以野生型或突变型eNOS对重症肢体缺血的基因治疗的制作方法

专利名称：以野生型或突变型eNOS对重症肢体缺血的基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用调控细胞内eNOS活性的eNOS多肽及多核苷酸来预 防、诊断或治疗重症肢体缺血(CLI)的方法。在本发明的方法中所使用 的是野生型和突变型eNOS多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。
背景技术：
周围动脉闭塞病(PAOD)在美国人群中的发病率为近12%。早期 PAOD (跛行)的特点是活动时的缺血性肌肉痛。因为PAOD进展所引起 的重症肢体缺血(CLI)的特点是静息时血流及氧供的减少，造成静息时 的肌肉痛以及非愈合性皮肤溃疡或坏疽(Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest 31:651-666 (2001); Dormandy and Rutherford, J, Vase. Surg. 31:S1-S296 (2000))，估计发生率为至少每年每百万人500-1000人。
对PAOD和跛行患者的治疗包括控制动脉粥样硬化危险因素、运动 以及在一些病例中应用Cilastozol或己酮可可碱的药物治疗(Robeer "a/.，
/ &仏Emfovayc. 15:36-43 (1998)。如果症状持续，可以用经
皮腔内血管成形术(PTA)治疗跛行、静息痛和/或非愈合性缺血性溃疡。 PTA最适合于髂动脉或股浅动脉的短的狭窄或闭塞。l年的畅通率为80-90%。对于更弥漫病变的患者，推荐进行外科血管成形术。主动脉股动 脉血管搭桥术或股动脉胭动脉搭桥术的5年畅通率相应为90%和70% (Dormandy and Rutherford, / 「■ 5W^. 31:S1國S296 (2000》。
然而，尽管在外科和介入血管重建技术上取得了很大的进展，但是
20-30°/。具有缺血性疼痛和溃疡的患者或因弥漫的远端血管病变而不适合 作为外科血管重建或血管成形术的候选者或治疗失败，并且目前的药物 治疗对进展性CLI患者的肢体挽救只有很小的作用。
这些无大截肢术的患者的1年后生存率小于50%。此外，需要截肢 的老年患者往往具有差的一般健康状况以及具有相对高的手术风险和较 差的长期预后(Dormandy and Rutherford, / Swg. 31:S1-S296
(2000) )。虽然已经报道血管紧张素转化酶抑制剂和它汀类药物在缺血的 实验模型中能增加血流，但是目前没有一种药物能促进新的血管形成 (Fabre a/.， O油"o" 99:3043-3049 (1999); Kureishi a/"淑Med 6:1004-1010(2000))。因此，需要治疗CLI的改进的治疗方法。
治疗缺血性疾病的一个新方法是用刺激血管形成的生长因子靶向增 强的血管生长(Rissanen W 五wr J C7!'". /"veW. 31:651-666 (2001); Yla-Herttuala & a/.，〖■" 355:213-222 (2000); Isner " C〃". /wveW.
103:1231-1236 (1999》Rutanen " a/.， C紅CaWo/.鄉ort 3:29-36
(2001) )。血管生长可以被分为血管发生、血管生成及动脉生成。血管发 生指的是从成血管细胞/内皮前体细胞(EPC)胚胎原位形成血管。血管生 成指的是由于已分化的内皮细胞(EC)的增生和迁移，从已经存在的毛 细血管生成新的血管(Risaua/., iVaft^ 386: 671-674 (1997))。动脉生
成指的是从已经存在的小动脉汇合处原位形成肌性的侧突血管 (collateral vessels) (Schaper a/" 及es 79:911-919 (1996))。然而，内 源性的血管形成和动脉形成不足以完全代偿CLI中的血流及氧供的减 少。尽管给予生长因子刺激血管形成可能是一种治疗CLI的辅助治疗方 法，越来越多的证据表明与年龄相关的内皮功能不全、动脉粥样硬化和 其它心血管的危险因素可能限制生长因子对血管生成的增强作用。
内皮型一氧化氮合酶(eNOS，也称为ecNOS或NOS3)已经被认为 是血管生成的重要的调节物/介质。一氧化氮(NO)供体(例如硝普盐)能
促进内皮细胞的增生及迁移，反之NOS抑制剂抑制了这一过程(Ziche W a/., / C//w. /wvew. 9:2036-2044 (1994); Morbidelli a/.，爿m. / P/^wo/. 270:H411-H415 (1996))。研究已经显示在eNOS缺陷小鼠(eNOS-KO)中 的不正常的血管生成及伤口愈合。利用外植的主动脉，Lee等证实 eNOS对于内皮细胞的体外迁移、增生和分化是必需的。通过证实在 eNOS-KO小鼠中减少了皮下植入的Matrigd栓内的毛细血管形成的体内 实验确认了这个发现。eNOS-KO小鼠的切除伤口的愈合也被明显延 迟，这强调了内皮NO在与伤口修复相关的血管生成过程中的作用(Lee "a/.，爿w. /尸/ywo/. 277:H1600-H1608 (1999))。在eNOS-KO小鼠中己经 证实在手术诱导后肢缺血后的显著的血管生成不良。给手术诱导后肢缺 血的兔施用L-精氨酸(NOS的底物)，显著地提高了血管生成，这证实了 内皮NO在缺血诱导的血管生成中的作用(Murohara W a/.， C//". /"ve" 101:2567-2578(1998》。
如上述的，也有越来越多的证据显示缺血所诱发的血管生成可能随 年龄和内皮功能不全而受损。在动物模型中已经观察到血管生成不良， 可能是因为内皮NO释放的减少和生长因子表达的减少(Rivard " a/.， Cz>cw/ariow 99:111-120 (1999); Van Belle W a/., Orcw/ario" 96:2667-2674 (1997))。已经表明例如同源半胱氨酸血症和高胆固醇血症的危险因素可 能通过减少内皮来源的NO的生物利用度而减弱后肢缺血的小鼠模型的 血管生成(Duan Wa/., C!>c"/a"o" 102:111370-111376 (2000))。
综上所述，需要一种CLI的有效治疗方法。因此开发了一种增加缺 血肢体的NO生物利用度的治疗CLI的基因治疗方法，它可以通过多种 机制纠正缺血，包括例如通过刺激受损的血管生成、改善已经存在的微 血管功能不全、恢复已经存在的血管的血管舒縮(血管扩张)活性以及促 进已经存在的侧突血管的重塑城熟(动脉生成)。

发明内容
本发明提供了用eNOS多肽或编码这些多肽的多核苷酸预防、诊断 和治疗CLI的方法。用本发明的方法，可以调控细胞内的eNOS活性使 得可以改善与eNOS活性相关的疾病或病变。具体地，用本发明的方法 通过增加缺血肢体的局部的NO生成可以调控细胞内的eNOS活性，使 得可以改善与缺血肢体中NO产生减少所相关的疾病或病变。因此，本 发明提供了基因治疗的方法，它通过给需要治疗的患者施用eNOS多肽 或它们的突变体或编码这些多肽的多核苷酸，提供给效应组织增高水平 的NO。
在一个方面，本发明提供了治疗CLI的方法，包括给需要治疗的患 者施用有效量的一种编码哺乳动物eNOS多力太的多核苷酸。
本发明进一步提供了治疗CLI症状的方法，这些症状例如微血管功 能不全、溃疡愈合和血管生成。在一个方面，本发明提供了治疗血管生 成的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的一种编码eNOS多肽的 多核苷酸，其中eNOS多肽包括至少一个相应于哺乳动物eNOS中的一 个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的一个位置上的突变。在一 个方面，本发明提供了改善微血管功能不全的方法，包括给需要治疗的 患者施用有效量的一种编码eNOS多肽的多核苷酸，其中eNOS多肽包 括至少一个相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化
的氨基酸残基的一个位置上的突变。
在一个相关的方面，本发明提供了在本发明方法中所用的eNOS多 肽和编码eNOS多肽的多核苷酸。在本发明的方法中所用的适宜的多核 苷酸包括例如编码野生型或突变型eNOS多肽的多核苷酸，或它们的变 体。优选地，编码的eNOS多肽是哺乳动物eNOS多肽，以及最优选的 是人eNOS多肽。在一个方面，eNOS多肽是SEQ ID NO: 1编码的人 eNOS多肽。
在另一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS 多肽在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突
变；以及在相应于SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的位置上具有第 二个突变。
在另一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS 多肽在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突 变；在相应于SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的位置上具有第二个 突变；以及在相应于SEQ ID NO: 1的2位氨基酸残基的位置上具有第三 个突变。
优选地，在相应于SEQ ID NO. 1的495位氨基酸残基的位置上的突 变是氨基酸取代成为Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Phe、 Tyr、 Trp、 Me、 Ser、 Cys、 Glu、 Asn、 Gln、 Lys、 Arg或His,以及更优选的是 Ala、 Val、 Leu或Ile，以及最优选的是Ala或Val;相应于SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的突变是氨基酸取代成为Asp;以及在相应于 SEQ ID NO: 1的2位氨基酸残基的位置上的突变是氨基酸取代成为 Ala。
在一些方面，与参照多肽比较，适用于本发明的方法的多核苷酸所 编码的人eNOS多肽的磷酸化是增强的或减弱的。
在一些方面，与参照eNOS多肽比较，适用于本发明的方法的多核 苷酸所编码的人eNOS多肽具有增高的eNOS活性。优选地，与参照 eNOS多肽比较，人eNOS多肽具有增高的NO产生、对钙调蛋白的结 合亲和力、和/或还原酶活性。最优选地，与参照eNOS多肽比较，人 eNOS多肽具有增高的NO产生。
在一些方面，与参照eNOS多肽比较，适用于本发明的方法的多核 苷酸所编码的人eNOS多肽具有减低的eNOS活性，例如与参照eNOS
多月太比较，降低了在<:3++-钙调蛋白介导的对多肽的刺激中的(^++依赖性。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸编码与人eNOS多肽 的氨基酸基本上同源的eNOS多肽。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸编码与SEQ ID NO: 1 的氨基酸序列具有95-99%序列相同性的eNOS多肽。
在另一方面，适用于本发明的方法的多核苷酸是编码一种编码 eNOS多肽的核酸序列的重组载体。在一个方面，核酸序列被可操纵地 连接于至少一种调节序列，使得在细胞内表达所编码的eNOS多肽。优 选地，至少一种调节序列是启动子，例如CMV启动子。在一个方面， 重组载体是一种质粒载体或腺病毒载体。
在一个方面，在本发明的治疗的方法中，治疗是通过调控需要治疗 的患者的细胞内的eN0S活性。优选地，细胞是内皮细胞，以及更优选 的是人内皮细胞。
在一个方面，本发明的方法进一步包括在给需要治疗的患者施用编 码人野生型或突变型eNOS多肽的多核苷酸之前、之中或之后施用一种 或多种血管生成因子。本发明的方法所使用的适宜的血管生成因子包括 但不限于例如HFG、 VEGF、 FGF、内皮细胞生长因子、表皮生长因 子、血小板衍生的生长因子、TGFa、 TGFP、 PDGF、 TNAa或IGF、 Del-l，优选的是FGF。
在一个方面，通过将多核苷酸回体(ex vivo)引入到患者的细胞内来 施用适用于本发明的方法的多核苷酸。在另一个方面，通过将多核苷酸 引入到患者的患病组织，或引入到患者的周围血管系统内来施用适用于 本发明的方法的多核苷酸。在另一个方面，通过经肌肉内或动脉内注射 到患者肢体的肌肉内来施用适用于本发明的方法的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了治疗重症肢体缺血(CLI)的方法，包 括给需要治疗的患者施用有效量的eNOS多肽，其中eNOS多肽包括至 少一个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞被磷酸化的氨 基酸残基的位置上的突变。优选地，适用于本发明的方法的eNOS多肽 是人eNOS并且在相应于SEQ ID NO: 1的495位或1177位氨基酸残基 的位置上至少有一个突变。 在一个方面，适用于本发明的方法的eNOS多肽在相应于SEQ ID NO: 1的495位或1177位氨基酸残基的位置上至少有一个突变。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多 肽在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突 变；以及在相应于1177位氨基酸残基的位置上具有第二个突变。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多 肽在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突 变；在相应于SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的位置上具有第二个 突变；以及在相应于SEQ ID NO: 1的2位氨基酸残基的位置上具有第三 个突变。
优选地，在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上的突 变是氨基酸取代成为Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Phe、 Tyr、 Trp、 Me、 Ser、 Cys、 Glu、 Asn、 Gln、 Lys、 Arg或His,以及更优选的是 Ala、 Val、 Leu或Ile，以及最优选的是Ala或Val;相应于SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的突变是氨基酸取代成为Asp;以及在相应于 SEQ ID NO: 1的2位氨基酸残基的位置上的突变是氨基酸取代成为 Ala。


当与附图一起阅读下面的描述时可以更充分地理解本发明的前述的 及其它的目的及其各种特点以及发明本身。
图1是说明哺乳动物eNOS的各种功能结构域的图。功能结构域包 括但不限于例如(顺序从N末端到C末端) 一个豆蔻酰化(myristoylation) 共有位点；两个棕榈酰化(palmitoylation)位点；氧化酶结构域；钙调蛋 白结合位点(例如，人eNOS的494-517位氨基酸)，它包括磷酸化共有 序列(例如人eNOS的495位Thr);以及还原酶结构域。人eNOS多肽 的功能结构域也包括例如自抑制环和血红素(heme)结合位点。
图2是说明与SEQ ID NO: 1 (WT)编码的野生型人eNOS比较，具 有单突变或双突变的eNOS多肽突变体对HEK293细胞合成NO的刺激 作用的直方图。具有单突变的eNOS多肽在相应于SEQIDNO: l编码的 人eNOS的Thr-495的位置上具有氨基酸取代成为Asp (T495D)、 Ala (T495A)、或Val (T495V)。具有双突变的eNOS多肽突变体在相应于 SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有第一个氨基酸取 代成为Asp，在相应于Thr-495的位置上具有第二个氨基酸取代成为 Asp (T495D + S1177D)、 Ala (T495A + S1177D)、或Val (T495V + S1177D)。
图3是说明与SEQ ID NO: 1 (野生型)编码的野生型人eNOS比较， 具有单突变的eNOS多肽突变体对人主动脉内皮细胞(HAEC)合成NO 的刺激作用的直方图。eNOS多肽突变体在相应于SEQ ID NO: l编码的 人eNOS的Thr-495的位置上具有氨基酸取代成为Asp (T495D)、 Ala (T495A)、或Val(T495V)。
图4是在手术后第0、 1、 4、 7、 10、 14、 21和28天，与含有野生 型eNOS小鼠(C57BL/6)比较，缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢
体灌注的激光多普勒图和图解说明。
图5是说明缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)与含有野生型eNOS 小鼠(C57BL/6)比较在手术后第0和4天的肢体的大体病理改变的照 片。
图6是说明缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)与含有野生型eNOS 小鼠(C57BL/6)比较在手术后第IO天的肢体的侧突血管形成的定量测定 的直方图。
图7是说明对缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体的不同手术 方法的图解(首行)；说明手术后肢体的大体病理改变的照片(中行)；以 及说明手术后肢体的灌注的激光多普勒图像(下行)。
图8是说明与含有野生型eNOS小鼠(C57BL/6)比较，不同年龄对
在3个月、6个月和12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的 肢体在手术后第0、 1、 3、 7、 17、 21和24天的自发性血流恢复的影响 的直方图。
图9是说明不同年龄对在3个月、6个月和11-12个月大的缺乏野生 型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体在手术后第IO天的缺血损伤的影响的 照片。
图10是通过测定萤光素酶的表达水平说明不同的肌肉内基因输送方 法的转染效率的直方图l)通过单独注射质粒pLuc(pLuc)输送的、通过 注射pLuc以及电穿孔(pLuc+ EP)输送的以及附加有透明质酸酶预处理 (pLuc+EP+Hyal)输送的编码萤光素酶的质粒；比较于2)通过注射编码萤 光素酶的腺病毒(Ad5.1Luc)。
图11是说明后肢缺血对编码萤光素酶的质粒载体pLuc的转染效率 的影响的直方图。将质粒载体注射到C57BL/6小鼠的内收肌，并通过测 定基因表达的水平来确定转染效率术前以及用质粒载体(PT)预处 理；与手术同一天(SDT);以及在手术后第3天和第7天。
图12是说明将eNOS基因输送到缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)后的eNOS表达的Western印迹与ELISA的直方图1)编码在相应 于SEQ ID NO.. 1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代 成为Asp (S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于 2)编码野生型eNOS的质粒载体。
图13是说明eNOS基因治疗在手术后第28天对6个月大的缺乏野 生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽救的作用的照片，利用1)编码 在相应于SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基 酸取代成为Asp (S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)， 比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图14是如缺血的对正常的血流灌注比例所测定的，eNOS基因治疗 在手术前(BOP)和手术后第0、 1、 4、 7、 10、 14、 18、 21和28天对6
个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的作用的图解说明，利用 1)编码在相应于SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具 有氨基酸取代成为Asp (S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体 (pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体 (pNull)。
图15是如肢体和肌肉容积以及取代脂肪和炎性浸润的量所测定 的，eNOS基因治疗在手术后第28天对6个月大的缺乏野生型eNOS小 鼠(ecNOS-KO)的作用的图解说明，利用l)编码在相应于SEQ ID NO: 1) 编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp (S1177D) 的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型 eNOS的质粒载体或空载体(pNull)以及未处理的对侧腿(肢体)。
图16是说明eNOS基因治疗在手术后第28天对6个月大的缺乏野 生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的溃疡愈合的影响的照片，利用1)编码在 相应于SEQ ID NO: 1)编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸 取代成为Asp (SI 177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224),比 较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图17是说明eNOS基因治疗在手术后第10天对11-12个月大的缺 乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽救的作用的照片，利用1)编 码在相应于SEQ ID NO: 1)编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨 基酸取代成为Asp (S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体 (pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体 (p薩)。
图18是eNOS表达的直方图(首行)、血流的激光多普勒图像(中行) 以及肢体坏死的照片(下行)，说明利用编码在相应于SEQ ID NO: 1)编 码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp (S1177D) 的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)的eNOS基因治疗在手术后 第10天对11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽
救的作用。pNOS224的基因表达与肢体坏死以及血流改变相关，即与较 小的表达(#1201)比较，表达越高(#1205)则血流越快，以及坏死的损 伤越小。
图19是eNOS基因治疗在手术后第1、 3、 7和10天对11-12个月 大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽救的作用的图解说 明，利用1)编码在相应于SEQ ID NO: 1)编码的人eNOS的Ser-l 177的 位置上具有氨基酸取代成为Asp (S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载 体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体 (p麵)。
图20是如缺血的对正常的血流灌注比所测定的，eNOS基因治疗在 手术后第1、 3、 7和10天对11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠 (ecNOS-KO)的作用的图解说明，利用1)编码在相应于SEQ ID NO: 1编 码的人eNOS的Ser-l 177的位置上具有氨基酸取代成为Asp (S1177D) 的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型 eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图21是说明在手术后第10天11-12个月大的缺乏野生型eNOS小 鼠(ecNOS-KO)的内收肌的eNOS表达水平的直方图，利用1)编码在相 应于SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-l 177的位置上具有氨基酸取 代成为Asp (SI 177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224);比较 于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull);以及3)对照的 未手术ecNOS-KO小鼠。直方图的右侧说明处理动物的单个表达水平。
图22是说明小鼠CLI模型的图示及照片。图示说明手术结扎并去 除股动脉及其分支，提供了已发育雄性成年斯普拉-道来小鼠的上大腿 区域。照片说明小鼠CLI模型在手术后第1、 4、 10和17天的大体病理改变。
图23是说明小鼠CLI模型的正常肢体(图像左侧)以及缺血肢体(图 像右侧)的CLI小鼠的血管造影的图像。
图24是说明小鼠CLI模型的正常肢体(图像左侧)以及缺血肢体(图 像右侧)的动脉形成的血管造影积分的CLI小鼠的血管造影的图像。
图25是CLI小鼠模型在利用编码在相应于SEQ ID NO: 1编码的人 eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代的eNOS多肽突变体的腺病 毒载体(Ad5NOS1177D)的eNOS基因治疗后的血流恢复的图解说明； 比较于编码绿色荧光蛋白的对照腺病毒载体(Ad5EGFP)，在手术前(BO) 以及在基因输送后第O、 3、 7和10天。
图26是说明用根据大体病理分级I-V的坏死积分测定利用编码在相 应于SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取 代的eNOS多肽突变体的腺病毒载体(Ad5NOS1177D)对CLI模型小鼠 的基因治疗的作用的图解和照片。
图27是说明用根据大体病理分级I-V的坏死积分测定利用编码在相 应于SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取 代的eNOS多肽突变体的腺病毒载体(Ad5NOS1177D)对CLI模型小鼠 的基因治疗的作用的直方图；比较于编码绿色荧光蛋白的对照腺病毒载 体(Ad5EGFP)，在手术前(BO)以及在基因输送后第0、 3、 7和10天。
图28是说明用根据测定动脉生成的的血管造影积分测定利用编码 在相应于SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基 酸取代的eNOS多肽突变体的腺病毒载体(Ad5NOS1177D)对CLI模型 小鼠的基因治疗的作用的直方图；在实验结束时，比较于编码绿色荧光 蛋白的对照腺病毒载体(Ad5EGFP)。
具体实施方案
本发明提供了一种治疗重症肢体缺血(CLI)的新方法。更具体地， 本发明提供了用eNOS多肽或多核苷酸预防、诊断和治疗CLI的方法。 用本发明的方法可以调控细胞内的eNOS活性，使得可以改善与eNOS 活性相关的疾病或病变。具体地，利用本发明的方法，通过增加缺血肢
体内的局部的NO产生可以调控eNOS活性，使得可以改善与缺血肢体 内的NO产生减少相关的疾病或病变。因此，本发明的组合物和方法提 供了新的治疗方法，它增加了病变组织的NO水平并因此通过多种机制 靶向于潜在的CLI病理生理改变，机制包括例如l)刺激血管生成；2) 改善微血管功能不全；3)恢复己经存在的血管的血管舒縮(血管舒张)活 性；以及4)己经存在的侧突血管的重塑/成熟(动脉生成)，已知都可以 通过增加NO水平而改善这些方面。预计所造成的皮肤及肌肉的血流和 氧供的提高都能缓解静息痛及愈合缺血性溃疡。此外，本发明的eNOS 突变体可能比野生型eNOS更为有效，因为突变型eNOS酶具有显著更 高的特异性活性。另外，eNOS的活性可以被钙离子严格地调节，并不 受氧化低密度脂蛋白(oxLDL)和年龄的影响。因此，与生长因子相反， 在基因治疗应用中使用本发明的eNOS组合物可以忽略"过量"所引起的 毒性。
将在此引用的参考文献的全部内容一同并入作为参考。
定义
除非有不同的定义，在此所用的技术和科学名词具有本发明所属领 域的人员所通常理解的意义。在此所列的参考文献是关于本领域人员所 熟知的各种方法学。在此将这些已知方法学的出版物和其它材料的全部 内容一同并入参考。重组DNA技术的常用原理的标准参考文献包括 Sambrook， J" " a/. (1989J M /ecw/ar C7o"/"g',' /1丄aftorato^y Ma""a/, 2c ￡d.， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N. Y.; McPherson， M. J" Ed. (1991) D/re"ed Afw啤ewesz's.. J尸racrica/ J/ /7roac/z, IRL Press, Oxford; Jones, J. (1992) Jw/"o爿"^朋cf尸e/ f/cfe S"f/ias&， Oxford Science Publications, Oxford; Austen, B. M. and Westwood， O. M. R. (1991) 尸rofe!'" 7brg幼'wg <Secr"/o", IRL Press, Oxford。可以利用任何本领域 人员熟知的适当的材料和/或方法进行本发明；然而，描述了优选的材料
和/或方法。除非有不同的提示，在下面的描述和实施例中所采用的材 料、试剂等都是从商品化来源中获得的。
"多肽"在此指的是全长蛋白质或它的片段，或肽。在优选的实施方
案中，本发明的eNOS片段或肽保持有eNOS活性，例如NO产生。然 而，与参照eNOS多肽比较(例如与全长或野生型多肽比较)，可以增加 或减少eNOS活性的水平。
"变体"在此指的是多肽或多核苷酸，指的是与参照多肽或多核苷酸 比较(例如与野生型多肽或多核苷酸比较)，相应地可能在一级、二级或 三级结构上有所不同的多肽或多核苷酸。例如，氨基酸或核酸序列可以 含有不同于参照氨基酸或核酸序列的突变或修饰。在一些实施方案中， eNOS变体可以是不同的异构体或多态性。变体可以是利用本领域己知 的方法分离的或合成的天然形成的、合成的、重组的或化学修饰的多肽 或多核苷酸。
"突变"在此指的是多肽或多核苷酸，指的是天然生成的、合成的、 重组的、或化学变更的或与参照多肽或多核苷酸比较(例如与野生型多 肽或多核苷酸比较)，相应地不同于多肽或核酸的一级、二级或三级结 构的多肽或多核苷酸。利用本领域熟知的方法可以分离或生成具有这些 突变的多肽和多核苷酸。
"eNOS多肽突变体"或其语法等价物(例如eNOS突变体、突变型 eNOS、 eNOS突变型多肽、突变型eNOS多肽)在此指的是在相应于哺 乳动物eNOS的功能结构域的一个位置上的氨基酸残基上至少有一个变 异或突变的eNOS多肽或它的片段或变体。在一个优选的实施方案中， 突变是在相应于人eNOS (SEQ ID NO: 1)的495位氨基酸残基的位置上 的氨基酸取代，其中氨基酸取代优选的是Ala或Val。在另一个优选的 实施方案中，与参照的eNOS多肽比较，增加或减少了 eNOS多肽的活 性。
eNOS多肽的"功能结构域"在此指的是与eNOS活性相关的多肽的
任何氨基酸残基、位点或区域，包括但不限于例如蛋白结合结构域(例 如，钙调蛋白结合结构域、激酶结合结构域、或配体结合结构域)、磷 酸化位点、豆蔻酰化位点、还原酶结构域或活性位点。
"eNOS活性"在此指的是与细胞内酶相关的任何活性，包括但不限 于例如，NO产生、钙调蛋白结合、刺激血管生成、改善微血管功能不 全、恢复已经存在的血管的血管收縮(血管舒张)活性、引起已经存在的 侧突血管的重塑/成熟(动脉生成)。eNOS活性也可以是与多肽相关的任 何生物或细胞活性，以及更具体地，是与eNOS多肽的功能结构域相关 的任何活性。eNOS活性也可以是与酶相关的活性的调控，包括但不限 于例如对本领域已知的或上述的任何eNOS活性的调控。
"调控"在此参照于eNOS活性，指的是这些活性的增加、减少、诱 导或抑制。在一些实施方案中，这些eNOS活性的增加、减少、诱导或 抑制是相对于参照分子的，例如eNOS野生型或突变型多肽。
"疾病"、"病态"或"病变"在此指的是患者的细胞、组织或器官内的 不良状态，其中可以调节eNOS活性以改善之中状态。内皮NOS涉及 各种病理过程，包括但不限于例如血管形成、血管舒张、免疫调节、血 小板聚集的抑制、平滑肌的松弛。因此，调控需要治疗的患者的细胞、 组织或器官内的eNOS活性可以改善在此描述的疾病、病态或病变。
"患者"在此为哺乳动物，优选的是人。
编码eNOS多肽的多核苷酸
内皮型一氧化氮合酶(eNOS，也称为ecNOS和NOS3)是三种已知 的NO合酶异构体的其中一种。eNOS见于例如血管内皮、心肌细胞、 血液血小板、各种类型的平滑肌和免疫系统的细胞，例如T细胞、中性 粒细胞和巨噬细胞。在本发明的方法中所用的编码eNOS多肽的多核苷 酸可以来源于在此描述的任何一种细胞或组织，优选的为内皮细胞。
在本发明的方法中所用的编码eNOS的多核苷酸可以来自或来源于
任何一种哺乳动物，例如人、小鼠、豚鼠、狗、猪、大鼠或兔，优选的
是人。总体而言，本申请针对的是人eNOS(SEQIDNO: 1)以及它的突 变体的应用。然而，本领域人员将认识到本阐述同样也可以很好地应用 于来自于例如上述的其它物种的eNOS多核苷酸和多肽以及它们的突变 体；和/或用编码eNOS多肽的多核苷酸治疗除人以外的其它物种。
可以被引入到宿主细胞内(例如通过转染或转导)并在其中表达的编 码eNOS多肽的任何形式的多核苷酸都适用于本发明的方法。
编码本发明的eNOS多肽的多核苷酸包括例如编码eNOS多肽的 cDNA、或无中断编码eNOS多肽的DNA。"无中断编码"的多核苷酸指 的是具有连续可读框("ORF，)的多核苷酸，比较于被内含子或其它非编 码序列所中断的ORF。
名词"基因"在此指的是涉及产生多肽链的DNA片段；它可以包括 编码区的前面或后面的区域(前导序列和尾部)以及各个编码片段(外显 子)之间的中断序列(内含子)。本发明包括编码本发明的eNOS多肽的 分离的基因(例如基因组克隆)。
本发明的多核苷酸可以是重组多核苷酸、天然多核苷酸、或合成的 或半合成的多核苷酸或它们的组合物。多核苷酸可以是RNA、 PNA或 DNA，例如cDNA、基因组DNA和合成的或半合成的DNA，或它们的 组合物。DNA可以是三链、双链或单链。它可以含有发夹或其它二级结 构。RNA包括mRNA、多腺苷化RNA、总RNA、单链或双链RNA等 等。本发明也包括DNA/RNA双链体。
在本发明的一个实施方案中，编码eNOS的多核苷酸具有天然存在 的多核苷酸的序列，例如是人多核苷酸。多种物种的编码eNOS的多核 苷酸的序列是己知的，例如人(Janssens " a/. (1992) /所o/. 267， 14,519-522)和牛(USP 5,498,539)。本发明的天然存在的多核苷酸可以有 例如野生型多核苷酸序列的等位基因变体的编码序列。如本领域已知 的，等位基因变体是多核苷酸序列的不同形式，它可以有一个或多个核
苷酸的取代、缺失或添加，它通常基本上不改变所编码的多肽的功能。
含有天然存在的单核苷酸多态性(SNPs)的多核苷酸也可以用于本发明 的方法。
在其它实施方案中，在本发明的方法中所用的多核苷酸可以是天然 存在的eNOS多核苷酸的变体。关于多肽或多核苷酸，名词"变体"在此 意思是基本上保持有野生型eNOS多肽或编码它的多核苷酸的一种或多 种活性或特性的变体。即变体是当通过本发明的方法被引入到患CLI的 患者的细胞、组织或器官内后可以改善CLI的一种或多种症状到可测定 程度的多肽或多核苷酸。变异多核苷酸可以编码野生型或突变型eNOS 多肽。
在另一个实施方案中，变异多核苷酸可以编码野生型或突变型 eNOS多肽的变体，例如，包括一个或多个缺失、插入、添加、取代、 反转或截断或它们的组合的多肽。这些变异多肽可以含有保守或非保守 氨基酸的一个或多个氨基酸取代，优选的是保守氨基酸。举例说明的保 持总体电荷、疏水性/亲水性、侧链基团和/或被取代氨基酸的空间体积 (steric bulk)的保守取代包括例如Gly/Ala、 Val/Ile/Leu、 Asp/Glu、 Lys/Arg、 Asn/Gln、 Thr/Ser和Phe/Trp/Tyr。
在本发明的方法中所用的编码eNOS的变异多核苷酸包括例如(i)在
多核苷酸中一种或多种核苷酸的多核苷酸被另一种核苷酸所取代，或被 其它方式突变的多核苷酸；或(ii) 一个或多个核苷酸被修饰的多核苷 酸，例如包括取代基；或(iii)另一种化合物与多核苷酸融合的多核苷 酸，例如增加多核苷酸半衰期的化合物；或(iv)附加的核苷酸与多核苷 酸共价结合的多核苷酸，例如编码前导肽或分泌序列的序列或用于纯化
多肽的序列。附加的核苷酸可以来自异种来源或可以是天然基因的内源 性核苷酸。
属于上述类型(i)的多核苷酸变体包括，例如多态性，包括单核苷酸 多态性(SNPs)、等位基因变体和突变体。变异多核苷酸可以包括例如一
个或多个添加、插入、缺失、取代、转换、转位、反转、染色体易位、
不同剪切(splicing)过程所形成的变体等，或它们的任何组合。
属于上述类型(ii)的多核苷酸变体包括例如修饰例如连接有可测定 的标记物(抗生物素蛋白、生物素、放射性元件、荧光标签和染料、能量 传递标记、能量释放标记、结合伴侣等)或提高表达、摄取、分类、标 记、杂交、检测和/或稳定性的基团。
属于上述类型(m)的多核苷酸变体包括例如各种长度的聚A+尾部、 5'帽结构以及核苷酸类似物，例如次黄嘌呤核苷、硫代核苷酸 (thionucleotides)等等。
属于上述类型(iv)的多核苷酸变体包括例如各种嵌合、杂交或融合 多核苷酸。例如本发明的多核苷酸可以包括编码序列以及融合于相同可 读框的附加的非天然存在的或异源性编码序列(例如编码前导肽、信号、 分泌、靶向、酶、荧光、抗生素抗性以及其它或诊断性肽的序列)；或编 码序列以及非编码序列，例如5，和3'末端的非翻译序列，或分散于表达 序列的非翻译序列，例如内含子。
本发明的方法所用的多核苷酸变体也可以具有在框内与容许识别和/ 纯化本发明的多肽的标记序列融合的编码序列。标记序列可以是例如六 组氨酸标记(例如由pQE-9载体所提供)，用于在细菌宿主中纯化与该标 记物相融合的成熟多肽。或标记序列例如可以是用于哺乳动物宿主例如 COS-7细胞的血凝素(HA)标记。HA标记对应来源于流感血凝素蛋白的 抗原决定簇(Wilson, I.，Cell， 37:767 (1984))。
其它类型的多核苷酸变体对本领域人员是显而易见的。例如，依赖 于所需的用途，例如耐受核酸酶例如RNAse H、增强的体内稳定性等， 多核苷酸的核苷酸可以各种已知的连键进行连接，这些连键例如为酯、 磺酸酯、硫酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯 (methylphosphonate)、氨基甲酸酯等，见美国专利No. 5，378，825。可以结 合任何一种所需的核苷酸或核苷酸类似物，例如6-巯基嘌呤、8-氧-鸟嘌
呤等。本发明的多核苷酸也可以具有来源于生物体的其它遗传位点的编
码序列，条件是它与野生型eNOS多肽基本上同源或者在一种物种与另 一种物种之间基本上同源(例如，直向同源物(ortholog))。
定位于编码序列或调节序列内的其它变异序列可以增强本发明的 eNOS多肽的合成、功能或活性。
其它的变异多核苷酸与编码eNOS的野生型多核苷酸具有具有不同 程度的序列同源性(相同性)，或编码与野生型eNOS多肽具有不同程度 的序列同源性(相同性)的多肽变体，当然，条件是当将变异多核苷酸或 多肽引入到患病的患者体内时，它们保留了在本发明的方法中的改善 CLI的一个或多个症状的能力，即多核苷酸或多肽是基本上同源于野生 型eNOS，或显示出大体上的序列同源性(序列相同性)。此外，在本发明 内的多核苷酸、多肽以及它们的片段可以包括与野生型多核苷酸或多肽 至少具有约65-70%序列同源性(相同性)的多核苷酸或氨基酸序列，优选 的约70-75%、 75-80%、 80-85%或85-90%序列同源性(相同性)，以及最 优选的约90-95%或95-99%序列同源性(相同性)。本发明也包括具有更 低程度序列相同性的多核苷酸或多肽，但是它们具有足够的相似性以行 使eNOS所表现的一种或多种功能或活性。
名词"基本上同源"，当指的是多核苷酸序列时，意思是具有至少约 90-95%或95-99%或更高一致性的核苷酸序列。
根据本发明，当指的是序列时，名词"相同性百分比"或"相同性的百 分比"意思是在将被比较的序列("比较序列")与所描述的或所要求保护的 序列("参照序列，，)比对后，将序列与要求保护的或描述的序列比较。根 据下面的公式计算出相同性百分比
相同性百分比-100[l-(C/R)〗
其中C是参照序列与比较序列之间在参照序列与比较序列之间的比 对长度上的差异的数目，其中(i)在比较序列内没有对应的比对碱基或氨 基酸的每个参照序列的碱基或氨基酸和(ii)参照序列上的每个间隙和(iii)
不同于比较序列的比对碱基或氨基酸的每个参照序列的比对碱基或氮基
酸，构成了一个差异。R是参照序列在比较序列比对长度上的碱基或氨 基酸数目，其中参照序列所生成的任何间隙也被计数为一个碱基或氨基 酸。
如果在比较序列和参照序列之间存在比对时，对此如上述所计算出 的相同性百分比是约等于或大于一个具体指出的最小相同性百分比，那 么比较序列与参照序列具有该具体指出的最小相同性百分比，尽管可以 存在这样的比对，即其中如上述所计算的相同性百分比低于该具体指出 的相同性百分比。
在优选的实施方案中，用于比较目的的被比对的参照序列的长度是 参照序列长度的至少30%，优选的至少40%，更优选的至少50°/。，甚至 更优选的至少60%，以及甚至更优选的至少70%、 80%或90%。在此描 述的相同性百分比或同源性百分比同样可以应用于核苷酸或氨基酸序 列。
用数学算法可以完成序列的比较以及两个序列之间的同源性百分比 和相4以性的测定。(Com; "ta"o"a/ Afo/ec"/ar 5/o/og^， Lesk， A.M., ed" Oxford University Press, New York, 1988;肠com戸"'打g: Jw/orma"cs awe GWzome /Vq/ec&, Smith, D.W.， ed" Academic Press, New York, 1993; Co附/ 她"wa—o,納we膨D加，Part 1， Griffin, A.M., and Griffin, H.G.， eds.， Humana Press, New Jersey, 1994; Sfe《wewce y4"a(y^ /" M /ecw/ar 5/o/ogV， von Heinje， G.， Academic Press, 1987; 以及5fe《"e"ce/4"fl/戸's Gribskov， M. and Devereux， J.， eds.， M Stockton Press, New York,
1991)。
在Karlin " a/. (1993)尸rac. Jaw3 . C/W卯:5873-5877中描述 了这种数学算法的优选的、非受限的实例。如Altschul"a/. (1997) 7VMc/e!'c血油及es. 25:3389-3402所描述的，将这种算法结合进NBLAST 和XBLAST程序(2.0版本)中。当利用BLAST和Gapped BLAST程序
时，可以使用相应程序(例如NBLASST)的默认参数。在一个实施方案 中，序列比较之间的参数可以被设定为积分=100，字长-12，或可以修 饰(例如W-5或W-20)。
在优选的实施方案中，利用Needlman等(1970) ( / Mo/.说'o/. 48:444-453)算法可以测定两个氨基酸序列之间的相同性百分比，该算法 已经被整合进使用BLOSUM62矩阵或PAM250矩阵，缺口加权为16、 14、 12、 10、 8、 6或4，以及长度加权为1、 2、 3、 4、 5或6的GCG 软件包的GAP程序中。仍在另一个实施方案中，利用使用NWSgapdna CMP矩阵以及缺口加权为40、 50、 60、 70或80，以及长度加权为1、 2、 3、 4、 5或6的的GCG软件包(Devereux " a/. (198" ATMC/e/c 及仏12 (I): 387)的GAP程序I测定两个核苷酸序列之间的相同性百分 比。
用于比较序列的数学算法的另一个优选的，非受限的实例是Myers 和Miller的算法CABIOS (1989)。这种算法被整合进ALIGN程序(版本 2.0)中，它是CGC序列排列软件包的一部分。当用ALIGN程序比较氨 基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表，缺口长度补偿为12以及 缺口补偿为4。其它的序列分析的算法是本领域已知的，包括在Torellis a/. (1994) CompW.所cwc/. 10:3-5中所描述的ADVANCE和 ADAM;以及在Pearson a/. (1988) /WJS 85:2444-8中所描述的 FASTA。
根据本发明，当指的是蛋白序列时，名词"基本上同源"意思是氨基 酸序列至少有约90-95%或97-99%或更高的相同性。在高严格性条件 下，与编码本发明的突变型多肽的序列的核酸序列或它们的片段杂交的 核酸序列可以编码基本上同源的氨基酸序列。
"高严格性"条件在此意思是例如在含有例如约5X SSC、 0.5°/。 SDS、 lOOpg/ml变性的鲑精DNA以及50%甲氨酰的杂交溶液中将一印 迹与长多核苷酸探针在42'C孵育过夜。然后在高严格性条件下洗涤印
迹，使得发生例如小于5°/。的碱基错配(例如在O.lx SSC和0.1°/。 SDS 65"C洗涤30分钟两次)，并选择具有例如95%或更大序列相同性的序 列。
其它高严格性条件的非限定实例包括用含有30mM NaCl和0.5% SDS的水性缓冲液在65X:进行终末洗涤。高严格性条件的另一个实例是 在7。/。SDS、 0.5MNaPO4、 pH 7、 1 mM EDTA 50°C下杂交，例如过夜 后，紧接着是用1%SDS在42'C洗涤一或多次。反之，高严格性洗涤可 以容许少于5%的错配，减弱或降低严格的条件能容许最大到20%的核 苷酸错配。可以如上述完成低严格的杂交，但要使用更低的甲氨酰条 件、更低的温度和域更低的盐浓度、以及更长时间的孵育时间。
本发明的多核苷酸片段可以是适合于本发明的任何大小，例如可以 是任何所需的当引入到患CLI的患者体内时能有效地起到治疗作用的大 小。例如，本发明的多核苷酸片段可以比全长的基因产物稍微更小。例 如，本发明的多肽可以包括至少约10、 25、 50、 100、 200、 300、 400、 500、 600、 800、 1000或1200个氨基酸。本发明的多核苷酸也可 以比全长cDNA更长，例如对于融合多核苷酸或为基因组序列的一部分 的多核苷酸。
根据任何所需的方法可以标记根据本发明的多核苷酸。用例如如 32P、 35S、 3H、或"C的放射性示踪物可以标记多核苷酸。根据任何方法 例如如利用放射性标记的核苷酸、多核苷酸激酶(有或无磷酸酶的脱磷酸 化)或连接酶(依赖于所标记的末端)的3'或5'末端的末端标记可以进行 放射性标记。也可以使用非放射性标记，将本发明的多核苷酸与残基联 合，所述残基具有对特定的试剂(配基)的特异性亲和力的免疫特性(抗 原、半抗原)、能完成可测定的酶反应的特性(酶或辅酶、酶底物或其它 参与于酶反应的物质)、或特征性的物理特性，例如荧光或在所需波长时 放射或吸收光等等。
eNOS多肽
本发明进一步涉及eNOS多肽以及它的突变体。 人eNOS (例如SEQ ID NO: 1编码的人eNOS)的适宜的突变包括但 不限于例如
(a) 相应于1177位氨基酸残基的磷酸化位点的突变，其中残基被取 代成其它的氨基酸，例如为Asp (S1177D)(见例如，WO00/62605);和/ 或
(b) 相应于2位氨基酸残基的豆蔻酰化位点的突变，其中残基被取代 成其它的氨基酸，例如为Ala (G2A)(见例如Sessa " a/. (1993), Ocw/ariow及esearc^ 72， 921-924.)。在豆蔻酰化位点突变的eNOS多肽可 以定位于细胞的胞浆内而不是细胞膜上。这些突变体可以耐受(与野生型 蛋白比较)下调eNOS/NO产生的病理性刺激(例如oxLDL)。这些特性有 利于应用突变体蛋白(或编码它的核苷酸)治疗存在这些外在的病理性刺 激的CLI。
(c) 相应于该区的氨基酸残基的钙调蛋白结合位点的突变(例如， SEQ ID NO: l的478-522位氨基酸)，特别的是495位氨基酸残基，已知 在哺乳动物细胞中该位点是被磷酸化的。在优选的实施方案中，495位 氨基酸残基被取代成Ala、 Gly、 Val、 Leu、 Ile、 Pro、 Phe、 Tyr、 Trp、 Met、 Ser、 Cys、 Glu、 Gln、 Lys、 Arg或His,更优选地被取代成Ala、 Val、 Leu或Ile，以及甚至更优选地被取代成Ala或Val。例如在共同未 决申请U.S. Serial No. 60/403,638中讨论了这些突变体，在此将其全部内
容一同并入参考。
共同未决申请U.S. Serial No. 60/403,638也阐述了各种其它的突变， 当eNOS出现这些突变时增强了它的活性。这些突变可以是在上述提及 的位点、在那些功能结构域的其它残基、或在eNOS分子的其它功能结 构域内。
可以被引入突变的eNOS多肽的功能结构域被很好地描述(见图1)
并包括，例如从N末端开始到C末端，豆蔻酰化的共有位点、两个棕榈 酰化位点、氧化酶结构域、钙调蛋白结合位点(例如SEQ ID NO: 1编码 的人eNOS的494-517位氨基酸)，它含有磷酸化共有序列(例如SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Thr-495)、以及含有磷酸化共有序列的还原酶 结构域(例如SEQ ID NO: 1编码的人eNOS的Ser-1177)。
在钙调蛋白结合位点DPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISA SLMGTVMAKRVKATI (例如SEQ ID NO: 2)， SEQ ID NO: 1的氮基酸 残基478-522)内可以有除Thr-495取代以外的其它突变。其它物种的与 之相当的序列可以是稍微不同的，特别是在N末端到磷酸化位点的残基 上(见图l， SEQIDNOS:3-7)。在该基序的每一个氨基酸都可以被变成 其它19种天然氨基酸的任何一种氨基酸，或变成非天然氨基酸。在一 些实施方案中，突变不是保守突变，例如Gly/Ala、 Val/Ile/Leu、 Asp/Glu、 Lys/Arg、 Asp/Gln、 Thr/Ser或Phe/Trp/Tyr。在一个实施方案 中，定位于相应于SEQ ID NO: 1的Thr-495的氨基酸残基的紧邻C末端 的本发明的eNOS多肽的一个或多个残基，例如残基496和498，可以 被Arg或Lys所取代。
本发明也包括在eNOS多肽的其它功能结构域的一个或多个氨基酸 被修饰的eNOS多肽。例如， 一个或多个突变被引入到一个或多个催化 区(例如氧化酶或还原酶结构域)或调节区(例如自身抑制环)、或任何的 本领域已知的或在此所描述的其它功能结构域。其它突变可以是任何一 种在此所描述的突变类型。
在本发明的方法中也可以使用具有两个或更多个在此所描述的突变 的组合的多肽突变体。在优选的实施方案中，本发明的eNOS多肽突变 体在至少两个功能结构域有突变并表现出比初始多肽或参照多肽更高的 eNOS活性。如果需要，在已经进行并描述这样一种附加突变后，可以 重复这个过程，直到在这两个功能结构域的其中一个或不同的功能结构 域进行并描述第三个突变。在一些实施方案中，随着每一种附加的突
变，eNOS多肽突变体的活性(例如，刺激NO产生)继续增加。在优选 的实施方案中，人eNOS突变型多肽包括在相应于SEQ ID NO: 1的Thr-495的位置上的氨基酸取代(例如取代成Ala、 Val、 Leu或Ile，优选的 Ala或Val)以及相应于SEQ ID NO: 1的Ser-1177的位置上的氨基酸取代 (优选的为Asp)，以及在豆蔻酰化位点的Gly-2上的氨基酸取代(优选的 为Ala)的组合。在最优选的实施方案中，本发明的多核苷酸编码 S1177RD突变及G2A突变；S1177D突变体及T495V或T495A突变体； G2A突变体及T495V或T495A突变体；或SI 177D突变体、G2A突变体 及T495V或T495A突变体。
当本发明的eNOS多肽来源于非人的哺乳动物时，可以突变eNOS 中的相当(等效)残基。在这些生物体中的相当残基是熟知的。例如，人 蛋白的495位残基相应于小鼠多肽的494位残基、豚鼠多肽的498位残 基、狗、牛或猪多肽的497位残基、大鼠多肽的22位残基或兔多肽的 40位残基。
生成这些突变体的方法是标准的方法并在本领域是熟知的。这些方 法包括例如，同源重组、定点突变、盒式突变以及基于PCR的突变，见 例如Sambrook " Afo/ecw/<ar C7ow"g， CSH Press (1989) and Kunkel " d (1985) /WJS 82， 488-492。这些突变的原材料可以是来源于任何动物 的cDNA，例如人、小鼠、豚鼠、狗、牛、猪、大鼠、兔、羊、马、非 人的灵长类、或其它动物。
可以用多种标准检测确定是否上述的这些突变体表现出eNOS活性 的增加。可以进行不同的eNOS活性的检测；或可以直接确定当应用本 发明的基因治疗方法时，突变型eNOS多核苷酸改善CLI 一种或多种症 状的能力。(见实施例)
eNOS将L-Arg转换为NO， 一种在许多生理反应中参与和/或作用 为调节功能的气态的第二信号分子。不用结合任何的特殊机制，当将编 码eNOS的多核苷酸被引入到病变细胞或组织时，eNOS所介导的一种
或多种活性造成了CLI的症状的改善。例如，eNOS直接或间接地(例如
通过酶合成NO)介导刺激血管生成；微血管功能不全的改善；剌激血 管舒张；刺激侧突血管的发育；增加周围肢体血流；抑制肢体坏死；抑 制皮肤溃疡；增强皮肤溃疡愈合的抑制或预防血小板粘附或聚集(它可 以导致例如血栓形成)；刺激内皮细胞增生和迁移；抑制白细胞活化和 粘附或平滑肌增生；调控免疫反应；以及清除超氧离子。测定这些及其 它eNOS活性的方法对于本领域人员是常用并熟知的。见例如，湖lj定抑 制肢体坏死的方法，如增加侧突血管依赖性缺血肢体的毛细血管密度或 血管舒缩反应性所证实的(见例如e.g., Murohara W a/. (1998) ■/ C7/". /wveW., 101,2567-2568.)。在此也见实施例。
测试eNOS活性的动物模型是标准的并在本领域是熟知的。例如， 见Murohara & a/. (1998 ibid); Couffinhal ef a/. (1998);爿w 尸a说o/ 152， 1667-1669; Cou伍nhal " a/.， (1999) Cz>cw/。ft'o" 99， 3188-3198;以及在此 的实施例。这些检测包括，例如手术后肢缺血的小鼠和大鼠模型，例如 其中在eNOS缺陷小鼠中实施手术。在这些参考文献中也描述了测定后 肢血流及毛细血管密度的方法。
编码eNOS多肽突变体的重组载体
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的重组载体、包含本发明的重 组载体的宿主细胞，以及本发明的多肽产物。
本发明涉及插入有编码eNOS多肽的多核苷酸的重组载体。这些多 核苷酸可以被从天然来源直接分离并克隆进适宜的表达载体中，或多核 苷酸可以被人工地加工成具有或天然存在的或突变的多核苷酸的序列。 突变DNA、克隆和表达DNA的方法，或其它分子生物学方法在此指的 是常用的方法并被许多教科书和其它参考材料所描述的方法。见例如， Sambrook Afo/ecw/ar C/om'"gv爿丄a6on^o y Afawwa/, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.， (1989); Wu et al, MeAoAGewe万/otec^wology
(CRC Press, New York, NY， 1997); 及eco油'""w/ Gewe Ex戸肌ow TVofoco/j, Af"/ioA /" M)/ecw/flr所o/ogv, Vol. 62， (Tuan, ed., Humana Press, Totowa， NJ, 1997); 以及Cwr/^wf尸rotoco/j /w Afo/ecw/ar历o/o"， (Ausabel et al, Eds.) , John Wiley & Sons, NY (1994-1999)。
本发明涉及含有其中如上述的插入有编码eNOS多肽的多核苷酸的 表达载体(例如质粒或病毒表达载体)的重组构建体，表达载体与适当的 表达控制序列(例如启动子和/或增强子)可操纵地连接，使得表达所编码 的eNOS多肽。
这些构建体可用于在此所描述的体内基因治疗或回体(基于细胞的) 基因治疗的方法。
可以为哺乳动物细胞例如人细胞选择适宜的表达控制序列，例如组 成的或可调节的启动子或控制真核细胞或它们的病毒的基因表达所已知 的其它序列(例如增强子)。本领域人员熟知各种这些表达控制序列。可 以使用内源性或异源性的表达控制序列。表达控制序列可以是组织特异 性的。在一个实施方案中，表达控制序列是来源于高表达基因。可以从 任何所需的基因中选出表达控制序列，例如用CAT (氯霉素转移酶)载体 或带有选择性标记物的其它载体。用于这种选择的两种适宜的载体是 pKK232-8和pCM7。
在本发明的重组载体中所能使用的适宜启动子包括，例如真核启动 子CMV早期即刻启动子、HSV腺苷激酶启动子、早期和晚期SV40启 动子、腺病毒启动子、逆转录病毒LTR以及小鼠金属硫蛋白I。本领域 人员容易选择出适宜的载体和启动子。
通过将增强子序列插入到表达载体中可以增加编码本发明的eNOS 多肽的多核苷酸序列的转录。增强子是顺式作用的DNA元件，通常是 作用于启动子增加其转录的约10到300个碱基对。代表实例包括在复制 起点尾侧第100到270个碱基对的SV增强子、巨细胞病毒早期启动子 增强子、在复制起点尾末侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。
重组表达载体通常也包括复制起点。表达载体可以含有用于翻译起 始的核糖体结合位点、转录终止序列、多腺苷化位点、剪切供体和受体
位点、以及5'侧翼或非转录序列。可以用来源于SV40剪切及多腺苷化 位点的DNA序列提供所需的非转录遗传元件。载体也可以含有用于扩 增表达的适宜序列。另外，表达载体优选地包括为选择转化的宿主细胞 提供表型标记的一种或多种可选择的标记物基因，例如真核细胞培养物 的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因。
本领域人员熟知大量的适宜的重组表达载体，并且许多都是商品化 可获得的。适宜的载体包括染色体、非染色体以及合成的DNA序列， 例如SV40的衍生物、杆状病毒、酵母菌质粒、来源于质粒和病毒DNA 的组合的载体、以及病毒DNA例如痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、 TMV、鸡痘病毒和伪狂犬病病毒。然而，可以使用任何其它的载体，只 要它们在宿主中是可复制的并能存活的。例如Sambrook等以及在此所讨 论的其它参考文献描述了适宜的克隆及表达载体。
特别地适用于基因治疗方法的重组载体包括被构建带有或表达所选 择的目标多核苷酸的重组逆转录病毒。可以采用的逆转录病毒载体包括 在EP 0 415 731、 WO 90/07936、 WO 94/03622、 WO 93/25698、 WO 93/25234、美国专利No. 5，219，740、 WO 93/11230、 WO 93/10218、 Vile and Hart, O "cer i es. 53:3860-3864 (1993)、 Vile and Hart， 7 es. 53:962-967 (1993)、 Ram " a/.， Ca"cw及es. 53:83-88 (1993)、 Takamiya " a/" / iVewrasc/.33:493-503 (1992)、 Baba a/., / Afewm wrg. 79:729-735 (1993)、美国专利No.4，777，127、英国专利No. 2，200，651、 EP 0 345 242及WO 91/02805中所描述的载体。
可以容易地制备适合与上述的逆转录病毒载体构建体使用的包装细 胞株(见例如，PCT文献WO 95/30763和WO 92/05266)，并将其用于生 成用于生产重组载体颗粒的生产细胞株(也称为载体细胞株)。在本发明 的优选的实施方案内，从人(例如HT 1080细胞)或水貂亲代细胞株制备
包装细胞株，因此容许生成能在人血清中无活性生存的重组逆转录病 毒。
本发明也采用基于a病毒的载体。可以由多种a病毒构建这些载体， 包括例如，辛德比斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67; ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373; ATCC VR-1246)以及委 内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR-1249; ATCC VR-532)。这些载体体系的代表性实例包括在美国专利 5,091,309、 5,217,879、和5,185,440;以及PCT Publication Nos. WO 92/10578 、 WO 94/21792 、 WO 95/27069 、 WO 95/27044 、和WO 95/07994中所描述的载体。
适宜的载体也可以是细小病毒，例如腺相关病毒(AAV)载体。代表 性实例包括Srivastava的WO 93/09239、 Samulski " a/,， / 63:3822-3828 (1989)、 Mendelson " "/.， Wra/. 166:154-165 (1988)、以及Flotte " a/.，户A^S90:10613-10617 (1993)所阐述的AAV载体。
在一个优选的实施方案中，使用腺病毒载体。各种经修饰的腺病毒 载体(例如Ad5或Ad2)，特别是无复制的载体和/或非辅助细胞依赖性 病毒是本领域熟知的。腺病毒载体的代表性实例包括那些Berkner, 所0tec/2m々was 6:616); Rosenfeld " a/" 5We"ce 252:431-434 (1991); WO 93/19191; Kolls " a/.， iWJS 215-219 (1994); Kass-Eisler " 尸歸 90:11498-11502 (1993); Guzman a/.， Oc由/o" 88:2838-2848 (1993); Guzman W "/.， Cz>. 73:1202-1207 (1993); Zabner " a/.， Ce〃 75:207-216 (1993); Li " a/" if腦.4:403-409 (1993); Cailaud " a/.,
/ iVewraJc/. 5: 1287-1291 (1993); Vincent " a/.， JVaf. Ge"et. 5:130-134 (1993); Jaffe " a/" Ato. Ge"". 1:372-378 (1992);以及Levrero " Gwe 101:195-202 (1992)所描述的腺病毒载体。在本发明中所采用的示 范的腺病毒基因治疗载体也包括那些在WO 94/12649、 WO 93/03769、 WO 93/19191、 WO 94/28938、 WO 95/11984以及WO 95/00655中所描
述的载体。可以采用施用如在Curiel， 3:147-154 (1992)
中所描述的与腺病毒相连接的(例如靶向于腺病毒)DNA。
通过任何方法都可以将适宜的DNA序列插入到载体中。通常可以 通过本领域已知的标准方法将DNA序列插入到适宜的限制性内切酶位 点。这些方法以及其它的方法被认为是在本领域人员的知识范围内的。 在许多容易获得的资源中都可以发现这些常用的方法以及在此所讨论的 其它分子生物学技术，例如Sambrook, " a/., Afo/ecw/ar C7om>2g:爿 Z^60raf07Mam/(3/， Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y" (1989)。用于 构建例如腺病毒基因转移颗粒的复苏重组技术也见于Graham "a/. (1988) Fz'ra/ogy 63, 614-617。本发明也涉及被例如上述的构建体(或病毒感染的 构建体)转化、转染、转导的细胞以及这些细胞的后代，特别是这些细胞 形成能被植入(或重新植入)到所需治疗的CLI患者体内的稳定细胞株。
用于基于细胞的基因治疗的适宜的宿主包括但不限于骨骼肌细 胞、平滑肌细胞、骨髓来源的干细胞、内皮前体细胞、成纤维细胞、树 突状细胞、脐带血来源的细胞以及内皮细胞。利用任何一种适宜的方法 都可以完成将构建体体外引入到宿主细胞中，例如磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂染、基因枪或电穿孔(Davis，L.，Dibner,M.,Battey, I.， 5aw'c M"/wds Afo/ecw/w历o/ogy， (1986))。在转化适宜的宿主细胞株 并将宿主细胞株繁殖到适宜的细胞密度后，如果需要就用适宜的方法(例 如温度迁变或化学诱导)引入所选择的启动子，并再培养细胞一段时间。 在按适合激活启动子(如果需要)所改良的常用的营养培养基中培养被加 工的宿主细胞，选择转化细胞，扩增本发明的基因和/或扩增用于基于细 胞的基因治疗的细胞的数目。细胞培养的条件，例如温度、pH值等都是 原先在选择用于表达的宿主细胞中所用的条件，这对于本领域人员是显 而易见的。
利用eNOS多肽和多核苷酸的CLI基因治疗
严重的周围动脉闭塞病(PAOD)所造成的重症肢体缺血(CLI)被描述 为进行性微循环功能不全以及血管生成不良。本发明涉及治疗患CLI患 者(例如Fontaine分期III或IV期的POAD患者)的基因治疗方法，用野 生型或突变型eNOS多肽或编码这些多肽的多核苷酸改善CLI的一种或 多种症状，这些症状包括但不限于微循环功能不全或血管形成不良、白 细胞的活化、血小板聚集、毛细血管闭塞、内皮细胞功能不全、 一氧化 氮利用率的减少、内皮细胞损伤、自由基的释放、组织损伤、坏死、静 息痛、增加踝或趾收縮压和/或皮肤溃疡。这种治疗的正性结果是血管形 成的增加和/或血管的血管舒张和/或损伤组织内和周围伤口的愈合。
可以体内(例如将多核苷酸或多肽直接施用给患者)或回体(例如将 多核苷酸或多肽引入到细胞内，例如取自需要治疗的患者的细胞或来源 于此的细胞株，或非来自于需要治疗的患者的细胞或细胞株，然后将被 转染的细胞引入到患者体内)完成将本发明的多核苷酸或多肽输送到需 要治疗的患者内。
本发明的方法包括将基因输送载体和/或转染细胞中的有效量的一种 编码eNOS的多核苷酸施用于需要治疗的患者。"有效量"在此意思是可 以可测定的或可检测的减轻或抑制CLI的一种或多种症状(例如在本文 的其它地方所描述的症状)的量。
回体基因治疗的方法(基于细胞)是常用的。上面描述了含有可表达 eNOS基因的适宜的细胞。通过许多适当的常用方法可以将这些细胞引 入到患者体内，例如注射、植入、静脉内给药、移植、定植、输送被载 体所包囊化的细胞、或在此所描述的用于体内给药的各种方法。可以使 用其它的强化输送的方法。这些方法包括但不限于透明质酸酶注射、 电穿孔和超声穿孔。对于体内给药，用各种常用的方法可以将如上述的 含有编码eNOS的多核苷酸的构建体(在此有时被称为"基因输送载体") 给需要治疗的患者施用。可以局部或全身地输送构建体。体内输送的适 宜途径对于本领域人员是熟知的并包括，但不限于静脉内、肌肉内、
腹腔内、皮内、动脉内和口服方法。对于常用的方法，见例如Jolly， Cawcer (7ewe T7jerajc;y 1:51-64 (1994) Kimura， //iw7a" C ewe Therapy 5:845-852 (1994); Connelly, //wwaw 7Tzera;^ 1:185-193 (1995);和Kaplitt， 淑歸Ge"e"'cs 6:148-153 (1994)。
利用常用的方法学可以将基因输送载体加工成包括常用的可药用的 赋形剂或载体的药用组合物。增强试剂转移通过细胞膜(促进穿透)或减 少降解的剂型或赋形剂在本领域也是熟知的。例如，用多种常用方法可 以将输送颗粒(用于体内或回体转移多核苷酸)输送到靶细胞内，这些方 法包括例如，脂质体介导的脂染，例如其中脂质体是含有例如SF-chol 或DC-chol的胆固醇衍生物的阳离子脂质体；按剂型制造的DNA (例如 PINC);以及用lipofectamine的转染等等。在USP 5，656;565; Mannino ef a/. (1988)及orec/^々"es 6， 682-690以及其参考文献；和Gao (1991) 历oc/zew历o; /^及esComm 179， 280-285中描述了常用的方法。
在一个实施方案中，将施用给患CLI患者的基因输送载体局部施用 到表现出疾病病变的部位。这些局部输送可以避免例如在非疾病相关的 细胞或组织内引入NO所造成的不必要的作用(例如副作用)。例如，通 过插入到一侧或双侧股动脉的近端部分的导管可以输送本发明的多核苷 酸，从而使得多核苷酸被转移到接受股动脉血流的骨骼肌细胞内(见例如 USP 5,792,453)。也可以直接注射到周围血管系统内，或注射到病变的组 织(例如骨骼肌)内，以及可以进行分离的组织灌注，例如分离的肢体灌 注(ILP)，其中在股动脉和股静脉之间可以形成闭合的回路(见例如WO 01/03728)。
在另一个实施方案中，用常用方法可以全身施用治疗性多核苷酸， 但这些多核苷酸是被修饰的，使得它们是靶向于细胞的。例如，多核苷 酸可以被放置在组织特异性表达控制元件的控制下，例如启动子或增强 子元件。
通过融合例如组织特异性的内皮转录控制序列以及例如腺病毒构建
体的构建体内的例如本发明的eNOS基因的转基因，转基因的表达可以 被限制在内皮细胞内。内皮细胞特异性启动子的实例包括，例如Tie-2 启动子(Schlaeger ef ^ (1997)尸rac Ato/爿cW Sci 1; 94 (7):3058-63)、内 皮素启动子(Lee " a/. (1990) /历o/. C7^加.265:10446-10450)、以及 eNOS启动子(Zhang ef a/. (1995) /历o/. C7zew 270 (25): 15320-6)。也可以 使用Flt-l和Flk-l启动子(见例如Bu " a/. (1997) 編.C/2亂 272:3216-32622)。其它潜在的启动子包括合成的及天然的骨骼肌特异性 启动子(见例如Hauser " a/. (2000) Mo/. 77^ra/7_y 2:16-24); Spc5-12合成 启动子(Li ef a/. Atow" (1999) 17:241-245)以及专利WO 99/02737。
可以采用其它的基因输送载体及方法，包括与腺病毒单独连接或未 连接(例如靶向的)的多阳离子凝聚(condensed)DNA(例如，Curid,Hwm.
77 er 3:147-154 (1992));与配体连接的DNA (例如，见Wu, Bz'o/. CTze肌264:16985-16987 (1989));真核细胞输送载体细胞(例如见1994年 5月9日归档的美国专利No. 08/240,030，以及美国专利No, 08/404,796);光聚合水凝胶材料的沉积；手提式基因转移颗粒枪(例 如，如在美国专利No. 5,149,655中所描述的)；电离辐射(如在美国专利 No. 5,206,152和WO 92/11033中所描述的)、核电荷中和或与细胞膜的 融合。在Philip, Mo/. CW/历o/. 14:2411-2418 (1994)和Woffendin， /Voc. JVaf/. XcW. 91:1581-1585 (1994)中描述了其它方法。
也可以采用裸DNA。在WO 90/11092和美国专利No. 5,580,859中 描述了示范的裸DNA导入方法。用生物可降解的乳胶珠可以提高摄取 效率。在乳胶珠启动内吞作用后，以DNA包被的乳胶珠被有效地输送 到细胞内。通过处理珠以增加其疏水性可以进一步地改进方法，并因此 促进内含体的瓦解并将DNA释放到胞浆内。在例如美国专利No. 5,422,120、 PCT专利申请Nos, WO 95/13796、 WO 94/23697和WO 91/14445、以及EP No. 0 524 968中描述了能作用为基因输送载体的适 宜的脂质体。另外，适用的非病毒的输送方法包括机械输送体系，例如
在Woffendin " Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (24):11581-11585 (1994)
中所描述的。此外，通过光聚合水凝胶材料的沉积可以输送编码序列以 及它们的表达产物。能用于输送编码序列的其它常用的基因输送方法包 括，例如适用手提式基因转移粒子枪(如在美国专利No. 5，149，655中所 描述的)；以及使用激活被转移基因的电离辐射(如例如在美国专利No. 5,206,152和PCT专利申请No. WO 92/11033中所描述的)。
已经设计出PINC ("protective interactive nonconsensing")多聚体例如 聚(N-乙烯砒咯烷酮)以及聚(乙烯醇)与质粒DNA形成多聚体以(i)保 护质粒避免被核酸酶的快速降解；(ii)在例如骨骼肌的靶组织内分散及 保持完整质粒；以及(iii)促进肌肉细胞对质粒的摄取(Mumper " a/., 1996, Rolland and Mumper, 1998)。 Mumper等(1998)表明PINC剂型增 强了对骨骼肌的转染效率(10到15倍)并延长了编码各种不同的转基因 的治疗DNA的表达持续时间(28天)，这些转基因包括小鼠的血清碱性 磷酸酶(SEAP)、人生长激素、以及人IGF-1。 Abruzzese等(2000)己经 表明PINC剂型联合电穿孔造成小鼠骨骼肌合成及分泌重组蛋白例如促 红细胞生成素以及血管内皮细胞生长因子(FGG)增加了 100倍。Fewdl 等(2001)已经证实在将结合有PINC的质粒注射到免疫缺陷小鼠的后肢 后，人IX因子有长时间、持续的表达(超过120天)。
另一方面是上述的方法除施用编码eNOS多肽的多核苷酸外，还进 一步包括在施用eNOS之前、之中或之后施用一种或多种血管生成调节 物，或是多肽或是编码这些多肽的多核苷酸。本领域人员熟知许多这样 的血管生成调节物。它们包括但不限于生长因子、转录因子、血管活性 物质、化学趋化分子。生长因子包括例如HGF、 VEGF (例如VEGF-2、 VEGF陽121、 VEGF-145或VEGF画165)、 FGF(例如FGF-1、 -2、 -4、 -5)、 内皮细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子、 TGF-a、 TGF-P、 PDGF、 TNF-a或IGF、发育调节内皮细胞位点-1 (Del-1)。潜在的血管生成调节物也包括但不限于转录因子(例如EPAS、
HIF)、血管活性物质(例如激肽释放酶、C型心钠肽(CNP)、 Bl受体激 动剂)以及化学趋化因子(例如GM-CSF、 MCP-1、 IL-8)以及其他肽(例 如PR-39)。
制备、施用和测定施用这些血管生成因子的作用的方法都是常见 的，无论是单独的或与eNOS多肽联合的因子。(见，例如 Papapetropoulos ef a/. ， (1997) / C/z'" /騰"100， 3131 -3139; Brock & ， (1991)y4wJ尸W/zo/ 138, 213-221;以及Ku"a/" (1993)JwJ/V^/0/. 265， H 586-592; WO 01/03728;以及它们的参考文献)。
利用常见的方法可以将这些生长因子克隆进合适的表达载体中(或 克隆进单一的载体或克隆进也表达本发明的eNOS多核苷酸的载体)。 (见，例如Rivard " fl/" (1999) 4附JPo^ioZ 154， 355-363 for a method to induce angiogenesis by intramuscular gene therapy with VEGF)。参照于编 码eNOS的多核苷酸，所克隆的血管生成因子当然可以为任何一种在此 所讨论的功能变体或片段，条件是所保留的功能是野生型血管生成因子 的血管生成功能。
在编码血管生成因子的序列的同相或上游融合有助于多肽从细胞内 分泌或促进多肽附着于细胞膜的序列将是有用的。这些适宜的前导序列 对于本领域人员是熟知的。
在一些实施方案中，基因输送的方法是通过骨骼肌注射。刺激缺血 腿的新血管形成的前血管生成基因的骨骼肌注射是基因输送的便利的、 相对无创的方法。骨骼肌包括多核的、有丝分裂后的肌纤维，因此可能 促进了转导细胞的有效及长时间的表达。既然新血管形成的过程只需要 1-2周，那么瞬时基因表达对于治疗性血管生成将是足够的。虽然新形 成的血管的持续存活需要更长时间的生长因子的表达是可能的，但是体 内数据表明一旦有血流通过新产生的毛细血管/动脉，这些新血管在没有 治疗性转基因的持续表达下也仍然开放。
在一些实施方案中，基因输送的方法是通过腺病毒。在血管生成基因治疗试验中已经使用腺病毒，因为它容易被大量地生产。病毒转染不 同来源(器官和物种)的分裂和非分裂细胞并且它能瞬时地表达转基因。
腺病毒的转导效率可能依赖于柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)及av整联 蛋白。另外，肌肉筋膜以及成熟肌纤维的细胞外基质可能作用为阻止病 毒基因有效地输送到肌肉的物理屏障。因此，用消化酶增加筋膜及细胞 外基质的通透性可以增强病毒基因的输送。另夕卜，透明质酸酶的预处理 可以造成利用病毒或质粒输送的转基因表达的增加(美国专利Serial No. 6,258,791)。另外，在CLI患者和实验动物的骨骼肌中所存在的肌纤维 的炎症和缺血性损伤和再生可能进一步地促进病毒基因的转移。
在另一个实施方案中，质粒载体被用于骨骼肌的基因输送。已经发 展一些方法以增强骨骼肌的非病毒基因转移的效率，包括电穿孔、质粒 多聚体剂型例如PINC和PVP，以及例如透明质酸酶或胶原酶的化合物 的预处理以增强裸DNA对肌纤维的进入及渗透能力。质粒的化学剂型 己经极大地提高了体内稳定性以及靶组织的摄取。已经设计PINC ("protective interactive nonconsensing")多聚体例如聚(N-乙烯砒咯烷酮) 以及聚(乙烯醇)与质粒DNA形成多聚体以(i)保护质粒避免被核酸酶的 快速降解；(ii)在例如骨骼肌的靶组织内分散及保持完整质粒；以及(iii) 促进肌肉细胞对质粒的摄取。最近已经显示PINC剂型造成一些转基因 的体内表达的水平及持续时间的增加。也证实了再次施用质粒的能力。
在一些实施方案中，用局灶的、导管介入的VEGF-腺病毒基因治疗 进行基因输送。
以举例说明的方式提供下面的实施例，其不以任何方式限定本发明。
实施例
实施例l: eNOS多肽突变体和重组质粒及病毒载体
生成编码具有单或双突变的eNOS多肽的质粒载体，用于在体外和
体内进行质粒载体输送及细胞内野生型eNOS和多肽突变体的表达。利 用直接在eNOS多核苷酸序列上的Kunkd定点诱变生成这些突变体 (Kunkel， T.A. /WJS 1985; 82:488-492)。测序确认这些突变。将野生型突 变构建体的cDNA克隆进质粒载体pShuttle-CMV中，将编码eNOS多 肽的多核苷酸放置于CMV表达盒内。因此，在这些构建体中，多核苷 酸被可操纵地连接于CMV启动子，使得启动子驱动在细胞内的表达所 编码的eNOS多肽突变体。
在具有单氨基酸取代的eNOS多肽突变体中，相应于人eNOS的钙 调蛋白结合位点(见图1)495位的Thr被取代成Ala、 Asp或Vd(分别称 为突变体T495A、 T495D、 T495V)。在具有双氨基酸取代的eNOS多肽 突变体中，相应于1177位的Ser被取代成Asp，另外相应于495位的 Thr被取代成Ala、 Asp或Val (分别被称为突变体T495A + S1177D、 T495D + S1177D、 T495V + Sl 177D)。测序确认这些突变体并测定它们 增加HEK293细胞的NO产生的能力(实施例2和图2)。
根据He等(1998)iW^S95 (5) , 2509-2514所描述的方法生成编码上 述的具有单和双突变eNOS多肽的腺病毒载体，并用于在体外和体内以 病毒载体将eNOS野生型和多肽突变体输送至细胞内。将带有编码 eNOS多肽突变体(如上述的)的多核苷酸与含有El和E3缺失的Ad5基 因组的质粒一起共转化五xo/i'. BJ5183。腺病毒载体骨架来自腺病毒5。 在该载体骨架中，454位和3333位核苷酸之间的腺病毒序列的El区被 缺失，以及用645bp外源DNA取代部分E3缺失。多核苷酸可以被插入 于El缺失的位点，使得CMV启动子(在-632到+7)以及SV40多腺苷信 号被可操纵地连接于多核苷酸以表达多核苷酸所编码的多肽。
然后选择出所形成的编码eNOS多肽突变体的重组腺病毒质粒并用 限制性内切酶分析确认。通过用无质粒的重组腺病毒基因组转染293细 胞复活相应的病毒，然后在293细胞中扩增病毒，用标准的CsCl梯度 纯化纯化病毒，并用于测定HAEC的NO产生(实施例3和图3)。
另外，eNOS多肽突变体NOS1177D(Sessa等，Yale大学提供)在相 应于SEQ ID NO: 1的还原酶结构域的1177位氨基酸残基的位置上具有 氨基酸取代成为Asp。为了测定这个eNOS多肽突变体在细胞内的活 性，将编码该突变体的多核苷酸插入到腺病毒骨架(如实施例1中所述) 的El被缺失的位置。所形成的重组载体Ad5NOS1177D编码eNOS多 肽突变的NOS1177D。将重组载体Ad5NOS1177D转染进包装细胞，所 形成的病毒是纯化斑，并进行两轮扩增。用第二轮扩增中得到的病毒在 3L生物反应器中进行大规模的HEK293细胞的感染接种。然后用两轮 CsCl梯度分离纯化所生成的病毒并用10 mM Tris pH 8.0、 2 mM MgCl2 和4%蔗糖透析病毒。也用纯化的重组病毒的一部分测定HAEC的NO 产生(见实施例3、 5和7)。
Ad5EGFP是对照载体，它是编码报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的 腺病毒载体。用Collateral Therapeutics制备，然后在HEK293细胞中扩 增，并用FPLC纯化。然后用PBS pH7.2和2%蔗糖透析所纯化的病 毒。然后将所纯化的对照病毒的一部分储存在-80'C，用作随后实验的 对照(见实施例5和7)。
实施例2: eNOS多肽突变体在HEK293细胞中的活性的检测和测定
为了检测和测定eNOS多肽突变体在HEK293细胞中的活性，用编 码eNOS多肽突变体的质粒载体(如实施例1所描述)在HEK293细胞中 输送和表达多肽突变体。首先将HEK293细胞放置在6孔板中，每孔有 2ml生长培养基(Alpha MEM, (Gibco 12561-056))，其中含有10%FBS (SeraCare)、 2mM附加的L-谷氨酰胺和50ng/ml庆大霉素。当细胞为约 75%汇合时，用编码T495A、 Thr495D或T495V eNOS多肽突变体(如 实施例中所描述的)、或编码野生型人(WT) eNOS (SEQ ID NO: 1)或编 码两种多肽的质粒穿梭载体转染细胞。
通过混合8飓编码WT eNOS或突变型eNOS的质粒穿梭载体、
60|il Lipofectamine 2000 (Invitrogen)以及200(il OptiMEM (Gibco)进行转 染，在室温下孵育30分钟后，将lll抖l混合液以及420W OptiMEM添 加到每个含有HEK 293细胞的孔中。在37'C孵育2.5小时后，将2ml生 长培养基加入到每个孔中。
两天后(细胞孵育在37'C, 5%C02)，用化学发光法测定细胞所生成 的NO，之后将细胞裂解并用下面所描述的ELISA检测法测定裂解物的 eNOS蛋白成分。为了纠正不同质粒之间的转染效率的差异，将NO产 生标准化为eNOS蛋白的量。
NO产生的测定
去除培养基，用2ml NO分析缓冲液(5 mM Na HEPES、 140 mM NaCl、 5mMKCl、 lmMMgCl2、 lOmM葡萄糖、10 mM CaCl2、 5 mM L-精氨酸、pH7.5)将每个孔都洗涤两遍。然后用lml含有100U/ml超氧 化物歧化酶及40ng/ml VEGF的NO分析缓冲液取代上述缓冲液。用石 蜡膜覆盖孔，在37。C孵育30分钟后，将细胞上方的0.8ml缓冲液注射 到西门子NOA280化学发光法测定器中，根据厂家说明书测定NO。真 实的NO气体作为标准。完成NO测定后，去除细胞上的残余缓冲液， 在0.6ml裂解缓冲液(0.5% NP-40、 50 mM Tris-HCl pH 7.5、 1 pg/ml胃 酶抑素A、 1 ng/ml亮抑酶肽、5 ng/ml抑肽酶、24 pg/ml Pefabloc SC (Boehringer Mannheim))中裂解细胞并储存于-2(TC 。
eNOS蛋白的测定
用每孔lOOpl含有5 pg/ml包被抗体(兔多克隆抗eNOS抗体)的 pH9.5的50mM碳酸钠缓冲液包被96孔ELISA板(Costar 3590)，并在 4。C孵育过夜。从用与钥孔戚血蓝素连接的相应于人eNOS的599到614 位残基的肽所接种的兔中收集多克隆抗体(Babco)，并用蛋白G琼糖脂 (Amersham)纯化。用200 pl/孔的0.5% I-Block (Tropix)的PBS+0.01% Tween 20封闭板，并在4'C孵育过夜。然后用每孔350^1 PBS+0.5ml/L Tween 20洗涤板三次。将含有eNOS的HEK293细胞裂解液加入到板
中，用裂解缓冲液稀释5或10倍到终体积为60nl/孔，并在室温下孵育 1.5到2个小时。然后用每孔350|ul PBS+0.5ml/L Tween 20洗涤板三次。
如下加入检测抗体， 一种单克隆抗eNOS抗体(Transduction Labs N30020),它是如参考文献2所描述的铕标记的单克隆抗体每孔lOOpl Wallac检测缓冲液中的125ng/ml铕标记的抗体(Wallac/PerkinElmer 1244-111)。然后将板在室温下孵育1.5个小时。然后用每孔350^1 PBS+0.5ml/L Tween 20洗涤板三次。然后加入每孔100|ul Wallac强化溶 液(Wallac/PerkinElmer 1244-105)。用板封闭剂覆盖板并在4。C储存过 夜，然后混合10分钟后，在Wallac 1420 VICTOR2多标记计数器 (PerkinElmer Life Sciences)中读取板，监测在615nm下所定时释放的荧 光。(Aberle S. " a/"胁/c Oc^ 1， 226 (1997); Meurer J & a/.，逾/70cfe ￡"，o/ogv 359, 433-444 (2002))。
结果显示eNOS多肽突变体刺激HEK293细胞合成NO，与野生型 eNOS比较，单突变体T495A和T495V、以及双突变体T495A+S1177D 和T495V+S1177D刺激了 NO产生水平的增加。
实施例3: eNOS多肽突变体在HAE细胞中的活性的检测和测定
将每孔350,000个人主动脉内皮细胞(HAEC)放置于6孔板中，每 孔包括4ml含有10% FBS的EGM生长培养基(Cambrex)。将细胞培养 在37。C、 5。/。C02中。第二天，往每孔中加入编码野生型或突变型eNOS (Thr495Ala、 Thr495Asp、 Thr495Val或Serll77Asp)的腺病毒。与病毒 孵育4个小时后，去除培养基并用2ml含有0.1%凝胶和3(HiM墨蝶呤 (Sigma)的EBM生长培养基(Cambrex)替换。20个小时后，用化学发光 法测定细胞所生成的NO，之后将细胞裂解并用下面所描述的ELISA检 测法测定裂解物的eNOS蛋白成分。为了纠正带有不同eNOS突变体的 不同的腺病毒构建体之间的转染效率的不同所造成的表达水平的差异， 将NO产生标准化为eNOS蛋白的量。
结果显示eNOS多肽突变体剌激HAE细胞合成NO，与野生型 eNOS比较，单突变体T495A和T495D刺激了 NO产生水平的增加(图 3)。这个研究的结果不同于在实施例2中所描述的结果，其中为了刺激 NO的释放，用VEGF刺激细胞，而在实施例2所描述的研究中使用了 钙离子载体。另外，腺病毒感染比用质粒DNA转染每个细胞生成了更 多的eNOS蛋白(以及更多的一氧化氮)。因此，在本研究中的eNOS的 大量表达可能造成了在eNOS多肽突变体中的所观察到的NO活性水 平。
人主动脉内皮细胞含有内源性野生型eNOS，但是大量表达的突变 型eNOS所生成的NO的量是内源性eNOS所生成的量的近20倍。在实 施例2和3所描述的数据中， 一氧化氮的产量被标准化为eNOS蛋白的 量，使得eNOS突变体具有相同范围内的活性。在不同的eNOS多肽突 变体、利用腺病毒载体和质粒载体以及不同细胞类型之间所测定到的 NO产生的水平是归结于细胞内的其他限制性因素例如共因子的利用率 是有可能的。因此，进一步测定eNOS多肽突变体在HAEC中的活性可 以进一步地解释在不同的细胞类型中eNOS的表达和活性的作用。
实施例4: eNOS-KO小鼠CLI模型的生成
为了建立CLI的动物模型，将3-12个月大的野生型(WT)和eNOS 缺陷(eNOS-KO)雄性小鼠进行股动脉的单侧手术切除(见下面的材料和 方法)。在手术前、和手术后1、 4、 7、 10、 14、 21和28天用激光多普 勒灌注显像(LDPI)系统测定后肢浅表血流的变化(图4)。在手术后l、 5 和10天进行缺血肢体的定量血管造影。在WT小鼠中，在闭塞后第一 周，血流显著减少，但是在第28天血流恢复到缺血前基础水平的 80%。然而，在eNOS-KO小鼠中，没有出现后肢血流的恢复(图4)并 伴有缺血肢体的坏死(图5)。用经验证的血管造影积分指数测定大的侧 突动脉的数目，在第10天时，WT (C57B1/6)的积分指数是eNOS-KO
小鼠的2.6倍(图6)。到了手术后第28天，因为坏死肢体的自动截肢 (autoamputation) ， eNOS-KO小鼠已经丢失了它们的缺血后肢。相反 的，没有一只野生型小鼠表现出肢体坏死的征象。
这些结果证实内皮起源的NO在缺血肢体的血管发生以及组织灌注 上的重要作用。
CLI模型的改进
缺血损伤的严重性表现出依赖于动脉切除的部位和长度，也依赖于 股静脉是否完整或被去除。切除全部股动脉和静脉造成eNOS-KO小鼠 的整个肢体的严重缺血及快速丢失。单独去除股动脉(保留完整的股静 脉)引起更为渐进的肢体缺血。单独节段性切除股动脉造成类似于人 CLI的更少广泛的缺血性坏死(足趾或远端肢体丢失)(图7)。
这个模型随后已经被用于研究发明对血流及肢体挽救的作用。
年龄对CLI的影响
利用上述的CLI模型，我们观察到血流的恢复及缺血性损伤的程度 是重要地依赖于动物的年龄。当进行股动脉的节段性切除时，血流恢复 不良和缺血性坏死的程度在较年长动物中比在较年轻的eNOS-KO小鼠 中要严重的多。3个月大的eNOS-KO小鼠表现得与WT对照组完全一 样。在第14天观察到血流的完全恢复，且没有大体病理的变化。6个月 大的动物的血流恢复明显不良以及足趾的营养的变化，在一些病例中造 成足的丢失(图8)。在11-12个月大的小鼠中，其足在手术后马上出现 变色以及小鼠在手术后第一天快速地发生进行性坏死，它在第10天造 成90%动物的肢体的丢失(图9)。
因为腿丢失的原因，所以不能在所有的实验组中评价一些实验终点 例如定量的血管造影或LDPI血流。在这些情况中，通过在手术后第 1、 4、 7、 10、 14、 21和28天计数动物的残余足趾及腿来测定治疗的疗 效。
基因输送的优化
在一些研究中，用质粒DNA (pDNA)联合电穿孔将基因输送到细胞
内。进行研究以优化l)DNA浓度；2)注射的体积、部位和次数；3) 电穿孔条件；4)与手术相关的治疗持续时间；5)用透明质酸酶预处理 (图lO和ll)。
在WT小鼠中用含有报告基因萤光素酶的质粒pLuc优化基因输 送，并通过在注射后第4天测定内收肌匀浆的萤光素酶活性来测定基因 输送。也用pNOS224 (含有NOS1177D基因的质粒)在eNOS-KO小鼠中 测定了最佳方案。在这些实验中，用Western印迹和eNOS特异性 EUSA领lj定了 eNOS水平(图12)。
实施例5: NOS1177D治疗在eNOS-KO小鼠CLI模型中的疗效
A. 在6个月大eNOS-KO小鼠中预防坏死并增加血流 在这个研究中使用了 6个月大雄性eNOS-KO小鼠。在节段性切除
股动脉后，小鼠被随机地分成了两个不同的治疗组(每组11=8只)。在手 术后第3天在大腿的两个部位(内收肌和四头肌)，用空载体注射一个 组，用pNOS224 (含有NOS1177D基因)联合电穿孔处理另一组。在手 术后第1、 4、 7、 10、 14、 21和28天进行LDPI血流测定及获得腿的照 片。在研究结束时，因为缺血性坏死的原因，空载体治疗组(8/8)比 pNOSl 177D处理动物(4/8)具有显著更高的腿丢失率(p<0.05)。
在第28天，处死动物并收集肢体进行治疗作用的组织形态学评 价。在研究结束时，空载体治疗组(8/8)比pNOS1177D处理动物(4/8) 具有显著更多的腿丢失(p<0.05)(图13)。另外，在pNOS治疗动物中观
察到了对溃疡愈合的好处。
B. 11-12个月大eNOS-KO小鼠的肢体挽救
用11-12个月大eNOS-KO小鼠进行第二个研究。因为这个年龄组 中的缺血损伤的严重性以及快速发展，所以修改了基因输送方案。在手 术当天在三个位点(包括内收肌、四头肌、腓肠肌)注射质粒DNA，并
在载体注射前20分钟在基因输送位点用透明质酸酶预处理肌肉。在空 载体组中，到手术后第10天，因为严重的坏死以及自动截肢，所有的 动物都丢失了它们的缺血后肢。相反的，在pNOSU77D治疗组中， LDPI测定的血流有显著的改善以及缺血性坏死的严重度被明显减轻， 并且挽救了所有的肢体(图15、 16和18-21)。
方案中的这些变化造成了基因表达的明显提高(图17)。
C.结论
综上所述，在手术性后肢缺血后，用NOS1177D治疗eNOS-KO小 鼠增加了血流并减少/预防了缺血性坏死，并挽救了肢体。这些结果证实 了一种概念，就是在疾病状态下内源性NO的利用度是严重不良的， NOS基因输送有治疗意义。
实施例6:无eNOS遗传学缺陷小鼠的新的重症肢体缺血模型的建立以 及测定eNOS基因治疗对其的疗效
在雄性成年斯普拉-道来小鼠中建立采用结扎并去除股内和股外动 脉以及所有供应大腿区域的侧支的新的CLI模型，领啶了 NOS1177D在 此动物模型中的疗效，该动物模型是无eNOS缺陷模型(图22)。图22 和23说明了在手术后第1、 4、 10、 17和28天小鼠CLI模型的大体病 理的改变。
此外，建立了 CLI小鼠模型的动脉生成的积分方法。图24说明了 小鼠CLI模型的正常肢体(左侧图像)以及缺血肢体(右侧图像)的血管 造影，以及图25说明了小鼠CLI模型的正常肢体(左侧图像)以及缺血 肢体(右侧图像)的动脉生成的血管造影积分。为了定量动脉生成，在正 常和缺血肢体的大腿内侧区域都绘制三条直线，直线从血管造影图像的 股骨的内1/4、中间、以及外1/4开始，两个对治疗(例如有或无eNOS 基因治疗)不清楚的分离的研究者分别计算出跨过这些线的动脉的总的 数目。为了将差异最小化，血管造影积分被表达为左侧后肢对右侧后肢
的总的动脉数目的比值。
手术及eNOS基因治疗方案
小鼠被分成两组并在手术后马上在三个位点(内收肌、四头肌-股内 肌、腓肠肌)肌肉内注射500pl PBS的lxlO"个病毒颗粒，每个缺血后 肢分三次注射总共3xl()U个病毒颗粒。9只注射Ad5EGFP (如实施例1 所示)的小鼠作为阴性对照，9只注射Ad5NOS1177D (如实施例1所示) 的小鼠作为治疗组。用激光多普勒灌注显像(LDPI)测定基因转移后第 1、 4、 7、 10、 14和21天的血流恢复。在相同时间对手术后肢照相以评 价缺血的组织损伤。在治疗结束时，进行血管造影。
在接受NOS1177D的小鼠中，血流从基因治疗后第1天的手术前水 平的31%恢复到第10天的57%。在接受EGFP对照基因的对照动物 中，后肢血流只表现出很小的恢复(第1天的30%对第10天的37%)， 在两组之间的第10天的p-0.0226(图25)。
在图26中显示了 NOS治疗组的根据大体病理分级I-V的坏死积 分。结果说明NOS1177D基因输送造成了与增加eNOS表达倾向相关的 对缺血性坏死的有效预防(在第10天，NOS处理组的积分为1.89，对照 组为2,89， p-0.014)(图27)。
此外，在基因转移后第14天进行的下后肢的动脉造影证实在 Ad5NOS1177D处理小鼠中比Ad5EGFP处理组具有更多的侧突血管(血 管造影积分为1.21对0.88， p=0.0147)(图28)。
因此，结果说明在小鼠CLI模型中的eNOS基因治疗可以预防治疗 后肢的缺血性坏死，并且这种作用与体内eNOS多肽突变体表达的增加 相关。
材料和方法
小鼠后肢手术
在所有实验中使用eNOS-KO雄性小鼠(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), 3-12个月大，重20到55g。在手术过程以及激光多普勒
测定肢体灌注中，用1.5%异氟垸将动物麻醉。进行手术干预以生成小 鼠的单侧的后肢缺血。在股动脉上方的左侧后肢的上端部分切开一个皮 肤切口 (2mm)。分离出股动脉的近端部分，并结扎所有的侧支。结扎并 切除股动脉和股静脉，以诱导最严重的缺血性损伤。在其它情况下，分 离并切除股动脉但不处理股静脉，或只处理动脉的一段(见图"l")。用手 术钉关闭所覆盖的皮肤。
激光多普勒灌注显像(LDPI)分析小鼠的后肢血流
用LDPI测定缺血(左)和正常(右)后肢的灌注。去除后肢的毛。在 开始显像前，将小鼠放置于37'C的加热板中，以将温度差异最小化。对 于每一个所描述的时间点，我们用LDPI进行腿的相同区域的连续测 定。为了将包括环境光线和温度的变量最小化，将灌注表示为左侧对右 侧后肢灌注的比值。测定灌注分析手术前；手术后即刻；以及在麻醉 下手术后第4、 7、 10、 14、 21和28天。
小鼠骨骼肌基因输送
手术3天后，用1.5%异氟烷将小鼠麻醉，并将50 pi PBS中的80吗 pNOS224或空质粒载体肌肉内注射到手术后肢的大收肌和四头肌中，随 后用双规型电极(200V/cm， 20ms， 1Hz， 8脉冲)进行电穿孔。
对于透明质酸酶的预处理，将50 ^ PBS中的20单位酶注射到大收 肌、四头肌和腓肠肌中，2小时后，再将50 i!lPBS中的80吗pNOS224 或空质粒载体注射到每个肌肉的相同部位，随后用双规型电极 (200V/cm， 20ms, 1Hz， 8脉冲)进行电穿孔。
对于腺病毒注射，将50pl注射体积的lx1011个病毒颗粒注射到大 收肌中。
用于转染效率研究的小鼠骨骼肌匀浆化
切断肌肉部分并储存在-80'C，直到进行Westem、 ELISA或酶活性 分析。将组织切成丁，并在含有25 mM Tris pH 7.8、 10%甘油、0.2% NP40、罗氏蛋白酶抑制剂微片剂(含有lmM EDTA和丝氨酸及半胱氨
酸蛋白酶抑制剂)的裂解缓冲液中用Kinematic polytron匀浆器将其匀浆 化。也加入酶活性的共因子4nMFAD、 FMN和BH4、 3 mM DTT、 3 mM CaCl2、 0.125 钙调蛋白。绝大多数内收肌重25到75mg。用 eppendorf离心机在最高速离心5-10分钟后，收集上清并利用Duall毛玻 璃匀浆器用50到75pl裂解缓冲液将碎片再次匀浆化。在第二次离心 后，混和两次上清液。第三次离心形成终体积为250到750 终浓度 为每ml 100mg肌肉。
eNOS特异性ELISA
用R&D体系(cat#DEN00)的特异性ELISA试剂盒测定eNOS蛋白 的浓度。通过加入100 pl检测稀释液激活所捕获的抗体。每个孔中加入 50到100 pl肌肉匀浆或标准eNOS。在室温下慢慢混和板2个小时或在-4。C下储存过夜。用R&D体系的洗涤缓冲液将每个孔洗涤三次。加入 200 ^结合有辣根过氧化物酶的抗体2个小时。充分洗涤后，加入200 Hl显色试剂。30分钟后用0.5N硫酸终止反应并在450nm下读数。用标 准eNOS所提供的标准曲线计算出eNOS浓度。
NOS活性检测
将60 nl每种肌肉匀浆或标准液与20 ^含有NADPH、精氨酸和 "C-精氨酸的反应混合物在37'C混和1小时。NADPH的终浓度是 0.2mM, 5 nC "C-精氨酸为20pM。将反应物过滤通过悬浮于含有2mM EDTA及EGTA的0.1M乙酸钠pH5.2缓冲液的AG 50W-树脂以终止反 应。在Wallac Micro Beta中用Microscint-40计数产物"C-瓜氨酸。
用于测定不同NOS异构体的小鼠骨骼肌裂解液的Western印迹
SDS扁PAGE:
对于每个样本，将30pl肌肉匀浆加入到IOjliI含有100mM二硫苏糖 醇的4x样本缓冲液中(Invitrogen Cat. No. NP0007)。在IOO'C加热7到8 分钟后，将每个样本加样到10n/pTris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上(BMA PAGEr Cat. No. 59102)。在所需要的地方，加入1 pl含有重组人eNOS
的HEK细胞裂解液作为阳性对照。将预先染色的蛋白标记物(10 ^ Invitrogen LC5725)也加入到在凝胶的一个电泳道中。在Berlex介质制 备部门所提供的lx Laemmli跑胶缓冲液中，130V (恒压)下跑胶1.5个 小时。
印迹到硝酸纤维素膜
利用Novex/Invitrogen装置(装置被预先浸泡在转移缓冲液中)在 20V (恒压)下2个小时，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上(转移缓冲液 -Berlex介质制备部门所提供的100ml 10x转移缓冲液+ 200ml甲醇+ 700ml水)。在印迹之后，将硝酸纤维素膜储存于20ml TBS+5Q/。脱脂奶 粉中4。C过夜。(TBS = 0.02MTris-HCl、 0.12MNaCl、 pH7.5)。
利用抗体检测蛋白(所有步骤都在室温下进行)
将印迹在第一抗体(抗eNOS或抗bNOS小鼠单克隆抗体，用TBS + 0.1% Tween 20 + 5%脱脂奶粉稀释1:2000， BD/Transduction Labs)中孵 育1小时15分钟。然后将印迹按如下洗涤在TBS+0.1% Tween 20中 10分钟洗涤一次以及5分钟洗涤两次)。然后将印迹在第二抗体中(结合 有过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG， Chemicon Intl.AP308P或Roche 1814168，用TBS + 0.1% Tween 20 + 5%脱脂奶粉稀释1:3000)孵育1小 时。如上述的洗涤加上在TBS (无Tween)中的附加的5分钟洗涤后，将 印迹在ECL试齐U (Amersham Pharmacia RPN2106)中孵育1小时。然后 用莎兰包装膜将印迹盖上，并将印迹暴露于Amersham Pharmacia超细 ECL(RPN1674A)1妾IJ5分钟，就形成了胶片。
内皮NO的释放(NO分析)
将每孔350,000个HAEC放置于6孔板中，每孔包括4ml含有 10。/。FBS的Clonetics生长培养基(EGM)。第二天，往每孔中加入编码野 生型或突变型eNOS (在Gly2和/或Serl177位置)的腺病毒。与病毒孵 育4个小时后，去除培养基并用2ml含有0.1%凝胶和30^M墨蝶呤的 Clonetics生长培养基(EBM)替换。第二天早晨，用2ml新鲜的有或无
100 i!g/ml氧化LDL (Intracel RP-047)的EBM-凝胶-墨蝶呤取代培养基。 6个小时后，去除培养基，用2ml NO分析缓冲液(5 mM Na HEPES、 140 mM NaCl、 5 mM KC1、 1 mM MgCl2、 10 mM葡萄糖、10 mM CaCl2、 5 mM L-精氨酸、pH 7.5)将每个孔洗涤两次。然后用lml含有 100U/ml超氧化物岐化酶和40ng/ml VEGF的NO分析缓冲液替换上述的 缓冲液。用石蜡膜覆盖孔，在37"C孵育30分钟后，将细胞上方的0.8ml 缓冲液注射到西门子NOA280化学发光法测定器中进行NO的测定。完 成NO测定后，去除细胞上的残余缓冲液，在0.3ml裂解缓冲液中裂解 细胞。在-20'C下储存过夜后，用eNOS ELISA分析裂解液(每种5到 20^il)的eNOS蛋白。为了校正在不同的突变体腺病毒之间的表达水平 的差异，将一氧化氮的合成标准化为eNOS蛋白的量。 质粒构建体
pGL3-control: SV40启动子/增强子(Promega)驱动该质粒的萤火虫 萤光素酶基因的表达。质粒骨架为pGL3-基本骨架。
pcDNA3.1/eNOS224: pcDNA3.1的CMV启动子驱动eNOS224基因 的表达并编码eNOS多肽突变体S1177D。
pcDNA3.1/hygro:是pcDNA3.1d (Promega)的对照质粒。
形态学分析
在手术后第28天处死已经进行左股动脉结扎以模拟PAOD的 eNOS-KO小鼠。将其后肢剥皮、固定并在脱钙溶液中放置2天，然后 以系统随机方式将其切块用于治疗疗效的形态学评价。简言之，在髋关 节处将腿脱关节，并按4mm间隔切片。将所有的切片放置在单个盒 中，将其脱水，并包埋，其中每个切片的横向切面为切块的切割面。切 出5微米厚的切片并用苏木精和伊红(H&E)染色，利用C.A.S.T.立体系 统进行形态学评价。
治疗和未治疗腿都表现出相似类型的病理改变。最一致的改变是肌 纤维的丢失以及脂肪细胞取代了肌容积。这个改变在大的肌肉组中始终
存在，并且通常与任何活动性的肌肉退化的证据无关。然而，在一些情 况中，仍存在被在替代的脂肪细胞周围以及退化的肌纤维周围的大量的 急性和慢性的炎性细胞浸润所证实的活动性的肌肉破坏。在显微镜下很 容易区分出正常形态的肌肉区域、脂肪替代组织区域以及炎性细胞浸润 的区域。分别定量这些组织在每个玻片上所占据的面积。在玻片上的所 有其它的区域(例如骨、皮肤、结缔组织等)在分类上都被组织在一起并 标记为"其它"。将这些区域的每一个区域的体积计算为对每条腿的总
体积的百分比。用ANOVA比较两个组的这些立体研究的结果(图21)。
在下面的参数上具有统计学显著差异的改变eNOS治疗肢体的总 的体积要显著地多于空载体治疗肢体，但与未手术(对照)肢体无差异。 空载体治疗组的健康肌肉的体积％也要比eNOS载体组明显的少。相应 地，与eNOS治疗肢体比较，空载体治疗肢体中的替代脂肪的量与之无 差异。空白组的炎症的数目也增加了，但这还没有达到显著差异 (P=0.0525)。
这些改变说明肌纤维在股动脉结扎后马上丢失，且脂肪组织替代了 所丢失的肌纤维。然而在一些区域，甚至脂肪组织都不能得到足够血流 的支持，以致持续地表现为活动的炎性细胞浸润所证实的组织坏死。 eNOS治疗改善了这些病理改变。
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<210〉 <211> <212> <213>
1203
PRT
Homo
sapiens
<■> 1
Met Gly Asn Leu Lys Ser Val Ala Gin Glu Pro Gly Pro Pro 15 10
Cys Gly 15
Leu Gly !Leu Gly Leu Gly !Leu Gly Leu Cys Gly Lys'. Gin Gly Pro Ala 20 25 30
Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Arg Ala Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro 35 40 45
Ala Pro Glu His Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Thr Gin Pro Pro Glu 50 55 60
Gly Pro Lys Phe Pro Arg Val Lys Asn Trp Glu Val Gly Ser lie Thr 65 70 75 80
Tyr Asp Thr Leu Ser Ala Gin Ala Gin Gin Asp Gly Pro Cys Thr Pro 85 90 95
Arg Arg Cys Leu Gly Ser Leu Val Phe Pro Arg Lys Leu Gin Gly Arg 100 105 110
Pro Ser Pro Gly Pro Pro Ala Pro Glu Gin Leu Leu Ser Gin Ala Arg 115 120 125
Asp Phe lie Asn Gin Tyr Tyr Ser Ser lie Lys Arg Ser Gly Ser Gin 130 135 140
Ala His Glu Gin Arg Leu Gin Glu Val Glu Ala Glu Val Ala Ala Thr 145 150 155 160
Gly Thr Tyr Gin Leu Arg Glu Ser Glu Leu Val Phe Gly Ala Lys Gin 165 170 175
Ala Trp Arg Asn Ala Pro Arg Cys Val Gly Arg lie Gin Trp Gly Lys
180
185
190
Leu Gin Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys Arg Ser Ala Gin Glu Met Phe
195
200
205
Thr Tyr lie Cys Asn His lie Lys Tyr Ala Thr Asn Arg Gly Asn Leu
210
215
220
Arg Ser Ala lie Thr Val Phe Pro Gin Arg Cys Pro Gly Arg Gly Asp
225
230
235
240
Phe Arg lie Trp Asn Ser Gin Leu Val Arg Tyr Ala Gly Tyr Arg Gin
245
250
255
Gin Asp Gly Ser Val Arg Gly Asp Pro Ala Asn Val Glu lie Thr Glu
260
265
270
Leu Cys 工le Gin His Gly Trp Thr Pro Gly Asn Gly Arg Phe Asp Val
275
280
285
Leu Pro Leu Leu Leu Gin Ala Pro Asp Glu Pro Pro Glu !Leu Phe Leu
290
295
300
Leu Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val Pro !Leu Glu His Pro Thr Leu
305
310
315
320
Glu Trp Phe Ala Ala Leu Gly Leu Arg Trp Tyr Ala Leu Pro Ala Val
325
330
335
Ser Asn Met Leu Leu Glu lie Gly Gly Leu Glu Phe Pro Ala Ala Pro
340
345
350
Phe Ser Gly Trp Tyr Met Ser Thr Glu lie Gly Thr Arg Asn Leu Cys
355
360
365
Asp Pro His Arg Tyr Asn lie Leu Glu Asp Val Ala Val Cys Met Asp
370
375
380
Leu Asp Thr Arg Thr Thr Ser Ser Leu Trp Lys Asp Lys Ala Ma Val
385
390
395
400
Glu lie Asn Val Ala Val Leu His Ser Tyr Gin Leu Ala Lys Val Thr
405
410
415
lie Val Asp His His Ala Ala Thr Ala Ser Phe Met Lys His Leu Glu
420
425
430
57
Asn Glu Gin Lys Ala Arg Gly Gly Cys Pro Ala Asp Trp Ala Trp工le 435 440 445
Val Pro Pro lie Ser Gly Ser Leu Thr Pro Val Phe His Gin Glu Met 450 455 460
Lys Gly Ser Ala Ala Lys Gly Thr Gly lie Thr Arg Lys Lys Thr Phe 485 490 495
Lys Glu Val Ala Asn Ala Val Lys lie Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr 500 505 510
Val Met Ala Lys Arg Val Lys Ala Thr lie Leu Tyr Gly Ser Glu Thr 515 520 525
Gly Arg Ala Gin Ser Tyr Ala Gin Gin Leu Gly Arg Leu Phe Arg Lys 530 535 540
Ala Phe Asp Pro Arg Val Leu Cys Met Asp Glu Tyr Asp Val Val Ser 545 550 555 560
Leu Glu His Glu Thr Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn 565 570 575
Gly Asp Pro Pro Glu Asn Gly Glu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Met Glu 580 585 590
Met Ser Gly Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gin His Lys Ser 595 600 605
Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Gly 625 630 635 640
Ala Leu Gly Thr Leu Arg Phe Cys Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala 645 650 655
Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Ala Arg Ala Val Asp Thr Arg Leu Glu 660 665 670
Glu Leu Gly Gly Glu Arg Leu Leu Gin Leu Gly Gin Gly Asp Glu Leu 675 680 685
Cys Gly Gin Glu Glu Ala Phe Arg Gly Trp Ala Gin Ala Ala Phe Gin
Val Asn Tyr Phe Leu Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Gin 465. 470 475
lie Arg Phe Asn Ser lie Ser Cys Ser Asp Pro Leu Val Ser 615 620
po
T 4
o
p
s
A
-o
p
y 1
L 6
T
690 695 700
Ala Ala Cys Glu Thr Phe Cys Val Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala 705 710 715 720
Arg Asp lie Phe Ser Pro Lys Arg Ser Trp Lys Arg Gin Arg Tyr Arg
725
730
735
Leu Ser Ala Gin Ala Glu Gly Leu Gin Leu Leu Pro Gly Leu lie His
740 745
750
Val His Arg Arg Lys Met Phe Gin Ala Thr lie Arg Ser Val Glu Asn
755 760
765
Leu Gin Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala Thr lie Leu Val Arg Leu Asp
770 775
780
Thr Gly Gly Gin Glu Gly Leu Gin Tyr Gin Pro Gly Asp His lie Gly
785 790
795
800
Val Cys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Leu Val Glu Ala Leu Leu Ser Arg
805
810
815
Val Glu Asp Pro Pro Ala Pro Thr Glu Pro Val Ala Val Glu Gin Leu
820 825
830
Glu Lys Gly Ser Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Trp Val Axg Asp Pro
835 840
845
Arg Leu Pro Pro Cys Thr Leu Arg Gin Ala Leu Thr Phe Phe Leu Asp
850 855
860
lie Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gin Leu Leu Arg Leu Leu Ser Thr Leu
865 870
875
880
Ala Glu Glu Pro Arg Glu Gin Gin Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gin Asp
885
890
895
Pro Arg Arg Tyr Glu Glu Trp Lys Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu
900 905
910
Glu Val Leu Glu Gin Phe Pro Ser Val Ala Leu Pro Ala Pro Leu Leu
915 920
925
Leu Thr Gin Leu Pro Leu Leu Gin Pro Arg Tyr Tyr Ser Val Ser Ser
930 935
940
Ala Pro Ser Thr His Pro Gly Glu lie His Leu Thr Val Ala Val Leu
955 960
945 950
Ala Tyr Arg Thr Gin Asp Gly Leu Gly Pro Leu His Tyr Gly Val Cys 965 970 975
Ser Thr Trp Leu Ser Gin Leu Lys Pro Gly Asp Pro Val Pro Cys Phe 980 985 990
lie Arg Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro Pro■Asp ProSer Leu Pro
995 1000
1005
Cys lieLeu Val Gly Pro GlyThr Gly lie Ala ProPhe Arg Gly
1010 1015
1020
Phe TrpGin Glu Arg Leu HisAsp lie Glu Ser LysGly Leu Gin
1025 1030
1035
Pro ThrPro Met Thr Leu ValPhe Gly Cys Arg CysSer Gin Leu
1040 1045
1050
Asp HisLeu Tyr Arg Asp Glu Val Gin Asn Ala GinGin Arg Gly
1055 1060
1065
Val PheGly Arg Val Leu ThrAla Phe Ser Arg GluPro Asp Asn
1070 1075
1080
Pro LysThr Tyr Val Gin Asplie Leu Arg Thr GluLeu Ala Ala
1085 1090
1095
Glu ValHis Arg Val Leu CysLeu Glu Arg Gly HisMet Phe Val
1100 1105
1110
Cys Gly Asp Val Thr Met AlaThr Asn Val Leu GinThr Val Gin
1115 1120
1125
Arg lie Leu Ala Thr Glu Gly Asp Met Glu Leu Asp Glu Ala Gly
1130- 1135
1140
Asp Vallie Gly Val Leu Arg Asp Gin Gin Arg TyrHis Glu Asp
1145 1150
1155
lie PheGly Leu Thr Leu ArgThr Gin Glu Val ThrSer Arg lie
1160 1165
1170
Arg Thr Gin Ser Phe Ser Leu Gin Glu Arg Gin Leu Arg Gly Ala
1175 1180
1185
Val Pro Trp Ala Phe Asp ProPro Gly Ser Asp Thr Asn Ser Pro
1190 1195
1200
<210> 2
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Ala Lys Gly Thr Gly lie Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val 15 10 15
Ala Asn Ala Val Lys lie Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Val Met Ala 20 25 30
Lys Arg Val Lys Ala 35
<210> <211> <212> <213>
3
37 PRT
Bos taurus
<400> 3
Ala Thr Lys Gly Ala Gly lie Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val 15 10 15
Ala Asn Ala Val Lys lie Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Leu Met Ala 20 25 30
Lys Arg Val Lys Ala 35
<210> <211> <212> <213>
4
38
PRT
Homo
S3pisns
<400> 4
Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala lie Gly Phe Lys Lys 15 10 15
Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gin Ala Met 20 25 30
Ala Lys Arg Val Lys Ala 35
<210> 5
<211> 38
<212> PRT
<213> Rattus rattus
<400> 5Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala lie Gly Phe Lys Lys 15 10 15
Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gin Ala Met 20 25 30
Ala Lys Arg Val Lys Ala 35
<210〉 6
<211> 37
<212> PRT
<213> Rattus rattus
<400> 6
Asp Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu lie Arg Phe Thr Val Leu 15 10 15
Val Lys Ala Val Phe Phe Ala Ser Val Leu Met Arg Lys Val Met Ala 20 25 30
Ser Arg Val Arg Ala 35
<210〉 7
<211> 37
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Asn Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu lie Arg Phe Arg Val Leu 15 10 15
Val Lys Val Val Phe Phe Ala Ser Met Leu Met Arg Lys Val Met Ala 20 25 30
Ser Arg Val Arg Ala 35
<210> <211> <212> <213>
8
37
PRT
Homo
sspisns
<400> 8
Asp Glu Lys Arg Arg Pro Lys Arg Arg Glu lie Pro Leu Lys Val Leu 15 10 15
Val Lys Ala Val Leu Phe Ala Cys Met Leu Met Arg Lys Thr Met Ala 20 25 30
Ser Arg Val Arg Val 3权利要求
1. 一种编码哺乳动物eNOS多肽变体的多核苷酸在制备一种用于治疗重症肢体缺血(CLI)患者的药物组合物中的用途，其中所述多肽变体包括至少一个在相应于在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。
2. 权利要求1的用途，其中所述的eNOS多肽变体包括在相应 于SEQIDNO: 1的495位氨基酸残基的位置上的一个突变。
3. 权利要求1的用途，其中所述的eNOS多肽变体包括在相应 于SEQIDNO: 1的1177位氨基酸残基的位置上的一个突变。
4. 权利要求1的用途，其中所述的eNOS多肽变体包括在相应 于SEQIDNO: 1的495位氨基酸残基的位置上的第一个突变以及在相应 于SEQIDNO 1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个突变。
5. 权利要求1的用途，其中所述的eNOS多肽变体包括在相应 于SEQIDNO: 1的495位氨基酸残基的位置上的第一个突变、在相应于 SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个突变、以及在相 应于SEQ ID NO: 1的2位氨基酸残基的位置上的第三个突变。
6. 权利要求2、 4和5中任一项的用途，其中在相应于495位氨 基酸残基的位置上的所述的突变是氨基酸取代成为Ala、 Val、 Leu、或 Ile。
7. 权利要求3、 4和5中任一项的用途，其中在相应于1177位 氨基酸残基的位置上的所述的突变是氨基酸取代成为Asp。
8. 权利要求5的用途，其中在相应于2位氨基酸残基的位置上 的所述的突变是氨基酸取代成为Ala。
9. 权利要求1的用途，其中与野生型eNOS多肽比较，所述的 eNOS多肽变体的磷酸化是增强的或减弱的。
10. 权利要求1的用途，其中与野生型eNOS多肽比较，所述的 eNOS多肽变体具有增强的与钩调蛋白的结合亲和力。
11. 权利要求1的用途，其中与野生型eNOS多肽比较，在Ca++-钙调蛋白介导的对所述的eNOS多肽变体的刺激中，(^++依赖性被减 弱。
12. 权利要求1的用途，其中与野生型eNOS多肽比较，所述的 eNOS多肽变体具有增强的eNOS活性。
13. 权利要求12的用途，其中所述的活性是产生NO。
14. 权利要求12的用途，其中所述的活性是还原酶活性。
15. 权利要求9-14中任一项的用途，其中所述的野生型多肽的氨 基酸序列是人eNOS的氨基酸序列或来源于人eNOS的氨基酸序列。
16. 权利要求15的用途，其中所述的野生型多肽的氨基酸序列是 SEQ ID NO: 1或来源于SEQ ID NO: 1 。
17. 权利要求1的用途，其中所述的eNOS多肽变体的氨基酸序 列与SEQ ID NO: 1的氨基酸序列具有95-99%的序列相同性。
18. 权利要求1的用途，其中所述的多核苷酸是一种重组载体， 其包括编码所述的多肽变体的核酸序列并且所述的序列被可操纵地连接 于至少一种调节序列，使得在细胞内表达所述的多肽变体。
19. 权利要求18的用途，其中所述的核酸序列被可操纵地连接于 一启动子。
20. 权利要求19的用途，其中所述的重组载体是一种病毒载体。
21. 权利要求20的用途，其中所述的病毒载体是一种腺病毒载体。
22. 权利要求1的用途，其中所述的治疗包括调控所述患者的细 胞内的eNOS活性。
23. 权利要求22的用途，其中所述的细胞是内皮细胞。
24. 权利要求22的用途，其中所述的细胞是骨髓来源的细胞。
25. 权利要求1的用途，其中在施用所述的药物组合物之前、之中或之后给所述的患者施用一种或多种血管生成因子。
26. 权利要求1的用途，其中所述药物组合物还包括一种或多种 血管生成因子。
27. 权利要求25或26的用途，其中所述的血管生成因子选自由 HGF、 VEGF、 FGF、内皮细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生 的生长因子、TGF-a、 TGF-P、 PDGF、 TNA-a或IGF、 Del-l所组成的 血管生成因子的组。
28. 权利要求1的用途，其中所述药物组合物被回体引入到所述 患者的细胞内。
29. 权利要求1的用途，其中所述药物组合物被输送至所述患者 的患病组织内。
30. 权利要求1的用途，其中所述药物组合物被输送至所述患者 的周围血管系统内。
31. 权利要求30的用途，其中通过肌肉内注射或动脉内注射到所 述患者的肢体肌肉内进行所述的输送。
32. —种编码eNOS多肽变体的多核苷酸在制备一种用于治疗有 治疗需求的患者的血管生成的药物组合物中的用途，其中所述的eNOS 多肽变体包括至少一个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细 胞内被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。
33. —种编码eNOS多肽变体的多核苷酸在制备一种用于改善有 治疗需求的患者的微血管功能不全的药物组合物中的用途，其中所述的 eNOS多肽变体包括至少一个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳 动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。
34. —种编码eNOS多肽变体的多核苷酸在制备一种用于治疗皮 肤溃疡的药物组合物中的用途，其中所述的eNOS多肽变体包括至少一 个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基 酸残基的位置上的突变。
35. 权利要求32、 33或34的用途，其中所述的eNOS多肽变体包 括在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上的一个突变，并 且所述的突变是氨基酸取代成为Ala、 Val、 Leu、或Ile。
36. 权利要求32、 33或34的用途，其中所述的eNOS多肽变体包 括在相应于SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的位置上的一个突变， 并且所述的突变是氨基酸取代成为Asp。
37. 权利要求1、 32、 33或34的用途，其中所述的eNOS多肽变 体包括i) 在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上的第一个突 变，并且所述第一个突变是氨基酸取代成为Ala、 Val、 Leu、或lie;以 及ii) 在相应于SEQ ID NO: 1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个 突变，并且所述的第二个突变是氨基酸取代成为Asp。
38. 权利要求1、 32、 33或34的用途，其中所述的eNOS多肽变 体包括i) 在相应于SEQ ID NO: 1的495位氨基酸残基的位置上的第一个突 变，并且所述第一个突变是氨基酸取代成为Ala、 Val、 Leu、或Ile;ii) 在相应于SEQIDNO: 1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个 突变，并且所述的第二个突变是氨基酸取代成为Asp;以及iii) 在相应于SEQ IDNa 1的2位氨基酸残基的位置上的第三个突 变，并且所述的第三个突变是氨基酸取代成为Ala。
全文摘要
本发明提供了利用调控细胞内eNOS活性的eNOS多肽和多核苷酸来预防、诊断、以及治疗重症肢体缺血(CLI)的新方法。在本发明的方法中所使用的是野生型和突变型eNOS多肽、以及编码这些多肽的多核苷酸。本发明的eNOS突变型多肽至少有一个相应于哺乳动物eNOS的功能结构域的一个在细胞内被磷酸化的位点上的突变。
文档编号A61P9/08GK101391105SQ200810125959
公开日2009年3月25日 申请日期2003年8月15日 优先权日2002年8月16日
发明者加博尔·鲁巴尼, 卡塔林·考泽, 威廉·P.·多尔, 钱虎声 申请人:舍林股份公司