专利名称：抗肿瘤蛋白p53单克隆抗体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤蛋白P53的单克隆抗体及其在检测P53蛋白中的应用。
背景技术：
P53基因是一种抑癌基因，是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，分为野生型和突变型两种，其蛋白产物为定位于人类染色体17pl3. 1，由393个氨基酸组成的核内磷酸 化蛋白，其分子量为53kD，因此被称为p53蛋白(Tumor protein p53)。P53蛋白分为野生型和突变型，野生型P53蛋白极不稳定，半衰期仅数分钟，并具有反式激活功能和广谱的肿瘤抑制作用；突变型P53蛋白稳定性增加，半衰期延长，可被免疫组化方法检测出来。p53基因的突变、缺失是人类肿瘤的常见事件，与肿瘤的发生、发展关系密切。目前研究认为引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是p53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能；而野生型p53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。一般认为，突变型P53的过表达与肿瘤的转移、复发及不良预后相关。p53蛋白临床意义包括(1)肝癌患者有一定比例的P53蛋白过表达，p53基因突变可能与肝癌的恶性分化程度有关；(2)p53突变还可见于胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等恶性肿瘤。因此目前临床上在进行肿瘤治疗之前，通常通过免疫组织化学(IHC)病理实验确定肿瘤细胞中突变型P53的表达水平，起到辅助诊断的目的。IHC实验的核心为特异性结合P53的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的抗P53蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题为提供一种结合特异性较高的抗P53蛋白的单克隆抗体，及其在制备用于检测P53蛋白的免疫检测工具中的应用。为解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC)，保藏日期为2012年5月16日，保藏编号为 CGMCC No. 6136。本发明还提供了一种特异性结合P53蛋白的单克隆抗体2C4，由上述杂交瘤细胞株产生。本发明所述单克隆抗体的制备方法如下(I)重组表达载体的构建根据p53基因的ORF全序列(如SEQID No. I所示)设计弓I物进行PCR扩增，基因两侧分别弓丨入限制性内切酶位点SgfI和MluI，并在其C末端引入Myc-DDK标签序列(如SEQ ID No. 2所示),插入表达载体pCMV6_Entry,构建p53重组表达质粒;(2)P53重组蛋白的表达与纯化以该质粒转染HEK293T细胞，裂解离心取上清，DDK亲和层析柱纯化，获得纯化的P53重组蛋白；
(3)单抗的筛选与制备采用上述P53重组蛋白免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗P53特异性抗体的杂交瘤细胞株，命名为2C4，亚型鉴定为IgGl ;制备小鼠腹水，通过亲和层析柱纯化P53单抗2C4。分别通过Western Blot、免疫组化实验、免疫荧光验证该单抗的灵敏度和特异性。上述单克隆抗体的特异性验证OriGene高密度蛋白芯片上包含10400个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。将本发明单克隆抗体2C4与上述芯片杂交并确定阳性信号位点，结果显示本发明单克隆抗体2C4特异性结合P53蛋白，与其他蛋白无交叉反应。 本发明还提供了单克隆抗体2C4在制备用于检测P53蛋白的免疫检测工具中的应用。具体地，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试纸。在具体的实施例中，本发明提供了一种免疫组化检测试剂盒，包括上述单克隆抗体2C4 ;可检测组织细胞中突变型p53的表达状况。本发明还提供了上述单克隆抗体在制备用于诊断p53相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。由于突变型P53的表达增高与肿瘤的发生、发展关系密切，因此使用本发明单克隆抗体检测突变型P53的水平高低，可用于辅助诊断p53相关性肿瘤。所述p53相关性肿瘤为胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤等恶性肿瘤。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为抗人TP53单克隆抗体杂交瘤细胞株2C4 ；保藏单位全称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位简称CGMCC ；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期2012年5月16日；保藏编号CGMCCNo. 6136。
图I为Western blot验证p53重组质粒在HEK293T细胞中的表达；左边泳道的上样样品为转染PCMV6空载体的HEK293T细胞裂解液，右边泳道的上样样品为转染重组质粒pCMV6-p53的HEK293T细胞裂解液，杂交所用一抗为DDK标签抗体；图2为p53重组蛋白的SDS-PAGE鉴定图；图3为单克隆抗体2C4在9种不同细胞系中的Western blot结果；图4为免疫组化检测肺癌组织中突变型P53蛋白的表达(以2C4单抗为一抗)。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例I抗p53单克隆抗体的制备一、p53重组表达质粒的构建以从ATCC获得的质粒BC003596 (含SEQ ID No. I所示p530RF序列)为模板，设计两条引物并分别引入酶切位点SgfI、MluI，以及C末端Myc-DDK标签(标签序列如SEQ IDNo. 2所示),并克隆入表达载体pCMV6-Entry,构建p53重组表达质粒。二、p53重组蛋白的表达与纯化I、转染 HEK293T 细胞 HEK293T细胞以1:3传至直径IOcm的细胞培养皿中继续培养；取7. 5ml DMEM (无血清及抗生素)培养基至50ml管中，加入300 μ IPEI MegaTranl. O混匀，然后加入75 μ g上述p53重组质粒DNA混匀并静置30分钟；分别取515 μ I上述混合液至上述各细胞培养皿中，于37°C、5%C02培养箱中继续培养。转染24小时后，每培养皿细胞添加25 μ I 2Μ 丁酸钠至终浓度5mM。2、裂解细胞转染48小时后，进行细胞裂解。吸去培养基，加入Iml PBS进行漂洗，吸去PBS。加入Iml裂解缓冲液，使用前加入蛋白酶抑制剂PI和PMSF。置于冰盒中在摇床上振荡，收集所有培养皿中得裂解液，4 °C离心，收集上清。3、DDK亲和层析柱纯化以孔径为O. 45 μ m,直径为33mm的PVDF膜滤器过滤离心后的裂解液上清并转入15ml管中，加入混合好的Sepharose Beads 1ml,封口后放入360度混勻器中，于4°C结合2小时；取出15ml管，将裂解液倒入BIO-RAD层析柱中，并接住穿透液，滴尽后穿透液取样WB检测，见图I (图I显示p53重组质粒在HEK293T细胞中正常表达)；以裂解缓冲液冲洗柱料1-2次，滴尽后再用TBST冲洗Beads 3次，滴尽后用O. IM Glycine (pH3. 5)洗脱，第一次200 μ 1，滴尽不收集，第二、三次各500 μ 1，第四次250 μ 1，收集至一个1.5mlTube中，并迅速加入NaH2PO4 CpH=Il. O)中和至pH7. O左右，每管加入甘油至终浓度为10%，Tween-80至终浓度为O. 1%。纯化后的p53重组蛋白用SDS-PAGE鉴定，结果见图2。三、单抗的筛选与制备I、动物免疫上述纯化的p53重组蛋白以完全弗氏佐剂乳化，采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50 μ g/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50 μ g/只。免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。2、细胞融合骨髓瘤细胞采用BALB/c小鼠来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取上述免疫的小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；免疫小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5-1:10混合，滴加370C的50%PEG (PH 8. O) 1ml，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，MC定容到50ml，分装到3. 5cm培养皿中，放于湿盒中，置于37°C、5% CO2恒温培养箱中进行培养。
3、筛选和克隆融合7-10天内挑选细胞克隆，使用上述纯化的p53重组蛋白进行ELISA测试，标记细胞株号。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取0D280阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性；挑取阳性值高的单克隆定株，其对应融合板细胞株为2C4。4、腹水单抗的制备与纯化10-12周龄的雄性BALB/c小鼠腹腔注射O. 5ml降植烷，一周后每只小鼠用Iml注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为
5X IO6/只，每株抗体打2只小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，亲和层析法进行腹水纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗2C4亚型为IgG I,采用proteinG进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在_20°C。以单抗 2C4 为一抗，对 H印G2、HeLa、SVT2、A549、C0S7、Jurkat、MDCK、PC 12、MCF7九种细胞系的蛋白裂解液进行杂交、显色，其结果如图3所示，由图3可见p53蛋白在细胞系H印G2、HeLa, C0S7中有不同程度的表达。 实施例2以单抗2C4为一抗对肺癌组织进行免疫组化检测I、取肺癌组织进行石蜡包埋，使用Finesse组织切片机进行切片，组织厚度为
6μ m ；2、脱錯与水化分析纯二甲苯3次X IOmin,无水乙醇3次X IOmin, 95 %乙醇5min，85%乙醇5min，75%乙醇5min，去离子水浸泡3minX 3次；3、加入抗原修复液(O. 01M, pH6. O枸橼酸钠缓冲液)高压锅高压热修复2min，待高压锅温度降至约90°C时，打开高压锅，取出标本，然后自然冷却至室温。去离子水浸泡3minX 3 次。4、使用3%过氧化氢灭活组织内源性过氧化物酶,室温静置lOmin。去离子水浸泡5minX 3 次。5、加上封闭液(PBS+5%脱脂奶粉+5%正常山羊血清)，37°C孵育60min。6、去除封闭液，勿冲洗，加入1:150比例稀释的本发明单抗2C4 ;置于湿盒中，37°C孵育 60min。PBST (含 O. l%Tween_20)洗涤 2 次，每次洗涤 5min。PBST (含 O. 02%Tween_20)洗漆I次，每次洗漆5min。7、滴加 Polink-试剂盒 2 (Catlog No. D37-15)中的试剂 1，37°C孵育 10-20 分钟。使用PBS洗涤3次，每次5min。滴加Pol ink-2试剂盒(Catlog No. D37-15)中的试剂2，37°C孵育10-20分钟，使用PBS洗涤3次，每次5min。8、应用DAB溶液(中杉金桥ZLI-9019)显色，显色3 lOmin。蒸馏水洗涤。9、苏木精复染细胞核2min，蒸馏水漂洗，1%盐酸分化。蒸馏水漂洗3次，室温静置lmin。10、脱水和透明75%乙醇5min, 100%乙醇5minX3次，85%乙醇乙醇5min, 100%乙醇3X 5min ;二甲苯3X 5min,中性树胶封片。11、镜检，见图4。由图4可见肺癌组织可见大量棕黄色颗粒，为p53蛋白表达阳性细胞。实施例3、单克隆抗体2C4的特异性检测OriGene高密度蛋白芯片上包含10400个HEK293T细胞蛋白过表达裂解物，每种蛋白裂解液在芯片上具有两个拷贝的重复。蛋白裂解液被印迹在硝酸纤维素膜上。每一钟蛋白裂解液的定位可以通过Excel文件进行准确定位。蛋白芯片上蛋白分为40个亚矩阵,每个亚矩阵上有一些参照，通过参照，可以定量每个芯片点上蛋白的含量，监控每次免疫反应数据的重复性，以及定位阳性信号的方向。以下为使用OriGene蛋白(OriGene Cat PA100001)芯片对2C4单克隆抗体进行特异性鉴定的具体步骤I、将一张蛋白芯片放在50ml离心管中，使用40ml去离子水浸润芯片，置于摇床上，室温混合30分钟；弃掉去离子水，使用IOmlPBST平衡芯片，室温处理10分钟。2、向50ml离心管中加入40ml 5%脱脂牛奶(用PBST进行稀释)置于摇床上，室温封闭30分钟。3、使用封闭液(5%脱脂牛奶)稀释一抗2C4 (稀释比例I :200)。
4、将洁净的封口膜粘贴到实验台上，滴加250-300 μ I上述稀释一抗在封口膜上。5、将蛋白芯片从封闭液中抽出，将蛋白芯片NC 旲的一面朝下，从芯片的一边接触抗体，慢慢滑下，依靠液体表面张力，抗体将慢慢浸润芯片NC膜，直至整张NC膜浸润在一抗溶液中。整个操作过程避免产生气泡。将芯片移到4度环境下，静置，一抗孵育过夜。在芯片上加盖培养皿盖，其上黏附一张湿纸巾，以防止长时间孵育导致抗体蒸发。6、第二天将芯片移至50ml离心管中，使用PBST漂洗芯片两次，去除多余的抗体。使用40ml PBSTC O. l%Tween_20)洗涤芯片，置于摇床上混合均匀，洗涤三次，每次洗涤5min。7、使用封闭液(5% 脱脂牛奶)稀释二抗 DyLight649_conjugated AffiniPureFragment Goat-anti-Mouse IgG,稀释比例为 I :400。8、按照上述步骤4，步骤5进行二抗孵育操作。室温孵育I小时。在芯片上方用铝箔纸遮盖，以防止发生信号漂白。9、按照上述步骤6，使用PBST洗涤芯片。10、使用去离子水冲洗芯片，以去除残余的盐分和变性剂。11、室温干燥芯片，确保芯片完全干燥。12、使用芯片扫描仪读取突光信号。13、根据B SA-Cy3以及BSA_Cy5确定芯片方向以及阳性信号的位点。14、根据阳性信号位点找出对应蛋白裂解液ID，根据裂解液数据库信息，查找到对应蛋白名称，NCBI录入号(accession number),蛋白ID,蛋白大小等信息。以单纯封闭液替代单克隆抗体2C4作为空白对照组，芯片杂交结果显示实验组芯片上出现两个阳性信号点，对应蛋白分别为TP53和UNC5A ;空白对照组的芯片上出现了一个阳性信号位点，对应蛋白为UNC5A，因此，UNC5A为假阳性信号位点；结论本发明单克隆抗体2C4仅特异性结合TP53蛋白，而与其他蛋白无交叉反应。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种特异性结合P53蛋白的单克隆抗体2C4，由保藏编号为CGMCC No. 6136的杂交瘤细胞株产生。
2.一种杂交瘤细胞株，其保藏编号为CGMCC No. 6136。
3.如权利要求I所述的单克隆抗体在制备用于检测P53蛋白的免疫检测工具中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫检测工具为试剂盒、芯片或试 纸。
5.一种免疫组化检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求I所述的单克隆抗体。
6.如权利要求I所述的单克隆抗体在制备用于诊断p53相关性肿瘤的病理诊断试剂盒中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述p53相关性肿瘤为胃癌、肝癌、大肠癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴造血系统肿瘤、胶质细胞瘤、软组织肉瘤。
全文摘要
本发明公开了一种杂交瘤细胞株(保藏编号为CGMCC No.6136)，以及由此杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体2C4。本发明还涉及单克隆抗体2C4在制备用于检测p53蛋白的免疫检测工具中的应用，含单克隆抗体2C4的免疫组化试剂盒，以及单克隆抗体2C4在制备用于诊断p53相关性肿瘤的试剂盒中的应用。本发明所述单克隆抗体可与p53蛋白特异性结合，而与细胞内其他蛋白无交叉反应，显著提高了p53蛋白免疫检测的特异性和可靠性。
文档编号C12R1/91GK102827278SQ201210274649
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者何为无, 马东辉, 袁克湖, 陈坚, 王超, 陈思, 袁丽, 龚世妍, 周春 申请人:无锡傲锐东源生物科技有限公司