专利名称：条件表达猪IκBα基因野生型和突变型的DNA片段的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物基因工程领域，特别涉及一种条件表达猪I K Bd基因野生型和突变型的DNA片段。
背景技术：
一、I κ B α对NF κ B信号通路调控及其在延缓性排斥反应中功能的研究进展NF κ B信号通路通常情况下，NF κ B是以同源或异源二聚体形式与I κ Ba蛋白形成复合物，以非活性形式存在于细胞质中。当受到外界因素刺激时，ΙκΒα第32，36位丝氨酸残基被IkB蛋白激酶(IKK)磷酸化，磷酸化的ΙκΒα进一步被蛋白酶降解，使NF κ B 活化，从NF κ B-I κ B α复合物中解离出并转位于细胞核，与相应的靶基因结合。NFKB信号通路在机体生长发育过程中具有重要功能，所以不宜在机体生长发育早期就将其阻断。I κ B α对延缓性排斥反应中NF κ B信号通路的调控将I κ B α第32、36位丝氨酸突变成丙氨酸，使I κ B α不能被IKK磷酸化、降解，从而抑制NF κ B的活化。二、猪异种移植延缓性排斥反应的机理在异种移植后几天至几周内移植物丧失活性的过程称为延缓性排斥反应(DXR)。II型内皮细胞激活是以内皮细胞出现新功能为特征，与DXR的发生相关，主要造成两个生理学效应促炎症反应和促凝血环境的形成，这两种效应都被认为是由NFk B介导的转录激活造成的。因此，目前认为通过对供者器官内皮细胞NF-κ B的抑制，从而抑制内皮细胞的活化，是较好的抑制D)(R的途径。考虑到I κ Ba在胚胎、幼年及成年各个时期均具有重要作用，很有必要采用条件性表达技术
发明内容
本发明的目的是提供一种条件表达猪ΙκΒα基因野生型和突变型的DNA片段。本发明提供的表达盒，为双链DNA，自上游至下游依次包括如下元件启动子、 Loxp序列、ΙκΒα蛋白的编码基因、终止序列甲、筛选基因、所述Loxp序列、ml κ B α蛋白的编码基因和终止序列乙；所述I κ B α蛋白如序列表的序列14所示；所述ml κ B α蛋白如序列表的序列15所示。所述I K Ba蛋白的编码基因(猪I K Ba基因野生型)可如序列表的序列1自5’ 末端第741至1817位核苷酸所示(开放阅读框为自5’末端第851至1795位核苷酸)。所述ml κ Ba蛋白的编码基因(猪I κ Ba基因突变型)可如序列表的序列1自5’ 末端第5125至6201位核苷酸所示(开放阅读框为自5，末端第5235至6179位核苷酸)。。所述Loxp序列具体可如序列表的序列1自5’末端第700至733位核苷酸(与序列表的序列1自5’末端第5084至5117位核苷酸相同)所示。所述终止序列甲和所述终止序列乙具体可为序列表的序列1自5’末端第1840至 2067位核苷酸(与序列表的序列1自5’末端第62 至6451位核苷酸相同)所示的pA终止序列。所述启动子具体可为序列表的序列1自5’末端第33至693位核苷酸所示的CMV
启动子。所述筛选基因具体可为序列表的序列1自5’末端第2088至5071位核苷酸所示的TKneo片段的编码基因。所述表达盒具体可为如下(a)或(b)(a)序列表的序列1自5，末端第33至6451位核苷酸所示的DNA ；(b)序列表的序列1所示的DNA。所述I κ B α基因或所述ml κ B α基因末端均可添加各种标签(如His、H0、c-myc
寸J ο含有以上任一所述表达盒的重组表达载体也属于本发明的保护范围。所述重组表达载体的骨架载体可为用于动物的克隆载体或表达载体。所述重组表达载体具体可为如下(C)或(d)(c)在重组质粒pUC19-2的Not I和Cla I酶切位点之间插入所述表达盒得到的重组质粒；所述重组质粒PUC19-2是将酶切识别序列乙插入重组质粒pUC19-l的EcoRI和 BamH I酶切位点之间得到的重组质粒；所述重组质粒pUC19_l是将酶切识别序列甲插入 PUC19载体的BamH I和HindIII酶切位点之间得到的重组质粒；所述酶切识别序列甲为将序列表的序列7所示的单链DNA和序列表的序列9所示的单链DNA经过变性和退火得到的双链DNA ；所述酶切识别序列乙为将序列表的序列10所示的单链DNA和序列表的序列12所示的单链DNA经过变性和退火得到的双链DNA ；(d)在pUC19载体的多克隆位点插入所述表达盒得到的重组质粒。含有所述重组表达载体的转基因细胞系也属于本发明的保护范围。所述转基因细胞系的宿主细胞具体可为细胞系PIEC(猪血管内皮细胞)。所述重组表达载体或所述转基因细胞系可用于表达所述I κ Ba蛋白的编码基因或所述ml κ Ba蛋白的编码基因。本发明还保护一种所述I κ Ba蛋白的编码基因或所述ml κ B α蛋白的编码基因的条件表达系统，包括如下(e)或(f)(e)所述重组表达载体和辅助质粒；(f)所述转基因细胞系和所述辅助质粒；所述辅助质粒为可以表达Cre重组酶的质粒；所述Cre重组酶为如下(g)或(h)(g)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(h)将序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列13衍生的蛋白质。所述转基因细胞系的宿主细胞具体可为离体的哺乳动物细胞系，优选为细胞系 PIEC(猪血管内皮细胞)。所述辅助质粒优选为质粒P0G231。本发明提供的表达盒可实现猪I κ Ba基因的野生型及突变型的可控表达，在前期表达野生型，在有特定需要的时候添加可以表达Cre重组酶的辅助质粒，利用表达盒中的两个同向LoxP位点删除野生型，使突变型得到表达。
图1为I κ Ba野生型及突变型真核表达载体构建过程中的质粒结构示意图；A pcDNA3. 1 (+)载体；B 重组质粒 pcDNA3. I-Loxp ；C 重组质粒 pcDNA3. l-Loxp-ml κ Ba ；D 重组质粒 pcDNA3. I-Loxp-I κ B a。图2为实施例1的RT-PCR产物进行Hinf I酶切后的电泳图；1为转染 cDNA3. I-Loxp-I κ Ba的细胞；2为转染pcDNA3. l-Loxp-ml κ Ba的细胞；3为阴性对照；4 为空白对照。图3为Loxp-ml κ B a -pA酶切位点添加过程示意图。图4为CMV-Loxp-I κ B a -pA酶切位点添加过程示意图。图5为Cre/Loxp系统三片段顺序拼接过程中的质粒结构示意图。图6为重组质粒pUC19-6的Not I和EcoR I酶切鉴定电泳图；M Ikbp DNA marker ；1 重组质粒pUC19_6 ；2 重组质粒pUC19_6的Not I和EcoR I酶切产物。图7为实施例2的RT-PCR产物的电泳图；1 细胞系PIEC ;2 转染重组质粒 PUC19-6的细胞；3 共转染重组质粒pUC19-6和质粒p0G231的细胞。图8为内参GAPDH的RT-PCR产物的电泳图；1 细胞系PIEC ;2 转染重组质粒 PUC19-6的细胞；3 共转染重组质粒pUC19-6和质粒p0G231的细胞。图9为实施例2的RT-PCR产物的Hinf I酶切鉴定电泳图；1 细胞系PIEC ；2 转染重组质粒PUC19-6的细胞；3 共转染重组质粒pUC19-6和质粒p0G231的细胞。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。细胞系PIEC(猪血管内皮细胞)购自中国科学院上海细胞库，产品目录号 GN015。pFPC-Ι载体(英国曼彻斯特大学Christopher Μ. Ward惠赠)，其全序列如序列表的序列2所示。pcDNA3. 1 (+)载体购自Invitrogen公司，产品目录号V790_20。猪肾细胞H(15 购自美国ATCC公司，产品目录号CCL-33。pUC19载体购自美国^ffiB公司，产品目录号:N3041。实施例1、pUC19-6载体的构建一、I κ B α野生型及突变型真核表达载体的构建ΚΙκΒα野生型及突变型真核表达载体构建(I)I κ Ba野生型真核表达载体构建①合成序列表的序列1自5，末端第695至735位核苷酸所示的单链DNA ；合成序列表的序列1自5，末端第699至739位核苷酸所示的单链DNA的反向互补单链DNA ；将两条单链DNA经过变性和退火，得到含有粘性末端的双链DNA (Loxp序列)。②用限制性内切酶Nhe I和BamH I双酶切pcDNA3. 1⑴载体(结构示意图见图 1A)，回收载体骨架(约5400bp)。
③将步骤①的双链DNA和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒 pcDNA3. I-Loxp (结构示意图见图1B)。④合成序列表的序列1自5’末端第741至1817位核苷酸所示的I κ Ba基因(双链DNA)，且在两端分别引入BamH I和Riie I酶切识别序列；用限制性内切酶BamH I和Riie I双酶切两端带有酶切识别序列的I κ B α基因，回收酶切产物。⑤用限制性内切酶BamH I和Riie I双酶切重组质粒pcDNA3. I-Loxp,回收载体骨架(约 5430bp)。⑥将步骤④的酶切产物和步骤⑤的载体骨架连接，得到重组质粒 pcDNA3. I-Loxp-I κ B α (结构示意图见图1D)，即为I κ B α野生型真核表达载体。⑦合成序列表的序列1自5’末端第5125至6201位核苷酸所示的ml κ B α基因 (艮ρ I κ B α基因的突变基因；双链DNA)，且在两端分别引入BamH I和Riie I酶切识别序列；用限制性内切酶BamH I和Riie I双酶切两端带有酶切识别序列的ml κ B α基因，回收酶切产物。⑧将步骤⑦的酶切产物和步骤⑤的载体骨架连接，得到重组质粒 pcDNA3. 1-Loxp-mI κ B α (结构示意图见图1C)，即为I κ B α突变型真核表达载体。2、I κ B α野生型及突变型真核表达实验经去内毒素处理后重组质粒pcDNA3. I-Loxp-I κβα和重组质粒 pcDNA3. Ι-Loxp-mI κβα分别转染猪肾细胞Η(15 ；猪肾细胞Η(15作为空白对照，转染重组质粒pcDNA3. I-Loxp的猪肾细胞Η(15作为阴性对照；转染48小时后提取细胞总RNA， RT-PCR检测基因表达情况。RT-PCR检测所用的引物对如下上游引物5，-AACAGTCCGAGGCCATCG-3，；下游引物5，-TCTTTTAGACACTTTCCAAAGC-3，。转染重组质粒pcDNA3. I-Loxp-I κ B α 和重组质粒 pcDNA3. l-Loxp-ml κ B α 的细胞的RT-PCR扩增产物均为1077bp。用限制性内切酶Hinf I酶切各个RT-PCR扩增产物后进行后电泳。结果见图2。转染pcDNA3. 1-Loxp-mI κ B α的细胞电泳显示334bp的条带，初步说明ml κ B α基因的cDNA 得到了表达，真核表达载体pcDNA3. 1-Loxp-mI κβα是有效的，同时也间接说明真核表达载体pcDNA3. I-Loxp-I κβα也是有效的。二、含有突变型和野生型I κ B α cDNA序列的Cre/Loxp系统构建(即pUC19_6载体的组装)构建过程中酶切位点引入和外源片段插入的示意图见图3和图4。构建过程中的各个重组质粒的结构示意图见图5。1、CMV-Loxp-I κ B α -pA、Loxp-ml κ B α -pA 酶切位点的添力口(1)分别合成序列表的序列3所示的单链DNA和序列表的序列4所示的单链DNA ； 将两条单链DNA经过变性和退火，得到含有粘性末端的双链DNA (酶切识别序列)。序列3 :5’ -AGCTGCGGCCGCACGCGTCTTAGAGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG-3’ ；序列4:5’ -AATTCCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCTCTAAGACGCGTGCGGCCGC-3，。(2)用限制性内切酶HindIII和EcoR I双酶切pUC19载体，回收载体骨架(约2680bp)。(3)将步骤(1)的双链DNA和步骤⑵的载体骨架连接，得到重组质粒 PUC19-NTEC。(4)用限制性内切酶Sph I和Mlu I双酶切重组质粒pUC19_NTEC，回收载体骨架 (约 2680bp)。(5)用限制性内切酶Sph I和Mlu I双酶切重组质粒pcDNA3. I-Loxp-I κ B α，回收 CMV-Loxp-I κ B α -ρΑ 片段(约 2IOObp)。(6)将步骤(4)的载体骨架和步骤(5)的CMV-Loxp-I κ B α -ρΑ片段连接，得到重组质粒 pUC19-CMV-Loxp_I κ Ba -ρΑ。(7)分别合成序列表的序列5所示的单链DNA和序列表的序列6所示的单链DNA ； 将两条单链DNA经过变性和退火，得到含有粘性末端的双链DNA (酶切识别序列)。序列5 :5’ -AGCTTGCTAGCCTTAGAGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGTATCGATG-3’ ；序列6:5’ -AATTCATCGATACCATAGAGCCCACCGCATCCCCAGCATGCTCTAAGGCTAGCA-3，。(8)将步骤(7)的双链DNA和步骤⑵的载体骨架连接，得到重组质粒 PUC19-NHCL1。(9)用限制性内切酶Sph I和Nhe I双酶切重组质粒pUC19_NHCLl，回收载体骨架 (约 2680bp)。(10)用限制性内切酶Sph I和Nhe I双酶切重组质粒pcDNA3. l-Loxp-ml κ B a， 回收 Loxp-ml κ B α -ρΑ 片段(约 1350bp)。(11)将步骤(9)的载体骨架和步骤(10)的Loxp-ml κ B α -ρΑ片段连接，得到重组质粒 pUC19-Loxp-mI κ B α -ρΑ。2、Cre/Loxp系统三片段顺序拼接(1)将pUC19载体多克隆位点进行改造，得到重组质粒PUC19-1。①分别合成序列表的序列7所示的单链DNA和序列表的序列8所示的单链DNA ； 将两条单链DNA经过变性和退火，得到含有粘性末端的双链DNA (酶切识别序列)。序列7 5'-GATCC ATCGAT GTCGAC ACGCGT TTTAAA CGGCCG GGCCGGCC ATGCAT-3，；序列8:3，-G TAGCTA CAGCTG TGCGCA MATTT GCCGGC CCGGCCGG TACGTA TCGA-5，。5 ’ 一 3 ’方向的序列8见序列9。序列9 5 ’ -AGCTATGCATGGCCGGCCCGGCCGTTTAAAACGCGTGTCGACATCGATG-3 ’。双链DNA上依次携带如下酶切识别序列(以空格隔开)BamH I-Cla I-Sal I-Mlu I-Dra I-Eag I-Fse I-Nsi I-^x- HindH^o②用限制性内切酶BamH I和HindIII双酶切pUC19载体，回收载体骨架(约 2660bp)。③将步骤①的双链DNA和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒PUC19-1。(2)将重组质粒pUC19-l多克隆位点进行改造，得到重组质粒pUC19_2。①分别合成序列表的序列10所示的单链DNA和序列表的序列11所示的单链DNA ； 将两条单链DNA经过变性和退火，得到含有粘性末端的双链DNA (酶切识别序列)。序列10 :5，-AATT GCGGCCGC GTTTAAAC AAGCTT GAATTC GATATC GCTAGC G-3，；序列11 :3，-CGCCGGCG CAAATTTG TTCGAA CTTAAG CTATAG CGATCG CCTAG-5，。
5’ 一 3’方向的序列11见序列12。序列12 :5，-GATCCGCTAGCGATATCGAATTCAAGCTTGTTTAAACGCGGCCGC-3，。双链DNA上依次携带如下酶切识别序列(以空格隔开)布X-EcoR I I -Not I-Pme I-HindIII-EcoR I-EcoRV-Nhe I-BamH I。②用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切重组质粒pUC19_l，回收载体骨架(约 2700bp)。③将步骤①的双链DNA和步骤②的载体骨架连接，得到重组质粒PUC19-2。(3)用限制性内切酶EcoR I和ka I双酶切pFPC-Ι载体，回收TKneo片段(约 3. Okb)。(4)用限制性内切酶EcoR I和EcoRV双酶切重组质粒pUC19-2，回收载体骨架(约 2700bp)。(5)将步骤(3)的TKneo片段和步骤(4)的载体骨架连接，得到重组质粒 pUC19-4(又称重组质粒 pUC19-TKneo)。(6)用限制性内切酶Nhe I和Cla I双酶切重组质粒pUC19_4，回收载体骨架(约 5700bp)。(7)用限制性内切酶Nhe I和Cla I双酶切重组质粒pUC19_Loxp-mI κ B α -ρΑ,回收 Loxp-ml κ B α -ρΑ 片段(约 1350bp)。(8)将步骤(7)的Loxp-ml κ B α-ρΑ片段和步骤(6)的载体骨架连接，得到重组质粒 pUC19-5 (又称重组质粒 pUC19-TKneo-Loxp-mI κ Ba -ρΑ)。(9)用限制性内切酶Not I和EcoR I双酶切重组质粒pUC19_5，回收载体骨架(约 7088bp)。(10)用限制性内切酶Not I和EcoR I双酶切重组质粒 pUC19-CMV-Loxp-I κ Ba -ρΑ,回收 CMV-Loxp-I κ B α -ρΑ 片段(约 2100bp)。(11)将步骤(9)的载体骨架和步骤(10)的CMV-Loxp-I κ B α -ρΑ片段连接，得到重组质粒 pUC19-6 (又称重组质粒 pUC19-CMV-Loxp_I κ Ba -pA-TKneo-Loxp-ml κ Ba -ρΑ)。重组质粒pUC19_6的酶切鉴定电泳图见图6。将重组质粒pUC19-6进行测序。结果表明重组质粒PUC19-6的骨架载体为pUC19 载体，在骨架载体的BamH I和HindIII酶切位点之间插入了酶切识别序列甲(将序列表的序列7所示的单链DNA和序列表的序列9所示的单链DNA经过变性和退火得到的双链DNA)， 得到了重组质粒PUC19-1 ；在重组质粒pUC19-l的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了酶切识别序列乙(将序列表的序列10所示的单链DNA和序列表的序列12所示的单链DNA 经过变性和退火得到的双链DNA)，得到了重组质粒pUC19-2 ；在重组质粒pUC19_2的Not I 和Cla I酶切位点之间插入了序列表的序列1所示的双链DNA，得到了重组质粒pUC19_6。 用重组质粒PUC19-2构建重组质粒pUC19-6的步骤如下在重组质粒pUC19_2的EcoR I和 EcoRV酶切位点之间插入了序列表的序列1自5，末端第2088至5071位核苷酸所示的TKneo 片段的编码基因，得到了重组质粒PUC19-4;在重组质粒pUC19-4的Nhe I和Cla I酶切位点之间插入了序列表的序列1自5’末端第5084至6451位核苷酸所示的Loxp-ml κ B α -ρΑ 片段，得到了重组质粒PUC19-5 ；在重组质粒pUC19-5的Not I和EcoR I酶切位点之间插入了序列表的序列1第33至2067位核苷酸所示的CMV-Loxp-I κ B α -ρΑ片段。
序列表的序列1所示的双链DNA中，自5’末端第33至693位核苷酸为CMV启动子，第700至733位核苷酸为Loxp序列，第741至1817位核苷酸为I κ B α基因，第1840至 2067位核苷酸为ρΑ终止序列，第2088至5071位核苷酸为TKneo片段的编码基因(正负筛选融合基因)，第5084至5117位核苷酸为Loxp序列，第5125至6201位核苷酸为ml κ B α 基因，第62 至6451位核苷酸为ρΑ终止序列。实施例2、I κ B α基因野生型及突变型条件表达质粒p0G231(表达Cre重组酶)购自美国Addgene公司，产品目录号17736。第一组用经去内毒素处理后的重组质粒PUC19-6转染细胞系PIEC(每一百万个细胞转染1微克质粒)；第二组用经去内毒素处理后重组质粒PUC19-6和质粒p0G231共转染细胞系 PIEC (每一百万个细胞转染1微克重组质粒pUC19-6和1微克质粒p0G231)；第三组(空白对照)细胞系PIEC。转染48小时后提取细胞总RNA，RT-PCR检测基因表达情况。RT-PCR检测所用的引物对如下上游引物5，-AACAGTCCGAGGCCATCG-3，；下游引物5，-TCTTTTAGACACTTTCCAAAGC-3，。上述引物对的靶序列为I κ Ba基因和ml K Ba基因，均为1077bp ;Ι κ B α基因被限制性内切酶Hinf I酶切后产生的酶切片段长度均不超过214bp，ml κ Ba基因被限制性内切酶Hinf I酶切后可以产生334bp的酶切片段。RT-PCR检测内参基因所用的引物对如下上游引物5，-GGTGAAGGTCGGAGTGAACG-3，；下游引物5，-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3，。RT-PCR扩增产物的电泳图见图7。内参基因的电泳图见图8。RT-PCR扩增产物的Hinf I酶切产物的电泳图见图9。结果表明第二组和第三组细胞中I κ Ba野生型表达相对有所提高；共转染PUC19-6与p0G231的PIEC细胞PCR产物Hinf I酶切后电泳显示 33仙？的条带，说明!1111^8(1基因的cDNA得到了条件表达；总之，I κ Ba基因野生型及突变型条件表达系统是有效的。
权利要求
1.一种表达盒，为双链DNA，自上游至下游依次包括如下元件启动子、Loxp序列、 ΙκΒα蛋白的编码基因、终止序列甲、筛选基因、所述Loxp序列、ml κ Ba蛋白的编码基因和终止序列乙；所述I κ Ba蛋白如序列表的序列14所示；所述ml κβα蛋白如序列表的序列15所示。
2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于所述ΙκΒα蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’末端第741至1817位核苷酸所示；所述ml κβα蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’末端第5125至6201位核苷酸所示；所述Loxp序列如序列表的序列1自5’末端第700至733位核苷酸所示；所述终止序列甲和所述终止序列乙为序列表的序列1自5’ 末端第1840至2067位核苷酸所示的ρΑ终止序列。
3.如权利要求1或2所述的表达盒，其特征在于所述启动子为序列表的序列1自5’ 末端第33至693位核苷酸所示的CMV启动子；所述筛选基因为序列表的序列1自5’末端第2088至5071位核苷酸所示的TKneo片段的编码基因。
4.如权利要求3所述的表达盒，其特征在于所述表达盒为如下(a)或(b)(a)序列表的序列1自5’末端第33至6451位核苷酸所示的DNA；(b)序列表的序列1所示的DNA。
5.含有权利要求1至4中任一所述表达盒的重组表达载体。
6.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为如下(c)或(d)(c)在重组质粒pUC19-2的NotI和Cla I酶切位点之间插入所述表达盒得到的重组质粒；所述重组质粒PUC19-2是将酶切识别序列乙插入重组质粒pUC19-l的EcoRI和BamH I酶切位点之间得到的重组质粒；所述重组质粒PUC19-1是将酶切识别序列甲插入pUC19 载体的BamH I和HindIII酶切位点之间得到的重组质粒；所述酶切识别序列甲为将序列表的序列7所示的单链DNA和序列表的序列9所示的单链DNA经过变性和退火得到的双链 DNA ；所述酶切识别序列乙为将序列表的序列10所示的单链DNA和序列表的序列12所示的单链DNA经过变性和退火得到的双链DNA ；(d)在pUC19载体的多克隆位点插入所述表达盒得到的重组质粒。
7.含有权利要求5或6所述重组表达载体的转基因细胞系。
8.权利要求5或6所述重组表达载体或权利要求7所述转基因细胞系在表达所述 I κ Ba蛋白的编码基因或所述ml κ Ba蛋白的编码基因中的应用。
9.一种I κ Ba蛋白的编码基因或ml κ Ba蛋白的编码基因的条件表达系统，包括如下 (e)或(f)(e)权利要求5或6所述重组表达载体和辅助质粒；(f)权利要求7所述转基因细胞系和所述辅助质粒；所述辅助质粒为可以表达Cre重组酶的质粒；所述Cre重组酶为如下(g)或(h)(g)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(h)将序列13的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列13衍生的蛋白质；所述ΙκΒα蛋白如序列表的序列14所示；所述mlKBa蛋白如序列表的序列15所示
10.如权利要求9所述的条件表达系统，其特征在于所述I κ Ba蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’末端第741至1817位核苷酸所示；所述ml κ Ba蛋白的编码基因如序列表的序列1自5’末端第5125至6201位核苷酸所示；所述(f)中，所述转基因细胞系的宿主细胞为离体的哺乳动物细胞系，优选为细胞系PIEC ；所述(e)和所述(f)中，所述辅助质粒为质粒P0G231。
全文摘要
本发明公开了一种条件表达猪IκBα基因野生型和突变型的DNA片段。本发明提供了一种表达盒，为双链DNA，自上游至下游依次包括如下元件启动子、Loxp序列、IκBα基因、终止序列甲、筛选基因、所述Loxp序列、mIκBα基因和终止序列乙；所述IκBα基因如序列表的序列1自5’末端第741至1817位核苷酸所示；所述mIκBα基因如序列表的序列1自5’末端第5125至6201位核苷酸所示。本发明提供的表达盒可实现猪IκBα基因的野生型及突变型的可控表达，在前期表达野生型，在有特定需要的时候添加Cre酶，利用表达盒中的两个同向LoxP位点删除野生型，使突变型得到表达。
文档编号C12N15/12GK102286475SQ20111014648
公开日2011年12月21日 申请日期2011年6月1日 优先权日2011年6月1日
发明者李和刚, 李奎, 杨述林 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所