细胞死亡诱导剂的制作方法

专利名称：：细胞死亡诱导剂的制作方法细胞死亡诱导剂
技术领域：
死亡诱导剂，
背景技术：
HLA在将外源性抗原、细菌、病毒感染细胞等作为异物识别并将它们除去的免疫反应中是重要的分子。HLA分子的主要作用是向CD8+T细胞提呈细胞中产生的、由约810个M酸构成的抗原肽，在由此诱导的免疫应答和免疫耐受中担负非常重要的作用。HLA分为classI(I类)和classII(II类)，上述classI基于由ala3三个结构i或组成的45KD的a链和12KD的p2微球蛋白(P2M)的异源二聚体而形成；上述classII基于由al、a2两个结构域组成的3(K34KD的a链和由pi、P2两个结构域组成的2629KD的卩链的异源二聚体而形成。并且，已知HLAclassI(HLA-I)中还存在HLA-A、B、C等(以下，将HLA-A也称为"HLAclassIA(HLA-IA)")。迄今为止，有人报道了淋巴细胞通过与抗HLAclassIA抗体连接而具有细胞增殖抑制效果和细胞死亡诱导效果，表明HLA分子可能是信号传递分子。例如有才艮道称抗人HLAclassIA的al结构域的抗体B9.12.1、抗a2结构域的抗体W6/32、抗a3结构域的抗体TP25.99和抗体A1.4抑制活化淋巴细胞的细胞增殖(非专利文献l、2)。另外，有报道称抗al结构域的两种抗体MoAb90、YTH862诱导活化淋巴细胞的凋亡(非专利文献2、3、4)。已经明确由这两种抗体诱导的凋亡是胱天蛋白酶介导的反应(非专利文献4),由此推测在淋巴细胞中表达的HLAclassIA还参与凋亡的信号传递。并且，有报道称抗人HLAclassIA的o3结构域的抗体5H7(非专利文献5)、抗小鼠MHCclassI的a2结构域的抗体RE2(非专利文献6)也在活化淋巴细胞等中i秀导细胞死亡。有人报道了对人骨髓瘤细胞进行免疫而得到的单克隆抗体2D7(非专利文献9)也是识别HLAclassIA的抗体，通过将该2D7小分子化(双抗体化)，可以在人骨髓瘤细胞中快速诱导严重的细胞死亡。2D7双抗体对各种人骨髓瘤细胞抹和活化淋巴细胞显示出强的细胞死亡诱导活性，在将人骨髓瘤细胞移植到小鼠中得到的多发性骨髓瘤模型小鼠中也显示出显著的延寿效果，所以其作为骨髓瘤治疗药正在开发之中(专利文献1、2、3、4和非专利文献7、8)。如果这种利用HLAclassI参与的细胞死亡诱导进行的治疗得到进一步发展，则期待着开发对骨髓瘤等的有效性高的药品。与本申请的发明有关的现有技术文献信息如下所示。WO2004/033499[专利文献2]WO2005/056603[专利文献3]WO2005/100560[专利文献4]PCT/JP2006/309890Fayen等人，Int.Immunol.10:1347-1358(1998)[非专利文献2]Genestier等人，Blood90:3629-3639(1997)[非专利文献3]Genestier等人,Blood卯726-735(1997)[非专利文献4]Genestier等人，J.Biol.Chem.273:5060-5066(1998)[非专利文献5]Woodle等人，J.Immunol.158:2156-2164(1997)[非专利文献6]Matsuoka等人,J.Exp.Med,181:2007-2015(1995)[非专利文献7]Goto等人.Blood84:1922-30(1994)[非专利文献8]Kimura等人.BiochemBiophysResCommun.，325:1201-1209(2004)岡達三，三共生命科学財団研究報告集12:46-56(1998)
发明内容发明所要解决的课题本发明鉴于上述状况而设，其目的在于提供包括重链可变区的抗体，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的^J^酸序列組成的CDR1、2、3。本发明的目的还在于提供包括轻链可变区的抗体，上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记载的M酸序列组成的CDR1、2、3。详细而言，本发明的目的在于提供识别HLAclassIA且具有较以往更高的细胞死亡诱导活性的抗体。解决课题的方法
技术领域：
：本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究。首先，使用共表i^AHLAclassIA和人P2M的细胞对小鼠进行免疫，得到单克隆抗体。再筛选所得的抗体，得到具有细胞死亡诱导活性的10个克隆的新型单克隆抗体。解析这些克隆时发现表位中具有HLAclassI抗原的a2结构域的3个克隆(C3B3、C11B9、C17D11抗体)通过与抗小鼠IgG抗体交联，显示出强的细胞毒活性。并且，通过将所得C3B3抗体修饰成低分子抗体(C3B3双抗体)，成功创制了细胞死亡诱导激动性抗体，该抗体肿瘤活性。更具体而言，本发明提供以下[1][25]。抗体，该抗体包括重链可变区，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3。抗体，该抗体包括重链可变区和轻链可变区，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3;上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记载的M酸序列组成的CDR1、2、3。抗体，该抗体包括以下(e)-(h)中任一项所述的轻链可变区(e)轻链可变区，其具有SEQIDNO:4记载的氨基,列；(f)轻链可变区，其具有在SEQIDNO:4记载的M酸序列中有一个或多个M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，该轻链可变区与(e)所述的轻链可变区功能相同；(g)轻链可变区，其具有包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA所编码的M酸序列；(h)轻链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列；抗体，该抗体包括以下(a;n:d)中任一项所述的重链可变区和(e卜(h)中任一项所述的轻链可变区(a)重链可变区，其具有SEQIDNO:2记载的氨基断列；(b)重链可变区，其具有在SEQIDNO:2记载的氨基酸序列中有一个或多个M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，该重链可变区与(a)所述的重链可变区功能相同；(c)重链可变区，其具有包含SEQIDNO:1记载的核苷酸序列的DNA所编码的M酸序列；(d)重链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:1记载的核苦酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列；(e)轻链可变区，其具有SEQIDNO:4记栽的M酸序列；(f)轻链可变区，其具有SEQIDNO:4记载的M酸序列中有一个或多个氣基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，该轻链可变区与(e)所述的轻链可变区功能相同；(g)轻链可变区，其具有包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA所编码的氨基酸序列；(h)轻链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列；抗体，该抗体具有以下(aHd)中任一项所述的M酸序列(a)SEQIDNO:6记载的氨基酸序列；(b)在SEQIDNO:6记载的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列；(c)包含SEQIDNO:5记载的核苷蔣列的DNA所编码的M齡列；(d)在严格条件下与包含SEQIDNO:5记载的核苷酸序列的DNA进《亍杂交的DNA所编码的氨基酸序列；抗体，该抗体与表位结合，该表位与[1][7]中任一项所述的抗体所结合的人白细胞抗原(HLA)蛋白的表位相同；[l卜[8]中任一项所述的抗体，该抗体为单克隆抗体。[1][9]中任一项所述的抗体，该抗体识别人白细胞抗原(HLA);[10]所述的抗体，其中HLA为HLAclassI;[12][11]所述的抗体，其中HLAclassI为HLA-A;[13][1卜[12]中任一项所述的抗体，该抗体为低分子抗体；[14][13]所述的抗体，其中低分子抗体为双抗体；[15]以下(a)或(b)所述的多核苷酸(a)多核苷酸，其包含SEQIDNO:1、3或5记载的核苷齡列；(b)多核苷酸，其在严格条件下与(a)所述的多核苷酸进行杂交，并且编码与[1][14]中任一项所述的抗体具有相同活性的抗体。载体，该载体包括[15]所述的多核苷酸。宿主细胞，该宿主细胞包括[15]所述的多核香酸或[16]所述的载体。[1][14]中任一项所述的抗体的制作方法，该方法包括以下步骤(a)制作[15]所述的多核苷酸的步骤；(b)制作载体的步骤，所述载体包4舌(a)所述的多核苷酸；(c)将(b)所述的载体导入宿主细胞中的步骤；(d)培养(c)所述的宿主细胞的步骤。细胞死亡诱导剂，其含有[1][14]中任一项所述的抗体作为有效成分。[19]所述的细胞死亡诱导剂，其特征在于该诱导剂诱导B细月包或T细力包的细胞死亡。[20]所述的细胞死亡诱导剂，其中B细胞或T细胞为活化B细胞或活4bT细月包。细胞增殖抑制剂，其含有[1][14]中任一项所述的抗体作为有效成分。抗肿瘤药，其含有[1][14]中任一项所述的抗体作为有效成分。[23]所述的抗肿瘤药，其中胂瘤为血液肿瘤。[25]自身免疫疾病治疗药，其含有[1][14]中任一项所述的抗体作为有效成分。附图简述图1是显示利用FACS确认HLA表达Ba/F3细胞抹和ARH77细胞的HLAclassIA的表达量的结果的图。图2是显示表iiA/小鼠嵌合HLAclassIA的细胞昧的模式图，所述人/小鼠嵌合HLAclassIA是将HLAclassIA结构域(ala3结构域)中的一个结构域置换成小鼠MHCclassIA所对应的结构域而得到的。图3以表的形式表示使用HLA-A/p2微球蛋白((32M)共表达Ba/F3细胞对小鼠进行免疫而得到的抗体10个克隆的表位解^f的结果。利用FACS解析与各种人/小鼠嵌合HLAclassIA表达Ba/F3细胞(MHH、HMH、HHM)的结合活性，确认到结合的表位用(+)表示，未确认到结合的表位用(-)表示。由各自的染色图案确定各克隆的表位。图4是显示在二次抗体的存在或不存在下，研究用HLA-A/(32微球蛋白((52M)共表达Ba/F3细胞对小鼠进行免疫而得到的抗体10个克隆对ARH77的细胞死亡诱导活性的结果的图。图5-l是显示2D7和新得到的C3B3、C17D11、C11B9的重链可变区的氛基^列的图。图5-2是显示2D7和新得到的C3B3、C17D11、C11B9的轻链可变区的g^列的图。图6是显示C3B3小抗体经凝胶过滤层析法纯化的分离图语的图。图7是显示经凝胶过滤层析法分离的C3B3小抗体的各峰(1)(3)对ARH77的体外细胞毒活性的图。图8是显示C3B3双抗体(C3B3DB)和2D7双抗体(2D7DB)各自对ARH77的体外细胞增殖抑制活性的曲线图。图9是显示C3B3双抗体(C3B3DB)和2D7双抗体(2D7DB)各自对来自人骨髓瘤细胞(ARH77、IM-9、HS-Sultan、MC/CAR)的体外细胞增殖抑制活性的曲线图。图10是显示IM-9移植小鼠中给予了PBS/吐温20(对照)、2D7双抗体(2D7DB)或C3B3双抗体(C3B3DB)的小鼠的存活期间的图。图11是显示IM-9移植小鼠中给予了PBS/吐温20(对照)、2D7双抗体(2D7DB)或C3B3双抗体(C3B3DB)的小鼠在移植后第14天血清中人IgG量的图。图12是显示C3B3双抗体和2D7双抗体各自对人末梢血单核细胞(PBMC)的体外细胞毒活性的图。图13是显示C3B3双抗体和2D7双抗体对人T细胞系肿瘤细胞^的增殖抑制效果的图。各抗体对培养了3天的Jurkat细胞显示增殖抑制效果。实施发明的方式本发明涉及包括重链可变区的抗体，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的氨基酸序列組成的CDR1、2、3。本发明还涉及包括轻链可变区的抗体，上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记载的M酸序列组成的CDR1、2、3。本发明人等以HLAclassI作为抗原，得到了具有细胞死亡诱导活性的新型抗体。在这些抗体中，发现表位具有HLAclassI的a2结构域的3个克隆(C3B3、C11B9、C17D11抗体)通过与抗小鼠IgG抗体交联，显示出强的细胞毒活性。并且，通过利用抗体工程技术将C3B3抗体修饰成低分子抗体(双抗体)，成功提供了激动剂抗体(C3B3双抗体)，该抗体自身发挥出较以往的2D7抗体的双抗体强的抗肿瘤效果。本发明正是基于上述发现。本发明提供包括重链可变区的抗体，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3。本发明还提供包括轻链可变区的抗体，上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记栽的^J^酸序列组成的CDR1、2、3。对本发明的抗体没有特别限定，只要具有重链可变区或轻链可变区即可，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的氨基^列组成的CDR1、2、3,上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3。本发明抗体的优选例子有包括以下(a卜(d)中任一项所述的重链可变区的抗体。(a)重链可变区，其具有SEQIDNO:2记载的氨基酸序列；(b)重链可变区，其具有在SEQIDNO:2记载的M酸序列中有一个或多个M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的^J-酸序列，该重链可变区与(a)所述的重链可变区功能相同；(c)重链可变区，其具有包含SEQIDNO:1记载的核苷酸序列的DNA所编码的M酸序列；(d)重链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:l记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列。或者，本发明抗体的例子有包括以下(e卜(h)中任一项所述的轻链可变区的抗体。(e)轻链可变区，其具有SEQIDNO:4记载的M酸序列；(f)轻链可变区，其具有在SEQIDNO:4记载的M酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，该轻链可变区与(e)所述的轻链可变区功能相同；(g)轻链可变区，其具有包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA所编码的氨基酸序列；(h)轻链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列。并且，具有上述重链可变区和轻链可变区的抗体的例子有具有以下(a)(d)中任一项所述的氨基酸序列的抗体。(a)SEQIDNO:6记载的M酸序列；(b)在SEQIDNO:6记载的絲齡列中有一个或多个4J^酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列；(c)包含SEQIDNO:5记载的核苷,列的DNA所编码的絲餅列；(d)在严格条件下与包含SEQIDNO:5记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列。重链可变区或轻链可变区的M酸序列可以被取代、缺失、附加和/或插入。并且，使重链可变区与轻链可变区締合时，只要具有抗原结合活性即可，可以缺失一部分，也可以附加其它多肽。另外，还可以将可变区嵌合或人源化。其中"功能相同，，是指，作为对象的抗体与具有重链可变区或轻链可变区的抗体具有相同的活性(例如HLA-A结合活性、细胞死亡诱导活性等)，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3,上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记栽的#^酸序列组成的CDR1、2、3。作为用于制备与某一多肽功能相同的多肽的、本领域技术人员所熟知的方法，已知有向多肽中导入突变的方法。例如，本领域技术人员通过利用位点特异性诱变法(Hashimoto-Gotoh,T.等人.(1995)Gene152，271-275;Zoller，MJ和Smith,M.(1983)MethodsEnzymol.100，468-500;Kramer,W.等人.(1984)NucleicAcidsRes.12,9441-9456;KramerW和FritzHJ(1987)Methods.Enzymol.154,350-367;Kunkel，TA(1985)ProcNatl.Acad.Sci.USA.82，488-492;Kunkel(1988)MethodsEnzymol.85，2763-2766)等，向本发明抗体中导入适当的突变，可以制备与该抗体功能相同的抗体。另外，氨基酸的突变也可以在自然界中发生。因此，具有本发明抗体的M酸序列中有一个或多个氨基貌t生突变而得到的M酸序列、且与该抗体功能相同的抗体也包含在本发明的抗体中。对发生突变的M酸数没有特别限定，通常为30个氨基酸以内、优选为15个M酸以内、进一步优选为5个M酸以内(例如3个氨基酸以内)。在发生突变的氨基酸残基中，优选突变成保存有氨基酸侧链性质的另一种氨基酸。例如，氨基酸侧链性质的例子有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性M酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、具有脂肪族側链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、具有含羟基的侧链的氨基酸(S、T、Y)、具有含硫原子的侧链的氨基酸(C、M)、具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、具有含碱基的侧链的氨基酸(R、K、H)和具有含芳族的側链的氨基酸(H、F、Y、W)(括弧内均表示氨基酸的一文字标记)。已知具有对某M酸序列通过一个或多个氛基酸残基的缺失、附加和/或用其它M酸取代而被修饰的氨基酸序列的多肽可维持其生物学活性(Mark,D.F.等人，Proc.Natl.Acad,Sci.USA(1984)81,5662-5666;Zoller，M.J.&Smith,M.NucleicAcidsResearch(1982)10,6487-6500;Wang,A.等人，Science224，1431-1433;Dalbadie-McFarland，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(1982)USA79，6409-6413)。本发明的抗体还包括在本发明抗体的氨基酸序列中附加了多个氨基酸残基的抗体。另外，还包括上述抗体与其它肽或蛋白融合的融合蛋白。制作融合蛋白的方法可以采用本领域技术人员所公知的方法，即连接编码本发明抗体的多核苷酸与编码其它肽或多肽的多核苷酸使构架一致，将其导入表达载体中，使之在宿主中表达即可。作为与本发明抗体融合的其它肽或多肽，例如可以使用FLAG(Hopp，T.P.等人,BioTechnology(1988)6，1204-1210)、包含6个His(组氨酸)残基的6xHis、10xHis、流感血凝素(HA)、人c-myc片4更、VSV-GP片段、pi8HIV片段、T7-tag、HSV-tag、E画tag、SV40T抗原片段、lcktag、a-微管蛋白片段、B-tag、蛋白C片段等公知的肽。另外，与本发明抗体融合的其它多肽例如有GST(谷胱甘肽-S-转移酶)、HA(流感血凝素)、免疫球蛋白恒定区、P-半乳糖苷酶、MBP(麦芽糖结合蛋白)等。使市售的编码这些肽或多肽的多核苷酸与编码本发明抗体的多核苷酸融合，使由此制备的融合多核苷酸表达，从而可以制备融合多肽。另外，本发明还提供结合在与本发明所公开的抗体所结合的表位相同的表位上的抗体。即，本发明涉及识别与本发明抗体所识别的表位相同的表位的抗体及其用途。上述抗体例如可以利用以下方法得到。受试抗体结合在与某抗体所结合的表位相同的表位上、即与某抗体共有表位，这可以通过两者对同一表位的竟争来确认。本发明中，抗体间的竟争可以通过FACS或交叉阻断分析来检测。在FACS中，首先使本发明的单克隆抗体与使HLA-IA在细胞表面表达的细胞结合，测定荧光信号。接下来，使候选竟争抗体与细胞反应，之后使本发明的抗体与相同的细胞反应，同样利用FACS进行解析。或者，还可以使本发明的单克隆抗体与受试竟争抗体同时与相同的细胞反应。使竟争抗体反应时，如杲本发明抗体的FACS解析图案发生变化，则可以确认竟争抗体与本发明抗体识别相同的表位。此外，例如竟争ELISA分析为优选的交叉阻断分析。具体而言，在交叉阻断(cross-blocking)分析中，将表达HLA-IA的细胞固定在微量滴定板的孔上。在候选竟争抗体的存在下或不存在下进行预温育，之后添加本发明的单克隆抗体。与孔中的HLA-IA表达细胞结合的本发明的抗体量，与竟争结合在相同表位上的候选竟争抗体(受试抗体)的结合能反相关。即，受试抗体与同一表位的亲和性越大，本发明抗体与固定有HLA-IA蛋白表达细胞的孔的结合量越低。或者，反之，受试抗体与同一表位的亲和性越大，受试抗体与固定有HLA-IA蛋白表达细胞的孔的结合量越增加。通过预先标记抗体，可以容易地测定与孔结合的抗体量。例如，生物素标记的抗体可以通过4吏用抗生物素蛋白-过氧化物酶缀合物和适当的底物来测定。利用了过氧化物酶等酶标记的交叉阻断分析特别称为竞争ELISA分析。抗体可以用可^^测或可测定的其它标记物标记。具体公知的有放射标记或焚光标记等。并且，当受试抗体具有来自不同于本发明抗体的种的恒定区时，还可以使用特异性识别来源于任意的种的恒定区的识别抗体，测定与孔结合的任一种抗体。或者，即使是来源于相同种的抗体，当类型不同时，可以使用特异性识别各类型的抗体测定与孔结合的抗体。与不存在候选竟争抗体时实施的对照试验中得到的结合活性相比，候选抗体可以阻断至少20%、优选至少20-50%、进一步优选至少50%的本发明的单克隆抗体的结合时，该候选竟争抗体是与本发明抗体实质上结合在相同表位上、或竟争结合在相同表位上的抗体。作为结合在与本发明的抗体所结合的表位相同的表位上的抗体，例如有上述[8]或[9]所述的抗体。如上所述，上述[8]或[9]所述的抗体中，不仅包括单价抗体，还包括多价抗体。本发明的多价抗体中，包括具有完全相同的抗原结合部位的多价抗体、或者具有一部分不同或完全不同的抗原结合部位的多价抗体。本发明的抗体根据后述的产生该抗体的细胞或宿主或纯化方法，而在氨基酸序列、分子量、等电点或是否具有糖链或构象等方面有所不同。但所得抗体只要具有与本发明抗体相同的功能，就包括在本发明中。例如，使本发明抗体在原核细胞例如大肠杆菌中表达时，在原始抗体的氨基酸序列的N末端附加曱硫氨酸残基。本发明的抗体也包括这样的抗体。本发明的抗体还可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素等各种分子结合的缀合抗体。上述缀合抗体可以通过对所得抗体实施化学修饰而得到。需要说明的是，抗体的修饰方法已在本领域中确立(例如US5057313、US5156840)。本发明中的"抗体"还包括上述缀合抗体。作为本发明的抗体，可以适当使用小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、绵羊抗体、骆驼抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等。并且，本发明的抗体可以使用低分子抗体等。作为本发明的抗体，可以使用以下抗体将抗体基因插入适当的载体中，将该栽体导入宿主中，利用基因重组技术产生的基因重組型净元体(例长口参'照Carl,A.K.Borrebaeck,James,W.Larrick,THERAPEUTICMONOCLONALANTIBODIES,PublishedintheUnitedKingdombyMACMILLANPUBLISHERSLTD,1990)。具体而言，当得到编码具有由SEQIDNO:7、8、9记载的^J^酸序列组成的CDR1、2、3的重链可变区或具有由SEQIDNO:10、11、12记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3的轻链可变区的DNA时，将其与编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接，将其插入表达载体中。或者，体中。为了在表达调节区例如增强子、启动子的调节下进行表达，将DNA插入表达载体中。接下来，可以利用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。本发明还提供编码本发明抗体的多核苷酸、或者在严格条件下与核苷酸。本发明的多核苷酸只要编码本发明的抗体即可，没有特别限定，是包含多个脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的碱基或碱基对的聚合物。本发明的多核苷酸可以包含非天然的碱基。本发明的多核香酸可以在利用基因工程方法表达抗体时使用。另外，本发明的多核苷酸还可以在筛选与本发明的抗体具有相同功能的抗体时用作探针。即，使用编码本发明抗体的多核苷酸或其一部分作为探针，利用杂交、基因扩增技术(例如PCR)等技术，可以得到在严*件下与该多核苷酸杂交、且编码与本发明的抗体具有相同活性的抗体的DNA。这种DNA也包含在本发明的多核苷酸中。杂交技术(Sambrook，J.等人，MolecularCloning第2版，9.47-9,58，ColdSpringHarborLab.press,1989)为本领域技术人员所熟知的技术。作为杂交条件，例如有严格性差的杂交条件。严格性差的杂交条件是指，在杂交后的清洗中例如42。C、0.1xSSC、0.1。/。SDS的条件，优选为50°C、0.1xSSC、0.1%SDS的条件。更优选的杂交条件例如有严格性强的杂交务降。严4各性强的杂交条件是指例如65""C、5xSSC和0.1。/。SDS的条件。在这些条件中，温度越高越可以期待高效率地得到具有高同源性的多核苷酸。但是，作为影响杂交严格性的要素，要考虑温度或盐浓度等多个要素，本领域技术人员通过适当选择这些要素，可以实现相同的严格性。利用上述杂交技术或基因扩增技术而得到的多核苷酸所编码的、与本发明抗体功能相同的抗体，通常与上述抗体在M酸序列方面具有高同源性。本发明的抗体中还包含与本发明抗体功能相同、且与该抗体的M酸序列具有高同源性的抗体。高同源性是指，在氛基酸水平上通常具有至少50%以上的同源性、优选75%以上的同源性、进一步优选85%以上的同源性、更进一步优选95%以上的同源性。确定多肽的同源性时，可以按照文献(Wilbur，W.J.和Lipman,D.J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1983)80，726-730)中记载的公式来确定。编码本发明抗体的多核苷酸的优选例子有以下(a)或(b)记载的多核香酸。(a)包含SEQIDNO:l、3或5记载的核苷酸序列的多核苷酸；(b)在严格条件下与(a)所述的多核苷酸杂交、且编码与本发明的抗体具有相同活性的抗体的多核苷酸。暂且分离抗体基因，将其导入适当的宿主中制作抗体时，可以使用适当的宿主与表达载体的组合。本发明提供包括上述多核苷酸的载体。载体的例子有M13系载体、pUC系载体、pBR322、pBluescript、pCR-Script等。为了亚克隆、切除cDNA时，除上述载体外，例如还有pGEM-T、pDIRECT、pT7等载体。为了产生本发明的抗体而使用载体时，表达载体特别有用。作为表达载体，例如为了在大肠杆菌中表达时，载体除了具有在大肠杆菌中扩增的上述特征外，当以JM109、DH5a、HBIOI、XL1-Blue等大肠杆菌作为宿主时，还必须持有可以在这些大肠杆菌中高效率地表达的启动子、例如lacZ启动子(Ward等人，Nature(1989)341,544-546;FASEBJ.(1992)6，2422-2427)、araB启动子(Better等人,Science(1988)240,1041-1043)或T7启动子等。作为这样的载体，除上述载体外，还包括pGEX-5X-l(Pharmacia社制)、"QIAexpresssystem，，(Quiagen社制)、pEGFP、或者pET(此时宿主优选表达T7RNA聚合酶的BL21)等。载体中还可以包括用于多肽分泌的信号序列。作为用于多肽分泌的信号序列，当向大肠杆菌的周质中分泌蛋白时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacteriol.(1987)169,4379)。例如可以利用氯化钙法、电穿孔法将载体导入宿主细胞中。除大肠杆菌外，用于制备本发明的多肽的载体例如还有来源于哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen社制)或pEGF-BOS(NucleicAcids.Res.1990，18(17)，第5322页)、pEF、pCDM8)、来源于昆虫细胞的表达载体(例如"Bac-to-BAC杆状病毒表达系统，，(Gibco-BRL社制)、pBacPAK8)、来源于植物的表达载体(例如pMHl、pMH2)、来源于动物病毒的表达载体(例如pHSV、pMV、pAdexLcw)、来源于反转录病毒的表达载体(例如pZIPneo)、来源于酵母的表达载体(例如"PichiaExpressionKit，，(Invitrogen社制)、pNVl1、SP-QOl)、来源于枯草菌的表达载体(例如pPL608、pKTH50)。为了在CHO细胞、COS细胞、NIH3T3细胞等动物细胞中表达，载体必须具有在细胞内表达所必需的启动子、例如SV40启动子(Mulligan等人，Nature(1979)277，108)、MMLV-LTR启动子、EFla启动子(Mizushima等人，NucleicAcidsRes.(19卯)18,5322)、CMV启动子等，进一步优选具有用于选择转化细胞的基因(例如可用药物(新霉素、G418等)判别的耐药性基因)。具有上述特性的载体的例子有pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13等。并且，为了稳定表达基因且扩增细胞内的基因拷贝数时，可以列举以下方法向缺失核酸合成路径的CHO细胞中导入填补该路径的具有DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，再用曱氨蝶呤(MTX)扩增该载体的方法。另外，为了瞬时表达基因，可以列举以下方法使用染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞，用持有SV40的复制起点的载体(pcD等)进行转化的方法。复制起点可以使用来源于多瘤病毒、腺病毒、牛乳头状瘤病毒(BPV)等的起点。为了在宿主细胞系中扩增基因拷贝数，表达载体可以进一步含有氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TX)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。另一方面，作为在动物体内表达本发明的多核苷酸的方法，可以列举将本发明的多核苷酸插入适当的载体中，再利用例如反转录病毒法、脂质体法、阳离子脂质体法、腺病毒法等将其导入机体内的方法等。所用载体例如有腺病毒载体(例如pAdexlcw)或反转录病毒载体(例如pZIPneo)等，但并不限于这些。将本发明的多核苷酸插入载体中等的一般基因操作可以按照常规方法进行(MolecularCloning,5.61-5.63)。对机体内给药可以按照先体外后体内(exvivo)法进行，也可以按照体内(invivo)法进行。本发明还提供导入有本发明的载体的宿主细胞。对导入有本发明的载体的宿主细胞没有特别限定，例如可以使用大肠杆菌或各种动物细胞等。本发明的宿主细胞可以用作例如用于制备或表达本发明抗体的产生系统。用于制备多肽的产生系统包括体外(invitro)和体内(invivo)产生系统。体外产生系统例如有使用真核细胞的产生系统或使用原核细胞的产生系统。使用真核细胞时，例如可以将动物细胞、才直物细胞、真菌细胞用于宿主。动物细胞包括哺乳动物细胞例如CHO(J.Exp.Med.(1995)108，945)、COS、NIH3T3、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾(babyhamsterkidney))、HeLa、Vero;两栖动物细胞例如非洲爪蟾卵母细胞(Xewo/^/aev^ooc声es)(Valle等人，Nature(1981)291:358-340);或者昆虫细胞例如Sf9、Sf21、Tn5。作为CHO细胞，特别适合使用缺失了DHFR基因的CHO细胞"-dhfr-CHO(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216-4220)或CHOK-l(Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1968)60,1275)。动物细胞中，以大量表达为目的时，特别优选CHO细胞。关于向宿主细胞内导入载体，例如可以通过以下方法来进行磷酸4丐法、DEAE-葡聚糖法、<吏用阳离子核糖体DOTAP(Boehringer-Mannheim社制)的方法、电穿孔法、脂质转染法等方法。植物细胞例如有来源于烟草(iWcof/amjrto6acww)的细胞，其作为多肽产生系统而众所周知，可以对其进行愈伤组织培养。真菌细胞例如有酵母、例如酵母菌(Sacc/wrrawyces)属(例如啤酒酵母CS(3cc^arawycascerev&z'ae));丝状菌、侈'j^口曲審(^s;7erg77/w5)属(，j^口,累、曲審(/^;7erg"/1^使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。细菌细胞包括大肠杆菌(￡.//)例如迴109、DH5a、HB101等，此外还已知枯草杆菌。利用目标多核苷酸转化上述细胞，并在体外培养已转化的细胞而得到抗体。可以按照公知方法进行培养。例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作为动物细胞的培养液。此时，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补充液，也可以进行无血清培养。培养时的pH优选为约6~8。通常是在约3040。C下培养约15200小时，根据需要可以交换培养基或进行通气、搅拌。另一方面，作为在体内产生多肽的系统例如有使用动物的产生系统或使用植物的产生系统。向这些动物或植物中导入目标多核苷酸，使在动物或植物体内产生多肽并回收。本发明的"宿主"包括上述动物和植物。使用动物时，有使用哺乳动物和昆虫的产生系统。哺乳动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛(VickiGlaser,SPECTRUMBiotechnologyApplications,1993)。另外，使用哺乳动物时，可以使用转基因动物。例如，制备目标多核苷酸，将其作为和山羊P-酪素等乳汁中固有产生的编码多肽的基因的融合基因。然后，将包括该融合基因的多核苷酸片段注入到山羊胚胎中，将该胚胎移植到雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊或其后代所产生的乳汁中可以得到目标抗体。为了使由转基因山羊产生的含有多肽的乳汁量增加，可以给予上述转基因山羊适当的激素(Ebert,K.M.等人，Bio/Technology(1994)12,699-702)。作为昆虫，例如可以使用蚕。使用蚕时，通过使蚕感染插入有目标多核苷酸的杆状病毒，可以从该蚕的体液中得到目标多肽(Susumu，M.等人，Nature(1985)315，592-594)。并且，使用植物时，例如可以使用烟草(to^c00)。使用烟草时，将目标多核苷酸插入植物表达用栽体例如pMON530中，将该载体导入根瘤土壤杆菌(v4gro6a"en'wmfwwe/ac!'era)等细菌中。用该细菌感染烟草例如烟草(Mc加'a脂to&cww)，可以从该烟草的叶中得到所需的多肽(JuIianK,C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24,131-138)。由此得到的本发明的抗体，可以将其从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离，并纯化成实质上纯粹且均匀的抗体。抗体的分离、纯化可以采用通常抗体的纯化中所使用的分离、纯化方法，但没有任何限制。例如，可以适当选择、组合层析柱、过滤器、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳法、透析、重结晶等来分离、纯化抗体。层析例如有亲合层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等(StrategiesforProteinPurificationandCharacterization(蛋白质纯化与鉴定实-睑指南)ALaboratoryCourseManual.EdDanielR.Marshark等人，ColdSpringHarborLaboratoryPress,1996)。上述层析可以使用液相层析例如HPLC、FPLC等来进行。亲合层析中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有HyperD、POROS、SepharoseF.F.(Pharmacia)等。本发明还包含利用上述纯化方法进行高度纯化的抗体。本发明中，测定所制备的抗体的抗原结合活性(AntibodiesALaboratoryManual.EdHarlow，DavidLane,ColdSpringHarborLaboratory,1988)时，可以使用/〉知的方法。例如可以采用ELISA(酶联免疫吸附测定法)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(it射免疫测定法)或荧光免疫法等。本发明还提供抗体的制作方法，该方法包括制作上述多核苷酸的步骤；制作包括上述多核苷酸的载体的步骤；将上述载体导入宿主细胞中的步骤；以及培养上述宿主细胞的步骤。另外，在本发明中，为了降低对人的异种抗原性等，可以使用人工修饰的基因重组型抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等。上述修饰抗体可以采用已知的方法来制备。嵌合抗体是指包含人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体，将编码小鼠抗体可变区的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，将其插入表达载体中，再将该表达载体导入宿主中，即可得到嵌合抗体。人源化抗体也称重构(reshaped)人抗体，是指将人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的互补性决定区(CDR;complementaritydeterminingregion)移植到人抗体的互补性决定区而得到的抗体，其通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，利用PCR法由制作成末端部具有重叠部分的多个寡核苷酸合成DNA序列，上述DNA序列设计成连接小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(frameworkregion;FR)。人源化抗体可如下得到连接所得DNA与编码人抗体恒定区的DNA,然后插入表达载体中，再将该表达载体导入宿主中，4吏之产生抗体(参照欧洲专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号WO96/02576)。经由CDR连接的人抗体的FR中，选择互补性决定区形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，可以取代抗体可变区的构架区的氨基酸，使重构人抗体的互补性决定区形成适当的抗原结合部位(Sato，K.等人,CancerRes.(1993)53,851-856)。另外，获得人抗体的方法也是已知的。例如，在体外用所需抗原或表达所需抗原的细胞致敏人淋巴细胞，使致敏淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，也可以得到具有抗原结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。另外，可以通过用所需抗原对具有全套人抗体基因库的转基因动物进行免疫而获得所需人抗体(参照国际专利申请公开号W093/12227、WO92/03918、WO94/02602、W094/25585、WO96/34096、W096/33735)。并且，还已知使用人抗体文库，通过淘选来获得人抗体的技术。例如，可以利用噬菌体展示法使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。通过解析所选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。如果清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，就可以制作具有该序列的适当的表达栽体，获得人抗体。上述方法广为人知，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、W093/11236、W093/19172、W095脇38、W095/15388。本发明的抗体优选为识别人白细胞抗原(HLA)的抗体。本发明中识别人白细胞抗原(HLA)的抗体在提高活性方面有用。其中，活性是指抗体通过与抗原结合而产生的生物学作用。其具体例子有细胞死亡诱导作用、凋亡诱导作用、细胞增殖抑制作用、细胞分化抑制作用、细胞分裂抑制作用、细胞增殖诱导作用、细胞分化诱导作用、细胞分裂诱导作用、细胞周期调节作用等。优选为细胞死亡诱导作用、细胞增殖抑制作用。对作为细胞死亡诱导作用、细胞增殖抑制作用等上述作用的对象的细胞没有特別限定，但优选造血细胞和非粘附细胞。造血细胞的具体例子有淋巴细胞(B细胞、T细胞)、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞(优选活化的末梢血单核细胞(PBMC))、血液肿瘤细胞(骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞、白血病细胞)等，优选淋巴细胞(B细胞、T细胞、活化B细胞、活化T细胞)，特别是活化B细胞或活化T细胞以及血液肿瘤细胞最优选。非粘附细胞是指，培养细胞时细胞不附着在玻璃或塑料等培养器的表面、而以非粘附状态进行增殖的细胞。本发明中，非粘附细胞的优选例子有Jurkat细胞或ARH77细胞。相对于此，粘附细胞(附着细胞)是指，培养细胞时附着在玻璃或塑料等培养器表面的细胞。通常，为了增强细胞死亡诱导活性，可以将全长抗HLA抗体与抗IgG抗体等交联，交联可以利用本领域技术人员所公知的方法进行。本发明的抗体是否在非粘附细胞中诱导细胞死亡，这可以通过本发明的抗体是否在Jurkat细胞或ARH77细胞中诱导细胞死亡来判定。抗体是否在粘附细胞中诱导细胞死亡，这可以通过本发明的抗体是否在HeLa细胞中箭导细胞死亡来判定(W02004/033499)。本发明中，通过给予上述识别HLA的抗体，可以治疗或预防下述疾病例如血液肿瘤(造血系统肺瘤)等肿瘤(具体例子有白血病、骨髓增生异常综合征、恶性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病、浆细胞异常症(骨髓瘤、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症)、骨髓增殖性疾病(真性红细胞增多症、原发性血小板增多症、特发性骨髓纤维化症)等)或自身免疫疾病(具体例子有风湿病、自身免疫性肝炎、自身免疫性甲状腺炎、自身免疫性水疱症、自身免疫性肾上腺皮质炎、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性血小板减少性紫癜、自身免疫性萎缩性胃炎、自身免疫性嗜中性粒细胞减少症、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性受体病、自身免疫性不孕症、克罗恩氏(Crohn，s)病、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、巴塞多氏(Basedow，s)病、少年糖尿病、阿狄森氏(Addison，s)病、重症肌无力、晶状体性葡萄膜炎、干裤、白塞氏(Behchet，s)病等)等疾病。另外，考虑到本发明的抗体在才几体内的稳定性优异，所以认为对机体给药时将特别有效。本发明中，HLA是指人白细胞抗原。HLA分子分为classI和classII，classl的例子已知有HLA-A、B、C、E、F、G、H、J等，classII的例子已知有HLA-DR、DQ、DP等。本发明的抗体所识别的抗原只要是HLA分子即可，没有特别限定，但优选分类为classI的分子，更优选为HLA-IA。本发明的抗体可以是低分子抗体。在本发明中，低分子抗体包括全长抗体(例如全长IgG等)的一部分缺失的抗体片段，只要具有抗原结合能即可，没有特别限定。本发明的抗体片段只要是全长抗体的一部分即可，没有特别限定，但优选包括重链可变区(VH)或轻链可变区(VL),特别优选为包括VH和VL两方的片段。抗体片段的具体例子有Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv、scFv(单链Fv)、sc(Fv》等，但优选为双抗体(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883;Plickthun"ThePharmacologyofMonoclonalAntibody(单克隆抗体药理学)"第113巻，Resenburg和Moore编，SpringerVerlag，NewYork，第269-315页，(1994))。为了得到这样的抗体片段，可以用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等处理抗体使生成抗体片段，或者构建编码上述抗体片段的基因，将其导入表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达即可(例如参照Co，M.S.等人，J.Immunol.(1994)152，2968-2976;Better,M.和Horwitz，A.H.，MethodsEnzymol.(1989)178,476-496;Pluckthun，A.和Skerra，A.,MethodsEnzymol.(1989)178，497-515;Lamoyi,E.，MethodsEnzymol.(1986)121，652-663;Rousseaux，J.等人，MethodsEnzymol.(1986)121，663-669;Bird,R.E.和Walker，B.W.,TrendsBiotechnol.(1991)9，132-137)。本发明中的低分子抗体优选较全长抗体的分子量小，但有时也会形成例如二聚体、三聚体、四聚体等多聚体，有时还会较全长抗体的分子量大。本发明中，优选的低分子抗体为包括抗体的两个以上的VH和两个以上的VL、且上述各可变区直接或经由接头等间接结合的抗体。结合可以是共价结合也可以是非共价结合，还可以是共价结合和非共价结合两方。进一步优选的低分子抗体为包括两个以上的VH和VL通过非共价键结合而成的VH-VL对的抗体。此时，优选低分子抗体中一方的VH-VL对与另一方的VH-VL对之间的距离较全长抗体中的距离短的抗体。本发明中，scFv是通过连接抗体的H链V区与L链V区而得到的。在该scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头进行连接(Huston,J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以是上述作为抗体记载的任一种来源。作为连接V区的肽接头，例如4吏用由12~19个氨基酸残基组成的任意的单链肽。编码scFv的DNA可如下得到以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA和编码L链或L链V区的DNA作为冲莫板，利用PCR法，将这些序列中的编码所需M酸序列的DNA部分用规定其两端的引物对进行扩增，然后再使编码肽接头部分的DNA和其两端分别少见定为与H链、L链连接的引物对组合，进行扩增而得到。一旦制作了编码scFv的DNA，就可以按照常规方法得到含有上述DNA的表达栽体和经该表达载体转化的宿主。另外，使用该宿主，按照常规方法可以得到scFv。关于上述抗体片段，可以如上操作获得其基因并使之表达，在宿主中产生。本发明中所说的"抗体"也包括这些抗体片段。本发明中，特别优选的低分子抗体为双抗体(diabody)。双抗体是指，使两个由可变区与可变区经接头等连接而形成的片段(例如scFv等)(以下称为构成双抗体的片段)结合而形成的二聚体，通常包括两个VL和两个VH(P,Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci,USA90，6444-6448(1993);EP404097号；W093/11161号；Johnson等人，MethodinEnzymology，203,88-98，(1991);Holliger等人，ProteinEngineering,9，299-305(1996);Perisic等人，Structure,2，1217-26(1994);John等人,ProteinEngineering,12(7)，597-604，(1999);Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90，6444-6448，(1993);Atwell等人，Mol.Immunol,33,130卜1312，(1996))。构成双抗体的片段间的键可以是非共价键也可以是共价键，但优选为非共价键。另外，还可以将构成双抗体的片段彼此用接头等连接，形成单链双抗体(sc双抗体)。此时，若将构成双抗体的片段彼此用约20个氨基酸长的接头连接，则存在于同一链上的构成双抗体的片段之间可以形成非共价键，从而形成二聚体。构成双抗体的片段包括VL与VH连接而成的片段、VL与VL连接而成的片段、VH与VH连接而成的片段等，优选为VH与VL连接而成的片段。在构成双抗体的片段中，对连接可变区与可变区的接头没有特别限定，优选使用短至在同一片段中的可变区之间无法形成非共价键的接头。上述接头的长度可以由本领域技术人员适当决定，但通常为2~14个氨基酸、优选39个氨基酸、特别优选为4~6个"tj^酸。此时，编码在同一片段上的VL和VH由于其间的接头短，而无法在同一链上的VL和VH之间形成非共价键，无法形成单链V区片段，从而利用与其它片段的非共价键形成二聚体。并且，还可以按照与制作双抗体相同的原理，使三个以上的构成双抗体的片段结合，制作三聚体、四聚体等多聚体抗体。作为本发明中的双抗体，可以例示具有SEQIDNO:6记载的氨基酸序列的双抗体；或具有SEQIDNO:6记栽的M酸序列中有一个或多个M酸发生突变(取代、缺失、插入和/或附加)而得到的氨基酸序列、且与具有SEQIDNO:6记载的M酸序列的双抗体功能相同的双抗体；或者具有SEQIDNO:2的CDR(或可变区)和SEQIDNO:4的CDR(或可变区)的氨基酸序列的双抗体；或具有SEQIDNO:2的CDR(或可变区)和SEQIDNO:4的CDR(或可变区)的^J^酸序列中有一个或多个M酸发生突变(取代、缺失、插入和/或附加)而得到的^tJ^蔣列、且与具有SEQIDNO:2的CDR(或可变区)和SEQIDNO:4的CDR(或可变区)的序列的双抗体功能相同的双抗体，但并不限于这些。其中，"功能相同"是指，作为对象的双抗体与具有SEQIDNO:6记载的M酸序列的双抗体或具有SEQIDNO:2的CDR(或可变区)和SEQIDNO:4的CDR(或可变区)的序列的双抗体具有相同的活性(例如与HLA-A的结合活性、细^JL亡诱导活性等)。对发生突变的氨基酸数目没有特别限定，但通常为30个氨基酸以内，优选为15个M酸以内，进一步优选为5个M酸以内(例如3个氨基酸以内)。另外，为了降低对人的异种抗原性等，可以将具有SEQIDNO:6记载的M酸序列的双抗体或具有SEQIDNO:2的CDR(或可变区)和SEQIDNO:4的CDR(或可变区)的序列的双抗体进4亍人源化或嵌合化。在SEQIDNO:2记载的絲齡列中，第1号第125号相当于可变区，第31号第35号相当于CDR1(SEQIDNO:7),第50号~第66号相当于CDR2(SEQIDNO:8)，第99号~第114号相当于CDR3(SEQIDNO:9)。在SEQIDNO:4记载的^J^酸序列中，第1号~第107号相当于可变区，第24号第34号相当于CDR1(SEQIDNO:10),第50号第56号相当于CDR2(SEQIDNO:11)，第89号~第97号相当于CDR3(SEQIDNO:12)。本发明中，识别HLA的低分子抗体只要与HLA进行特异性结合、并具有生物学作用即可，没有特别限定。本发明的低分子抗体可以利用本领域技术人员所公知的方法进行制作。例如，可以如实施例所述，根据识别HLA的抗体的序歹ij(特别是可变区的序列和互补性决定区(CDR)的序列)，采用本领域技术人员所公知的基因重组技术来制作。识别HLA的抗体的序列可以使用已公知的抗体的序列，或者以HLA作为抗原，利用本领域技术人员所公知的方法制作抗HLA抗体，取得该抗体序列并加以使用。具体而言，例如可如下进行。使用HLA蛋白或其片段作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，再按照通常的细胞融合法使所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，利用通常的筛选法篩选单克隆抗体产生细胞(杂交瘤)。抗原的制备可以按照公知的方法、例如使用杆状病毒的方法(W098/46777等)等进行。杂交瘤的制作例如可以按照Milstein等人的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73:3-46)等来进行。当抗原的免疫原性4氐时，可以使抗原与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合进行免疫。之后，使用逆转录酶，由杂交瘤的mRNA合成抗体可变区(V区)的cDNA，所得cDNA的序列可以用公知的方法进行解读。识别HLA的抗体只要与HLA结合即可，没有特别限定，可适当使用小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、绵羊抗体、人抗体等。另外，为了降低对人的异种抗原性等，还可以使用人工修饰的基因重组型抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等。上述^"饰抗体可以采用已知的方法来制备。嵌合抗体是指包含人以外的哺乳动物例如小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体等，所述嵌合抗体可通过下述方法得到将编码小鼠抗体可变区的DNA和编码人抗体恒定区的DNA连接，将其插入表达载体中，再将该表达载体导入宿主中，使之产生嵌合抗体。本发明人等发现本发明的抗体诱导细胞死亡。基于这一发现，胞增殖抑制剂。另外，本发明人等已经发现将抗HLA抗体小分子化而得到的双抗体对人骨髓瘤模型动物具有抗肿瘤效果(WO2004/033499)。并且，认为本发明抗体的细胞死亡诱导活性在活化T细胞或B细胞中效果特别大。因此，认为本发明的抗体对癌症等肿瘤(特别是血液胂瘤)或自身免疫疾病的治疗或预防特别有效。本发明还提供含有本发明的抗体作为有效成分的抗肿瘤药或自身免疫疾病治疗药。另外，本发明提供含有本发明的抗体作为有效成分的细胞死亡诱导剂或细胞增殖抑制剂。考虑到本发明抗体的细胞死亡诱导活性在活化T细胞或B细胞中效果特别大，因此认为其对癌症等肿瘤(特别是血液肿瘤)或自身免疫疾病的治疗或预防特别有效。如上所述，本发明还提供使用本发明抗体的癌症等肿瘤(特别是血液肿瘤)或自身免疫疾病的治疗方法或预防方法。使用未进行小分子化的抗体作为有效成分时，优选与抗IgG抗体等交联。本发明的药物还可以和干扰素结合使用。通过将抗HLAclassI抗体和干扰素结合使用，可以大大增强细胞死亡诱导等抗HLAclassI抗体的作用(W02006/123724)。通常，干扰素是指利用病毒、双链RNA、凝集素等从动物细胞中诱发的、具有抗病毒作用的蛋白或糖蛋白的总称。干扰素除具有抗病毒作用外，还具有细胞增殖抑制作用、免疫调节作用。根据产生细胞、与特异性受体的结合能、生物和物理化学性质，干扰素被分为数种类型，主要有a、P、y,此外还存在IFNco、IFNt。并且，已知干扰素a中还存在20种以上的亚型。现在不仅有天然型干扰素制剂，就连PEG-干扰素、复合干扰素等各种基因重组型制剂也已开发、上市。本发明中的干扰素可以是上述任一种类型，但优选为a或Y。本发明中的干扰素只要增强由抗HLAclassI抗体诱导的细胞死亡即可，可以是天然型、人工修饰的基因重组型、天然存在的突变体、融合蛋白或它们的片段等任一种。对本发明中的干扰素的来源没有特别限定，例如可以来源于人、黑猩猩、猩猩(马来西亚产)、狗、马、绵羊、山羊、驴、猪、猫、小鼠、豚鼠、大鼠、兔等，但并不限于这些，可以来源于其它哺乳动物。优选为来源于人的干扰素。在本发明中，本发明的抗体与干扰素的结合使用是指，将本发明的抗体与干扰素一同给药或使用(以下，仅记作"给药")，对给药顺序或给药间隔等没有限定。本发明的抗体与干扰素的给药顺序可以是下述任一顺序给予干扰素后再给予本发明的抗体、同时给予干扰素和本发明的抗体、或者给予本发明的抗体后再给予干扰素，但优选为给予干扰素后再给予本发明的抗体、或同时给予干扰素和本发明的抗体，进一步优选为给予干扰素后再给予本发明的抗体。在给予干扰素后再给予本发明抗体的情况下，对干扰素和本发明抗体的给药间隔没有特别限定，可以考虑给药途径和剂型等要因后再设定。给药间隔的一个例子为通常为0小时72小时，优选为0小时~24小时，进一步优选为0小时~12小时。本发明的抗体可以和干扰素一起制成一种医药组合物。另外，本发明的抗体可以制成以与干扰素结合使用为特征的医药组合物。本发明的药物可以以药品形式进行给药，可以经口服或胃肠外进行全身或局部给药。例如，可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠、口服性肠溶剂等，可以根据患者的年龄、症状选择适宜的给药方法。有效给药量在每次、每lkg体重为0.01mg100mg的范围内选择。或者可以选择每名患者为1~1000mg、优选550mg的给药量。关于优选的给药量、给药方法，例如当为识别HLA的抗体时，血中存在游离抗体的程度的量为有效给药量，具体例子有每个月(4周)每1kg体重1次或分为数次给予0.5mg~40mg、优选lmg20mg,例如按照2次/周、l次/周、l次/2周、1次/4周等给药时间表，通过点滴等静脉内注射、皮下注射等方法进行给药的方法等。还可以边观察给药后的状态和血液检查值的动向，边调整给药时间表，例如将给药间隔由2次/周或1次/周延长至1次/2周、1次/3周、1次/4周等。本发明的药物中可以添加保存剂或稳定剂等制剂上可接受的载体。制剂上可接受的载体是指其本身具有或不具有上述活性、可与上述药物一同给药的制剂上可接受的材料。还可以是即使不具有上述活性、但通过与抗HLA抗体结合使用而具有协同或相加效果的材料。制剂上可接受的材料例如包括灭菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、緩冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。本发明中，作为稳定剂，可以使用0.2%左右的明胶或葡聚糖、0.1-1.0%的谷氨酸钠、或者约5%的乳糖或约2%的山梨醇等，但并不限于这些。保存剂的典型例子有0.01%左右的疏柳汞或0.1%左右的p-丙内酯等。本发明中，表面活性剂的例子有非离子表面活性剂，典型例子有脱水山梨糖醇单辛酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯等脱水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；单硬脂酸十聚甘油酯、二硬脂酸十聚甘油酯、单亚油酸十聚甘油酯等脂肪酸聚甘油酯；聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯十六烷基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧乙烯蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB6-18的非离子表面活性剂等。另外，表面活性剂还包括阴离子表面活性剂，典型例子有十六烷基硫酸钠、十二烷基疏酸钠、油烯基硫酸钠等具有碳原子数为10~18的烷基的烷基碌L酸盐；聚氧乙烯十二烷基碌u酸钠等环氧乙烷的平均加成摩尔数为2~4、烷基的碳原子数为10~18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基磺基琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8~18的烷基磺基琥珀酸酯盐；天然系的表面活性剂例如有卯磷脂、甘油磷脂；鞘磷脂等鞘磷脂类；碳原子数为1218的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。在本发明的药物中，可以添加上述表面活性剂中的一种或将两种以上组合添加。本发明的制剂中使用的优选的表面活性剂为聚山梨酸酯20、40、60或80等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，特别优选聚山梨酸酯20和80。另外，还优选泊洛沙姆(PluronicF-68(注册商标)等)所代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。表面活性剂的添加量根据使用的表面活性剂的种类而不同，使用聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80时，其添加量通常为0.001100mg/mL,优选为0.003~50mg/mL，进一步优选为0,0052mg/mL。本发明中，缓冲剂的例子有磷酸、枸橼酸緩沖液、乙酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡萄糖酸、辛酸、去氧胆酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸、其它有机酸等、或碳酸緩冲液、Tris緩冲液、组氨酸緩沖液、咪唑緩冲液等。另外，可以将本发明的药物溶解于溶液制剂领域中公知的水性緩冲液中，制成溶液制剂。緩沖液的浓度通常为1500mM，优选为5~100mM,进一步优选为1020mM。另外，本发明的药物可以含有其它小分子多肽、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质、M酸、多糖和单糖等糖类或碳水化合物、糖醇。本发明中，氨基酸的例子有碱性氨基酸、例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、乌氨酸等，或这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷酸盐的形式、即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时，通过添加适当的生理上可接受的緩冲物质、例如无机酸、特别是盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它们的盐，而调节至优选的pH值。此时，使用磷酸盐在得到特别稳定的冷冻干燥物方面特别有利。在制备物实质上不含有机酸、例如苹果酸、酒石酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸等的情况下或者不存在对应的阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、枸橼酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)的情况下特别有利。优选的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。并且，还可以使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸及其盐的形式(优选钠盐)；或中性氨基酸、例如异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、曱硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸；或芳族氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或其衍生物N-乙酰基色氨酸。本发明中，多糖和单糖等糖类和碳水化合物的例子有葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖和蜜三糖等。本发明中，糖醇的例子有甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。制成注射用水溶液时，例如有生理盐水、含葡萄糖或其它佐剂的等渗溶液、例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠，可以与适当的助溶剂、例如醇(乙醇等)、聚醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨酸酯80、HCO-50)等结合使用。根据需要，可以进一步含有稀释剂、助溶剂、pH调节剂、安慰剂(soothingagent)、含碌逸原剂、抗氧化剂等。本发明中，含硫还原剂的例子有N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酰基同型半胱氨酸、硫辛酸、硫代二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、硫代乙醇酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、以及碳原子数为1~7的硫代烷酸等具有硫氢基的还原剂等。本发明中，抗氧化剂的例子有异抗坏血酸、二丁基羟基曱苯、丁基羟基茴香醚、a-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚碌b酸氢钠、亚石危酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。根据需要，还可以将药物装入微嚢(羟甲基纤维素、明胶、聚[曱基丙烯酸甲酯]等的微嚢)中，或者制成胶体药物传递系统(脂质体、白蛋白微球体、微乳、纳米粒子和纳米嚢等)(参照"Remington'sPharmaceuticalScience第16版，，，Oslo编,1980等)。并且，将药物制成緩释制剂的方法也已公知，可适用于本发明(Langer等人,J.Biomed.Mater.Res.1981，15:167-277;Langer，Chem.Tech.1982,12:98-105;美国专利第3,773,919号；欧洲专利申请公开(EP)第58,481号；Sidman等人，Biopolymers1983,22:547-556;EP第133,988号)。所使用的制剂上可接受的载体，根据剂型从上述载体中适当或组合进行选择，但并不限于这些。制备注射剂时，根据需要添加pH调节剂、緩冲剂、稳定化剂、保存剂等，利用常规方法制成皮下、肌肉内、静脉内注射剂。关于注射剂，可以将溶液收纳在容器中，之后通过冷冻干燥等制成固体制剂，作为临用前调制的制剂。另外，可以将单剂量收纳在容器中，也可以将多剂量收纳在同一容器中。本发明药物的给药方法可以采用公知的各种方法。本发明中，"给药，，包括口服给药或胃肠外给药。口服给药的例子有以口服制剂的形式进行的给药。作为口服制剂，可以选择颗粒剂、散剂、片剂、胶嚢剂、溶液剂、乳剂或悬浮剂等剂型。胃肠外给药的例子有以注射剂形式进行的给药，注射剂的例子有点滴等静脉注射剂、皮下注射剂、肌肉注射剂或皿内注射剂等。另外，可以采用基因疗法，向机体内导入含有应该给予的寡核苷酸的基因，从而达到本发明方法的效果。还可以将本发明的药物在欲实施处置的区域进行局部给药。例如，还可以通过手术中的局部注入、导管的使用、或通过编码本发明抑制剂的DNA的耙基因传递进行给药。对患者给药时，除了采用例如动脉内注射、静脉内注射、皮下注射等以外，还可以利用本领域技术人员所公知的方法进行经鼻、经支气管、肌肉内、经皮或口服给药。给药量根据患者的体重、年龄、给药方法等而变动，但本领域技术人员可以适当选择适当的给药量。另外，当该化合物可通过DNA进行编码时，还可以考虑将该DNA插入基因治疗用载体中进行基因治疗。给药量、给药方法根据患者的体重、年龄、症状等而变动，但本领域技术人员可适当选择。本发明药物的一次给药量还根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法而不同，例如以注射剂的形式进行给药时，通常成人(体重60kg)每天约0.1~1000mg、优选约1.0-50mg、更优选约1.020mg。胃肠外给药时，其一次给药量还根据给药对象、对象脏器、症状、给药方法而不同，例如以注射剂的形式进行给药时，认为成人(体重60kg)通常按照每天约0.01~30mg、优选约1,0~20mg、更优选约0.1-10mg左右，通过静脉注射进行给药比较适合。对其它动物给药时，也可以给予每60kg体重的换算量或每体表面积的换算量。接种方法适当与否，这要考虑药物种类、接种对象的种类等来确定。容器可以是小瓶(vial)、预充式注射器制品(pre-filledsyringe)。根据需要，可以是溶液状也可以是通过冷冻干燥等得到的粉末制品。可以是一次接种用也可以是多次接种用。给药量才艮据接种对象的种类、体重、年龄、给药方法等而变动，但本领域技术人员可W适当选择适当的给药量。需要说明的是，本说明书中引用的所有专利、公开专利公报和公开文献，均以参照的形式纳入本说明书中。实施例以下，通过实施例来进一步具体说明本发明，但本发明并不受限于这些实施例。建立表达HLAclassIA/卩2M的Ba/F3细胞株建立表达人HLAclassIA和人卩2M的Ba/F3细胞。首先，如下制作全长HLAclassIA(HLA-fUll)表达载体。以编码全长HLAclassIA的cDNA为模板，使用以下引物(sHLA-l、fHLA-3，)进行PCR,扩增编码全长HLAclassIA的基因片段。sHLA-1:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(SEQIDNO:13)fHLA-3，TTGCGGCCGCTCACACTTTACAAGCTGTGAGAGACA(SEQIDNO:14)用EcoRI/Notl切断所得DNA片段，并插入动物细胞表达载体pCXND3的EcoRI/Notl间，构建全长HLAclassIA(fHLA-A)表达栽体(pCXND3-HLA掘)。接下来，如下制作全长P2-微球蛋白(p2M)表达载体。以来源于人脾脏的cDNA(人脾脏cDNA，Clontech弁S1206)为模板，使用以下引物(卩2M-1、卩2M-2)进行PCR，扩增编码全长J32M的基因片段。J32M-1:AAGCGGCCGCCACCATGTCTCGCTCCGTGGC(SEQIDNO:15),-2:TTTCTAGATTACATGTCTCGATCCCACTTAACT(SEQIDNO:16)用Notl/Xbal切断所得DNA片段，并插入pCOS2-ZEO的Notl/Xbal间，构建全长p2M表达载体(pCOS2zeo-p2M)。然后，如下建立表达HLA-A/p2M的Ba/F3细胞抹。用Pvul切断各20,g的pCXND3-HLA-fUll和pCOS2zeo-p2M，之后利用电穿孔法(BIO-RAD社GenePulser,0.33kV，950^F，timeconst.27.0)将其导入到悬浮于PBS(-)中的Ba/F3细胞(lxl07细胞/mL，800;/L)中。用生长培养基(RPMI1640+10%FCS+P/S+1ng/mLIL-3)稀释至适当的细胞数后，接种在96孔板中，第二天添加G418和Zeocin,使分别达到400^g/mL和800//g/mL。之后每隔34天交换一半的培养基，IO天后选择单一克隆。通过2D7IgG(10//g/mL)染色来测定所得表达HLA-A/卩2M的Ba/F3细胞林(弁9、#10、#22)、和ARH77细胞中HLAclassIA的表达量，利用FACS(COULTER,EUTE)解析各抗原在细胞膜上的表达(图1)。其结果,确认到在细胞林約中具有与ARH77细胞相同水平的HLAclassIA的表达。于是，将该细胞林用含有1ng/mLIL-3、500〃g/mLG418、800//g/mLZeocin(Invitrogen#46-0072)和10%FCS的RPMI1640培养基大量培养，用于细胞免疫。细胞免疫将表达HLA-A/P2M的Ba/F3细胞抹(BaF-HLA#9)用PBS(-)清洗两次，之后悬浮于PBS(-)中使达到1.52.0xl()7细胞/200〃L,将200户L该悬浮液注入小鼠(MRL/lpr,雄性，4周龄，日本CharlesRiver)腹腔内进行免疫(lmLTerumo注射器，针26G)。1周免疫1次，共免疫8次，第9周用200/^L2.5xl(f细胞/200;uL的悬浮液进行最终免疫，4天后进行细胞融合。杂交瘤的制作经无菌操作从小鼠体内摘出脾脏，在培养基l[RPMI1640(+P/S)]中搅匀，制成单一细胞悬浮液。将该悬浮液通过70/mi的尼龙筛(Falcon),除去脂肪组织等，计算细胞数。将所得B细胞与小鼠骨髓瘤细胞(P3U1细胞)以约2:1的细胞数比进行混合，加入1mL50%的PEG(Roche,cat#:783641，lot#:14982000)，进行细胞融合。将已融合的细胞悬浮于培养基2[RPMI1640(+P/S,10%FCS)]中，按100^L/孔分注到适当板数(10板)的96孔板中，在37。C下培养。第二天，按IOO;/L/孔加入培养基3[RPMI1640(+P/S,10%FCS,HAT(Sigma,H0262)，5%BMCondimedHI(Roche,cat#:1088947,lot#:14994800))],以后每天从每孔中除去100pL培养基、并按100//L/孔加入新的培养基3，重复操作4天。细胞死亡诱导抗体的筛选自细胞融合起约1周后筛选具有细胞死亡诱导活性的杂交瘤。细胞死亡诱导抗体的筛选以细胞聚集诱导能为指标如下进行。将表达HLA-A/卩2M的Ba/F3细胞按2.5x104细胞/孔接种在96孔板中，加入80/zL各杂交瘤的培养上清，在37。C下培养1小时。之后，加入抗小鼠IgG抗体(Cappel#55482,#55459),使达到6//g/mL。再培养4小时以进行交联反应，之后用显微镜观察细胞，选择观察到细胞聚集的孔。筛选1000个克隆份的培养上清，结果最终得到10个阳性杂交瘤。重新向96孔板中接种上述阳性孔的细胞使达到2.5细胞/孔，培养约10天，再次解析细胞聚集诱导活性。通过该操作得到IO种单一克隆。抗体组(panel)的制作5-1.抗体的纯化使用1mLHiTrap蛋白GHP柱(AmershamBiosciences#17-0404-01)，从所得克隆的杂交瘤的80mL培养上清中纯化抗体。以1mL/分钟的流速吸附杂交瘤上清，用20mL20mM的磷酸緩冲液(pH7.0)清洗后，用3.5mL0.1M的甘氨酸-HCl(pH2.7)进行洗脱。将洗脱组分按每0.5mL回收在事先加入了50//L1M的Tris-HCl(pH9.0)的微量离心管(Eppendorftube)中。测定OD加nm，合并含有抗体的组分，加入PBS(-)使总量达到2.5mL，之后使用PD-10柱(AmershamBiosciences#17-0851-01)将緩冲液置换成PBS(-)。使已纯化的抗体通过0.22,m的滤器(MILLIPORE#SLGV033RS),以下详细研究各纯化抗体的性质。5-2.亚型的确定抗体的亚型确定使用IsoStrip(Roche#1493027)来进行。确定亚型时使用经PBS(-)稀释了IO倍的杂交瘤的培养上清。5-3.表位解析5-3-1.小鼠MHCclassIA基因的克隆为了解析所得抗体识别HLAclassIA分子上的哪一个结构域，如下建立表达嵌合HLAclassIA的细胞林(图2)，上述嵌合HLAclassIA是将HLAclassIA的各种结构域(al结构域、a2结构域、a3结构域)分别置换成小鼠MHCclassI对应的结构域而得到的。首先，以小鼠MHCclassIA基因作为模板，按以下方法进行克隆。利用以下引物(mHLA-l和mHLA-2)，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA弁R005)对小鼠脾脏cDNA(MTC组，Clontech)进行PCR，扩增小鼠HLAclassIA的基因片段。mHLA-1:CTGCTCCTGCTGTTGGCGGC(SEQIDNO:17)mHLA-2:CAGGGTGAGGGGCTCAGGCAG(SEQIDNO:18)将所得基因片段TA克隆(TA-cloning)到pCRII-TOPO(InvitrogenTOPOTA-cloningkit，#45-0640)中，来确认核香^f列。5-3-2.构建用于表位解析的嵌合HLA-A表达载体然后，如下实施构建用于表位解析的嵌合HLA-A表达载体。HLA-A的al结构域为小鼠(MHH)的MHH表达载体(pCOS2-chHLA-MHHflag)按以下方法进行构建。以具有全长HLA-A的表达载体(pCXND3-HLAftill)为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005),利用以下引物(sHLA-A和chHLA-Hl)将HLA-A的信号序列(片段A)进行PCR扩增。sHLA-A:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(包括EcoRI位点)(SEQIDNO:19)chHLA-Hl:AATCTAGACTGGGTCAGGGCCAGGGCCCC(包括Xbal位点)(SEQIDNO:20)另外，利用以下引物(chHLA-H2和chHLA-H3)，将HLA-A的从a2结构域到终止密码子的序列(片段B)进行PCR扩增。chHLA-H2:TTTCTAGAGCCGGTTCTCACACCATCCAGAGG(包括Xbal位点)(SEQIDNO:21)chHLA-H3:AAGGATCCCACTTTACAAGCTGTGAGAGACACAT(包括BamHI位点)(SEQIDNO:22)用Eco-RI-XbaI切断片段A、用Xbal-BamHI切断片段B,将这些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI间。确认所得质粒的核苷酸序列，作为pCOS2-(M)HH。同时，以小鼠MHCclassIA基因为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA弁R005),利用以下引物(chHLA-Ml和chHLA-M2)，将小鼠MHCclassIA的al结构域(片段C)进行PCR扩增。chHLA-Ml:TTTCTAGAGCGGGCCCACATTCGCTGAGG(包括Xbal位点)(SEQIDNO:23)chHLA-M2:TTTCTAGACTGGTTGTAGTATCTCTGTGCGGTCC(包括Xbal位点)(SEQIDNO:24)用Xbal切断所得片段C,并插入用Xbal切开的pCOS2-(M)HH中。确认核苷酸序列，完成将al结构域置换成小鼠MHC-A的表达载体pCOS2-chHLA-MHH-flag的构建。a2结构域为小鼠(HMH)的HMH表达栽体(pCOS2-chHLA-HMHflag)按以下方法进行构建。以具有全长HLA-A的表达载体(pCXND3-HLAfUll)为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005),利用以下引物(sHLA-A和chHLA-H4),将HLA-A的信号序列-al结构域(片段D)进行PCR扩增。sHLA-A:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(包括EcoRI位点)(SEQIDNO:19)chHLA-H4:TTGTCGACCCGGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAG(包括Sail位点)(SEQIDNO:25)另外，使用以下引物(chHLA-H5和chHLA-H3)，将HLA-A的从a3结构域到终止密码子(片,殳E)进行PCR扩增。chHLA-H5:AAGTCGACGCCCCCAAAACGCATATGACT(包括Sail位点)(SEQIDNO:26)chHLA-H3:AAGGATCCCACTTTACAAGCTGTGAGAGACACAT(包括BamHI位点)(SEQIDNO:22)用EcoRI-SalI切断片段D、用Sall-Bamffl切断片段E,将这些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI间。确认所得质粒的核苷断列，作为pCOS2-H(M)H。同时，以小鼠MHCclassIA基因为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA存R005)，利用以下引物(chHLA-M3和chHLA-M4)，将小鼠MHCclassIA的a2结构域(片段F)进行PCR扩增。chHLA-M3:TTGTCGACCACGTTCCAGCGGATGTTCGGC(包括Sail位点)(SEQIDNO:27)chHLA掘GAGTCGACGCGCAGCAGCGTCTCATTCCCG(包括Sail位点)(SEQIDNO:28)用Sail切断所得片段F，将其插入用Sail切开的pCOS2-H(M)H中。确认核香酸序列，完成将a2结构域置换成小鼠MHC-A的表达载体pCOS2-chHLA-HMH-flag的构建。a3结构域为小鼠(HHM)的HHM表达载体(pCOS2-chHLA-HHMflag)按以下方法进行构建。以具有全长HLA-A的表达载体(pCXND3-HLAfiill)为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，利用以下引物(sHLA-A和chHLA-H6),将HLA-A的信号序列-a2结构域(片段G)进行PCR扩增。sHLA-A:TCCGAATTCCACCATGGCCGTCATGGCGCCCCGAAC(包括EcoRI位点)(SEQIDNO:19)chHLA-H6:TTTCTAGAGTCCGTGCGCTGCAGCGTCTCCT(包括Xbal位点)(SEQIDNO:29)另外，使用以下引物(chHLA-H7和chHLA-H3)，将HLA-A的胞内结构域(片段H)进行PCR扩增。chHLA-H7:TTTCTAGAATGGGAGCCGTCTTCCCAGCCCA(包括Xbal位点)(SEQIDNO:30)chHLA-H3:AAGGATCCCACTTTACAAGCTGTGAGAGACACAT(包括BamHI位点)(SEQIDNO:22)用EcoRI-XbaI切断片段G、用Xbal-BamHI切断片段H,将这些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI间。确认所得质粒的核普酸序列，作为pCOS2-HH(M)。同时，以小鼠MHCclassIA基因为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，利用以下引物(chHLA-M5和chHLA-M6),将小鼠画CclassIA的a3结构域(片段I)进行PCR扩增。chHLA-M5:AATCTAGAAAGGCCCATGTGACCTATCACCCC(包括Xbal位点)(SEQIDNO:31)chHLA掘TATCTAGAGTGAGGGGCTCAGGCAGCCCC(包括Xbal位点)(SEQIDNO:32)用Xbal切断所得片段I,将其插入用Xbal切开的pCOS2-HH(M)中。确认核苷酸序列，完成将a3结构域置换成小鼠MHC-A的表达载体pCOS2-chHLA-HHM-flag的构建。ala3结构域为小鼠(MMM)的MMM表达载体(pCOS2-chHLA-MMMflag辨以下方法进行构建。用EcoRI-XbaI切断片段A、用Xbal-BamHI切断片段H，将这些片段插入pCOS2-FLAG的EcoRI-BamHI间。确i人所得质粒的核苷酸序列，作为pCOS2-(MMM)。以小鼠MHCclassIA基因为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA#R005)，利用以下引物(chHLA-Ml和chHLA-M6)，将小鼠MHCclassIA的ala3结构域(片段J)进行PCR扩增。chHLA-Ml:TTTCTAGAGCGGGCCCACATTCGCTGAGG(包括Xbal位点)(SEQIDNO:23)chHLA德TATCTAGAGTGAGGGGCTCAGGCAGCCCC(包括Xbal位点)(SEQIDNO:32)用Xbal切断所得片段J,将其插入用Xbal切开的pCOS2-(MMM)中确认核苷酸序列，完成将cxla3结构域置换成小鼠MHC-A的表达栽体pCOS2-chHLA-MMM-flag的构建。5-3-3.建立用于表位解析的表达嵌合HLA-A/卩2M的Ba/F3细月沐用Pvul切断各20pg的pCOS2-chHLA-MHH-flag、pCOS2-chHLA-HMH-flag、pCOS2-chHLA-HHM-flag和pCOS2-chHLA-MMM-flag,再利用电穿孔法(BIO-RAD社GenePulser,0.33kV，950〃F,timeconst.27.0)导入到悬浮于PBS(-)中的Ba/F3细胞(lx107细胞/mL,800//L)中。用生长培养基(RPMI1640+l()o/oFCS+P/S+1ng/mLIL-3)稀释至适当的细胞数后，接种在96孔板中，第二天添加G418使达到500pg/mL。10天后在显微镜下选择单一克隆。关于上述克隆，将lxl()S个细胞溶解于50//L0.5%的NP40lysis緩冲液(含有0.5%NP40、150mMNaCl和5mMEDTA的10mMTris-HCl(pH7.5))中，使用12;uL上清液进行SDS-PAGE。印迹到PVDF膜上后，使用抗FlagM2抗体(SIGMA弁F3165)和HRP-抗小鼠抗体(AmershamBiosciences弁NAW10)进行蛋白质印迹，篩选产生chHLA的细胞林。选择chHLA的表达最高的chHLA-MHH弁8、chHLA-HMH#6、chHLA-HHM弁2和chHLA-MMM弁4，用含有1ng/mLIL-3、500yWg/mLG418和10%FCS的RPMI1640培养基大量培养。并且，利用电穿孔法向这些chHLA表达细胞林中导入各15的被PvuI切断的pCOS2zeo-卩2M。第二天添加G418和Zeocin(Invitrogen#46-0072),使分别达到500〃g/mL和800pg/mL。12天后在显微镜下选择单一克隆。将这些细胞用抗人P2M抗体(SIGMA^M7398)和抗小鼠IgG-FITC抗体(BeckmanCoulter弁IM0819)染色，通过FACS(BeckmanCoulter，ELITE)分析p2M在细胞膜上的表达。将(32M的表达最高的c孤A-MHH/(32M#1-3、chHLA曙HMH/卩2M#2-1、c孤A-HHM/卩2M弁3-4和chHLA-MMM/J32M存4-6在含有1ng/mLIL-3、500^g/mLG418、800〃g/mLZeocin和10%FCS的RPMI1640培养基中大量培养，用于表位解析。5-3-4.利用FACS进行的表位分析为了确定所得抗体(IO个克隆)的表位,解析它们与上述嵌合HLA/|32M表达细胞的结合能。将嵌合HLA/|32M表达细胞按8xl05细胞/孔接种在96孔板中，添加各抗体使达到10〃g/mL。在冰上孵育1小时后，用150FACS緩沖液清洗细胞，再用抗小鼠IgG-FITC抗体(BeckmanCoulter釘M0819)染色，之后用FACS(BeckmanCoulter,ELITE)进行解析(图3)。其结果，C3B3、C11B9、C17D11并没有与HMH/Ba/F3(a2结构域为小鼠HLA)结合，由此可知表位为a2结构域。另一方面，尽管C17A4、C17E9、C23H12、C26D8没有与小鼠MHCclassI交叉(结杲未显示)，但均与嵌合HLA结合，其FACS染色图案与抗I32M抗体产生的染色图案一致，由此判断这些克隆不与HLA反应，而与(32M反应。C7C5、C20D4并没有与HMH(具有小鼠HLAa2结构域)或HHM(具有小鼠HLAa3结构域)的HLA结合，由此推测这些克隆识别a2a3之间的区域。5-4.细胞死亡诱导活性所得抗体对ARH77细胞的细胞死亡诱导活性的评价如下进行。向ARH77细胞中添加各纯化抗体(5//g/mL)，之后在二次抗体(抗小鼠IgG抗体，Cappel#55482，存55459)的存在下(120/zg/mL)或不存在下，在37。C下培养4小时。培养后回收细胞，进行碘化丙锭(PI)染色，使用FACS(BeckmanCoulter，ELITE)测定PI阳性细胞(死细月包)的比例(图4)。其结果，在交联存在下，在C3B3、C17D11、C11B9抗体中确认到较强的细胞死亡诱导活性。5-5.可变区的克隆使用RNeasyMiniKit(QIAGEN#74104)和QIAshredder(QIAGEN#79654)，从约5乂106个杂交瘤中纯化总RNA。使用SMARTRACEcDNAAmplificationKit(CLONTECH弁PT3269-1)由1的总RNA合成cDNA。此时使用试剂盒中所含的5，-CDS引物。以所得cDNA为模板，按以下条件进行PCR，扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(Vt)。引物UPM<~~^G2a(VH;IgG2a)，UPM<~~^k(VL;k)94。C下5秒钟、72。C下2分钟，5循环94。C下5秒钟、70。C下10秒钟、72。C下2分钟，5循环94。C下5秒钟、68。C下10秒钟、72。C下2分钟，27循环将所得基因片段TA克隆到pCRII-TOPO(InvitrogenTOPOTA-cloningkit，#45-0640)中，来确认核苷*列。对于每个基因解析最少2个以上的质粒，确认序列。包括本实施例中确认的前导序列的重链可变区的核苷酸序列见SEQIDNO:46,该核苷酸序列所编码的重链可变区的#^酸序列见SEQIDNO:47。SEQIDNO:46的第58号-第432号的核苷酸序列(SEQIDNO:l)和SEQIDNO:47的第20号第144号的M齡列(SEQIDNO:2)相当于重链可变区。另外，包括本实施例中确认的前导序列的轻链可变区的核苷,列见SEQIDNO:48，该核苷酸序列所编码的轻链可变区的M^列见SEQIDNO:49。SEQIDNO:48的第61号~第381号的核苷,列(SEQIDNO:3)和SEQIDNO:49的第21号第127号的絲,列(SEQIDNO:4)相当于轻链可变区。5-6.抗体组的制作将以上所得抗体的相关信息分组概括如表1所示，所述信息包括:抗体的同工型分类、编码抗体可变区的基因序列、表位、与ARH77细胞的结合活性以及细胞死亡诱导活性等。分析编码可变区的M酸序列的结果在表位具有(x2结构域的3个克隆(C3B3、C17D11、Cl1B9)的重链可变区中，虽然C3B3和C17D11具有相同的氨基酸，但C11B9与C3B3/C17D11相比，有一个氨基酸不同(图5-l)。另外，轻链可变区中3个克隆的序列完全相同(图5-2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>双抗体的制作6-1.双抗体载体的制作尽管在二次抗体(GAM)存在下确认所得C3B3抗体对ARH77细胞具有细胞死亡诱导活性，但抗体单独存在时并未确认到强的细胞死亡诱导活性。因此，制作C3B3抗体的可变区经5mer肽(GGGGS)(SEQIDNO:33)连接而成的双抗体。以TA克隆到pCRII-TOPO中的Vn为模板，使用pyrobestDNA聚合酶(TAKARA弁R005)进行PCR,扩增H链可变区的从信号序列到FR4部分。使用5，侧的引物中附加有EcoRI位点、3'侧的引物中附加有接头序列(氨基酸GGGGS)的引物。同样，以TA克隆到pCRII-TOPO中的Vt为模板进行PCR，扩增L链可变区的从FR1到FR4序列。使用5'侧的引物中附加有接头序列(^j^酸GGGGS)、3，側的引物中附加有Flagtag和NotI位点的引物。使已扩增的VH、V^彼此退火，之后使用两端的引物进行PCR，扩增双抗体的基因。用EcoRI/Notl切断所得片段，将其插入pCXND3的EcoRI/Notl间，确认核苷酸序列，完成表达载体的构建。以下给出制作C3B3双抗体(接头5个^j^酸)时的引物和PCR反应条件。引物C3B3DB-H1:cctgaattcCACCATGTACTTCAGGCTCAGCTCAG(SEQIDNO:34)C3B3DB-H2:GGATATCgctaccgcetccaccTGAGGAGACGGTGACTGAAATTCCTT(SEQIDNO:35)C3B3DB-L1:CAggtggaggcggtagcGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCC(SEQIDNO:36)C3B3DB-L2:attgcggecgettatcacttategtegteatecttgtagtcTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCGATCCG(SEQIDNO:37)PCR反应条件94。C下1分钟94。C下30分钟、72。C下30分钟、25循环接下来，使用S-300HR柱(AmershamBiosciences#27-5130-0l)纯化所得PCR产物，使用pyrobestDNA聚合酶，按以下条件使各1的Vh和Vi^退火。94°。下1分钟94。C下30分钟、72。C下30分钟，5循环使用较C3B3DB-H1、C3B3DB-L2短的引物C3B3DB-5，、C3B3DB-3，，按以下条件对退火后的1反应液进行PCR。C3B3DB-5，cctgaattcCACCATGTACTTCAGGC(SEQIDNO:38)C3B3DB-3，attgcggecgettatcacttateg(SEQIDNO:39)94。C下1分钟94。C下30分钟、72。C下l分钟，25循环使用S-400HR柱(AmershamBiosciences#27-5140-0l)纯化已扩增的片段，用EcoRI/Notl切断该片段，并插入pCXND3的EcoRI/Notl间，确认核苷酸序列，完成pCXND3-C3B3DB-Flag的构建。包括本实施例中确认的前导序列和Flag-tag序列的双抗体的核普酸序列见SEQIDNO:50，该核苷酸序列所编码的双抗体的M酸序列见SEQIDNO:51。在SEQIDNO:50中，第58号第432号的核苷酸序列相当于重链可变区，第433号~第447号的核苷,列相当于接头序列，第448号~第768号的核苷酸序列相当于轻链可变区。在SEQIDNO:51中，第20号第144号的M,列相当于重链可变区，第145号第149号的M酸序列相当于接头序列，第150号第256号的M酸序列相当于轻链可变区。6-2.建立双抗体表达细胞株将上述载体导入DG44细胞中，建立C3B3双抗体产生细胞林。社GenePulser，1,5kV，25^F)导入到悬浮于PBS(-)中的DG44细胞(1x107细胞/mL，800yuL)中。用生长培养基(CHO-S-SFMII/PS)稀释至适当的细胞数后，接种在96孔板中。第二天添加G418使达到500^g/mL。约2周后在显微镜下选择含有单一克隆的孔，使用10//L的各培养上清进行SDS-PAGE。印迹到PVDF膜上后，使用抗FlagM2抗体(SIGMA#F3165)、HRP-抗小鼠抗体(AmershamBiosciences#NA9310)进行蛋白质印迹，筛选产生双抗体的细胞林。大量培养产量最高的细胞株。6-3.双抗体的纯化使表达C3B3双抗体的DG44细胞抹的100mL培养上清通过0.22;mi的滤器(MILLIPORE弁SL(JV033RS),之后使用Pl泵使上述培养上清以1mL/分钟的流速吸附在填充有1mLANTI-FLAGM2琼脂糖亲和^J^(SIGMA弁A-2220)的K9柱(AmershamBiosciences#19-0870-01)上。用6mL50mM的Tris-HCl(pH7.4)、150mM的NaCl、0.01%的Tween20清洗柱，之后用7mL0.1M的甘氨酸-HCl(pH3.5)、0.01%的Tween20洗脱。使用AKTAexplorer10S以1mL/分钟的流速进行清洗和洗脱。监测280nm的吸光度，同时将洗脱组分以每0.5mL回收在事先加入了50〃L1M的Tris-HCl(pH8.0)的5mL管中。合并回收的组分，使用CentriconYM-10(amicon弁4205)浓缩至300/^L，之后立即进行凝胶过滤层析。凝胶过滤层析使用Superdex200HR柱(Amersham#17-1088-01)和AKTAexplorerIOS，以0.4mL/分钟的流速进行。用0.01%Tween20、PBS(-)平衡后，手动注入上述M2纯化样品。监测280nm的吸光度，同时将组分按每0.5mL分取到5mL的管中。合并、回收每个峰的组分，使之通过0.22/mi的滤器(MLLIPORE#SLGV033RS或SLGV004SL)后，在4。C下保存。6-4.双抗体的细胞死亡诱导活性的分析如图6所示，C3B3小抗体经凝胶过滤层析，结果根据分子量(立体结构)的不同分离成3个主要组分(峰(l)、峰(2)、峰(3))。测定各组分的细力包死亡诱导活性。与2D7双抗体的细胞死亡i秀导活性进4亍比较。其结果，在分子量大的组分(峰(l)、(2):C3B3多聚体)中仅确认到弱的细胞死亡诱导活性，而在二聚体组分(峰(3):C3B3双抗体)中确认到胜过2D7双抗体的强的细胞死亡诱导活性(图7)。6-5.比较纯化C3B3双抗体与2D7双抗体的增殖抑制效果比较已纯化的C3B3双抗体(图6、峰(3))和已知的2D7双抗体的增殖抑制能力。将ARH77细胞以12xl0"田胞/孔的细胞浓度接种在96孔板中，向其中添加所得各抗体使达到适当浓度，培养3天后测定细胞数。测定活细胞数时使用WST-8(活细胞数测定试剂SF;NacalaiTesque)。即，将该试剂按10;/L/孔添加到细胞中，在37。C下培养1.5小时后，用分光光度计测定450nm的吸光度，将该数值作为相对活细胞数(图8)。其结果，与2D7双抗体相比，C3B3双抗体以更低的浓度显示出强的增殖抑制能力。由此证明C3B3双抗体是具有较2D7双抗体强的抗肿瘤效果的〗氐分子抗体。C3B3双抗体的大量制备7-1.培养上清的制备将lxl()7个表达C3B3双抗体-Flag的DG44细胞悬浮于2LCHO-S腸SFMII(Invitrogen,c/n:12052-098)/PS(Invitrogen，c/n:15140-122)培养基中，接种在cellSTACK(Coming,c/n:3271)中。在5%C02培养箱内于37。C下培养，存活率达到不足60%时回收培养上清(培养约7天)。回收的培养上清以3000rpm的转速在4。C下离心20分钟，使上清液通过0.22;mi的滤器(Coming，c/n:430513)，在4。C下保存。7-2.利用色谱法进行的纯化(l)7-2-1，利用阴离子柱进行的粗纯化向XK50柱中填充QSepharoseFastFlow(AmershamBiosciences,c/n:17-0510-01)(床体积为100mL)。将该柱用500mLmilliQ7JC、500mL含1MNaCl和0.01%Tween20的20mM的Tris-HCl(pH7.5)(QB)依次清洗，之后用500mL含0.01%Tween20的20mM的Tris-HCl(pH7.5)(QA)平衡。向2L培养上清中加入2LmilliQ水以稀释2倍，再加入约20mL1M的Tris调节至pH7.8,将所得溶液吸附在已平衡的柱上。吸附时使用Pl泵，以10mL/分钟的最大流速在4。C下进行约15小时。接下来，使用AKTAprime以10mL/分钟的流速进行清洗和洗脱。用300mL16%的QB清洗柱后，用400mL25%的QB和100mL30%的QB进行洗脱。将组分按每12mL分取在15mL的管中。监测280nm的吸光度，同时回收从变换成25%QB后的最初峰到流过100mL30%的QB时的组分。合并回收的组分，使之通过0.22/nn滤器(Coming，c/n:430626)，加入0.6当量的QA,使盐浓度达到约150mM，之后在4。C下保存。柱经400mLQB、200mL0.1M的NaOH、200mLQB依次清洗后，用500mLQA平衡后再生。7-2-2.使用ANTI-FLAGM2亲和柱(M2柱)进行的纯化向XK26柱中填充ANTI-FLAGM2AffinityGelFreezer-Safe(SIGMA，c/n:A2220)(床体积为10mL)。将该柱用50mL含150mMNaCl和0.01%Tween20的50mMTris-HCl(pH7.4)(MA)、30mL含0.01%Tween20的0.1M甘氨酸-HCl(pH3.5)(MB)清洗后，用50mLMA平衡。然后，将540mL经阴离子柱粗纯化的样品(相当于约2L的培养上清)吸附在两根串联的M2柱上。吸附时使用PI泵，以1mL/分钟的最大流速在4。C下进行约15小时。之后，使用AKTAexplorer10S以4mL/分钟的流速进行清洗和洗脱。用50mLMA清洗柱后，用30mL100。/。的MB洗脱。洗脱时，监测280nm的吸光度，同时将组分按每2mL回收在事先加入了2001M的Tris-HCl(pH8.0)的5mL管中。合并回收的組分，使用CentriprepYM-10(amicon，c/n:4304)浓缩至5mL，之后立即进行凝胶过滤，置换緩冲液。当目视确认到不溶物时，将溶液通过0.22/mi的滤器(MIIXIPORE，c/n:SLGV013SL)，之后再进行凝胶过滤。洗脱样品后，将柱用50mLMA平衡，之后在4'C下保存。当1周以上都不使用柱时，用30mL以上含150mMNaCl和0.02。/。NaN3的50mMTris-HCl(pH7.4)冲洗柱，之后在4。C下保存。7-2-3.利用凝胶过滤层析进行的纯化以使用HiLoad26/60Superdex200pg(Amersham,c/n:17-1071-01)的凝胶过滤分离双抗体，同时置换緩冲液。操作中使用AKTAexplorer10S,流速为2mL/分钟。用含0.0P/。Tween20的PBS(-)平衡后，手动注入上述M2纯化样品。监测280nm的吸光度，同时将保留体积为约200mL时的洗脱峰的组分^^2.5mL回收在5mL管中。合并回收的组分，使之通过0.22//m的滤器(MILLIPORE,c/n:SLGV033RS)后在4'C下保存。研究每一批已纯化的双抗体的活性后合并，用CentriprepYM-10(amicon，c/n:4304)浓缩至约1mg/mL,使之通过0.22/rni的滤器(MILLIPORE,c/n:SLGV033RS)后保存。7-3.利用色谱法进行的纯化(2)通过离子交换色语法、羟基磷灰石层析、凝胶过滤层析法这3个步骤，从上述(7-l)得到的培养上清中纯化C3B3双抗体。培养上清经超纯水稀释至3倍后，用1MTris调节至pH8.0。之后将培养上清加入到经含0.02%Tween20的20mMTri-HCl(pH8.0)平衡的QSepharoseFastFlow柱(GEHealthcare)上，用相同的緩冲液清洗该柱后，使用相同的緩冲液，以0M(X5M的NaCl的直线浓度梯度洗脱吸附在该柱上的多肽。用SDS-PAGE分析所得组分，收集所有含C3B3小抗体(C3B3多聚体和C3B3双抗体)的组分。将步骤一得到的C3B3组分添加到经含0.02%Tween20的10mM磷酸緩冲液(pH7.0)平衡的羟基磷灰石柱(BIO-RAD，typeI,20〃m)上，用相同緩冲液清洗该柱后，使磷酸緩沖液浓度直线上升至250mM,洗脱吸附在该柱上的多肽。洗脱峰用SDS-PAGE和使用了Superdex200PC3.2/30柱(GEHealthcare)的凝胶过滤进行分析。仅收集显示目标C3B3双抗体的分子量的峰。步骤二得到的C3B3双抗体的峰组分用amiconultra10kDacut(MILLIPORE)进行浓缩，再用含0.01。/oTween20的PBS(-)平衡，之后添加到HiLoad26/60Superdex200pg柱(GEHealthcare)上。用SDS-PAGE分析所得组分，将含有目标C3B3双抗体的主峰作为纯化组分。使用Superdex200PC3.2/30柱，对已纯化的C3B3双抗体进行分析凝胶过滤时出现单峰，表观分子量为约52kDa。C3B3双抗体的SDS-PAGE分析结果为在还原和非还原条件下，在单体的分子量位置(约27kDa)均显示出单谱带。由以上可知C3B3双抗体是两分子单链Fv进行非共价结合的二聚体。C3B3双抗体的药效评价8-1.C3B3双抗体对体外细胞增殖的抑制效果为了详细解析C3B3双抗体的抗肺瘤效果，首先，如下研究该双抗体对各种人血液肿瘤细胞株的增殖抑制效杲。细胞使用人EBV-转化B细胞林ARH-77、IM-9、MC/CAR和人Burkitt，s淋巴瘤细胞抹HS-Sultan。培养ARH-77、IM-9和HS-Sultan时使用含10%FCS的RPMI1640培养基。培养MC/CAR时使用含20%FCS的Iscove，smodifiedDulbecco，s培养基。ARH-77和IM-9以3xl03细胞/孔的浓度接种在96孔板中、MC/CAR以5xl03细胞/孔的浓度接种在96孔板中，而HS-Sultanand以lx104细胞/孔的浓度接种在96孔板中，在C3B3双抗体或2D7双抗体的存在下，在5%032培养箱中于37。C下培养3天。然后向各孔中添加WST-8(Cat.No.07553-15,NakalaiTesque林式会社)，再培养4小时，之后用酶标仪测定450nm(参比波长为655nm)的吸光度。以未添加抗体的孔的吸光度为100%、以未添加细胞的孔的吸光度为0%,测定细胞增殖。用三份样品进行试验，算出平均值和标准偏差(图9)。用于实验的所有细胞^f朱中，C3B3双抗体和2D7双抗体均显示出浓度依赖性的细胞增殖抑制。但两者相比，C3B3双抗体以较2D7双抗体低的低浓度下，也显示出远远超过2D7双抗体的最大活性的增殖抑制效果。8-2.C3B3双抗体的体内抗肿瘤效果8-2-1.小鼠血清人IgG定量法使用下述ELISA定量小鼠血清中所含的人IgG。将100/^L经0.1mol/L碳酸氢盐緩冲液(pH9.6)稀释至1pg/mL的山羊抗人IgG(BIOSOURCE社制)加入到96孔板(Nunc社制)上，在4。C下孵育一夜，使抗体固定。封闭后，添加100//L梯式稀释的小鼠血清或100//L作为标准品的人IgG(CAPPEL社制)，在室温下温浴2小时。清洗后，加入100//L稀释了5000倍的碱性磷酸酶标记抗人IgG(BIOSOURCE社制)，在室温下温浴2小时。清洗后加入底物溶液，温浴后用酶标仪(BIO-RAD社)测定405nm的吸光度。8-2-2.C3B3双抗体对人EBV转化B细胞(IM-9)移植小鼠的抗肿瘤效果8-2-2-1.IM-9移植小鼠的制作IM-9移植小鼠如下制作。将在含有10%FCS(Hyclone社制)的RPMI1640培养基(SIGMA-ALDRICH社制)中进行体外继代培养的IM-9细胞用上述培养基调节至5xl()S细胞/mL。对前一天事先腹腔内给予了100pL抗asialo-GMl(和光纯药社制)的Scid小鼠(雌性、6周龄、日本Clea)/A^静脉注入200戶L上述IM-9细胞调整液。8-2-2-2.抗体的给予对上述IM-9移植小鼠，在IM-9移植后第1、2、3天，按10mg/kg尾静脉给予抗体(2D7双抗体或C3B3双抗体)，每天2次，共计6次。对照組按10mL/kg尾静脉给予含Tween20的PBS。8-2-2-3.C3B3双抗体对IM-9移植小鼠的抗肿瘤效果的评价关于C3B3双抗体的抗肿瘤效果，以小鼠的存活期间和血清中的人IgG量进行评价。如图IO所示，给予了C3B3双抗体的小鼠与对照组的小鼠相比，确认其存活期间明显延长。即使与给予了2D7双抗体的小鼠相比，其存活期间也有所延长。另外，在IM-9移植后第14天从小鼠体内采取血清，使用上述8-2-1的ELISA进行测定(图11)。其结果，如图ll所示，给予了C3B3双抗体的小鼠与对照组的小鼠相比，血清中人IgG量明显降低。即使与给予了2D7双抗体的小鼠相比，确认其血清中人IgG量也有下降的趋势。由此表明C3B3双抗体对人EBV转化B细胞移植小鼠具有较2D7双抗体强的抗肿瘤效果。[实施例9]研究C3B3双抗体对人PBMC的细胞死亡诱导作用研究C3B3双抗体和2D7双抗体对人末梢血单核细胞(PBMC)的细胞死亡诱导效果。利用比重离心法从健康成人志愿者的末梢血中分离PBMC。将该PBMC以5xl04细胞/孔(用伴刀豆球蛋白A进行刺激时)或1.5xl()S细胞/孔(用SAC进行刺激时)的浓度接种在96孔板中。伴刀豆球蛋白A(以下记作ConA,和光纯药工业)以最终浓度10yUg/mL进行添加，SAC(PansorbinCell,Carbiochem)以最终浓度0.01%进行添加。并且，C3B3双抗体或2D7双抗体分别以最终浓度10/^g/mL进行添加。将该细胞在5。/。C02培养箱中于37。C下培养3天。在培养的第3天向每孔添加10//LCellCountingKit-8(Dojindo社制),在5%C02培养箱中于37°C下反应7小时，之后用酶标仪(BIO-RAD社)测定450nm(参比波长为630nm)的吸光度。其结果，如图12所示，用ConA刺激时和SAC剌激时，C3B3双抗体均显示出较2D7双抗体强的细胞死亡诱导活性。C3B3双抗体对体外细胞增殖的抑制效果如下研究C3B3双抗体对人T细胞系肿瘤细胞的增殖抑制效果。细胞使用Jurkat(E6-l)抹(从ATCC购入)。培养Jurkat(E6-l)细胞时使用含10%FCS的RPMI1640培养基。将Jurkat细胞以2xl04细胞/孔的浓度接种在96孔板中，在C3B3双抗体或2D7双抗体的存在下，在5%C02培养箱中于37。C下培养3天。然后，向各孔中添加CellCountingKit-8(Code.No.CK04，DojindoLaboratories,Japan),再培养2小时，之后用酶标仪测定450nm(参比波长为630nm)的吸光度。以未添加抗体的孔的吸光度为100%、以未添加细胞的孔的吸光度为0%，测定细胞增殖。用三份样品进行试验，算出平均值和标准偏差(SE)(图13)。C3B3双抗体和2D7双抗体在Jurkat细胞中均显示出浓度依赖性的细胞增殖抑制。但两者相比，C3B3双抗体在较2D7双抗体低的低浓度下也显示出强的增殖抑制效果。在迄今为止的研究中已经明确HLA抗体对所有淋巴细胞均显示出效果(W02004/033499、WO2005/100560)，根据以上结果，认为本果'产业实用性根据本发明，提供通过与抗小鼠IgG抗体交联而具有细胞死亡诱导活性的新型抗HLA-A抗体和C3B3抗体。另夕卜，将C3B3抗体低分子化(双抗体化)而得到的抗体，即使不添加抗小鼠IgG抗体，也显示出强效的细胞死亡诱导活性，其活性在体外肿瘤细胞分析系统中远远超过以往的低分子抗体的活性。并且，该低分子抗体在体内胂瘤移植模型小鼠中也显示出较以往的低分子抗体高的抗肿瘤效果。即，C3B3低分子抗体与以往的低分子抗体相比，在对血液肿瘤细胞显示出高的杀细胞活性、同时以更低的浓度显示出细胞死亡诱导活性方面优异。因此，可以期待该低分子抗体作为血液肿瘤、骨髓免疫性疾病和自身免疫疾病等的治疗药，发挥比以往的低分子抗体更优异的药效。权利要求1.抗体，该抗体包括重链可变区，上述重链可变区具有由SEQIDNO7、8、9记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3。2.抗体，该抗体包括轻链可变区，上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3。3.抗体，该抗体包括重链可变区和轻链可变区，上述重链可变区具有由SEQIDNO:7、8、9记载的氨基酸序列组成的CDR1、2、3;上述轻链可变区具有由SEQIDNO:10、11、12记载的M酸序列组成的CDRl、2、3。4.抗体，该抗体包括以下(a)(d)中任一项所述的重链可变区(a)重链可变区，其具有SEQIDNO:2记载的絲瞎列；(b)重链可变区，其具有在SEQIDNO:2记载的氨基酸序列中有一个或多个氨基酸#1取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，该重链可变区与(a)所述的重链可变区功能相同；(c)重链可变区，其具有包含SEQIDNO:1记载的核苷酸序列的DNA所编码的M酸序列；(d)重链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:1记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列。5.抗体，该抗体包括以下(e卜(h)中任一项所述的轻链可变区(e)轻链可变区，其具有SEQIDNO:4记载的M酸序列；(f)轻链可变区，其具有在SEQIDNO:4记载的^J^酸序列中有一个或多个氨基酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的氨基酸序列，该轻链可变区与(e)所述的轻链可变区功能相同；(g)轻链可变区，其具有包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA所编码的皿酸序列；(h)轻链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的氨基酸序列。6.抗体，该抗体包括以下(a卜(d)中任一项所述的重链可变区和(e)(h)中任一项所述的轻链可变区(a)重链可变区，其具有SEQIDNO:2记载的M酸序列；(b)重链可变区，其具有在SEQIDNO:2记载的M酸序列中有一个或多个M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，该重链可变区与(a)所述的重链可变区功能相同；(c)重链可变区，其具有包含SEQIDNO:1记载的核苷酸序列的DNA所编码的氨基^列；(d)重链可变区，其具有在严格条件下与包含SEQIDNO:1记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列；(e)轻链可变区，其具有SEQIDNO:4记载的氨基酸序列；(f)轻链可变区，其具有在SEQIDNO:4记载的氨基酸序列中有一个或多个氛基酸^皮取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列，该轻链可变区与(e)所述的轻链可变区功能相同；(g)轻链可变区，其具有包含SEQIDNO:3记载的核苷酸序列的DNA所编码的M酸序列；(h)轻链可变区，其具有在严格条件下与包舍SEQIDNO:3记载的核普酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的M酸序列。7.抗体，该抗体具有以下(a卜(d)中任一项所述的M酸序列(a)SEQIDNO:6记载的^J^酸序列；(b)在SEQIDNO:6记载的氨基酸序列中有一个或多个M酸被取代、缺失、插入和/或附加而得到的M酸序列；(c)包含SEQIDNO:5记载的核苷酸序列的DNA所编码的氨基,列；(d)在严格条件下与包含SEQIDNO:5记载的核苷酸序列的DNA进行杂交的DNA所编码的^J^酸序列。8.抗体，该抗体与表位结合，该表位与权利要求1~7中任一项所述的抗体所结合的人白细胞抗原蛋白的表位相同，该人白细胞抗原简称为HLA。9.权利要求18中任一项所述的抗体，该抗体为单克隆抗体。10.权利要求1~9中任一项所述的抗体，该抗体识别人白细胞抗原，该人白细胞抗原简称为HLA。11.权利要求10所述的抗体，其中HLA为HLAclassI。12.权利要求11所述的抗体，其中HLAclassI为HLA-A。13.权利要求1~12中任一项所述的抗体，该抗体为低分子抗体。14.权利要求13所述的抗体，其中低分子抗体为双抗体。15.以下(a)或(b)所述的多核苷酸(a)多核苷酸，其包含SEQIDNO:1、3或5记载的核苷酸序列；(b)多核苷酸，其在严格条件下与(a)所述的多核苷酸进行杂交，并且编码与权利要求114中任一项所述的抗体具有相同活性的抗体。16.载体，该载体包括权利要求15所述的多核苷酸。17.宿主细胞，该宿主细胞包括权利要求15所述的多核苷酸或权利要求16所述的载体。18.权利要求114中任一项所述的抗体的制作方法，该方法包括以下步骤(a)制作权利要求15所述的多核苷酸的步骤；(b)制作载体的步骤，所述载体包括(a)所述的多核苷酸；(c)将(b)所述的栽体导入宿主细胞中的步骤；(d)培养(c)所述的宿主细胞的步骤。19.细胞死亡诱导剂，其含有权利要求1~14中任一项所述的抗体作为有效成分。20.权利要求19所述的细胞死亡诱导剂，其特征在于该诱导剂i秀导B细力包或T细胞的细胞死亡。21.权利要求20所述的细胞死亡诱导剂，其中B细胞或T细胞为活化B细胞或活化T细胞。22.细胞增殖抑制剂，其含有权利要求1~14中任一项所述的抗体作为有效成分。23.抗肿瘤药，其含有权利要求1~14中任一项所述的抗体作为有效成分。24.权利要求23所述的抗肿瘤药，其中肿瘤为血液肿瘤。25.自身免疫疾病治疗药，其含有权利要求114中任一项所述的抗体作为有效成分。全文摘要本发明以提供具有高细胞死亡诱导活性的抗体为课题。本发明人等为了解决上述课题，首先用表达人HLAclassIA和人β2微球蛋白(β2M)的细胞对小鼠进行免疫，得到单克隆抗体。在所得抗体中筛选具有细胞死亡诱导活性的抗体，得到10个克隆。解析这些克隆时发现表位上具有HLAclassI抗原的α2结构域的3个克隆(C3B3、C11B9、C17D11抗体)能够与抗小鼠IgG抗体交联，从而显示出强细胞毒活性。进一步在制作C3B3抗体的双抗体时，发现该双抗体与以往的HLAclassIA抗体-2D7抗体的双抗体相比，显示出更强的抗肿瘤效果。文档编号A61K39/395GK101517075SQ20078003410公开日2009年8月26日申请日期2007年7月13日优先权日2006年7月13日发明者川合重人,木村直纪申请人:中外制药株式会社