专利名称：几丁糖-胶原-得宝松缓释放系统及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术和高分子医用材料领域，具体涉及几丁糖一胶原一得宝松 缓释放系统及其制备方法和在周围神经修复中的应用。
背景技术：
周围神经损伤是临床上常见的创伤，由于其发生率高、治疗效果差， 一直是 创伤外科领域的棘手难题。临床实践表明，阻碍周围神经损伤后修复疗效进一步 提高的一个重要原因是神经缝合口局部的疤痕增生。神经修复术后局部产生血肿, 来自不同部位的成纤维细胞游移并侵入血肿，在炎性细胞释放的炎性介质、生长 因子趋化刺激下，成纤维细胞向创口内聚集、增殖、合成、分泌胶原纤维逐渐形 成疤痕组织。疤痕组织主要通过两种方式影响神经功能的恢复， 一是与损伤神经 粘连,直接压迫神经，并影响神经的血供；二是疤痕生长入缝合口间隙，阻碍近 端再生的神经纤维通过缝合口。研究证明，周围神经修复术后，约50%的轴突 刚通过缝合口就终止于疤痕组织中。所述的上述两种方式均会阻碍神经再生，影 响其功能恢复。而一旦形成致密疤痕，则将严重影响再生神经的通过。单纯应用 各种促进神经生长的药物或其它手段，往往不能获得理想的效果。己成为目前周 围神经损伤修复研究领域的一项亟待解决的难题。因此，研究预防周围神经术后 的疤痕增生，提高周围神经修复疗效，改善功能恢复，是当前国内外学者研究的 热点。
目前，国内外学者在基础实验和临床实践方面进行了大量的研究,主要集中 在两方面，一是利用生物制剂阻隔祌经缝合口和周围组织以达到物理防粘连的效 果；二是利用甾体类激素抑制炎症反应的药理作用以达到防止疤痕增生的效果。 但是，总体效果均不令人满意。
几丁糖(Chitosan)又称壳聚糖，是几丁质脱乙酰化的衍生物，是一种含有大 量阳离子的葡萄糖胺多聚体，广泛存在于虾、蟹的外壳，贝类、动物软骨等，具 有较好的组织相容性，极强的生物活性，良好的生物降解性和特殊的生理功能，被广泛用于医疗、保健、农业等领域。被国际学术界称为继蛋白质、脂类、糖类、 维生素和矿物质之后的人类第6生命要素。研究表明，几丁糖具有止血、止痛、 抑制微生物生长、调节巨噬细胞和成纤细胞等作用，因此，许多学者将其作为创 面愈合的促进剂。不同浓度的几丁糖及其衍生物一方面促进成纤维细胞的增殖和 迁移，有利于新生修复组织的结构重塑和构建，能增强或恢复伤口愈合的力学强 度；另一方面抑制成纤维细胞的过度增殖，防止疤痕增生，有助于外观和功能的 恢复，使伤口得到高质量的愈合。因引，可以作为局部缓释药物的良好载体，有 研究通过动物实验证实，几丁糖庆大霉素药物释放系统在治疗骨感染方面具有较 好的体内、外缓释作用，使用简单、方便、安全、无需二期取出。但是，几丁糖 在体内降解需要较长时间。
胶原(Collagen)是一类研究较深入的结构蛋白，在动物组织和器官的构成中 起着重要的作用。由于其来源广泛，具有生物可降解性、生物相容性和低免疫原 性，已应用于药物载体系统和人造血管、瓣膜等组织工程领域。胶原可应用于医 药领域的一个主要原因在于它经过自聚和交联，可形成具有一定强度和稳定性的 结构，用弱酸水提取后可制成多种形式的药物载体系统。胶原的吸收和活性物质 的释放受所用的交联剂种类和数量的影响。目前，胶原释放系统主要包括眼科用 的胶原罩、烧伤和创伤用胶原海绵,用于基因释放的微球等。
得宝松是一种长效糖皮质激素，每ml注射液由5mg 二丙酸倍他米松和2mg 倍他米松磷酸二钠组成。倍他米松磷酸二钠可溶于水，在体内很快吸收而迅速起 效，而二丙酸倍他米松微溶于水，可在体内储存而缓慢吸收，维持3—6周的作 用时间。具有抑制毛细血管和纤维母细胞的增生,延缓肉芽组织生长，并且使胶 原纤维溶解，防止粘连及瘢痕形成，从而起到抗增生的作用。但是，全身长期应 用副作用大，局部应用浓度不易控制等缺点。
尽管各种不同降解速度及力学性能的生物膜及局部缓释使药物不断问世，在 促进神经再生方面也已有了一些尝，但迄今为止，国内外尚无报道有关使得物理 阻隔和药理作用能持久、无副作用地同时发挥，促进神经再生作用的药物缓释放 系统。
发明内容
本发明的目的是提供一种几丁糖一胶原一得宝松缓释放系统。本发明缓释放
4系统可用于临床周围神经修复，能为探讨几丁糖一胶原一得宝松缓释放系统促进 神经再生、提高神经功能恢复提供有意义的参考。
本发明采用医用几丁糖和胶原作为支撑材料制成复合膜，以该复合膜为载 体，以甾体类激素(得宝松)为缓释药物，采用药物缓释技术，将甾体激素加入 该膜中，制成几丁糖一胶原一得宝松缓释放系统。
所述的几丁糖一胶原复合膜以1: 9度比例配制，使其在体内一定时间内完
全降解；所述的甾体激素(得宝松)以适合的比例加入该膜中，使其以恒定速度 释放。本发明采用药物缓释技术，使甾体类激素在局部长期维持在有效浓度，与 复合膜的防粘连功能产生协同作用，抑制疤痕增生，提高神经功能恢复的作用。
本发明的另一目的是提供制备几丁糖一胶原一得宝松缓释放系统的方法。
所述的缓释放系统通过下述方法和步骤制备
取3%酸溶性几丁糖与1. 5%胶原(上海其胜生物材料技术研究所提供)以1: 9 的比例混合，再加入得宝松混悬液，所加入的得宝松混悬液的量分别为0.2ml、 0.4ml、 0.6ml、 0.8ml、 lml，优选0.6ml，充分混合60分钟，然后在200转/分 钟搅拌下逐渐滴入36%甲醛2 ml, 5分钟后灌入模具内，静置1小时后脱模，蒸 馏水清洗后冰冻真空抽干机间断干燥12小时，制得几丁糖一胶原一得宝松缓释 放系统，4。C下存放，所述的膜的厚度为0.5國，干燥后的膜为一侧开口的管状 结构。
本发明的进一步目的是提供所述几丁糖一胶原一得宝松缓释放系统在周围 神经修复中的应用。
本发明进行了周围神经修复动物实验
60只成年雄性SD大鼠(中科院实验动物中心提供)体重250—280g,随机分 为六组，每组10只，A:对照组；B、 C、 D、 E、 F:几丁糖一胶原一得宝松组，加 入的得宝松混悬液的量分别为0.2ml、 0.4ml、 0.6ml、 0.8ml、 lml，分别在术后 2周、4周、8周、12周、16周进行各项监测指标检测。
结果显示
1)几丁糖-胶原一得宝松组
大体观察结果各组大鼠术后2周内双侧下肢均出现不同程度肿胀，2周后
逐渐减轻。共42只大鼠足趾或足底出现皮肤溃疡，平均约8周时溃疡基本愈合，患肢无明显肿胀，活动自如。无一例发生感染。
术后2周取材时，实验组可见局部几丁糖一胶原一得宝松缓释膜与周围组织
无明显粘连，神经活动度可。其中，以E组明显；F组神经吻合口缝线大部分脱
落，仅部分丝状结构相连，周围组织菲薄。故未作进一步检测。12周时几丁糖 一胶原一得宝松缓释膜已基本降解吸收，形成膜样组织，局部无明显瘢痕组织增 生。其中，以D组明显。16周时，该缓释膜已完全降解吸收，局部无明显瘢痕 和粘连，神经活动度良好，D组优于E组优于C组优于B组。
组织学结果见神经缝合口局部瘢痕组织增生不明显，与周围组织分界清楚， 2周后炎症反应不明显。术后12周时，纵切面上见通过缝合口的再生神经纤维 较直，排列结构较整齐。其中，以D组较为明显。16周时，几丁糖一胶原一得 宝松缓释膜降解吸收完全。AChE染色见通过缝合口的运动神经纤维数量明显增 多，D组优于E组优于C组优于B组。
电生理结果术后3周时D、 E既有早期恢复，12、 16周，实验组坐骨神经 诱发电位的波幅的恢复率比对照组高，且差异有显著性意义(户<0.05);潜伏期 的延迟率与对照组相比有所降低，且差异有显著性意义(尸<0.05)。以D组最为 明显。
计算机图像分析结果术后16周，轴突的平均直径和有髓神经纤维再生明 显提高。D组明显高于其它实验组。 2)对照组
大体观察结果共9只大鼠足趾或足底出现皮肤溃疡，平均约10周时溃疡 基本愈合，患肢无明显肿胀，活动自如。
术后2周时可见神经缝合口局部瘢痕组织增生，与周围组织粘连，神经活动 受限。术后4周、8周、12周、16周时缝合口局部粘连加重，神经基本无活动 度。
组织学结果见神经缝合口局部瘢痕增生和粘连明显。纵切面上见神经缝合 口局部被瘢痕压迫而有不同程度变窄，通过缝合口的再生神经纤维扭曲明显，排 列不整齐。AChE染色见通过缝合口的运动神经纤维数量较少。
电生理结果术后早期无活动电位，12、 16周，坐骨神经诱发电位的波幅底。
6计算机图像分析结果术后16周，轴突的平均直径的有髓神经纤维再生较
实验组低，且有显著性差异(Z3〈0.05)。
3)应用stata 8.0统计软件，进行实验组数据与对照组数据间非配对t检验。
本发明经动物实验结果显示，
(1) 几丁糖一胶原一得宝松缓释膜能有效地抑制成纤维细胞的生长增殖， 并能减少胶原的产生，使神经缝合口瘢痕减少， 一方面防止瘢痕与神经粘连，直 接压迫神经，影响神经的血供，；另一方面有利于再生神经纤维通过缝合口；
(2) 通过缝合口的再生神经纤维较直，排列结构较整齐，且运动神经纤维 数量明显增多；
(3) 修复神经的诱发电位的波幅的恢复率明显提高；轴突的平均直径和有 髓神经纤维再生也明显提高；
(4) 所述的几丁糖一胶原一得宝松缓释系统中加入的得宝松混悬液的量为 0.6ral时为最佳，浓度过高影响神经再生，过低则抑制瘢痕作用不理想。
本发明采用几丁糖一胶原复合膜为药物载体系统，既可利用几丁糖和胶原在 体内的良好的生物相容性和可吸收性，起到物理隔阻和抑制成纤维细胞生长而促 进内皮细胞生长作用；又可利用胶原是神经基底膜的成分之一，在神经再生过程 中参与形成基质桥，有利行于轴突爬行延伸作用。同时，可以避免单纯的几丁糖 管脆性较高，易碎塌陷；单纯的胶原管降解时间较短的缺点。本发明缓释放系统 为新型的生物可降解材料，兼有现有技术的优点，增加了材料的柔韧性，延长了 降解时间。本发明采用得宝松为缓释药物利用了其在体内储存而缓慢吸收,能维 持3—6周的作用时间，通过恒定的速度释放，使其具有长期抑制毛细血管和纤 维母细胞的增生，能延缓肉芽组织生长，并使胶原纤维溶解，防止了粘连及瘢痕 形成,起到抗增生的作用。
本发明几丁糖一胶原一得宝松缓释系统用于修复周围神经，解决了神经再生 过程中瘢痕组织对其压迫和阻隔作用，使神经轴突通过率明显提高，神经修复获 得满意的效果。
具体实施方式
实施例1
取3%酸溶性几丁糖与1. 5%胶原，以1: 9的比例混合,再渐加入得宝松混悬 液0. 2ml，充分混合60分钟，然后在200转/分钟搅拌下逐渐滴入36%甲醛2 ml， 5 分钟后灌入模具内，静置l小时后脱模，蒸馏水清洗后冰冻真空抽干机间断干燥 12小时，得几丁糖一胶原一得宝松缓释膜，4r下存放。所述的膜的厚度为0. 5mra， 干燥后的膜为一侧开口的管状结构。 实施例2
取3%酸溶性几丁糖与1. 5%胶原，以1: 9的比例混合，再渐加入得宝松混悬 液0. 4ml ，充分混合60分钟，然后在200转/分钟搅拌下逐渐滴入36%甲醛2 ml， 5 分钟后灌入模具内，静置1小时后脱模，蒸馏水清洗后冰冻真空抽干机间断干燥 12小时，得几丁糖一胶原一得宝松缓释膜，4'C下存放。所述的膜的厚度为0. 5mm， 干燥后的膜为一侧开口的管状结构。
实施例3
取3%酸溶性几丁糖与1. 5%胶原，以1: 9的比例混合，再渐加入得宝松混悬 液0. 6ml，充分混合60分钟，然后在200转/分钟搅拌下逐渐滴入36%甲醛2 ral， 5 分钟后灌入模具内，静置1小时后脱模，蒸馏水清洗后冰冻真空抽千机间断干燥 12小时，得几丁糖一胶原一得宝松缓释膜，4。C下存放。所述的膜的厚度为0. 5mm， 干燥后的膜为一侧开口的管状结构。 ' 实施例4
取3%酸溶性几丁糖与1.5%胶原，以l: 9的比例混合，再渐加入得宝松混悬 液0.8ml ，充分混合60分钟，然后在200转/分钟搅拌下逐渐滴入36%甲醛2 ml， 5 分钟后灌入模具内，静置l小时后脱模，蒸馏水清洗后冰冻真空抽干机间断干燥 12小时，得几丁糖一胶原一得宝松缓释膜,4'C下存放。所述的膜的厚度为0. 5ram， 干燥后的膜为一侧开口的管状结构。 实施例5
取3%酸溶性几丁糖与1. 5%胶原，以1: 9的比例混合，再渐加入得宝松混悬 液lml，充分混合60分钟，然后在200转/分钟搅拌下逐渐滴入36%甲醛2 ml， 5 分钟后灌入模具内，静置1小时后脱模，蒸馏水清洗后冰冻真空抽干机间断干燥 12小时，得几丁糖一胶原一得宝松缓释膜，4'C下存放。所述的膜的厚度为0. 5mm,
8干燥后的膜为一侧开口的管状结构。 实施例7动物实验
60只成年雄性SD大鼠(购自中科院实验动物中心)体重250—280g，随机分为
六组，每组10只。分为对照组；实验组几丁糖—胶原一得宝松组，编号B、 C、
D、 E、 F，加入的得宝松混悬液的量分别为0.2ml、 0.4ml、 0.6ml、 0.8ml、 lml， 分别在术后2周、4周、8周、12周、16周进行各项监测指标检测。 1)几丁糖一胶原一得宝松组
2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，30 — 35mg/kg，无菌条件下常规显露右侧坐骨神 经并于梨状肌下缘l.Ocm处切断，在手术显微镜下以神经表面血管为解剖标志，采 用外膜缝合法，用11一0尼龙线间断吻合4针，所有的显微缝合均由转专人操作， 能保证对合、打结松紧度一致。神经吻合口周围缠绕植入上述不同浓度的几丁糖一 胶原一得宝松生物膜，所述膜的近、远端各与近、远端神经外膜缝合一针固定。局 部肌肉覆盖，缝合皮肤，分笼词养。
结果显示
术后2周内双侧下肢均出现不同程度肿胀，2周后逐渐减轻，共42只大鼠足 趾或足底出现皮肤溃疡，平均约8周时溃疡基本愈合，患肢无明显肿胀，活动自如， 无一例发生感染；
术后2周取材时，实验组可见局部几丁糖一胶原一得宝松缓释膜与周围组织无 明显粘连，神经活动度可，其中，以E组明显；F组神经吻合口缝线大部分脱落， 仅部分丝状结构相连，周围组织菲薄。12周时几丁糖一胶原一得宝松缓释膜已基
本降解吸收，形成膜样组织，局部无明显瘢痕组织增生，其中，以D组明显；16
周时，该缓释膜已完全降解吸收，局部无明显瘢痕和粘连，神经活动度良好，按顺
序D组优于E组优于C组优于B组。
组织学结果神经缝合口局部瘢痕组织增生不明显，与周围组织分界清楚，2 周后炎症反应不明显；术后12周；，纵切面上见通过缝合口的再生神经纤维较直， 排列结构较整齐，其中，以D组较为明显；16周时，几丁糖一胶原一得宝松缓释 膜降解吸收完全，AChE染色见通过缝合口的运动神经纤维数量明显增多，按顺序D 组优于E组优于C组优于B组。
9电生理结果术后3周D、 E既有早期恢复，12、 16周，实验组坐骨神经诱发 电位的波幅的恢复率比对照组高，差异有显著性意义(P<0.05);潜伏期的延迟率 与对照组相比有所降低，差异有显著性意义(P<0.05),以D组最为明显。
计算机图像分析结果术后16周，轴突的平均直径和有髓神经纤维再生明显 提高，D组明显高于其它实验组。
2)对照组
2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30-35mg/kg)。无菌条件下常规显露右侧坐骨神 经并于梨状肌下缘l.Ocm处切断，在手术显微镜下以神经表面血管为解剖标志，采 用外膜缝合法，用11一0尼龙线间断吻合4针，所有的显微缝合均由专人操作，保 证对合、打结松紧度一致，神经吻合口周围未用几丁糖一胶原一得宝松缓释膜。
术后共9只大鼠足趾或足底出现皮肤溃疡，平均约10周时溃疡基本愈合，患 肢无明显肿胀，活动自如。
术后2周时见神经缝合口局部瘢痕组织增生，与周围组织粘连，神经活动受限； 术后4周、8周、12周、16周时缝合口局部粘连加重，神经基本无活动度。
组织学结果见神经缝合口局部瘢痕增生和粘连明显，纵切面上见神经缝合口 局部被瘢痕压迫而有不同程度变窄，通过缝合口的再生神经纤维扭曲明显，排列不 整齐，AChE染色见通过缝合口的运动神经纤维数量较少。
电生理结果术后早期无活动电位，12、 16周，坐骨神经诱发电位的波幅低。
计算机图像分析结果术后16周，轴突的平均直径的有髓神经纤维再生较实 验组低，且有显著性差异(/^<0.05)。
权利要求
1、几丁糖-胶原-得宝松缓释系统，其特征是由医用几丁糖和胶原复合膜为载体，加入甾体类激素得宝松为缓释药物，制成几丁糖-胶原-得宝松缓释膜；所述的几丁糖和胶原混合比例为1∶9，所述的缓释药物制成混悬液，加入量分别为0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1ml。
2、 按权利要求1所述的几丁糖一胶原一得宝松缓释膜，其特征是所述的几 丁糖一胶原一得宝松缓释膜厚度为0.5mm，所述的缓释药物混悬液加入量为 0. 6ml。
3、 按权利要求1所述的几丁糖一胶原一得宝松缓释系统，其特征是所述的 膜为一侧开口的管状结构。
4、 权利要求1所述的几丁糖—胶原一得宝松缓释系统的制备方法，其特征 是通过下述方法和步骤取3%酸溶性几丁糖与1. 5%胶原，以1: 9的比例混合，再分别加入得宝松混 悬液0. 2ml、 0. 4ml、 0. 6ml、 0. 8ml或lml，充分混合60分钟后，在200转/分 钟搅拌下滴入36%甲醛2 ml,5分钟后灌入模具内，静置l小时后脱模，蒸馏水 清洗，冰冻，真空抽干机间断干燥12小时，制得几丁糖一胶原一得宝松缓释放 系统，4'C下存放。。
5、 按权利要求1的几丁糖一胶原一得宝松缓释系统在制备修复周围神经药 物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术和医用材料领域，涉及一种几丁糖-胶原-得宝松缓释系统。本发明采用医用几丁糖和胶原为药物载体，以甾体类激素(得宝松)为缓释药物，制成几丁糖-胶原-得宝松缓释系统。本发明在体内具有良好的生物相容性和可吸收性，能起到物理隔阻和抑制成纤维细胞生长作用；通过药物缓释技术使得宝松以恒定的速度释放，使其能长期抑制毛细血管和纤维母细胞的增生，防止粘连及瘢痕形成。本发明可用作临床周围神经修复，能为探讨几丁糖-胶原-得宝松缓释放系统促进神经再生、提高神经功能恢复提供有意义的参考。
文档编号A61K47/42GK101664558SQ20081004247
公开日2010年3月10日 申请日期2008年9月3日 优先权日2008年9月3日
发明者徐建光, 蒋军健, 陆九洲 申请人:复旦大学附属华山医院