-PEG-SC(7.30g，0.35mmol)。然后，添加DIEA(3mL,16.8mmol)且所得悬浮液在室温搅拌5小时。真空蒸发反应混合物然后在0。C用DCM/Et20沉淀。将固体过滤然后溶于80mLDCM中。添加20mL0.1NHC1后，搅拌该混合物5分钟，然后转移至分液漏斗并分离有机层并再次用0.1NHC1(20mL)和盐水(20mL)洗涤。有机层通过MgS04干燥，过滤并在真空蒸发。残余物在0。C用DCM7Et20沉淀。将固体过滤并在真空烘箱在30。C干燥至少2小时13C丽RS170.90，156.66,155.68,153.86，142.41,133.85,121.24,72.96-69.30,64.08,53.01,41.82。实施例29.化合物31b:向化合物30(765mg，2.33mmol)在DMF/DCM(20mL/40mL)中的溶液中添加20K4臂-PEG画SC(6.0g,0.29mmol)。然后，添加DIEA(1.2mL,6.96mmol)且所得悬浮液在室温搅拌5小时。真空蒸发反应混合物然后用DCM/Et20沉淀。将固体过滤然后溶于60mLDCM中。加入15mL的0.1NHCl后，搅拌该混合物5分钟，然后转移至分液漏斗并分离有机层，且用0.1NHCl(15mL)和盐水(15mL)再次洗涤。有才几层通过MgS04干燥，过滤并在真空蒸发。残余物用DCM/Et20沉淀。将固体过滤并在真空烘箱在30。C干燥至少2小时13C醒R5170.76,156.53,155.57,153.85，142.37,133.79,121.23,72,44-69.30,63.99,52.95,45.36，41.82。实施例30.化合物32a-I(n=4，寡聚物I=LNA存活蛋白)向C6-硫代-LNA-存活蛋白(120mg,0.021mmol)在60mL的pH6.5磷酸盐緩冲液中的溶液中添加化合物31a(2.3mg,0.107mmol)并将溶液在室温搅拌1小时。反应过程通过阴离子交换HPLC监测。反应混合物通过0.2微米滤器过滤并装载在Poros阴离子交换柱上。使用20mMTris.HC12MNaCl的pH7.0的緩冲液体系梯度洗脱产物，。脱盐后的产量为80mg(寡聚物等价实施例30A:化合物321>1(11=4，寡聚物I=LNA存活蛋白)向C6-硫代-LNA-存活蛋白(300mg,0.054mmol)在150mLpH6.5磷酸盐緩沖液中的溶液中添加化合物31b(4.8g，0.273mmol),并将溶液在室温搅拌lh。反应过程通过阴离子交换HPLC监测。反应混合物通过0.2微米滤器过滤并装载在Poros阴离子交换柱上。用梯度液洗脱产物，使用在pH7.0的緩冲液体系20mMTris.HC12MNaCl。脱盐后的产量为225mg(寡聚物等价实施例31.化合物33a小Rl(n=8，寡聚物I=LNA存活蛋白，R=Rl=-C-TAT):将化合物32a(80mg(寡聚物等价物)，0.0142mmol)溶于20ml緩冲液(5M脲，100mMKH2P04)t。将溶液在0。C在氮气下冷却然后添加肽C-TAT(329mg，0.198mmol)。观察到浓黄色。在氮气氛下在0。C继续搅拌该反应1.5小时然后使用Source15S树脂通过阳离子交换色谱法纯化。柱(IOmmx10mm)用三倍柱体积緩冲液A(5M脲，lOOmMKH2P04,25%CH3CN,pH6.5)平衡然后将样品装载在柱上。将该产物用緩冲液B(2MKBr)洗脱。冻干收集的产物并在HiPrep除盐柱上用50mM的pH7.4的PBS緩冲液脱盐。然后将脱盐的溶液浓缩至约Img/mL(寡聚物等价物)溶液。产物产量21.75mg(寡聚物等价物)。实施例31A.化合物33a-I-R2(n=84，寡聚物I=LNA存活蛋白，R=R2=_C-Arg9):以与实施例31所述相同的反应条件将化合物32a与C-Arg9反应得到产72物。实施例31B.化合物33a-I-R3(n=84,寡聚物I=LNA存活蛋白，R=R3=-C-TAT-RGD):以与实施例31所述相同的反应条件将化合物32a与C-TAT-RGD反应得到产物。实施例31C.化合物33b-I-R，(n=4,寡聚物I，R=Rl=-C-TAT):将化合物32b(20mg(寡聚物等价物)，0.0035mmol)溶于10ml緩冲液(5M脲，100mMKH2P04)。在0°C氮气下冷却该溶液然后添加肽C-TAT(52mg,0.0315mmol)。观察到浓黄色。在氮气下0°C继续搅拌该反应1.5小时然后使用Source15S树脂通过阳离子交换色谱法纯化。柱(IOmmx10mm)用三倍柱体积的緩沖液A(5M脲，1OOmMKH2P04,25%CH3CN，pH6.5)平衡，然后将样品装载在柱上。将该产物用緩冲液B(2MKBr)洗脱。冻干收集的产物并在HiPrep除盐柱上用50mM的pH7.4的PBS缓冲液脱盐。然后将脱盐的溶液浓缩至约lmg/ml(寡聚物等价物)溶液。产物产量12.5mg(寡聚物等价物)。实施例32.化合物34:向8臂皿-SCPEG(1当量)在DMF中的溶液中添加肽(16当量)。然后，添加DIEA(32当量)且所得悬浮液在室温搅拌5小时。在0。C将该反应混合物用DCM/Et20沉淀。将固体过滤然后使其溶于水。粗固体使用C18反相色语法纯化。收集峰产物(Productpeak)并冻干至固体。实施例33.化合物35:将化合物34添加至2%肼在DMF中的溶液中，且该溶液在室温搅拌4h。将该反应混合物装载在反相柱上并纯化。收集峰产物并冻干。实施例34.化合物36:将化合物35(1当量)溶于20ml緩沖液(5M脲，100mMKH2P04)t。在0。C氮气下冷却溶液，然后添加寡聚物-SH(8当量)。在氮气下0。C继续搅拌该反应1.5小时然后使用Source15S树脂通过阳离子交换色镨法纯化。柱(10mmx10mm)用三倍柱体积緩冲液A(5M脲，lOOmMKH2P04，25%CH3CN，pH6.5)平衡，然后将样品装载在柱上。产物用緩冲液B(2MKBr)洗脱。冻干收集的产物并在HiPrep除盐柱上用50mM的pH7.4的PBS緩沖液脱盐。然后将脱盐的溶液浓缩至约lmg/mL(寡聚物等价物)溶液。实施例35.化合物37:向20k-8臂-PEG琥珀酰亚胺基碳酸酯(1当量)在二氯曱烷中的溶液中添加H-Cys(StBu)-OH盐酸盐(l当量)和二异丙基乙基胺(l当量)。将该反应在室温搅拌约5小时。部分去除溶剂然后用乙醚沉淀。过滤收集粗产物且从2-丙醇结晶。实施例36.化合物38:将化合物37(1当量)和氨基-3,6-二氧杂辛酸马来酰亚胺(35当量)溶于二氯曱烷。然后在水浴中冷却该溶液。添加二异丙基乙基胺(70当量)直到达到pH为7-8。该反应在室温进行6.5小时然后在真空部分去除溶剂。然后固体用乙醚沉淀并用烧瓶在水箱中储存过夜。然后将固体过滤并从DMF/IPA重结晶。实施例37.化合物39:将化合物38(215mg，O.Ollmmol,1当量)溶于緩冲液(5M脲，100mMKH2P04)t。在0。C氮气下冷却溶液然后添加SH-TAT(250mg,14当量)。在氮气下0。C持续搅拌该反应1.5小时，然后在Source15S树脂上纯化。柱用緩沖液A(5M脲，100mMKH2PO4,25。/oCH3CN，pH6.5)平衡。产物用緩沖液B(2MKBr)洗脱。冻干收集的产物并在HiPrep除盐柱上用50mM的PBS(pH7.4)脱盐。然后将脱盐的溶液浓缩至约lmg/mL溶液。实施例38.化合物40:向化合物39(1当量)的水溶液中添加二硫苏糖醇(2当量)。将该反应在室温搅拌两小时然后去除溶剂。粗物质从异丙醇结晶然后与寡聚物-S-S-Py(3当量)的100mM磷酸盐緩冲液(pH6.5)在室温混合2小时。该反应在Source15S树脂上纯化。柱用緩冲液A(5M脲，100mMKH2P04，25%CH3CN,pH6.5)平衡。产物用缓冲液B(2MKBr)洗脱。冻干收集的产物并在HiPrep除盐柱上用50mM的PBS(pH7.4)脱盐。然后将脱盐的溶液浓缩至约lmg/mL溶液。实施例39.化合物41:将20k8臂PEG-OH(2.0g,0.1mmol)溶于DCM(20mL)中。添加TEA(1.62g，16.0mmol)。在0°C经1小时将该溶液添加至丙烯酰氯(0.724g)在DCM(10mL)中的溶液中。将该反应混合物在0。C搅拌过夜。在0。C将该溶液添加至IPA/乙醚(250mL/250mL)。过滤形成的固体。将湿固体溶于DCM并用0.4NHC1洗涤。有机层用硫酸镁干燥并通过硅藻土(celite)过滤。去除溶剂且残余物从DCM/乙醚重结晶。13CNMR(75.4MHz，CDC13):S165.5:130.5，127.8，71.0-67.1(PEG),63.2。实施例40.化合物42:向C6-硫代-LNA-存活蛋白(100mg,0.018mmol)在60mL的pH8.0的磷酸盐緩冲液的溶液中添加化合物41(3.6g,0.18mmol),并将该溶液在室温搅拌1小时。反应过程通过阴离子交换HPLC监测。反应混合物通过0.2微米滤器过滤并装载在Poros阴离子交换柱上。使用20mMTris.HC12MNaCl的pH7.0的緩沖液体系梯度洗脱产物。脱盐后的产量为60mg(寡聚物等价物)。实施例41.化合物43:在氮气下将化合物42(8mg，0.0014mmo1,寡聚物等价物)与SH-TAT-RGD(11lmg，0.0496mmol)在3mL緩冲液(5M脲，100mMKH2P04)t混合。该反应进行2小时。粗产物在Source15S树脂上纯化。柱用緩沖液A(5M脲，100mMKH2P04,25%CH3CN，pH6.5)平衡。产物用緩冲液B(2MKBr)洗脱。收集的产物在HiPrep脱盐柱上脱盐，冻干且产量为57|iig。实施例42.化合物46:在黑暗中向1,2-二(吡啶-2-基)二硫烷(disulfane)(化合物44)(8.8g,39.9mmol)在50mL无水乙酸乙酯中的溶液中添加3-疏基丙酸(4.2g,39.9mmol)，75然后添加13滴三氟硼烷乙醚络合物(trifluoroboraneetherate)。在黑暗中将该反应搅拌5小时然后过滤。然后将50mL冷乙酸乙酯添加至该固体。然后将滤液旋转蒸发(rotovaped)至约50mL的化合物45的溶液。向该溶液添加肼基曱酸叔丁酯(t-butylcarbazate)(4.8g,36.3mmol),然后添加DCC(7.5g，36.3mmol)。将该反应在室温黑暗中搅拌16小时然后将其过滤，蒸发并通过柱色语使用1:1己烷/乙酸乙酯的混合物纯化得到8.1g产物化合物46。"CNMR5170.1，158.9，155.2，149.5，137.0,121.1,120.4,81.5，34.9，33.7，28.2。实施例43.化合物47:在0。C向2-(3-(吡啶-2-基二硫基(disulfanyl))丙酰基)肼曱酸叔丁酯(化合物46)(8,1g，24.6mmol)在64mL的DCM中的溶液中添加16mLTFA。将反应在室溫搅拌1小时。反应完成后，旋转蒸发溶剂然后残余物在0。C从20/300mLDCM/Et20沉淀。将固体过滤并干燥得到5.5g化合物47:13C丽R5173.8,159.6，147.9,138.5，121.1，120.7，33.4,32.2。实施例44.化合物49:在0。C向3,3-二乙氧基丙-1-胺(化合物48)(5.2g，35.3mmol)在30mLDCM的溶液中添加Fmoc-OSu(24g,70.6mmol),然后温热至室温。将该反应在室温搅拌2小时直到通过TLC观察到没有起始物质。然后该反应用30mLDI水稀释。水层用2x30mLDCM萃取，然后有机层通过无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩。粗物质通过柱色谱使用DCM作为洗脱溶剂纯化，得到5.7g化合物49:13CNMR5156.2,143.9,141.2,127.5,126.9,125.0,119.8，102.2，66.5,61.8,47.3,37.2,33.3,15.4。实施例45.化合物50:在室温将化合物49(200mg)在86%曱酸(1.1mL)中搅拌1小时。在室温真空用Rotavapor去除溶剂且将残余物溶于DCM(30mL)中。该溶液用水(30mL)洗涤。分离的有机层用硫酸镁干燥。完全去除溶剂得到白色固体化合物50(145mg):13C丽R5156.2,143.7，141.2,127.6,126.9，124.9,119.9,66.7，47.2,44.1,34.5。76实施例46.化合物51:将化合物47(258.3mg,0.8746mmol)和化合物50(300mg，0.8746mmol)溶于THF(15mL)。添加分子筛。该反应在10分钟内完成。反应后过滤分子筛。去除溶剂且残余物用乙醚洗涤得到粗化合物51(385mg)。实施例47.化合物52:不进一步纯化，将化合物51(270mg，0.53mmol)用10%(w/v)DMAP(0.54g)的DMF(5.4mL)溶液在氮气下室温处理8.5小时，得到化合物52。将20k8臂SCPEG(650mg,0.033mmol)原位(insitu)添加至反应混合物。反应在室温放置过夜。去除溶剂且残余物用DCM/乙醚(ether)沉淀。分离的湿固体从乙腈/IPA重结晶两次得到含E和Z异构体的化合物10(630mg):13CNMR5172.1,166.8,159.7，159.1,156.0,149.1,149.0，144.8，136.9,136.7,120.7，120.3,119.7,119.3，78.0-69,2(PEG),63.5，37.6,37.5,34.4,34.1,33.2,32.8,32.4,32.1。实施例48.化合物54:向C6-硫代-LNA-存活蛋白(10mg,0.0018mmol)在5mLpH7.0的磷酸盐緩沖液中的溶液中添加化合物53(0.36g，0.018mmol)，并将溶液在室温搅拌1小时。反应过程通过阴离子交换HPLC监测。反应混合物通过0.2微米滤器过滤并装载在Poros阴离子交换柱上。使用20mMTris.HC12MNaCl的pH7.0的緩冲液体系梯度洗脱产物。脱盐后的产量为2mg(寡聚物等价物)。实施例49.4匕合物55:在氮气下将化合物54(3mg，0.00053mmo1，寡聚物等价物)与SH-TAT-RGD(16.7mg,0.00743mmol)在lmL的pH7.0磷酸盐緩冲液中混合。该反应进行2小时。粗产物在Source15S树脂上纯化。柱用缓沖液A(5M脲，100mMKH2P04,25%CH3CN，pH6.5)平衡。产物用缓冲液B(2MKBr)洗脱。收集的产物在HiPrep除盐柱上脱盐并冻干。实施例50.化合物56:在室温向20K4臂PEGNHS(5g,0.25mmol)在50mL无水DCM中的溶液中添力口4-氨基丙醛缩二乙醇(4-aminopropionaldehydediethylacetal)(0.04g，0.275mmol)。将该反应混合物在室温搅拌20小时。真空蒸发溶剂且粗化合物用乙腈/IPA结晶得到白色固体的化合物56(4.7g):13CNMR5168.17，155.87,151.38，101.37，70.21,69.89，63.46，61.29,45.22,36.78,33.24,25.19,15.12。实施例51.化合物57:在室温向化合物30(0.36g,0.117mmol)在10mL无水DCM中的溶液中添加DIPEA(0.40mL，0.233mmoles)。向该撹拌的混合物中添加化合物56(4.00g,0.0194mmol)在30mL无水DCM中的溶液，然后添加DMF(13mL)。将该反应混合物在室温搅拌5小时。真空蒸发溶剂且所得残余物用DCM/乙醚沉淀。粗化合物用乙腈/IPA重结晶得到白色固体化合物57(3.6g):13CNMRS170.74，156.53,155.49,153.75,142.27,133.69,121.08,101.44，70.66,69.70，69.17,63.89，63.51，62.71,61.34，53.37,52.91,45.27，41.74,36.84,33.27,25.15,15.15。实施例52.化合物58.在室温向化合物57(0.70g,0.0:34mmol)在氯仿中的溶液中添力口(8S。/c))曱酸(0.15mL)。反应混合物在室温搅拌20小时。在真空蒸发溶剂。将粗油状物用乙醚研制得到淡黄色固体化合物58(0.65g):13CNMR:S170.72，161.87,160,59,156.59,55.57，153.76,142.33，133.75，121.14，70.30,69.75,69.19,68.59:63.98，63.75,62.77,61.40，53.55,52.93,45,31,43.88，41.76,34,26。实施例53.化合物59:将化合物58(53mg,0.026mmol)与C10-存活蛋白酰肼(C10-survivinhydrazide)(6mg，0.885pmol)在2mL的pH7.0磷酸盐緩沖液中反应。反应在室温进行2小时。；祖物质4吏用流动相A:20mmolTris,pH7,0和B:20mmolTris，2MNaCl，pH7.0在Poros上纯化，然后用水脱盐。产量1.5mg(寡聚物等价物)。将1.2mg(寡聚物等价物)该物质溶于0.5mL緩冲液(5M脲，100mMKH2P04)。在氮气下添加SH-TAT(2.3mg,0.00138mmo1)。该反应进行1.5小时，然后在Source15S树脂上纯化。柱用緩冲液A(5M脲，100mMKH2P04,7825%CH3CN，pH6.5)平衡。产物用緩沖液B(2MKBr)洗脱。收集的产物在HiPrep除盐柱上用pH7.4PBS脱盐并冻干。产量250(ig(寡聚物等价物)。实施例54.化合物60:向4-羟基-3,5-二甲基苯曱醛(1.36g，10mmol)在无水曱醇(5mL)中的溶液中添加1.0M四氟硼酸锂(0.3mL)，然后添加原曱酸三曱基酯(1.378g,13mmol)。将该反应混合物回流3小时然后通过加入饱和碳酸氢钠(20mL)淬灭。混合物用乙酸乙酯萃取两次(60mL,30mL)。合并的有机层用饱和氯化钠(20mL)洗涤并用MgS04干燥。过滤后真空蒸发溶剂得到化合物60。实施例55.化合物62:向化合物61(10g，0.25mmol)在无水DCM(100mL)中的溶液中添加化合物60(50.0mg，0.275mmol)，然后添加DMAP(33.6mg,0.275mmol)。混合物回流过夜。真空蒸发溶剂且残余物用DCM/乙醚结晶。分离湿固体且从CNCH3/IPA重结晶得到化合物62。实施例56.化合物63:向化合物62(10g，0.25mmol)在无水DCM(100mL)中的溶液中添加化合物18(342mg,1.5mmol)，然后添加DMAP(183mg,1.5mmol)。混合物回流过夜。真空蒸发溶剂且残余物用DCM/乙醚结晶。分离湿固体且从CNCH3/IPA重结晶得到化合物63。实施例57.化合物64:将化合物63(0.7g,0.0175mmol)溶于氯仿(0.6mL)。添加曱酸(85%，0.15mL)。混合物搅拌过夜。真空蒸发溶剂且残余物从DCM/乙醚重结晶得到化合物64。实施例58.化合物65:将化合物64与SH-TAT-RGD在pH7.0磷酸盐緩冲液中在氮气下混合。该反应进行2小时。粗产物在Source15S树脂上纯化。柱用緩冲液A(5M脲,100mMKH2P04,25%CH3CN,pH6.5)平衡。产物用緩沖液B(2MKBr)洗脱。冻干。实施例59.4匕合物68:向8臂PEG-SC(5.5g，0.26mmol)在115mL无水DCM中的溶液中添加化合物66(117.2mg，0.28mmol,1.1当量)。反应混合物搅拌过夜，然后添加化合物67(1.75g,4.52mmol，17.5当量)在60mLTHF中的溶液，且混合物在室温搅拌4天。真空去除溶剂且所得固体用IPA重结晶两次得到化合物68(4.4g):13CNMRS27.93,35.19，37.27,52.53,52.87,53.03，56.26，56.64，61,09,62,77,63.60，69.35-70.51(PEG),126.67，127,78,128.73，137.38，155.87，169.47。实施例60.化合物69:将化合物68添加至TFA/DCM溶剂混合物(50/100mL)中，且该混合物在室温搅拌过夜。真空去除溶剂且残余物通过加入乙醚沉淀。将固体过滤且用IPA重结晶得到化合物3的羧酸(4.6g):13CNMRd33.88,35.54，48.65,49.72，50.68,51.48，56.47，56.85，59.67,61.05,64.18，69.05-70.36(PEG),128.79，129.81，156.43,169.30。在00C向羧酸(3.3g,0.14mmol,1当量)和3，5-二曱基-4-羟基-千基-OTBS(114mg，0.43mmol,3当量)在52mL无水DCM中的溶液中添加DMAP(105mg,0.86mmol,6当量)和EDC(110mg，0.57mmol，4当量)。反应混合物在室温搅拌。真空去除溶剂且残余物用DCM/乙醚沉淀。过滤所得固体且用IPA重结晶得到化合物69(3g):13CNMR5-5.29,16.35,25.86,34.15,36.34，50.01，51.36，52.12,56.67，56.93，60.54，61.52,63.92,64.21，69.25-71.34(PEG),125.98,127.88,128.12，128.36,129.23，156.17，169.90。实施例61.化合物70:将化合物69(3g)溶于12mL乙腈和6mL水，然后加入30mL乙酸。溶液在室温搅拌过夜，然后真空去除溶剂。固体用乙醚沉淀然后从DMF/IPA重结晶得到脱保护的醇。将醇(2.7g，0.08mmol，1当量)溶于3mLDMF和30mL的二氯曱烷，然后将溶液冷却至0。C。添加DSC(170mg,0.65mmol,8当量)，然后添加吡啶(46nL,0.57mmol,7.2当量)。将反应混合物逐渐温热至室温过夜。真空部分去除DCM然后用乙醚沉淀该固体。然后将固体从80DMF/IPA重结晶得到化合物70(2.3g)。实施例62.化合物71:向寡聚物-丽2(oligo-NH2)(3mg，0.5pmol)在PBS緩沖液(1.5mL，pH7.8)中的溶液中添加化合物70(140mg，5pmol)，并在室温搅拌2小时。将反应混合物用水稀释至10mL，并将其装载在PorosHQ、强阴离子交换柱(IOmmx1.5mm,柱床体积16mL)上，该柱用20mMTris-HCl緩冲液，pH7.0(緩沖液A)预平衡。将该柱用3-4倍柱体积的緩冲液A洗涤以去除过量PEG连接基。然后该产物以流速为10mL/分钟用梯度为0至100%的1MNaCl在20mMTris-HCl缓冲液(pH7.0,缓沖液B)中的溶液洗脱10分钟，然后以100%緩冲液B洗脱10分钟。洗脱的产物用HiPrep除盐柱(50mL)除去盐分并冻干得到化合物71。产量2.2mg(寡聚物等价物，73%)。生物学数据实施例63化合物23a-II-Rl的体外细胞摄取测定癌细胞的细胞摄取以确定寡核苷酸缀合(conjugate)至包含带正电荷部分的PEG聚合物作用。本发明的缀合物(23a-II-Rl)包含连接至C-TAT(SECIDNO:1)的七个臂以及连接至5'反义BCL-2寡核苦酸，TCTCCCAGCGTGCGCCAT,(SECIDNO:6)的一个臂。对照缀合物类似于化合物23a-II-Rl，但不包含带正电荷的部分TAT。化合物101的寡核苷酸和对照寡核苷酸均通过供应商提供的方法用FITC标记。在37。C，在4孔板中，用10%FBS生长培养基培养A549人肺癌细胞过夜。细胞用每种待测化合物转染，用PBS洗涤三次，并添加50%甘油的PBS的溶液(20ml100%甘油+20mlPBS)以在载波片上覆盖细胞。将载波片在4°C储存过夜。使用焚光显微镜和共聚焦显微镜以显示PEG-寡核香酸的细胞摄取。待测化合物的细胞摄取示于图13(荧光显微镜图像)和图14(共聚焦显微镜图像)。数据显示癌细胞摄取该带负电荷的治疗剂，如缀合至带正电荷的聚合物的寡核苷酸。数据表明聚合物的正电荷骨架使得治疗性的寡核苦酸穿过细胞膜并达到肿瘤细胞中的靶位。实施例6423a-II-Rl的细胞才聂取的效力在存在或不存在转染试剂的情况下使用化合物23a-II-Rl以显示化合物的细胞摄取效力。在37°C，将含10%FBS生长培养基的培养基中的A549人肺癌细胞在6孔板中培养过夜。之后，去除培养基且细胞用lml/孔含每种待测化合物的10%FBS生长培养基处理。对照化合物为未结合至聚合物或带正电荷的部分的寡核芬酸，反义BCL-2寡核苷酸(SECID:7)。对照和本发明化合物均用FITC标记以显示化合物的细胞摄取。结果示于图15。细胞摄取连接至化合物23a-II-Rl的寡核苷酸多于没有转染试剂的对照寡核芬酸。与天然寡核香酸相比，当培养基含血清时，缀合至带正电荷聚合物的寡核芬酸的细胞摄取明显改进，这与体内环境相似。结果表明本发明的聚合物增加带负电荷的治疗剂如寡核苷酸向靶细胞的递送，因此基于寡核苷酸的治疗可从该优点获益。实施例6523a-II-Rl和23a-II-R2的剂量依赖性细胞摄取使用流式细胞仪以显示缀合至带正电荷的聚合物的寡核苦酸的细胞摄取效力。在37°C，将含10%FBS生长培养基的培养基中的A549人肺癌细胞在6孔板中培养过夜。之后，去除培养基且用lml/孔各含化合物23a-II-Rl和天然寡核苷酸(SEQIDNO:6)的10%FBS生长培养基处理细胞。处理后，收获细胞，胰蛋白酶处理，用1%BSAPBS洗涤三次并使用FACS分析。化合物101的寡核芬酸和对照寡核苷酸用FITC标记。结果示于图16。结果显示缀合至带正电荷的聚合物的含TAT(23a-II-Rl)或Arg9(23a-II-R2)的寡核香酸以剂量依赖性方式被细胞摄取。这种特性在治疗癌症中是有利的，因为临床医生可根据患者的需要调节治疗性寡核苷酸的剂量。实施例6623a-I-Rl的BCL2mRNA下调进行该研究以确定癌细胞摄取的寡核苷酸是否下调癌症相关的特异基因表达。A431细胞用天然寡核苷酸和不含转染试剂的化合物23a-I-Rl转染。所述带正电荷的聚合物缀合物包含TAT和BCL2siRNA。BCL2mRNA的RT-PCR分对斤如图17所示。这些结果显示4b合物102的寡核苷酸和对照寡核苷酸均在人肺癌细胞中剂量依赖性地下调了BCL2mRNA表达。与天然Bcl2siRNA相比，缀合至带正电荷的聚合物的BCL2siRNA显示明显较高的BC12mRNA表达的下调。结果表明本文所述的包含反义寡核苷酸或siRNA的PEG-寡核香酸缀合物使得siRNA用作治疗剂。实施例67在AM9细胞模型(实体肿瘤，肺癌)中，通过[RGD-TATC-S-S7-20K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA下调存活蛋白mRNA进行该研究以确定带正电荷的聚合物对存活蛋白mRNA表达的影响。A549人肺细胞用化合物33b-I-R4、33b-I-R5和33a-I-R3中的每一个以浓度1000nM、200nM、40nM、8nM和1.6nM转染。化合物33b-I-R4([直链RGD-S-S]r2GK4臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)和33b-I-R5([环状RGD-S-S]3-2QK4臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)均包含反义存活蛋白LNA但不包含带正电荷的肽(TAT)。化合物3h-I-R3([RGD-TATC-S-S]7-2°K8臂PEG-SS-反义存活蛋白LNA)包含TAT肽和反义存活蛋白LNA。处理一天后，通过RT-PCR检测用每种化合物处理的A549细胞中的存活蛋白mRNA表达。不含转染试剂的情况下，包含TAT肽的化合物明显下调了存活蛋白mRNA表达。该下调是剂量依赖性的。这些结果示于图18。不含TAT肽的化合物的反义存活蛋白LNA和天然反义存活蛋白LNA都没有抑制存活蛋白mRNA表达。数据显示使用带正电荷的聚合物有利于使用带负电荷的寡核香酸的治疗。实施例68在DU145细，型(实体肿瘤，前列腺癌)中，通过[RGD-TATC-S-S7-2°K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA下调存活蛋白mRNADU145细胞用与实施例67使用的相同化合物转染。如实施例67，含TAT肽的化合物显示明显的存活蛋白mRNA表达的下调。在DU145细胞中，天然反义存活蛋白LNA和不含带正电荷的肽的化合物的反义存活蛋白LNA都没有下调存活蛋白mRNA表达。这些结果示于图19。数据表明带正电荷的聚合物可有利于治疗各种类型的癌症。在DU145细胞中观察到存活蛋白mRNA下调与对化合物33a-I-Rl(TATC-S-S)7-2°K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)的研究类似。实施例69在A549细胞模型中，通过[(Arg)9C-S-S7-加K8臂PEG-S画S國反义存活蛋白LNA下调存活蛋白mRNAA549人肺癌细胞用化合物33a-I-R2和天然反义存活蛋白LNA中的每一种转染。化合物33a-I-R2([(Arg)9C-S-S]7-20K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)包括连接至C(Arg)9的七个聚合物臂末端和经细胞内可释放的二硫键连接至反义存活蛋白LNA的一个臂末端。该天然寡核苦酸(反义存活蛋白LNA)也用转染试剂lipofectamine转染。含(Arg)9的化合物在没有转染试剂的情况下明显下调了存活蛋白mRNA表达。结果示于图20。数据表明本发明含带正电荷的肽如TAT和(Arg)9的聚合物使得治疗性寡核苷酸递送至细胞内的靶位。该基于寡核苷酸的抗癌疗法可受益于带正电荷的聚合物。实施例70通过含细胞内不稳定的连接基的带正电荷的聚合物下调存活蛋白的mRNAA549细胞用化合物59和反义存活蛋白LNA二聚物中的每一种转染。由C6-SH尾修饰的反义存活蛋白LNA的二聚物(反义存活蛋白LNA-C6-S-S-Q-反义存活蛋白LNA)还用该转染试剂转染。化合物59含有基于腙的可释放的连接基。该mRNA下调结果示于图21。通过腙连接基连接至聚合物的反义存活蛋白LNA下调存活蛋白mRNA表达。数据表明该通过腙连接基连接的反义寡核苷酸可在穿过细胞膜后在细胞内从聚合物释放。其表明该聚合物可使用各种类型的可释放的连接基如二硫键和基于腙的连接基，并调整反义寡核苷酸从聚合物的释放速率和位点。实施例71在A549细胞模型中，通过[RGD-TATC-S-S7-20K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA下调存活蛋白mRNA进行该研究以确定含靶向剂的带正电荷的聚合物是否与不含靶向剂的带正电荷的聚合物同样有效，从而该含靶向剂的聚合物可用于輩巴向递送。A549细胞用化合物33a-I-Rl(TATC-S-S)7-2°K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白-TATC-S-S]7-20K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)中的每一个转染。在化合物33a-I-Rl和33a-I-R3中，将七个聚合物臂末端分别连接至C-TAT和C-TAT-RGD。该细胞也在有转染试剂或没有转染试剂的情况下，用由SH-Cs尾修饰的反义存活蛋白LNA转染。含有靶向剂或不含靶向剂的聚合物都下调了存活蛋白mRNA表达。结果示于图22。这种带正电荷的聚合物的特征有利于寡核苷酸治疗剂的靶向剂的定向递送。实施例71.存活蛋白mRNA表达的特异抑制进行该研究以确定在穿过癌细胞膜后寡核苦酸是否选择性抑制基因表达。A549人肺癌细胞用化合物33a-I-Rl(TATC-S-S)7-2°K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)、化合物33a-II-Rl(TATC-S-S)7-20K8臂PEG-S-S-乱序的(scrambled)存活蛋白LNA)和天然反义存活蛋白LNA中的每一种转染。化合物33a-II-Rl相应于化合物33a-I-Rl,除了其在反义存活蛋白LNA中包括错配核苷酸(乱序的存活蛋白LNA:5，-smCsGsmCsAsgsaststsasgsasasAsmCsmCst-3，)。天然反义存活蛋白LNA也用该转染试剂转染。结果示于图23。结果表明与化合物33a-II-Rl的错配反义存活蛋白LNA和天然反义存活蛋白LNA相比，化合物33a-I-Rl的反义存活蛋白LNA明显抑制存活蛋白mRNA表达。含错配核苷酸的反义存活蛋白LNA没有抑制存活蛋白基因表达。该mRNA下调是特异性抑制。该特征是令人满意的，以使在癌症治疗中不需要的基因表达选择性下调。实施例73.在Calu-6肿瘤中体内存活蛋白下调在用Calu6肿瘤细胞异种移植的小鼠中评价含有反义存活蛋白LNA的PEG的三种类似物的存活蛋白下调效力。每个组用化合物33a-I-Rl(TATC-S-S)7-20K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)、化合物33a-I-R3([RGD-TATC-S-S]7-2°K8臂PEG-SS-反义存活蛋白LNA)或化合物33a-I-R2([(Arg)9C-S-S]7-20K8臂PEG-S-S-反义存活蛋白LNA)治疗。治疗后，当小鼠处死时切除肿瘤组织且测定存活蛋白mRNA表达。与天然反义存活蛋白LNA相比，所有三种含反义存活蛋白LNA的聚合物在肿瘤组织中明显抑制存活蛋白mRNA表达。该结果示于图24。结果显示连接至带正电荷的聚合物的寡核苦酸在癌症如实体肿瘤的治疗中比天然反义存活蛋白LNA明显更有效。权利要求1.式(I)的化合物{Z2}b——R1——{Z1}a其中每个Z1独立地为每个Z2是独立选择的封端基团、——(L″″1)i″-(B″1)c″；R1是基本上非抗原性的聚合物；R2和R’2是独立选择的含正电荷的肽或含氮的环烃部分；R3和R’3是独立选择的靶向剂；R4为生物活性部分；B1、B’1和B”1是独立选择的支链基团；L1、L’1、L1”、L1’”和L1””是独立选择的双官能连接基；L2、L’2和L”2是独立选择的可释放的连接基；(a)为正整数；(b)为零或正整数；(c)、(c’)和(c”)独立地为零或正整数；(d)、(d’)、(i)、(i’)和(ii)独立地为零或正整数；(e)为正整数；(e’)和(e”)独立地为零或正整数；(f)和(f’)独立地为零或正整数；(g)为正整数；(g’)为零或正整数；和(h)和(h’)独立地为正整数；条件是当(b)不为零且所有Z2为封端基团、——(L″″1)i″-(B″1)c″或其组合时，(g’)为正整数。2.根据权利要求1的化合物，其具有下式:3.根据权利要求1的化合物，其中(a)和(b)的和为约1至约32。4.根据权利要求1的化合物，其中(a)和(b)的和为2、3、4、8、16或32。5.根据权利要求1的化合物，其中Z2为封端基团且(a)和(g，)为1。6.根据权利要求1的化合物，其中(a)为1且(b)为1至7的正整数。7.根据权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分选自含-NH2的部分、含-OH的部分和含-SH的部分。8.根据权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分选自药物活性化合物、酶、蛋白质、寡核苷酸、抗体、单克隆抗体、单链抗体和肽。9.根据权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分包括寡核脊酸。10.根据权利要求7的化合物，其中所述寡核苦酸选自反义寡核苷酸、锁核酸(LNA)、短干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、适体、肽核酸(PNA)、磷酰二胺吗啉代寡核香酸(PMO)、三环-DNA、双链寡核香酸(诱捕性ODN)、催化性RNA(RNAi)、适体、镜相异构物、CpG寡聚物及其组合。11.根据权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分选自反义Bcl-2寡核苷酸、反义HIF-la寡核苷酸和反义存活蛋白寡核香酸。12.根据权利要求1的化合物，其中所述肽包含约1至约50个带正电荷的氨基酸。13.根据权利要求1的化合物，其中所述肽包含约2至约20个带正电荷的氨基酸。14.根据权利要求1的化合物，其中所述肽包括CYGRKKRRQRRR(SEQIDNO:l)或CRRRRRRRRR(SEQIDNO:2)。15.根据权利要求1的化合物，其中所述含氮的环烃具有下式<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中(aa)为约2至IO的正整数;(bb)为1、2或(cc)为1或2;(dd)为约1至约5的正整数；R,o,独立地选自氢、d—6烷基、(:2.6烯基、(32.6炔基、C3—19支链烷基、C3-8环烷基、Cw取代的烷基、C2-6取代的烯基、。2.6取代的炔基、C3—8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、d，6杂烷基、取代的Cw杂烷基、Cw烷氧基、芳氧基、d—6杂烷氧基、杂芳氧基、C2—6烷酰基、芳基羰基、C^烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2—6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C^取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2—6取代的烷酰基氧基、取代的烷酰基氧基和芳基羰基氧基；和(q)为约2至约30的正整数。16.根据权利要求15的化合物，其中所述含氮的环烃选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>17.根据权利要求1的化合物，其中所述靶向剂选自单克隆抗体、单链抗体、细胞粘附肽、细胞穿透肽、受体配体、耙向碳水化物分子或凝集素和寡核苷酸。18.根据权利要求1的化合物，其中所述靶向剂选自RGD肽、选择蛋白、TAT、穿膜肽、(Arg)9和叶酸。19.根据权利要求1的化合物，其中B,和B、独立地选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>其中Rs独立地选自氢、C,-6烷基、(^.6烯基、C2-6炔基、Cw9支链烷基、C3.8环烷基、C,，6取代的烷基、(32.6取代的烯基、C2，6取代的炔基、(33.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C,.6杂烷基、取代的C,-6杂烷基、C,—6烷氧基、芳氧基、Cb6杂烷氧基、杂芳氧基、C^烷酰基、芳基羰基、C2.6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2.6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C^取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基，和取代的芳基羰基氧基；(cl)、(c2)、(c3)、(c4)、(c5)、(c6)、(c'6)、(c"6)、(c7)和(c8)独立地为零或正整数，和(dl)、(d2)、(d3)、(d4)、(d5)和(d7)独立地为零或正整数。20.根据权利要求19的化合物，其中B,和B，,独立地选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage0</formula>21.根据权利要求1的化合物，其中L,和L、独立地选自氨基酸和氨基酸衍生物。22.根据权利要求1的化合物，其中L,和L、独立地选自-[c(=o)]v(CR22R23)t[C(=0)]v，-,-[c(=o)]v(CR22R23)rO[C(K))]v,-，-[c(=o)]v(CR22R23)t-NR26[C(=0)]v，-，-[c(=o)]vO(CR22R23)t[C(=0)]v,-,-[c(=0)]vO(CR22R23)tO[C(=0)]v，-,-[c(=o)]vO(CR22R23)tNR26[C(=0)]v,-，-[c(=0)]vNR21(CR22R23)t[C(=0)]v'-，-[c(=0)]vNR21(CR22R23)tO[C(=0)]v，-,-[c(=0)]vNR21(CR22R23)tNR26[C(=0)]v，-,-[c(=o)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=0)]v'-，-[c(=0)]v(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t,[C(=0)]v'-,-[c(=o)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=0)]v，-，-[c(=0)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t，[C(=0)]v'-，-[c(=o)]vO(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t,[C(=0)]v'-，-[c(=o)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=0)]v'-，-[c(=o)]vNR21(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=0)]v'-，-[c(=o)]VNR2,(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t,[C(喝]v,-,-[c(=0)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t，[C(=0)]v'-,-[c(=0)]v(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v'-,-[c(=0)]v(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v，-,-[c(=0)]vO(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v'-，画[c(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v'-，-[c(=o)]vNR21(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v-，-[c(=o)]vNR21(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v-，-[c(=o)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t，[C(=0)]v'-,-[c(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t，[C(=0)]v'-，-[c(=o)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,[C(=0)]v--[c(=o)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'0[C(=0)]v'-，-[c(=o)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'[C(=0)]v，-,-[C(=0)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'NR26[C(=0)],-，-[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t，0[C(=0)]v'-，-[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'[C(=0)]v'-，-[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R290)t，NR26[C(=0)]v'--[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'0[C(=0)]v'-，-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t，[C(=0)]v,-，-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'NR26[C(=0)]、-[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24R25)t,NR26[C(=0)]v,--[C(=0)]vO(CR22R23)t~^j^(CR24R25)t,0[C(=0)]、-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t~^^(CR24R25)t,NR26[C(=0)]v,-禾R■27-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t"^^~(CR24R25)t,0[C(=0)]v.-其中R化29独立地选自氢、C,-6烷基、Cw2支链烷基、C3—8环烷基、C^取代的烷基、C3—8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、Cw杂烷基、取代的d.6杂烷基、d.6烷氧基、苯氧基和Q.6杂烷氧基；(t)和(t，)独立地为零或正整数；和(v)和(v，)独立地为零或i。23.根据权利要求1的化合物，其中L,和L，,独立地选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>24.根据权利要求1的化合物，其中k和L，2独立地选自基于千基消除的连接基、基于三烷基锁定的连接基、基于N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸的连接基、酸不稳定的连接基、溶酶体可切割的肽和组织蛋白酶B可切割的肽。25.根据权利要求24的化合物，其中所述酸不稳定的连接基选自二硫基、含腙的连接基和含巯基丙酸的连接基。26.根据权利要求24的化合物，其中L2和L，2独立地选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>-Val-Cit-C(=0)-CH2OCH2-C(=0)-，-Val-Cit-C(=0)-CH2SCH2-C(=0)-,和-NHCH(CH3)-C(=0)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=0)-其中，Yu.w独立地为O、S或NR48;R3l-48、R5G-5l和As,独立地选自氢、C"烷基、Cw2支链烷基、C3-s环烷基、d，6取代的烷基、C3，8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、Q.6杂烷基、取代的d-6杂烷基、C,—6烷氧基、苯氧基和C,—6杂烷氧基；Ar为芳基或杂芳基部分；L,w5是独立选择的双官能间隔基；J和J，独立地选自主动转运至靶细胞的部分、疏水部分、双官能连接部分和其组合；(cll)、(hll)、(kll)、(111)、(mll)和(nll)是独立选择的正整数;(all)、(ell)、(gll)、(jll)、(oll)和(qll)独立地为零或正整数；和(bll)、(xll)、(x，ll)、(fll)、(ill)和(pll)独立地为零或1。27.根据权利要求1的化合物，其中所述封端基团选自H、NH2、OH、C02H、d.6烷氧基和d.6烷基。28.根据权利要求l的化合物，其中R,包括直链、支链或多臂的聚环氧烷。29.根据权利要求28的化合物，其中所述聚环氧烷选自直链、支链或多臂的聚乙二醇和直链、支链或多臂的聚丙二醇。30.根据权利要求28的化合物，其中所述聚环氧烷选自-Y71-(CH2CH20)n-CH2CH2Y71-,-Y71-(CH2CH20)n-CH2C(=Y22)-Y71-,和-Y71-(CR71R72)a2-Y73-(CH2)b2-0-(CH2CH20)n-(CH2)b2-Y73-(CR71R72)a2-Y71-,其中Y"和Y"独立地为O、S、SO、S02、服73或化学键；Y72为O、S或NR74;R".73独立地选自氢、Cw烷基、<:2.6烯基、C2-6炔基、Cw9支链烷基、C3—8环烷基、C,-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C,_6杂烷基、取代的d—6杂烷基、C,—6烷氧基、芳氧基、d，6杂烷氧基、杂芳氧基、C2，6烷酰基、芳基羰基、C2—6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2.6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2，6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；(a2)和(b2)独立地为零或正整^:;且(n)为约10至约2300的整数。31.根据权利要求28的化合物，其中所述聚环氧烷包括式-0-(CH2CH20)n-的聚乙二醇，其中(n)为约10至约2,300的整数。32.根据权利要求1的化合物，其中Ri的平均分子量为约2,000至约100，000道尔顿。33.根据权利要求1的化合物，其中R,的平均分子量为约5,000至约60,000道尔顿。34.根据权利要求1的化合物，其中R,的平均分子量为约5,000至约25,000道尔顿或约20,000至约45,000道尔顿。35.根据权利要求1的化合物，其具有选自以下的式(la)(R'3)f一(R2)g—(L'2)e'—(LN)d.^(B、)c.j"F^"[(B0c^f(L山一(L2)e—R,其中(e)为1或2;(e，)为0、1或2;且(f')为0或1;和(lb)Ri--(Li)d—(L"2)e..—(R'2)q.—(L2)e—R4其中(g，)为正整数。36.根据权利要求l的化合物，其具有下式:CH30_(CH2CH20)nZ-(CH2CH2。)n—禾「口、(OCH2CH2)n、0\(OCH2CH2)n、0-Z-(OCH2CH2)nZ-(OCH2CH2)n'Z-(OCH2CH2)n'-(CH2CH20)n—-0_(CH2CH20)n-其中(CH2CH20)n-Z(CH2CH20)n-Z(CH2CH20)n-ZZ-(OCH2CH2)n-00-(CH2CH20)n-Z，oo/rz每个Z为Z,或Z2其中每个z,独立地为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>每个Z2是独立选择的封端基团、<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>h'，或数。L2、L，2和L"2独立地为可释放的连接基，其选自二硫基、含腙的连接基、含巯基丙酸的连接基、基于卡基消除的连接基、基于三烷基锁定的连接基和基于N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸的连接基、溶酶体可切割的肽和组织蛋白酶B可切割的肽；(c)、(c，)和(c")独立地为零或正整数；(d)、(d，)、(i)、(i，)和(i")独立地为零或正整数；(e)为正整数；(e，)和(e")独立地为零或正整数；(f)和(f，)独立地为零或正整数；(g)为正整数；(g，)为零或正整数；(h)和(h，)独立地为正整数，和所有其它变量如前所定义，条件是当所有Z2为封端基团、一(L'"'1V—(8"1)。''或其组合时，(g，)为正整37.根据权利要求1的化合物，其选自<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>38.治疗方法，包括向需要的哺乳动物给药有效量的权利要求1的化合物。39.向哺乳动物细胞给药多核苦酸的方法，包括向需要这种治疗的细胞递送有效量的权利要求1的化合物。全文摘要本发明提供含带正电荷部分的聚合缀合物。还公开了制备该聚合物递送体系的方法和使用其治疗哺乳动物的方法。文档编号A61K31/7028GK101516362SQ200780034234公开日2009年8月26日申请日期2007年9月15日优先权日2006年9月15日发明者伊万·霍拉克,靖夏,普拉桑纳·雷迪,洪赵申请人:安佐制药股份有限公司