专利名称：：茶多酚的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及茶多酚或其溶剂化物在制备用于治疗人结直肠肿瘤药物中的用途。二
背景技术：
：茶多酚Teapolyhenols是从茶叶中提取，包括黄垸醇类、羟基-[4]-黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。其中以儿茶素(Catechin，属黄垸醇类)最为重要，约占多酚类总量的60-80%;儿茶素类主要由GEC、D，L-C、EC、没食子酸酯EGCG、GCG、ECG等几种单体组成。儿茶素类化合物因多含酚性羟基，故极易发生氧化，聚合，縮合等变化，决定其具有较好的抗氧化能力和清除自由基的能力。其抗氧化能力是人工合成抗氧化剂BHT、BHA的4-6倍，是VE的6-7倍，VC的5-10倍，且用量少0.01-0.03%即可起作用，而无合成物的潜在毒副作用；儿茶素对食品中的色素和维生素类有保护作用，使食品在较长时间内保持原有色泽与营养水平，能有效防止食品、食用油类的哈败，并能消除异味。目前应用包括1.油脂抗氧化剂其功效优于维他命e及人工合成bha,bht。2.自由基清除剂可保护细胞膜,减缓人体老化、抗衰老。3.色素保护剂防止天然食品着色剂的降解退色，效果比维他命C高。4.天然除臭剂日本人用儿茶素对猪、鸡及人体实验,服用儿茶素二周后，粪便臭味显着减轻。5.抗菌、抗病毒及改变人体肠内微生物分布相中国及俄罗斯，有以茶汁治疗痢疾的纪录。日本有以儿茶素提炼治疗阴部皮肤黏膜之皮肤病。6.防止感冒经实验结果茶中的多酚类对流行性感冒病毒〈influenzavirus〉有极强的不活化作用。7.防龋齿，临床证明儿茶素类可减少菌斑及牙周指数。在医药上的作用在过去十年中，已发表了数百篇论文和大量的基础研究均表明了茶多酚对下列疾病有明显的防治效果降血压、抗血凝、降血脂、减肥、防治动脉粥样硬化和血栓形成等心血管病、降血糖、防治糖尿病、杀菌抗病毒；防治胃肠道、呼吸道、流感等疾病；防治肝炎、脂肪肝、抗衰老和增强免疫机能；抑制血压上升根据人体实验,每天摄取500毫克儿茶素类,经三个月测定其饮食前后之血压，发现舒张压与收縮压均明显降低。也有抗高血脂、抗心血管疾病、清除自由基及除臭等作用。健齿、防治牙周炎、防龋、消臭解毒等疗效。可以作为上述疾病患者的辅助药品和保健药品的原料。但未见用于治疗人结直肠肿瘤的报导。三
发明内容本发明目的是提出一种茶多酚或其溶剂化物在制备用于治疗人结直肠肿瘤药物中的用途。本发明的技术解决方案是茶多酚或其溶剂化物在制备用于治疗人结直肠肿瘤药物中的用途。本发明的茶叶提取物——茶多酚用普通的赋形剂、稀释剂或载体配制，并压制成片，或配制成便于口服或肌肉或静脉内给药的药剂或溶液剂。还可经皮施用，并可以用肠溶包衣成援释剂型等，如口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型，即片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂形式。适于这些配方的赋形剂、稀释剂和载体包括下列物质填充剂和增量剂如淀粉、蔗糖、甘露醇以及硅衍生物；粘合剂如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、和聚乙烯吡咯垸酮；湿润剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素等；溶解抑制剂如石蜡；助溶促进剂如季胺化合物；表面活性剂如十六垸醇、单硬脂酸甘油酯、吸附载体如高岭土和膨润土；以及润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁和微粉硅胶。本发明的茶多酚也可配制成适于肌肉、皮下或静脉内途径施用的溶液剂。此外，本发明的化合物非常适于作为缓释剂型。这些制剂可以适当组成，以使它们能在一段时间内只释放活性成分或者优选在肠道特定部分释放活性成分。根据本发明，具体剂量，将依据病情的严重程度、施药途径和相关因素决定，这由主治医生确定。一般，可接受的和有效的每日剂量从约10至200mg/天，且更常见的是从30至120mg/天。将上述剂量给需要治疗的患者每天施用一次至三次或者按需要采用缓控释制剂或注射液进行治疗。本发明使用错配修复基因MSH2基因缺失的Lovo细胞作为研究对象，在使用不同剂量的茶多酚对Lovo细胞治疗研究中发现，茶多酚在150mg/ral剂量即对Lovo产生80-90%以上的抑制率，随着剂量的增加并不能增加其抑制效果，而对于错配修复基因表达正常的SW480细胞其抑制效果较差，而且其呈现剂量与增殖抑制的正相关关系，与Lovo细胞的增殖曲线不同，提示茶多酚对于Lovo细胞的抑制作用。本发明尤其是适用于微卫星不稳定(MSI)结直肠癌的治疗，其机制是微卫星不稳定(MSI)结直肠癌是由于错配修复基因突变导致的结直肠癌，约占结直肠癌20-30%,MSI结直肠癌分子病理学特点是由于错配修复基因表达缺失、导致DNA复制错误增加、MSI而导致结直肠癌。本发明发现使用茶多酚可以特异性的错配修复基因表达缺失的结直肠癌细胞株。四图1是茶多酚对SW480和Lovo细胞增殖抑制率曲线图2是茶多酚处理结肠造口的结肠癌原位移植模型的肿瘤生长曲线五具体实施例方式(一)实施材料与方法1、细胞株Lovo细胞(hMSH2缺失结肠癌细胞株)、SW480细胞(错配修复基因正常的结肠癌细胞株)购自南京中医药大学细胞库。2、茶多酚制备茶多酚购自杭州茶叶有限公司，以蒸馏水配置成50mg/ml的溶液，灭菌后备用。3、MTT检测(活细胞数量Promega经典的细胞增殖检测方法)测定细胞增殖抑制和MSI检测按MTT检测，每个剂量3个重复，茶多酚溶液共0、50、100、150、200、250和300ng/mL8个剂量，设计空白对照一个，分别于24小时、72小时和一周后检测细胞增殖情况；留取细胞抽提DNA，以Genescan方法(DetectionofmismatchrepairgenegermlinemutationcarrieramongChinesepopulationwithcolorectalcancer.BMCCancer2008,8:44)检测药物处理后细胞24h、72h和一周的微卫星不稳定情况和TGFe1、TGF02和IGF片段的大小，与未使用药物和空白对照的细胞的微卫星进行比较。4、结肠造口结肠癌原位移植模型的建立和茶多鼢的处理(1)试验动物BALB/Cnu/nu裸鼠，SPF级，购自北京科丽华实验动物中心，体重2428g,分笼饲养于独立送风笼具，室温控制在24°C25°C，相对湿度50%60%。(2)细胞株及细胞培养人结肠腺癌细胞株(Lovo)购自中国科学院上海细胞生物研究所。Lovo细胞以RPMI-1640培养基，10%小牛血清，在37。C，5XC02培养，0.25y。胰酶-EDTA消化，PBS洗2次，调整细胞浓度制成1X106的细胞悬液。(3)裸鼠皮下接种模型的建立裸鼠颈部右侧皮肤消毒，用一次性lmL注射器将Lovo细胞悬液注入皮下0.2mL/只。注射完毕后，对注射部位进行观察，约4周成瘤，对成瘤小鼠进行观察，待其自然死亡后解剖观察肿瘤特点，肿瘤在肺、肝、肠系膜处转移情况。(4)裸鼠结肠造口氯胺酮(0.17mg/ml)裸鼠腹腔注射麻醉，左腹部碘BJ消毒，将皮肤及腹膜剪一小口，将裸鼠盲肠提出腹壁约0.5cm，以5—0缝线将盲肠与周围皮肤缝合固定，术后注意补充葡萄糖生理盐水，加强营养，术后23天造口部位会结痂，约一周结痂脱落，露出肠道。术后两周可进行下一步手术。(5)造口处肿瘤原位移植取皮下接种小鼠肿瘤50mg，切取lmm的2块，种植于结肠造口处，待肿瘤生长至5mm时开始进行茶多酚处理。(6)茶多酚的治疗研究选取已结肠造口结肠癌原位移植模型40只，设空白对照对照组10只、茶多酚三个剂量50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg处理组各10只，观察肿瘤增长情况。分别于用药前、用药后3天、7天、14天、28天的肿瘤处取材，Genescan方法检测微卫星不稳定情况和TGFP1、TGFe2和IGF片段的大小变化。肿瘤体积估计公式为(肿瘤长轴X肿瘤短轴2)/2;肿瘤抑制率估算公式(用药后肿瘤体积-用药开始肿瘤体积)/用药开始肿瘤体积。5、结果5-1茶多酚对Lovo细胞和SW480细胞的增殖抑制作用在处理后药物处理后24小时Lovo细胞抑制率明显增加，而且在浓度超过150ug/ml后抑制率趋于稳定，对SW480细胞的抑制率不明显，72小时和一周后对Lovo细胞的抑制率具有同样的趋势，对SW480细胞的抑制率随时间延长和浓度的增加逐渐上升。不同时间的细胞增殖抑制率见表l、表2和图la、lb和lc。5-2、茶多酚(150ug/ml)处理后的Lovo细胞和SW480细胞微卫星不稳定和TGFe1、TGFP2和IGF片段的大小变化空白对照的Lovo细胞在BAT-25和D2S123出现片段的延长，提示为微卫星不稳定的结肠癌细胞株而SW480空白对照未出现微卫星不稳定现象。在使用茶多酚治疗的细胞Lovo细胞中，24小时后出现BAT-25和D2S123新的峰，提示为MSI，除D17S250在1周时出现片段长度变化以外，其余在72h和1周差异不明显。TGFP1、TGFP2和IGF片段大小变化不大。在Lovo细胞中，BAT-26未扩增出。SW480细胞的变化不明显。各微卫星标志测量数值见表3。5-3、使用茶多酚处理结肠造口的结肠癌原位移植模型的结果50mg/kg、75mg/kg和100mg/kg三个治疗组在注射査多酚后，一周开始出现肿瘤的縮小，2-3周左右肿瘤縮小最多，在3周以后肿瘤开始增长；而对照组肿瘤一直处理增长状况，治疗组和对照组差异有显著意义，而3个治疗组之间差异无显著意义。经治疗后的肿瘤生长曲线见图2。5-4、结肠造口的结肠癌原位移植模型的肿瘤微卫星不稳定和TGFe1、TGFe2和IGF片段大小变化；在空白对照组，能扩增到的4个微卫星标志和TGFP1、TGFP2和IGF均出现延长和縮短。茶多酚治疗后微卫星标志和TGFP1、TGFP2和IGF变化如表4。提示Lovo在增殖过程表现出明显的含简单重复序列基因的突变，符合Lovo细胞的增殖特点，但是在使用茶多酚治疗后，微卫星标志出现稳定趋势。在使用结肠造口的结肠癌原位移植模型进行茶多酚治疗研究中发现，在3个不同的剂量，茶多酚可以使肿瘤縮小，特别在治疗后3周内肿瘤縮小明显。该结果在以往的研究中没有见到相同的报道，特别在使用非细胞毒性药物对肿瘤治疗的研究中，在在体水平很难发现肿瘤縮小。但是Lovo细胞为MSI结直肠癌细胞，其C0X-2为低表达，因此不可能通过抑制C0X-2来达到抑制Lovo细胞的作用。本研究研究了Lovo细胞的微卫星不稳定变化和一些含有简单重复序列基因如TGFP1、TGF02禾BIGF在茶多酚治疗后的变化。空白对照的Lovo细胞在培养过程中出现了微卫星不稳定现象，符合Lovo作为错配修复基因缺失的肿瘤细胞的特征，而在使用茶多酚治疗后的Lovo细胞，24小时后出现BAT-25和D2S123新的峰，但是在在72h和1周差异不明显。提示茶多酚可能具有抑制微卫星不稳定的特点，但是由于培养细胞无法长时间进行培养，因此很难出现明显的微卫星不稳定的变化。在细胞学研究中我们没有发现TGFP1、TGFP2和IGF的片段变化证据，可能是由于培养细胞时间较短，使许多错配修复基因缺失后的分子特点无法表达的缘故。我们使用结肠造口的结肠癌原位移植模型，在不同治疗时间进行取样后进行微卫星不稳定检测发现使用在空白对照组，能扩增到的4个微卫星标志和TGFei、TGFe2和IGF均出现延长和縮短，提示Lovo在增殖过程表现出明显的含简单重复序列基因的突变，符合Lovo细胞的增殖特点，但是在使用茶多酚治疗后，3天可以检测到微卫星标志和TGFe1、TGFP2和IGF等基因的变化，但是在1周、2周禾tl3周后这些微卫星序列有趋于稳定的趋势，提示茶多酚可能是抑制了这些含有简单重复序列基因的突变而导致抗肿瘤的作用。(二)茶多酚、溶液在预防MSI结肠癌术后结肠息肉形成中的作用40例MSI结直肠癌术后的患者作为研究对象，其中20例从术后6月、9月开始给与茶多酚水溶液50mg/kg/天，连续用药15天，20例不进行治疗，6月后观察患者结肠息肉形成情况并对其毒副作用进行研究。试验组共4例患者中发现13枚息肉，发生息肉的比例为20%，而对照组ll例患者中发现54枚息肉，息肉的发现率为55%。2组息肉发生率和发生的个数统计学检查差异有显著意义。结论茶多酚水溶液可以预防MSI结肠癌患者息肉的形成，减少肿瘤的发生。下一步将继续扩大样本量并申请院内制剂批号。(三)实施例h人结肠肿瘤患者的症状改善作用选出一组20名人结直肠肿瘤患者，另有一组试验组。对这些患者治疗前后进行测定将上述患者以75mg/天的剂量给予茶多酚注射，持续给药1周(茶多酚肠溶制剂)，治疗组有明显效果，血检验癌蛋白指标变好。实施例2:人直肠肿瘤患者的症状改善作用进行与试验l同样的试验，给药的时间为3周，治疗前后进行症状选出一组20名人结直肠肿瘤患者，另有一组试验组。对这些患者治疗前后进行测定将上述患者以100mg/天的剂量给予茶多酚注射，持续给药3周(茶多酚肠溶制剂)，治疗组有明显效果。血检验癌蛋白指标明显变好。表l:茶多酚对Lovo细胞的增殖抑制率(3X)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2:茶多酚对SW480细胞的增殖抑制率(3X)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3:各微卫星标志测量数值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、茶多酚或其溶剂化物在制备用于治疗人结直肠肿瘤药物中的用途。2、茶多酚或其溶剂化物在制备用于治疗MSH2基因缺失人结直肠肿瘤药物中的用途。3、根据权利要求1或2所述的治疗人结直肠肿瘤药物中的用途，其特征是采用赋形剂、稀释剂或载体配制，与茶多酚压制成片；或将茶多酚配制成口服或肌肉或静脉内给药的药剂或溶液剂。4、根据权利要求1或2所述的治疗人结直肠肿瘤药物中的用途，其特征是将茶多酚配制成肠溶包衣成援释剂型。5、根据权利要求1或2所述的治疗人结直肠肿瘤药物中的用途，其特征是使用的剂量为10至200mg/天。6、根据权利要求1或2所述的治疗人结直肠肿瘤药物中的用途，其特征是剂量30至120mg/天。全文摘要茶多酚或其溶剂化物在制备用于治疗人结直肠肿瘤药物中的用途。尤其是在制备用于治疗MSH2基因缺失人结直肠肿瘤药物中的用途。采用赋形剂、稀释剂或载体配制，与茶多酚压制成片；或将茶多酚配制成口服或肌肉或静脉内给药的药剂或溶液剂。文档编号A61K31/7042GK101336916SQ20081002113公开日2009年1月7日申请日期2008年8月8日优先权日2008年8月8日发明者丁义江,丁曙晴,刘秀芳,谈瑄忠,金黑鹰申请人:南京市中医院