以野生型或突变型eNOS对重症肢体缺血的基因治疗的制作方法

专利名称：以野生型或突变型eNOS对重症肢体缺血的基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及用调控细胞内eNOS活性的eNOS多肽及多核苷酸来预防、诊断或治疗重症肢体缺血(CLI)的方法。在本发明的方法中所使用的是野生型和突变型eNOS多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。
背景技术：
周围动脉闭塞病(PAOD)在美国人群中的发病率为近12％。早期PAOD(跛行)的特点是活动时的缺血性肌肉痛。因为PAOD进展所引起的重症肢体缺血(CLI)的特点是静息时血流及氧供的减少，造成静息时的肌肉痛以及非愈合性皮肤溃疡或坏疽(Rissanen et al.，Eur.J.Clin.Invest.31651-666(2001)；Dormandy and Rutherford，J.Vasc.Surg.31S1-S296(2000))，估计发生率为至少每年每百万人500-1000人。
对PAOD和跛行患者的治疗包括控制动脉粥样硬化危险因素、运动以及在一些病例中应用Cilastozol或己酮可可碱的药物治疗(Robeer et al.，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.1536-43(1998)。如果症状持续，可以用经皮腔内血管成形术(PTA)治疗跛行、静息痛和/或非愈合性缺血性溃疡。PTA最适合于髂动脉或股浅动脉的短的狭窄或闭塞。1年的畅通率为80-90％。对于更弥漫病变的患者，推荐进行外科血管成形术。主动脉股动脉血管搭桥术或股动脉腘动脉搭桥术的5年畅通率相应为90％和70％(Dormandy and Rutherford，J.Vasc.Surg.31S1-S296(2000))。
然而，尽管在外科和介入血管重建技术上取得了很大的进展，但是20-30％具有缺血性疼痛和溃疡的患者或因弥漫的远端血管病变而不适合作为外科血管重建或血管成形术的候选者或治疗失败，并且目前的药物治疗对进展性CLI患者的肢体挽救只有很小的作用。
这些无大截肢术的患者的1年后生存率小于50％。此外，需要截肢的老年患者往往具有差的一般健康状况以及具有相对高的手术风险和较差的长期预后(Dormandy and Rutherford，J.Vasc.Surg.31S1-S296(2000))。虽然已经报道血管紧张素转化酶抑制剂和它汀类药物在缺血的实验模型中能增加血流，但是目前没有一种药物能促进新的血管形成(Fabre et al.，Circulation 993043-3049(1999)；Kureishi et al.，Nat Med61004-1010(2000))。因此，需要治疗CLI的改进的治疗方法。
治疗缺血性疾病的一个新方法是用刺激血管形成的生长因子靶向增强的血管生长(Rissanen et al.，Eur.J.Clin.Invest.31651-666(2001)；Yla-Herttuala et al.，Lancet 355213-222(2000)；Isner et al.J.Clin.Invest.1031231-1236(1999)；Rutanen et al.，Curr.Cardiol.Report 329-36(2001))。血管生长可以被分为血管发生、血管生成及动脉生成。血管发生指的是从成血管细胞/内皮前体细胞(EPC)胚胎原位形成血管。血管生成指的是由于已分化的内皮细胞(EC)的增生和迁移，从已经存在的毛细血管生成新的血管(Risau et al.，Nature 386671-674(1997))。动脉生成指的是从已经存在的小动脉汇合处原位形成肌性的侧突血管(collateral vessels)(Schaper et al.，Circ Res 79911-919(1996))。然而，内源性的血管形成和动脉形成不足以完全代偿CLI中的血流及氧供的减少。尽管给予生长因子刺激血管形成可能是一种治疗CLI的辅助治疗方法，越来越多的证据表明与年龄相关的内皮功能不全、动脉粥样硬化和其它心血管的危险因素可能限制生长因子对血管生成的增强作用。
内皮型一氧化氮合酶(eNOS，也称为ecNOS或NOS3)已经被认为是血管生成的重要的调节物/介质。一氧化氮(NO)供体(例如硝普盐)能促进内皮细胞的增生及迁移，反之NOS抑制剂抑制了这一过程(Ziche etal.，J.Clin.Invest.92036-2044(1994)；Morbidelli et al.，Am.J.Physiol.270H411-H415(1996))。研究已经显示在eNOS缺陷小鼠(eNOS-KO)中的不正常的血管生成及伤口愈合。利用外植的主动脉，Lee等证实eNOS对于内皮细胞的体外迁移、增生和分化是必需的。通过证实在eNOS-KO小鼠中减少了皮下植入的Matrigel栓内的毛细血管形成的体内实验确认了这个发现。eNOS-KO小鼠的切除伤口的愈合也被明显延迟，这强调了内皮NO在与伤口修复相关的血管生成过程中的作用(Leeet al.，Am.J.Physiol.277H1600-H1608(1999))。在eNOS-KO小鼠中已经证实在手术诱导后肢缺血后的显著的血管生成不良。给手术诱导后肢缺血的兔施用L-精氨酸(NOS的底物)，显著地提高了血管生成，这证实了内皮NO在缺血诱导的血管生成中的作用(Murohara et al.，J.Clin.Invest.1012567-2578(1998))。
如上述的，也有越来越多的证据显示缺血所诱发的血管生成可能随年龄和内皮功能不全而受损。在动物模型中已经观察到血管生成不良，可能是因为内皮NO释放的减少和生长因子表达的减少(Rivard et al.，Circulation 99111-120(1999)；Van Belle et al.，Circulation 962667-2674(1997))。已经表明例如同源半胱氨酸血症和高胆固醇血症的危险因素可能通过减少内皮来源的NO的生物利用度而减弱后肢缺血的小鼠模型的血管生成(Duan et al.，Circulation 102III370-III376(2000))。
综上所述，需要一种CLI的有效治疗方法。因此开发了一种增加缺血肢体的NO生物利用度的治疗CLI的基因治疗方法，它可以通过多种机制纠正缺血，包括例如通过刺激受损的血管生成、改善已经存在的微血管功能不全、恢复已经存在的血管的血管舒缩(血管扩张)活性以及促进已经存在的侧突血管的重塑/成熟(动脉生成)。

发明内容
本发明提供了用eNOS多肽或编码这些多肽的多核苷酸预防、诊断和治疗CLI的方法。用本发明的方法，可以调控细胞内的eNOS活性使得可以改善与eNOS活性相关的疾病或病变。具体地，用本发明的方法通过增加缺血肢体的局部的NO生成可以调控细胞内的eNOS活性，使得可以改善与缺血肢体中NO产生减少所相关的疾病或病变。因此，本发明提供了基因治疗的方法，它通过给需要治疗的患者施用eNOS多肽或它们的突变体或编码这些多肽的多核苷酸，提供给效应组织增高水平的NO。
在一个方面，本发明提供了治疗CLI的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的一种编码哺乳动物eNOS多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供了治疗CLI症状的方法，这些症状例如微血管功能不全、溃疡愈合和血管生成。在一个方面，本发明提供了治疗血管生成的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的一种编码eNOS多肽的多核苷酸，其中eNOS多肽包括至少一个相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的一个位置上的突变。在一个方面，本发明提供了改善微血管功能不全的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的一种编码eNOS多肽的多核苷酸，其中eNOS多肽包括至少一个相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的一个位置上的突变。
在一个相关的方面，本发明提供了在本发明方法中所用的eNOS多肽和编码eNOS多肽的多核苷酸。在本发明的方法中所用的适宜的多核苷酸包括例如编码野生型或突变型eNOS多肽的多核苷酸，或它们的变体。优选地，编码的eNOS多肽是哺乳动物eNOS多肽，以及最优选的是人eNOS多肽。在一个方面，eNOS多肽是SEQ ID NO1编码的人eNOS多肽。
在另一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多肽在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突变；以及在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上具有第二个突变。
在另一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多肽在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突变；在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上具有第二个突变；以及在相应于SEQ ID NO1的2位氨基酸残基的位置上具有第三个突变。
优选地，在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上的突变是氨基酸取代成为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Me、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，以及更优选的是Ala、Val、Leu或Ile，以及最优选的是Ala或Val；相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的突变是氨基酸取代成为Asp；以及在相应于SEQ ID NO1的2位氨基酸残基的位置上的突变是氨基酸取代成为Ala。
在一些方面，与参照多肽比较，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多肽的磷酸化是增强的或减弱的。
在一些方面，与参照eNOS多肽比较，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多肽具有增高的eNOS活性。优选地，与参照eNOS多肽比较，人eNOS多肽具有增高的NO产生、对钙调蛋白的结合亲和力、和/或还原酶活性。最优选地，与参照eNOS多肽比较，人eNOS多肽具有增高的NO产生。
在一些方面，与参照eNOS多肽比较，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多肽具有减低的eNOS活性，例如与参照eNOS多肽比较，降低了在Ca++-钙调蛋白介导的对多肽的刺激中的Ca++依赖性。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸编码与人eNOS多肽的氨基酸基本上同源的eNOS多肽。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸编码与SEQ ID NO1的氨基酸序列具有95-99％序列相同性的eNOS多肽。
在另一方面，适用于本发明的方法的多核苷酸是编码一种编码eNOS多肽的核酸序列的重组载体。在一个方面，核酸序列被可操纵地连接于至少一种调节序列，使得在细胞内表达所编码的eNOS多肽。优选地，至少一种调节序列是启动子，例如CMV启动子。在一个方面，重组载体是一种质粒载体或腺病毒载体。
在一个方面，在本发明的治疗的方法中，治疗是通过调控需要治疗的患者的细胞内的eNOS活性。优选地，细胞是内皮细胞，以及更优选的是人内皮细胞。
在一个方面，本发明的方法进一步包括在给需要治疗的患者施用编码人野生型或突变型eNOS多肽的多核苷酸之前、之中或之后施用一种或多种血管生成因子。本发明的方法所使用的适宜的血管生成因子包括但不限于例如HFG、VEGF、FGF、内皮细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、TGFα、TGFβ、PDGF、TNAα或IGF、Del-1，优选的是FGF。
在一个方面，通过将多核苷酸回体(ex vivo)引入到患者的细胞内来施用适用于本发明的方法的多核苷酸。在另一个方面，通过将多核苷酸引入到患者的患病组织，或引入到患者的周围血管系统内来施用适用于本发明的方法的多核苷酸。在另一个方面，通过经肌肉内或动脉内注射到患者肢体的肌肉内来施用适用于本发明的方法的多核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了治疗重症肢体缺血(CLI)的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的eNOS多肽，其中eNOS多肽包括至少一个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。优选地，适用于本发明的方法的eNOS多肽是人eNOS并且在相应于SEQ ID NO1的495位或1177位氨基酸残基的位置上至少有一个突变。
在一个方面，适用于本发明的方法的eNOS多肽在相应于SEQ IDNO1的495位或1177位氨基酸残基的位置上至少有一个突变。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多肽在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突变；以及在相应于1177位氨基酸残基的位置上具有第二个突变。
在一个方面，适用于本发明的方法的多核苷酸所编码的人eNOS多肽在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上具有第一个突变；在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上具有第二个突变；以及在相应于SEQ ID NO1的2位氨基酸残基的位置上具有第三个突变。
优选地，在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上的突变是氨基酸取代成为Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Me、Ser、Cys、Glu、Asn、Gln、Lys、Arg或His，以及更优选的是Ala、Val、Leu或Ile，以及最优选的是Ala或Val；相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的突变是氨基酸取代成为Asp；以及在相应于SEQ ID NO1的2位氨基酸残基的位置上的突变是氨基酸取代成为Ala。


当与附图一起阅读下面的描述时可以更充分地理解本发明的前述的及其它的目的及其各种特点以及发明本身。
图1是说明哺乳动物eNOS的各种功能结构域的图。功能结构域包括但不限于例如(顺序从N末端到C末端)一个豆蔻酰化(myristoylation)共有位点；两个棕榈酰化(palmitoylation)位点；氧化酶结构域；钙调蛋白结合位点(例如，人eNOS的494-517位氨基酸)，它包括磷酸化共有序列(例如人eNOS的495位Thr)；以及还原酶结构域。人eNOS多肽的功能结构域也包括例如自抑制环和血红素(heme)结合位点。
图2是说明与SEQ ID NO1(WT)编码的野生型人eNOS比较，具有单突变或双突变的eNOS多肽突变体对HEK293细胞合成NO的刺激作用的直方图。具有单突变的eNOS多肽在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Thr-495的位置上具有氨基酸取代成为Asp(T495D)、Ala(T495A)、或Val(T495V)。具有双突变的eNOS多肽突变体在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有第一个氨基酸取代成为Asp，在相应于Thr-495的位置上具有第二个氨基酸取代成为Asp(T495D+S1177D)、Ala(T495A+S1177D)、或Val(T495V+S1177D)。
图3是说明与SEQ ID NO1(野生型)编码的野生型人eNOS比较，具有单突变的eNOS多肽突变体对人主动脉内皮细胞(HAEC)合成NO的刺激作用的直方图。eNOS多肽突变体在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Thr-495的位置上具有氨基酸取代成为Asp(T495D)、Ala(T495A)、或Val(T495V)。
图4是在手术后第0、1、4、7、10、14、21和28天，与含有野生型eNOS小鼠(C57BL/6)比较，缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体灌注的激光多普勒图和图解说明。
图5是说明缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)与含有野生型eNOS小鼠(C57BL/6)比较在手术后第0和4天的肢体的大体病理改变的照片。
图6是说明缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)与含有野生型eNOS小鼠(C57BL/6)比较在手术后第10天的肢体的侧突血管形成的定量测定的直方图。
图7是说明对缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体的不同手术方法的图解(首行)；说明手术后肢体的大体病理改变的照片(中行)；以及说明手术后肢体的灌注的激光多普勒图像(下行)。
图8是说明与含有野生型eNOS小鼠(C57BL/6)比较，不同年龄对在3个月、6个月和12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体在手术后第0、1、3、7、17、21和24天的自发性血流恢复的影响的直方图。
图9是说明不同年龄对在3个月、6个月和11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体在手术后第10天的缺血损伤的影响的照片。
图10是通过测定萤光素酶的表达水平说明不同的肌肉内基因输送方法的转染效率的直方图1)通过单独注射质粒pLuc(pLuc)输送的、通过注射pLuc以及电穿孔(pLuc+EP)输送的以及附加有透明质酸酶预处理(pLuc+EP+Hyal)输送的编码萤光素酶的质粒；比较于2)通过注射编码萤光素酶的腺病毒(Ad5.1Luc)。
图11是说明后肢缺血对编码萤光素酶的质粒载体pLuc的转染效率的影响的直方图。将质粒载体注射到C57BL/6小鼠的内收肌，并通过测定基因表达的水平来确定转染效率术前以及用质粒载体(PT)预处理；与手术同一天(SDT)；以及在手术后第3天和第7天。
图12是说明将eNOS基因输送到缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)后的eNOS表达的Western印迹与ELISA的直方图1)编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)编码野生型eNOS的质粒载体。
图13是说明eNOS基因治疗在手术后第28天对6个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽救的作用的照片，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图14是如缺血的对正常的血流灌注比例所测定的，eNOS基因治疗在手术前(BOP)和手术后第0、1、4、7、10、14、18、21和28天对6个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的作用的图解说明，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图15是如肢体和肌肉容积以及取代脂肪和炎性浸润的量所测定的，eNOS基因治疗在手术后第28天对6个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的作用的图解说明，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1)编码的人eNOS的Ser-1 177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)以及未处理的对侧腿(肢体)。
图16是说明eNOS基因治疗在手术后第28天对6个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的溃疡愈合的影响的照片，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1)编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图17是说明eNOS基因治疗在手术后第10天对11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽救的作用的照片，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1)编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图18是eNOS表达的直方图(首行)、血流的激光多普勒图像(中行)以及肢体坏死的照片(下行)，说明利用编码在相应于SEQ ID NO1)编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)的eNOS基因治疗在手术后第10天对11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽救的作用。pNOS224的基因表达与肢体坏死以及血流改变相关，即与较小的表达(#1201)比较，表达越高(#1205)则血流越快，以及坏死的损伤越小。
图19是eNOS基因治疗在手术后第1、3、7和10天对11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的肢体挽救的作用的图解说明，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1)编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图20是如缺血的对正常的血流灌注比所测定的，eNOS基因治疗在手术后第1、3、7和10天对11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的作用的图解说明，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)，比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)。
图21是说明在手术后第10天11-12个月大的缺乏野生型eNOS小鼠(ecNOS-KO)的内收肌的eNOS表达水平的直方图，利用1)编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代成为Asp(S1177D)的eNOS多肽突变体的质粒载体(pNOS224)；比较于2)不编码野生型eNOS的质粒载体或空载体(pNull)；以及3)对照的未手术ecNOS-KO小鼠。直方图的右侧说明处理动物的单个表达水平。
图22是说明小鼠CLI模型的图示及照片。图示说明手术结扎并去除股动脉及其分支，提供了已发育雄性成年斯普拉-道来小鼠的上大腿区域。照片说明小鼠CLI模型在手术后第1、4、10和17天的大体病理改变。
图23是说明小鼠CLI模型的正常肢体(图像左侧)以及缺血肢体(图像右侧)的CLI小鼠的血管造影的图像。
图24是说明小鼠CLI模型的正常肢体(图像左侧)以及缺血肢体(图像右侧)的动脉形成的血管造影积分的CLI小鼠的血管造影的图像。
图25是CLI小鼠模型在利用编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代的eNOS多肽突变体的腺病毒载体(Ad5NOS1177D)的eNOS基因治疗后的血流恢复的图解说明；比较于编码绿色荧光蛋白的对照腺病毒载体(Ad5EGFP)，在手术前(BO)以及在基因输送后第0、3、7和10天。
图26是说明用根据大体病理分级I-V的坏死积分测定利用编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代的eNOS多肽突变体的腺病毒载体(Ad5NOS1177D)对CLI模型小鼠的基因治疗的作用的图解和照片。
图27是说明用根据大体病理分级I-V的坏死积分测定利用编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代的eNOS多肽突变体的腺病毒载体(Ad5NOS1177D)对CLI模型小鼠的基因治疗的作用的直方图；比较于编码绿色荧光蛋白的对照腺病毒载体(Ad5EGFP)，在手术前(BO)以及在基因输送后第0、3、7和10天。
图28是说明用根据测定动脉生成的的血管造影积分测定利用编码在相应于SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177的位置上具有氨基酸取代的eNOS多肽突变体的腺病毒载体(Ad5NOS1177D)对CLI模型小鼠的基因治疗的作用的直方图；在实验结束时，比较于编码绿色荧光蛋白的对照腺病毒载体(Ad5EGFP)。
具体实施方案本发明提供了一种治疗重症肢体缺血(CLI)的新方法。更具体地，本发明提供了用eNOS多肽或多核苷酸预防、诊断和治疗CLI的方法。用本发明的方法可以调控细胞内的eNOS活性，使得可以改善与eNOS活性相关的疾病或病变。具体地，利用本发明的方法，通过增加缺血肢体内的局部的NO产生可以调控eNOS活性，使得可以改善与缺血肢体内的NO产生减少相关的疾病或病变。因此，本发明的组合物和方法提供了新的治疗方法，它增加了病变组织的NO水平并因此通过多种机制靶向于潜在的CLI病理生理改变，机制包括例如1)刺激血管生成；2)改善微血管功能不全；3)恢复已经存在的血管的血管舒缩(血管舒张)活性；以及4)已经存在的侧突血管的重塑/成熟(动脉生成)，已知都可以通过增加NO水平而改善这些方面。预计所造成的皮肤及肌肉的血流和氧供的提高都能缓解静息痛及愈合缺血性溃疡。此外，本发明的eNOS突变体可能比野生型eNOS更为有效，因为突变型eNOS酶具有显著更高的特异性活性。另外，eNOS的活性可以被钙离子严格地调节，并不受氧化低密度脂蛋白(oxLDL)和年龄的影响。因此，与生长因子相反，在基因治疗应用中使用本发明的eNOS组合物可以忽略“过量”所引起的毒性。
将在此引用的参考文献的全部内容一同并入作为参考。
定义除非有不同的定义，在此所用的技术和科学名词具有本发明所属领域的人员所通常理解的意义。在此所列的参考文献是关于本领域人员所熟知的各种方法学。在此将这些已知方法学的出版物和其它材料的全部内容一同并入参考。重组DNA技术的常用原理的标准参考文献包括Sambrook，J.，et al.(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2dEd.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Planview，N.Y.；McPherson，M.J.，Ed.(1991)Directed MutagenesisA Practical Approach，IRL Press，Oxford；Jones，J.(1992)Amino Acid and Peptide Synthesis，Oxford SciencePublications，Oxford；Austen，B.M.and Westwood，O.M.R.(1991)Protein Targeting and Secretion，IRL Press，Oxford。可以利用任何本领域人员熟知的适当的材料和/或方法进行本发明；然而，描述了优选的材料和/或方法。除非有不同的提示，在下面的描述和实施例中所采用的材料、试剂等都是从商品化来源中获得的。
“多肽”在此指的是全长蛋白质或它的片段，或肽。在优选的实施方案中，本发明的eNOS片段或肽保持有eNOS活性，例如NO产生。然而，与参照eNOS多肽比较(例如与全长或野生型多肽比较)，可以增加或减少eNOS活性的水平。
“变体”在此指的是多肽或多核苷酸，指的是与参照多肽或多核苷酸比较(例如与野生型多肽或多核苷酸比较)，相应地可能在一级、二级或三级结构上有所不同的多肽或多核苷酸。例如，氨基酸或核酸序列可以含有不同于参照氨基酸或核酸序列的突变或修饰。在一些实施方案中，eNOS变体可以是不同的异构体或多态性。变体可以是利用本领域已知的方法分离的或合成的天然形成的、合成的、重组的或化学修饰的多肽或多核苷酸。
“突变”在此指的是多肽或多核苷酸，指的是天然生成的、合成的、重组的、或化学变更的或与参照多肽或多核苷酸比较(例如与野生型多肽或多核苷酸比较)，相应地不同于多肽或核酸的一级、二级或三级结构的多肽或多核苷酸。利用本领域熟知的方法可以分离或生成具有这些突变的多肽和多核苷酸。
“eNOS多肽突变体”或其语法等价物(例如eNOS突变体、突变型eNOS、eNOS突变型多肽、突变型eNOS多肽)在此指的是在相应于哺乳动物eNOS的功能结构域的一个位置上的氨基酸残基上至少有一个变异或突变的eNOS多肽或它的片段或变体。在一个优选的实施方案中，突变是在相应于人eNOS(SEQ ID NO1)的495位氨基酸残基的位置上的氨基酸取代，其中氨基酸取代优选的是Ala或Val。在另一个优选的实施方案中，与参照的eNOS多肽比较，增加或减少了eNOS多肽的活性。
eNOS多肽的“功能结构域”在此指的是与eNOS活性相关的多肽的任何氨基酸残基、位点或区域，包括但不限于例如蛋白结合结构域(例如，钙调蛋白结合结构域、激酶结合结构域、或配体结合结构域)、磷酸化位点、豆蔻酰化位点、还原酶结构域或活性位点。
“eNOS活性”在此指的是与细胞内酶相关的任何活性，包括但不限于例如，NO产生、钙调蛋白结合、刺激血管生成、改善微血管功能不全、恢复已经存在的血管的血管收缩(血管舒张)活性、引起已经存在的侧突血管的重塑/成熟(动脉生成)。eNOS活性也可以是与多肽相关的任何生物或细胞活性，以及更具体地，是与eNOS多肽的功能结构域相关的任何活性。eNOS活性也可以是与酶相关的活性的调控，包括但不限于例如对本领域已知的或上述的任何eNOS活性的调控。
“调控”在此参照于eNOS活性，指的是这些活性的增加、减少、诱导或抑制。在一些实施方案中，这些eNOS活性的增加、减少、诱导或抑制是相对于参照分子的，例如eNOS野生型或突变型多肽。
“疾病”、“病态”或“病变”在此指的是患者的细胞、组织或器官内的不良状态，其中可以调节eNOS活性以改善之中状态。内皮NOS涉及各种病理过程，包括但不限于例如血管形成、血管舒张、免疫调节、血小板聚集的抑制、平滑肌的松弛。因此，调控需要治疗的患者的细胞、组织或器官内的eNOS活性可以改善在此描述的疾病、病态或病变。
“患者”在此为哺乳动物，优选的是人。
编码eNOS多肽的多核苷酸内皮型一氧化氮合酶(eNOS，也称为ecNOS和NOS3)是三种已知的NO合酶异构体的其中一种。eNOS见于例如血管内皮、心肌细胞、血液血小板、各种类型的平滑肌和免疫系统的细胞，例如T细胞、中性粒细胞和巨噬细胞。在本发明的方法中所用的编码eNOS多肽的多核苷酸可以来源于在此描述的任何一种细胞或组织，优选的为内皮细胞。
在本发明的方法中所用的编码eNOS的多核苷酸可以来自或来源于任何一种哺乳动物，例如人、小鼠、豚鼠、狗、猪、大鼠或兔，优选的是人。总体而言，本申请针对的是人eNOS(SEQ ID NO1)以及它的突变体的应用。然而，本领域人员将认识到本阐述同样也可以很好地应用于来自于例如上述的其它物种的eNOS多核苷酸和多肽以及它们的突变体；和/或用编码eNOS多肽的多核苷酸治疗除人以外的其它物种。
可以被引入到宿主细胞内(例如通过转染或转导)并在其中表达的编码eNOS多肽的任何形式的多核苷酸都适用于本发明的方法。
编码本发明的eNOS多肽的多核苷酸包括例如编码eNOS多肽的cDNA、或无中断编码eNOS多肽的DNA。“无中断编码”的多核苷酸指的是具有连续可读框(“ORF”)的多核苷酸，比较于被内含子或其它非编码序列所中断的ORF。
名词“基因“在此指的是涉及产生多肽链的DNA片段；它可以包括编码区的前面或后面的区域(前导序列和尾部)以及各个编码片段(外显子)之间的中断序列(内含子)。本发明包括编码本发明的eNOS多肽的分离的基因(例如基因组克隆)。
本发明的多核苷酸可以是重组多核苷酸、天然多核苷酸、或合成的或半合成的多核苷酸或它们的组合物。多核苷酸可以是RNA、PNA或DNA，例如cDNA、基因组DNA和合成的或半合成的DNA，或它们的组合物。DNA可以是三链、双链或单链。它可以含有发夹或其它二级结构。RNA包括mRNA、多腺苷化RNA、总RNA、单链或双链RNA等等。本发明也包括DNA/RNA双链体。
在本发明的一个实施方案中，编码eNOS的多核苷酸具有天然存在的多核苷酸的序列，例如是人多核苷酸。多种物种的编码eNOS的多核苷酸的序列是已知的，例如人(Janssens et al.(1992)J.Biol.Chem.267，14，519-522)和牛(USP 5,498,539)。本发明的天然存在的多核苷酸可以有例如野生型多核苷酸序列的等位基因变体的编码序列。如本领域已知的，等位基因变体是多核苷酸序列的不同形式，它可以有一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加，它通常基本上不改变所编码的多肽的功能。含有天然存在的单核苷酸多态性(SNPs)的多核苷酸也可以用于本发明的方法。
在其它实施方案中，在本发明的方法中所用的多核苷酸可以是天然存在的eNOS多核苷酸的变体。关于多肽或多核苷酸，名词“变体”在此意思是基本上保持有野生型eNOS多肽或编码它的多核苷酸的一种或多种活性或特性的变体。即变体是当通过本发明的方法被引入到患CLI的患者的细胞、组织或器官内后可以改善CLI的一种或多种症状到可测定程度的多肽或多核苷酸。变异多核苷酸可以编码野生型或突变型eNOS多肽。
在另一个实施方案中，变异多核苷酸可以编码野生型或突变型eNOS多肽的变体，例如，包括一个或多个缺失、插入、添加、取代、反转或截断或它们的组合的多肽。这些变异多肽可以含有保守或非保守氨基酸的一个或多个氨基酸取代，优选的是保守氨基酸。举例说明的保持总体电荷、疏水性/亲水性、侧链基团和/或被取代氨基酸的空间体积(steric bulk)的保守取代包括例如Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asn/Gln、Thr/Ser和Phe/Trp/Tyr。
在本发明的方法中所用的编码eNOS的变异多核苷酸包括例如(i)在多核苷酸中一种或多种核苷酸的多核苷酸被另一种核苷酸所取代，或被其它方式突变的多核苷酸；或(ii)一个或多个核苷酸被修饰的多核苷酸，例如包括取代基；或(iii)另一种化合物与多核苷酸融合的多核苷酸，例如增加多核苷酸半衰期的化合物；或(iv)附加的核苷酸与多核苷酸共价结合的多核苷酸，例如编码前导肽或分泌序列的序列或用于纯化多肽的序列。附加的核苷酸可以来自异种来源或可以是天然基因的内源性核苷酸。
属于上述类型(i)的多核苷酸变体包括，例如多态性，包括单核苷酸多态性(SNPs)、等位基因变体和突变体。变异多核苷酸可以包括例如一个或多个添加、插入、缺失、取代、转换、转位、反转、染色体易位、不同剪切(splicing)过程所形成的变体等，或它们的任何组合。
属于上述类型(ii)的多核苷酸变体包括例如修饰例如连接有可测定的标记物(抗生物素蛋白、生物素、放射性元件、荧光标签和染料、能量传递标记、能量释放标记、结合伴侣等)或提高表达、摄取、分类、标记、杂交、检测和/或稳定性的基团。
属于上述类型(iii)的多核苷酸变体包括例如各种长度的聚A+尾部、5’帽结构以及核苷酸类似物，例如次黄嘌呤核苷、硫代核苷酸(thionucleotides)等等。
属于上述类型(iv)的多核苷酸变体包括例如各种嵌合、杂交或融合多核苷酸。例如本发明的多核苷酸可以包括编码序列以及融合于相同可读框的附加的非天然存在的或异源性编码序列(例如编码前导肽、信号、分泌、靶向、酶、荧光、抗生素抗性以及其它或诊断性肽的序列)；或编码序列以及非编码序列，例如5’和3’末端的非翻译序列，或分散于表达序列的非翻译序列，例如内含子。
本发明的方法所用的多核苷酸变体也可以具有在框内与容许识别和/纯化本发明的多肽的标记序列融合的编码序列。标记序列可以是例如六组氨酸标记(例如由pQE-9载体所提供)，用于在细菌宿主中纯化与该标记物相融合的成熟多肽。或标记序列例如可以是用于哺乳动物宿主例如COS-7细胞的血凝素(HA)标记。HA标记对应来源于流感血凝素蛋白的抗原决定簇(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
其它类型的多核苷酸变体对本领域人员是显而易见的。例如，依赖于所需的用途，例如耐受核酸酶例如RNAse H、增强的体内稳定性等，多核苷酸的核苷酸可以各种已知的连键进行连接，这些连键例如为酯、磺酸酯、硫酰胺、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯(methylphosphonate)、氨基甲酸酯等，见美国专利No.5,378,825。可以结合任何一种所需的核苷酸或核苷酸类似物，例如6-巯基嘌呤、8-氧-鸟嘌呤等。本发明的多核苷酸也可以具有来源于生物体的其它遗传位点的编码序列，条件是它与野生型eNOS多肽基本上同源或者在一种物种与另一种物种之间基本上同源(例如，直向同源物(ortholog))。
定位于编码序列或调节序列内的其它变异序列可以增强本发明的eNOS多肽的合成、功能或活性。
其它的变异多核苷酸与编码eNOS的野生型多核苷酸具有具有不同程度的序列同源性(相同性)，或编码与野生型eNOS多肽具有不同程度的序列同源性(相同性)的多肽变体，当然，条件是当将变异多核苷酸或多肽引入到患病的患者体内时，它们保留了在本发明的方法中的改善CLI的一个或多个症状的能力，即多核苷酸或多肽是基本上同源于野生型eNOS，或显示出大体上的序列同源性(序列相同性)。此外，在本发明内的多核苷酸、多肽以及它们的片段可以包括与野生型多核苷酸或多肽至少具有约65-70％序列同源性(相同性)的多核苷酸或氨基酸序列，优选的约70-75％、75-80％、80-85％或85-90％序列同源性(相同性)，以及最优选的约90-95％或95-99％序列同源性(相同性)。本发明也包括具有更低程度序列相同性的多核苷酸或多肽，但是它们具有足够的相似性以行使eNOS所表现的一种或多种功能或活性。
名词“基本上同源”，当指的是多核苷酸序列时，意思是具有至少约90-95％或95-99％或更高一致性的核苷酸序列。
根据本发明，当指的是序列时，名词“相同性百分比”或“相同性的百分比”意思是在将被比较的序列(“比较序列”)与所描述的或所要求保护的序列(“参照序列”)比对后，将序列与要求保护的或描述的序列比较。根据下面的公式计算出相同性百分比相同性百分比＝100[1-(C/R)]其中C是参照序列与比较序列之间在参照序列与比较序列之间的比对长度上的差异的数目，其中(i)在比较序列内没有对应的比对碱基或氨基酸的每个参照序列的碱基或氨基酸和(ii)参照序列上的每个间隙和(iii)不同于比较序列的比对碱基或氨基酸的每个参照序列的比对碱基或氨基酸，构成了一个差异。R是参照序列在比较序列比对长度上的碱基或氨基酸数目，其中参照序列所生成的任何间隙也被计数为一个碱基或氨基酸。
如果在比较序列和参照序列之间存在比对时，对此如上述所计算出的相同性百分比是约等于或大于一个具体指出的最小相同性百分比，那么比较序列与参照序列具有该具体指出的最小相同性百分比，尽管可以存在这样的比对，即其中如上述所计算的相同性百分比低于该具体指出的相同性百分比。
在优选的实施方案中，用于比较目的的被比对的参照序列的长度是参照序列长度的至少30％，优选的至少40％，更优选的至少50％，甚至更优选的至少60％，以及甚至更优选的至少70％、80％或90％。在此描述的相同性百分比或同源性百分比同样可以应用于核苷酸或氨基酸序列。
用数学算法可以完成序列的比较以及两个序列之间的同源性百分比和相似性的测定。(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；以及Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。
在Karlin et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5877中描述了这种数学算法的优选的、非受限的实例。如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.253389-3402所描述的，将这种算法结合进NBLAST和XBLAST程序(2.0版本)中。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如NBLASST)的默认参数。在一个实施方案中，序列比较之间的参数可以被设定为积分＝100，字长-12，或可以修饰(例如W＝5或W＝20)。
在优选的实施方案中，利用Needlman等(1970)(J.Mol.Biol.48444-453)算法可以测定两个氨基酸序列之间的相同性百分比，该算法已经被整合进使用BLOSUM 62矩阵或PAM250矩阵，缺口加权为16、14、12、10、8、6或4，以及长度加权为1、2、3、4、5或6的GCG软件包的GAP程序中。仍在另一个实施方案中，利用使用NWSgapdnaCMP矩阵以及缺口加权为40、50、60、70或80，以及长度加权为1、2、3、4、5或6的的GCG软件包(Devereux et al.(1984)Nucleic AcidsRes.12(1)387)的GAP程序I测定两个核苷酸序列之间的相同性百分比。
用于比较序列的数学算法的另一个优选的，非受限的实例是Myers和Miller的算法CABIOS(1989)。这种算法被整合进ALIGN程序(版本2.0)中，它是CGC序列排列软件包的一部分。当用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120加权残基表，缺口长度补偿为12以及缺口补偿为4。其它的序列分析的算法是本领域已知的，包括在Torelliset al.(1994)Comput.Appl.Biosci.103-5中所描述的ADVANCE和ADAM；以及在Pearson et al.(1988)PNAS 852444-8中所描述的FASTA。
根据本发明，当指的是蛋白序列时，名词“基本上同源”意思是氨基酸序列至少有约90-95％或97-99％或更高的相同性。在高严格性条件下，与编码本发明的突变型多肽的序列的核酸序列或它们的片段杂交的核酸序列可以编码基本上同源的氨基酸序列。
“高严格性”条件在此意思是例如在含有例如约5X SSC、0.5％SDS、100μg/ml变性的鲑精DNA以及50％甲氨酰的杂交溶液中将一印迹与长多核苷酸探针在42℃孵育过夜。然后在高严格性条件下洗涤印迹，使得发生例如小于5％的碱基错配(例如在0.1x SSC和0.1％SDS65℃洗涤30分钟两次)，并选择具有例如95％或更大序列相同性的序列。
其它高严格性条件的非限定实例包括用含有30mM NaCl和0.5％SDS的水性缓冲液在65℃进行终末洗涤。高严格性条件的另一个实例是在7％SDS、0.5M NaPO4、pH7、1mM EDTA 50℃下杂交，例如过夜后，紧接着是用1％SDS在42℃洗涤一或多次。反之，高严格性洗涤可以容许少于5％的错配，减弱或降低严格的条件能容许最大到20％的核苷酸错配。可以如上述完成低严格的杂交，但要使用更低的甲氨酰条件、更低的温度和/或更低的盐浓度、以及更长时间的孵育时间。
本发明的多核苷酸片段可以是适合于本发明的任何大小，例如可以是任何所需的当引入到患CLI的患者体内时能有效地起到治疗作用的大小。例如，本发明的多核苷酸片段可以比全长的基因产物稍微更小。例如，本发明的多肽可以包括至少约10、25、50、100、200、300、400、500、600、800、1000或1200个氨基酸。本发明的多核苷酸也可以比全长cDNA更长，例如对于融合多核苷酸或为基因组序列的一部分的多核苷酸。
根据任何所需的方法可以标记根据本发明的多核苷酸。用例如如32P、35S、3H、或14C的放射性示踪物可以标记多核苷酸。根据任何方法例如如利用放射性标记的核苷酸、多核苷酸激酶(有或无磷酸酶的脱磷酸化)或连接酶(依赖于所标记的末端)的3’或5’末端的末端标记可以进行放射性标记。也可以使用非放射性标记，将本发明的多核苷酸与残基联合，所述残基具有对特定的试剂(配基)的特异性亲和力的免疫特性(抗原、半抗原)、能完成可测定的酶反应的特性(酶或辅酶、酶底物或其它参与于酶反应的物质)、或特征性的物理特性，例如荧光或在所需波长时放射或吸收光等等。
eNOS多肽本发明进一步涉及eNOS多肽以及它的突变体。
人eNOS(例如SEQ ID NO1编码的人eNOS)的适宜的突变包括但不限于例如(a)相应于1177位氨基酸残基的磷酸化位点的突变，其中残基被取代成其它的氨基酸，例如为Asp(S1177D)(见例如，WO00/62605)；和/或(b)相应于2位氨基酸残基的豆蔻酰化位点的突变，其中残基被取代成其它的氨基酸，例如为Ala(G2A)(见例如Sessa et al.(1993)，Circulation Research 72，921-924.)。在豆蔻酰化位点突变的eNOS多肽可以定位于细胞的胞浆内而不是细胞膜上。这些突变体可以耐受(与野生型蛋白比较)下调eNOS/NO产生的病理性刺激(例如oxLDL)。这些特性有利于应用突变体蛋白(或编码它的核苷酸)治疗存在这些外在的病理性刺激的CLI。
(c)相应于该区的氨基酸残基的钙调蛋白结合位点的突变(例如，SEQ ID NO1的478-522位氨基酸)，特别的是495位氨基酸残基，已知在哺乳动物细胞中该位点是被磷酸化的。在优选的实施方案中，495位氨基酸残基被取代成Ala、Gly、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Tyr、Trp、Met、Ser、Cys、Glu、Gln、Lys、Arg或His，更优选地被取代成Ala、Val、Leu或Ile，以及甚至更优选地被取代成Ala或Val。例如在共同未决申请U.S.Serial No.60/403,638中讨论了这些突变体，在此将其全部内容一同并入参考。
共同未决申请U.S.Serial No.60/403,638也阐述了各种其它的突变，当eNOS出现这些突变时增强了它的活性。这些突变可以是在上述提及的位点、在那些功能结构域的其它残基、或在eNOS分子的其它功能结构域内。
可以被引入突变的eNOS多肽的功能结构域被很好地描述(见图1)并包括，例如从N末端开始到C末端，豆蔻酰化的共有位点、两个棕榈酰化位点、氧化酶结构域、钙调蛋白结合位点(例如SEQ ID NO1编码的人eNOS的494-517位氨基酸)，它含有磷酸化共有序列(例如SEQ IDNO1编码的人eNOS的Thr-495)、以及含有磷酸化共有序列的还原酶结构域(例如SEQ ID NO1编码的人eNOS的Ser-1177)。
在钙调蛋白结合位点DPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAKRVKATI(例如SEQ ID NO2)，SEQ ID NO1的氨基酸残基478-522)内可以有除Thr-495取代以外的其它突变。其它物种的与之相当的序列可以是稍微不同的，特别是在N末端到磷酸化位点的残基上(见图1，SEQ ID NOS3-7)。在该基序的每一个氨基酸都可以被变成其它19种天然氨基酸的任何一种氨基酸，或变成非天然氨基酸。在一些实施方案中，突变不是保守突变，例如Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Asp/Glu、Lys/Arg、Asp/Gln、Thr/Ser或Phe/Trp/Tyr。在一个实施方案中，定位于相应于SEQ ID NO1的Thr-495的氨基酸残基的紧邻C末端的本发明的eNOS多肽的一个或多个残基，例如残基496和498，可以被Arg或Lys所取代。
本发明也包括在eNOS多肽的其它功能结构域的一个或多个氨基酸被修饰的eNOS多肽。例如，一个或多个突变被引入到一个或多个催化区(例如氧化酶或还原酶结构域)或调节区(例如自身抑制环)、或任何的本领域已知的或在此所描述的其它功能结构域。其它突变可以是任何一种在此所描述的突变类型。
在本发明的方法中也可以使用具有两个或更多个在此所描述的突变的组合的多肽突变体。在优选的实施方案中，本发明的eNOS多肽突变体在至少两个功能结构域有突变并表现出比初始多肽或参照多肽更高的eNOS活性。如果需要，在已经进行并描述这样一种附加突变后，可以重复这个过程，直到在这两个功能结构域的其中一个或不同的功能结构域进行并描述第三个突变。在一些实施方案中，随着每一种附加的突变，eNOS多肽突变体的活性(例如，刺激NO产生)继续增加。在优选的实施方案中，人eNOS突变型多肽包括在相应于SEQ ID NO1的Thr-495的位置上的氨基酸取代(例如取代成Ala、Val、Leu或Ile，优选的Ala或Val)以及相应于SEQ ID NO1的Ser-1177的位置上的氨基酸取代(优选的为Asp)，以及在豆蔻酰化位点的Gly-2上的氨基酸取代(优选的为Ala)的组合。在最优选的实施方案中，本发明的多核苷酸编码S1177RD突变及G2A突变；S1177D突变体及T495V或T495A突变体；G2A突变体及T495V或T495A突变体；或S1177D突变体、G2A突变体及T495V或T495A突变体。
当本发明的eNOS多肽来源于非人的哺乳动物时，可以突变eNOS中的相当(等效)残基。在这些生物体中的相当残基是熟知的。例如，人蛋白的495位残基相应于小鼠多肽的494位残基、豚鼠多肽的498位残基、狗、牛或猪多肽的497位残基、大鼠多肽的22位残基或兔多肽的40位残基。
生成这些突变体的方法是标准的方法并在本领域是熟知的。这些方法包括例如，同源重组、定点突变、盒式突变以及基于PCR的突变，见例如Sambrook et al.，Molecular Cloning，CSH Press(1989)and Kunkel etal.(1985)PNAS 82，488-492。这些突变的原材料可以是来源于任何动物的cDNA，例如人、小鼠、豚鼠、狗、牛、猪、大鼠、兔、羊、马、非人的灵长类、或其它动物。
可以用多种标准检测确定是否上述的这些突变体表现出eNOS活性的增加。可以进行不同的eNOS活性的检测；或可以直接确定当应用本发明的基因治疗方法时，突变型eNOS多核苷酸改善CLI一种或多种症状的能力。(见实施例)eNOS将L-Arg转换为NO，一种在许多生理反应中参与和/或作用为调节功能的气态的第二信号分子。不用结合任何的特殊机制，当将编码eNOS的多核苷酸被引入到病变细胞或组织时，eNOS所介导的一种或多种活性造成了CLI的症状的改善。例如，eNOS直接或间接地(例如通过酶合成NO)介导刺激血管生成；微血管功能不全的改善；刺激血管舒张；刺激侧突血管的发育；增加周围肢体血流；抑制肢体坏死；抑制皮肤溃疡；增强皮肤溃疡愈合的抑制或预防血小板粘附或聚集(它可以导致例如血栓形成)；刺激内皮细胞增生和迁移；抑制白细胞活化和粘附或平滑肌增生；调控免疫反应；以及清除超氧离子。测定这些及其它eNOS活性的方法对于本领域人员是常用并熟知的。见例如，测定抑制肢体坏死的方法，如增加侧突血管依赖性缺血肢体的毛细血管密度或血管舒缩反应性所证实的(见例如e.g，Murohara et al.(1998)J.Clin.Invest.，101，2567-2568.)。在此也见实施例。
测试eNOS活性的动物模型是标准的并在本领域是熟知的。例如，见Murohara et al.(1998 ibid)；Couffinhal et al.(1998)；Am J.Pathol 152，1667-1669；Couffinhal et al.，(1999)Circulation 99，3188-3198；以及在此的实施例。这些检测包括，例如手术后肢缺血的小鼠和大鼠模型，例如其中在eNOS缺陷小鼠中实施手术。在这些参考文献中也描述了测定后肢血流及毛细血管密度的方法。
编码eNOS多肽突变体的重组载体本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的重组载体、包含本发明的重组载体的宿主细胞，以及本发明的多肽产物。
本发明涉及插入有编码eNOS多肽的多核苷酸的重组载体。这些多核苷酸可以被从天然来源直接分离并克隆进适宜的表达载体中，或多核苷酸可以被人工地加工成具有或天然存在的或突变的多核苷酸的序列。突变DNA、克隆和表达DNA的方法，或其它分子生物学方法在此指的是常用的方法并被许多教科书和其它参考材料所描述的方法。见例如，Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)；Wu et al，Methods in Gene Biotechnology(CRC Press，New York，NY，1997)；Recombinant Gene ExpressionProtocols，in Methods in Molecular Biology，Vol.62，(Tuan，ed.，HumanaPress，Totowa，NJ，1997)；以及Current Protocols in Molecular Biology，(Ausabel et al，Eds.)，John Wiley & Sons，NY(1994-1999)。
本发明涉及含有其中如上述的插入有编码eNOS多肽的多核苷酸的表达载体(例如质粒或病毒表达载体)的重组构建体，表达载体与适当的表达控制序列(例如启动子和/或增强子)可操纵地连接，使得表达所编码的eNOS多肽。
这些构建体可用于在此所描述的体内基因治疗或回体(基于细胞的)基因治疗的方法。
可以为哺乳动物细胞例如人细胞选择适宜的表达控制序列，例如组成的或可调节的启动子或控制真核细胞或它们的病毒的基因表达所已知的其它序列(例如增强子)。本领域人员熟知各种这些表达控制序列。可以使用内源性或异源性的表达控制序列。表达控制序列可以是组织特异性的。在一个实施方案中，表达控制序列是来源于高表达基因。可以从任何所需的基因中选出表达控制序列，例如用CAT(氯霉素转移酶)载体或带有选择性标记物的其它载体。用于这种选择的两种适宜的载体是pKK232-8和pCM7。
在本发明的重组载体中所能使用的适宜启动子包括，例如真核启动子CMV早期即刻启动子、HSV腺苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、腺病毒启动子、逆转录病毒LTR以及小鼠金属硫蛋白I。本领域人员容易选择出适宜的载体和启动子。
通过将增强子序列插入到表达载体中可以增加编码本发明的eNOS多肽的多核苷酸序列的转录。增强子是顺式作用的DNA元件，通常是作用于启动子增加其转录的约10到300个碱基对。代表实例包括在复制起点尾侧第100到270个碱基对的SV增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点尾末侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子。
重组表达载体通常也包括复制起点。表达载体可以含有用于翻译起始的核糖体结合位点、转录终止序列、多腺苷化位点、剪切供体和受体位点、以及5’侧翼或非转录序列。可以用来源于SV40剪切及多腺苷化位点的DNA序列提供所需的非转录遗传元件。载体也可以含有用于扩增表达的适宜序列。另外，表达载体优选地包括为选择转化的宿主细胞提供表型标记的一种或多种可选择的标记物基因，例如真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性基因。
本领域人员熟知大量的适宜的重组表达载体，并且许多都是商品化可获得的。适宜的载体包括染色体、非染色体以及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、杆状病毒、酵母菌质粒、来源于质粒和病毒DNA的组合的载体、以及病毒DNA例如痘病毒、腺病毒、腺相关病毒、TMV、鸡痘病毒和伪狂犬病病毒。然而，可以使用任何其它的载体，只要它们在宿主中是可复制的并能存活的。例如Sambrook等以及在此所讨论的其它参考文献描述了适宜的克隆及表达载体。
特别地适用于基因治疗方法的重组载体包括被构建带有或表达所选择的目标多核苷酸的重组逆转录病毒。可以采用的逆转录病毒载体包括在EP 0 415 731、WO 90/07936、WO 94/03622、WO 93/25698、WO93/25234、美国专利No.5,219,740、WO 93/11230、WO 93/10218、Vileand Hart，Cancer Res.533860-3864(1993)、Vile and Hart，Cancer Res.53962-967(1993)、Ram et al.，Cancer Res.5383-88(1993)、Takamiya etal.，J.Neurosci.Res.33493-503(1992)、Baba et al.，J.Neurosurg.79729-735(1993)、美国专利No.4,777,127、英国专利No.2,200,651、EP 0 345242及WO 91/02805中所描述的载体。
可以容易地制备适合与上述的逆转录病毒载体构建体使用的包装细胞株(见例如，PCT文献WO 95/30763和WO 92/05266)，并将其用于生成用于生产重组载体颗粒的生产细胞株(也称为载体细胞株)。在本发明的优选的实施方案内，从人(例如HT 1080细胞)或水貂亲代细胞株制备包装细胞株，因此容许生成能在人血清中无活性生存的重组逆转录病毒。
本发明也采用基于α病毒的载体。可以由多种α病毒构建这些载体，包括例如，辛德比斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)以及委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR-1249；ATCC VR-532)。这些载体体系的代表性实例包括在美国专利5,091,309、5,217,879、和5,185,440；以及PCT Publication Nos.WO92/10578、WO 94/21792、WO 95/27069、WO 95/27044、和WO95/07994中所描述的载体。
适宜的载体也可以是细小病毒，例如腺相关病毒(AAV)载体。代表性实例包括Srivastava的WO 93/09239、Samulski et al.，J.Vir.633822-3828(1989)、Mendelson et al.，Virol.166154-165(1988)、以及Flotte etal.，PNAS9010613-10617(1993)所阐述的AAV载体。
在一个优选的实施方案中，使用腺病毒载体。各种经修饰的腺病毒载体(例如Ad5或Ad2)，特别是无复制的载体和/或非辅助细胞依赖性病毒是本领域熟知的。腺病毒载体的代表性实例包括那些Berkner，Biotechniques 6616)；Rosenfeld et al.，Science 252431-434(1991)；WO93/19191；Kolls et al.，PNAS 215-219(1994)；Kass-Eisler et al.，PNAS9011498-11502(1993)；Guzman et al.，Circulation 882838-2848(1993)；Guzman et al.，Cir.Res.731202-1207(1993)；Zabner et al.，Cell 75207-216(1993)；Li et al.，Hum.Gene Ther.4403-409(1993)；Cailaud et al.，Eur.J.Neurosci.51287-1291(1993)；Vincent et al.，Nat.Genet.5130-134(1993)；Jaffe et al.，Nat.Genet.1372-378(1992)；以及Levrero et al.，Gene 101195-202(1992)所描述的腺病毒载体。在本发明中所采用的示范的腺病毒基因治疗载体也包括那些在WO 94/12649、WO 93/03769、WO 93/19191、WO 94/28938、WO 95/11984以及WO 95/00655中所描述的载体。可以采用施用如在Curiel，Hum.Gene Ther.3147-154(1992)中所描述的与腺病毒相连接的(例如靶向于腺病毒)DNA。
通过任何方法都可以将适宜的DNA序列插入到载体中。通常可以通过本领域已知的标准方法将DNA序列插入到适宜的限制性内切酶位点。这些方法以及其它的方法被认为是在本领域人员的知识范围内的。在许多容易获得的资源中都可以发现这些常用的方法以及在此所讨论的其它分子生物学技术，例如Sambrook，et al.，Molecular CloningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)。用于构建例如腺病毒基因转移颗粒的复苏重组技术也见于Graham et al.(1988)Virology 63，614-617。本发明也涉及被例如上述的构建体(或病毒感染的构建体)转化、转染、转导的细胞以及这些细胞的后代，特别是这些细胞形成能被植入(或重新植入)到所需治疗的CLI患者体内的稳定细胞株。
用于基于细胞的基因治疗的适宜的宿主包括但不限于骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨髓来源的干细胞、内皮前体细胞、成纤维细胞、树突状细胞、脐带血来源的细胞以及内皮细胞。利用任何一种适宜的方法都可以完成将构建体体外引入到宿主细胞中，例如磷酸钙转染、DEAE-Dextran介导的转染、脂染、基因枪或电穿孔(Davis，L.，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))。在转化适宜的宿主细胞株并将宿主细胞株繁殖到适宜的细胞密度后，如果需要就用适宜的方法(例如温度迁变或化学诱导)引入所选择的启动子，并再培养细胞一段时间。在按适合激活启动子(如果需要)所改良的常用的营养培养基中培养被加工的宿主细胞，选择转化细胞，扩增本发明的基因和/或扩增用于基于细胞的基因治疗的细胞的数目。细胞培养的条件，例如温度、pH值等都是原先在选择用于表达的宿主细胞中所用的条件，这对于本领域人员是显而易见的。
利用eNOS多肽和多核苷酸的CLI基因治疗严重的周围动脉闭塞病(PAOD)所造成的重症肢体缺血(CLI)被描述为进行性微循环功能不全以及血管生成不良。本发明涉及治疗患CLI患者(例如Fontaine分期III或IV期的POAD患者)的基因治疗方法，用野生型或突变型eNOS多肽或编码这些多肽的多核苷酸改善CLI的一种或多种症状，这些症状包括但不限于微循环功能不全或血管形成不良、白细胞的活化、血小板聚集、毛细血管闭塞、内皮细胞功能不全、一氧化氮利用率的减少、内皮细胞损伤、自由基的释放、组织损伤、坏死、静息痛、增加踝或趾收缩压和/或皮肤溃疡。这种治疗的正性结果是血管形成的增加和/或血管的血管舒张和/或损伤组织内和周围伤口的愈合。
可以体内(例如将多核苷酸或多肽直接施用给患者)或回体(例如将多核苷酸或多肽引入到细胞内，例如取自需要治疗的患者的细胞或来源于此的细胞株，或非来自于需要治疗的患者的细胞或细胞株，然后将被转染的细胞引入到患者体内)完成将本发明的多核苷酸或多肽输送到需要治疗的患者内。
本发明的方法包括将基因输送载体和/或转染细胞中的有效量的一种编码eNOS的多核苷酸施用于需要治疗的患者。“有效量”在此意思是可以可测定的或可检测的减轻或抑制CLI的一种或多种症状(例如在本文的其它地方所描述的症状)的量。
回体基因治疗的方法(基于细胞)是常用的。上面描述了含有可表达eNOS基因的适宜的细胞。通过许多适当的常用方法可以将这些细胞引入到患者体内，例如注射、植入、静脉内给药、移植、定植、输送被载体所包囊化的细胞、或在此所描述的用于体内给药的各种方法。可以使用其它的强化输送的方法。这些方法包括但不限于透明质酸酶注射、电穿孔和超声穿孔。对于体内给药，用各种常用的方法可以将如上述的含有编码eNOS的多核苷酸的构建体(在此有时被称为“基因输送载体”)给需要治疗的患者施用。可以局部或全身地输送构建体。体内输送的适宜途径对于本领域人员是熟知的并包括，但不限于静脉内、肌肉内、腹腔内、皮内、动脉内和口服方法。对于常用的方法，见例如Jolly，Cancer Gene Therapy 151-64(1994)Kimura，Human Gene Therapy 5845-852(1994)；Connelly，Human Gene Therapy 1185-193(1995)；和Kaplitt，Nature Genetics 6148-153(1994)。
利用常用的方法学可以将基因输送载体加工成包括常用的可药用的赋形剂或载体的药用组合物。增强试剂转移通过细胞膜(促进穿透)或减少降解的剂型或赋形剂在本领域也是熟知的。例如，用多种常用方法可以将输送颗粒(用于体内或回体转移多核苷酸)输送到靶细胞内，这些方法包括例如，脂质体介导的脂染，例如其中脂质体是含有例如SF-chol或DC-chol的胆固醇衍生物的阳离子脂质体；按剂型制造的DNA(例如PINC)；以及用lipofectamine的转染等等。在USP 5,656,565；Mannino etal.(1988)BioTechniques 6，682-690以及其参考文献；和Gao et al.(1991)Biochem Biophys Res Comm 179，280-285中描述了常用的方法。
在一个实施方案中，将施用给患CLI患者的基因输送载体局部施用到表现出疾病病变的部位。这些局部输送可以避免例如在非疾病相关的细胞或组织内引入NO所造成的不必要的作用(例如副作用)。例如，通过插入到一侧或双侧股动脉的近端部分的导管可以输送本发明的多核苷酸，从而使得多核苷酸被转移到接受股动脉血流的骨骼肌细胞内(见例如USP 5,792,453)。也可以直接注射到周围血管系统内，或注射到病变的组织(例如骨骼肌)内，以及可以进行分离的组织灌注，例如分离的肢体灌注(ILP)，其中在股动脉和股静脉之间可以形成闭合的回路(见例如WO01/03728)。
在另一个实施方案中，用常用方法可以全身施用治疗性多核苷酸，但这些多核苷酸是被修饰的，使得它们是靶向于细胞的。例如，多核苷酸可以被放置在组织特异性表达控制元件的控制下，例如启动子或增强子元件。
通过融合例如组织特异性的内皮转录控制序列以及例如腺病毒构建体的构建体内的例如本发明的eNOS基因的转基因，转基因的表达可以被限制在内皮细胞内。内皮细胞特异性启动子的实例包括，例如Tie-2启动子(Schlaeger et al.(1997)Proc Natl Acad Sci 1；94(7)3058-63)、内皮素启动子(Lee et al.(1990)J.Biol.Chem.26510446-10450)、以及eNOS启动子(Zhang et al.(1995)J Biol.Chem 270(25)15320-6)。也可以使用Flt-1和Flk-1启动子(见例如Bu et al.(1997)J.Biol.Chem.2723216-32622)。其它潜在的启动子包括合成的及天然的骨骼肌特异性启动子(见例如Hauser et al.(2000)Mol.Therapy 216-24)；Spc5-12合成启动子(Li et al.Nature(1999)17241-245)以及专利WO 99/02737。
可以采用其它的基因输送载体及方法，包括与腺病毒单独连接或未连接(例如靶向的)的多阳离子凝聚(condensed)DNA(例如，Curiel，Hum.Gene Ther.3147-154(1992))；与配体连接的DNA(例如，见Wu，J.Biol.Chem.26416985-16987(1989))；真核细胞输送载体细胞(例如见1994年5月9日归档的美国专利No.08/240,030，以及美国专利No.08/404,796)；光聚合水凝胶材料的沉积；手提式基因转移颗粒枪(例如，如在美国专利No.5,149,655中所描述的)；电离辐射(如在美国专利No.5,206,152和WO 92/11033中所描述的)、核电荷中和或与细胞膜的融合。在Philip，Mol.Cell Biol.142411-2418(1994)和Woffendin，Proc.Natl.Acad.Sci.911581-1585(1994)中描述了其它方法。
也可以采用裸DNA。在WO 90/11092和美国专利No.5,580,859中描述了示范的裸DNA导入方法。用生物可降解的乳胶珠可以提高摄取效率。在乳胶珠启动内吞作用后，以DNA包被的乳胶珠被有效地输送到细胞内。通过处理珠以增加其疏水性可以进一步地改进方法，并因此促进内含体的瓦解并将DNA释放到胞浆内。在例如美国专利No.5,422,120、PCT专利申请Nos.WO 95/13796、WO 94/23697和WO91/14445、以及EP No.0 524 968中描述了能作用为基因输送载体的适宜的脂质体。另外，适用的非病毒的输送方法包括机械输送体系，例如在Woffendin et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(24)11581-11585(1994)中所描述的。此外，通过光聚合水凝胶材料的沉积可以输送编码序列以及它们的表达产物。能用于输送编码序列的其它常用的基因输送方法包括，例如适用手提式基因转移粒子枪(如在美国专利No.5,149,655中所描述的)；以及使用激活被转移基因的电离辐射(如例如在美国专利No.5,206,152和PCT专利申请No.WO 92/11033中所描述的)。
已经设计出PINC(“protective interactive nonconsensing”)多聚体例如聚(N-乙烯砒咯烷酮)以及聚(乙烯醇)与质粒DNA形成多聚体以(i)保护质粒避免被核酸酶的快速降解；(ii)在例如骨骼肌的靶组织内分散及保持完整质粒；以及(iii)促进肌肉细胞对质粒的摄取(Mumper et al.，1996，Rolland and Mumper，1998)。Mumper等(1998)表明PINC剂型增强了对骨骼肌的转染效率(10到15倍)并延长了编码各种不同的转基因的治疗DNA的表达持续时间(28天)，这些转基因包括小鼠的血清碱性磷酸酶(SEAP)、人生长激素、以及人IGF-1。Abruzzese等(2000)已经表明PINC剂型联合电穿孔造成小鼠骨骼肌合成及分泌重组蛋白例如促红细胞生成素以及血管内皮细胞生长因子(FGG)增加了100倍。Fewell等(2001)已经证实在将结合有PINC的质粒注射到免疫缺陷小鼠的后肢后，人IX因子有长时间、持续的表达(超过120天)。
另一方面是上述的方法除施用编码eNOS多肽的多核苷酸外，还进一步包括在施用eNOS之前、之中或之后施用一种或多种血管生成调节物，或是多肽或是编码这些多肽的多核苷酸。本领域人员熟知许多这样的血管生成调节物。它们包括但不限于生长因子、转录因子、血管活性物质、化学趋化分子。生长因子包括例如HGF、VEGF(例如VEGF-2、VEGF-121、VEGF-145或VEGF-165)、FGF(例如FGF-1、-2、-4、-5)、内皮细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的内皮细胞生长因子、TGF-α、TGF-β、PDGF、TNF-α或IGF、发育调节内皮细胞位点-1(Del-1)。潜在的血管生成调节物也包括但不限于转录因子(例如EPAS、HIF)、血管活性物质(例如激肽释放酶、C型心钠肽(CNP)、B1受体激动剂)以及化学趋化因子(例如GM-CSF、MCP-1、IL-8)以及其他肽(例如PR-39)。
制备、施用和测定施用这些血管生成因子的作用的方法都是常见的，无论是单独的或与eNOS多肽联合的因子。(见，例如Papapetropoulos et al.，(1997)J Chin Invest 100，3131-3139；Brock et al.，(1991)Am J Pathol 138，213-221；以及Ku et al.，(1993)Am J Physiol.265，H 586-592；WO 01/03728；以及它们的参考文献)。
利用常见的方法可以将这些生长因子克隆进合适的表达载体中(或克隆进单一的载体或克隆进也表达本发明的eNOS多核苷酸的载体)。(见，例如Rivard et al.，(1999)Am J Pathol 154，355-363 for a method toinduce angiogenesis by intramuscular gene therapy with VEGF)。参照于编码eNOS的多核苷酸，所克隆的血管生成因子当然可以为任何一种在此所讨论的功能变体或片段，条件是所保留的功能是野生型血管生成因子的血管生成功能。
在编码血管生成因子的序列的同相或上游融合有助于多肽从细胞内分泌或促进多肽附着于细胞膜的序列将是有用的。这些适宜的前导序列对于本领域人员是熟知的。
在一些实施方案中，基因输送的方法是通过骨骼肌注射。刺激缺血腿的新血管形成的前血管生成基因的骨骼肌注射是基因输送的便利的、相对无创的方法。骨骼肌包括多核的、有丝分裂后的肌纤维，因此可能促进了转导细胞的有效及长时间的表达。既然新血管形成的过程只需要1-2周，那么瞬时基因表达对于治疗性血管生成将是足够的。虽然新形成的血管的持续存活需要更长时间的生长因子的表达是可能的，但是体内数据表明一旦有血流通过新产生的毛细血管/动脉，这些新血管在没有治疗性转基因的持续表达下也仍然开放。
在一些实施方案中，基因输送的方法是通过腺病毒。在血管生成基因治疗试验中已经使用腺病毒，因为它容易被大量地生产。病毒转染不同来源(器官和物种)的分裂和非分裂细胞并且它能瞬时地表达转基因。腺病毒的转导效率可能依赖于柯萨奇病毒-腺病毒受体(CAR)及αv整联蛋白。另外，肌肉筋膜以及成熟肌纤维的细胞外基质可能作用为阻止病毒基因有效地输送到肌肉的物理屏障。因此，用消化酶增加筋膜及细胞外基质的通透性可以增强病毒基因的输送。另外，透明质酸酶的预处理可以造成利用病毒或质粒输送的转基因表达的增加(美国专利Serial No.6,258,791)。另外，在CLI患者和实验动物的骨骼肌中所存在的肌纤维的炎症和缺血性损伤和再生可能进一步地促进病毒基因的转移。
在另一个实施方案中，质粒载体被用于骨骼肌的基因输送。已经发展一些方法以增强骨骼肌的非病毒基因转移的效率，包括电穿孔、质粒多聚体剂型例如PINC和PVP，以及例如透明质酸酶或胶原酶的化合物的预处理以增强裸DNA对肌纤维的进入及渗透能力。质粒的化学剂型已经极大地提高了体内稳定性以及靶组织的摄取。已经设计PINC(“protective interactive nonconsensing”)多聚体例如聚(N-乙烯砒咯烷酮)以及聚(乙烯醇)与质粒DNA形成多聚体以(i)保护质粒避免被核酸酶的快速降解；(ii)在例如骨骼肌的靶组织内分散及保持完整质粒；以及(iii)促进肌肉细胞对质粒的摄取。最近已经显示PINC剂型造成一些转基因的体内表达的水平及持续时间的增加。也证实了再次施用质粒的能力。
在一些实施方案中，用局灶的、导管介入的VEGF-腺病毒基因治疗进行基因输送。
以举例说明的方式提供下面的实施例，其不以任何方式限定本发明。
实施例实施例1eNOS多肽突变体和重组质粒及病毒载体生成编码具有单或双突变的eNOS多肽的质粒载体，用于在体外和体内进行质粒载体输送及细胞内野生型eNOS和多肽突变体的表达。利用直接在eNOS多核苷酸序列上的Kunkel定点诱变生成这些突变体(Kunkel，T.A.PNAS 1985；82488-492)。测序确认这些突变。将野生型突变构建体的cDNA克隆进质粒载体pShuttle-CMV中，将编码eNOS多肽的多核苷酸放置于CMV表达盒内。因此，在这些构建体中，多核苷酸被可操纵地连接于CMV启动子，使得启动子驱动在细胞内的表达所编码的eNOS多肽突变体。
在具有单氨基酸取代的eNOS多肽突变体中，相应于人eNOS的钙调蛋白结合位点(见图1)495位的Thr被取代成Ala、Asp或Val(分别称为突变体T495A、T495D、T495V)。在具有双氨基酸取代的eNOS多肽突变体中，相应于1177位的Ser被取代成Asp，另外相应于495位的Thr被取代成Ala、Asp或Val(分别被称为突变体T495A+S1177D、T495D+S1177D、T495V+S1177D)。测序确认这些突变体并测定它们增加HEK293细胞的NO产生的能力(实施例2和图2)。
根据He等(1998)PNAS 95(5)，2509-2514所描述的方法生成编码上述的具有单和双突变eNOS多肽的腺病毒载体，并用于在体外和体内以病毒载体将eNOS野生型和多肽突变体输送至细胞内。将带有编码eNOS多肽突变体(如上述的)的多核苷酸与含有E1和E3缺失的Ad5基因组的质粒一起共转化E.coli.BJ5183。腺病毒载体骨架来自腺病毒5。在该载体骨架中，454位和3333位核苷酸之间的腺病毒序列的E1区被缺失，以及用645bp外源DNA取代部分E3缺失。多核苷酸可以被插入于E1缺失的位点，使得CMV启动子(在-632到+7)以及SV40多腺苷信号被可操纵地连接于多核苷酸以表达多核苷酸所编码的多肽。
然后选择出所形成的编码eNOS多肽突变体的重组腺病毒质粒并用限制性内切酶分析确认。通过用无质粒的重组腺病毒基因组转染293细胞复活相应的病毒，然后在293细胞中扩增病毒，用标准的CsCl梯度纯化纯化病毒，并用于测定HAEC的NO产生(实施例3和图3)。
另外，eNOS多肽突变体NOS1177D(Sessa等，Yale大学提供)在相应于SEQ ID NO1的还原酶结构域的1177位氨基酸残基的位置上具有氨基酸取代成为Asp。为了测定这个eNOS多肽突变体在细胞内的活性，将编码该突变体的多核苷酸插入到腺病毒骨架(如实施例1中所述)的E1被缺失的位置。所形成的重组载体Ad5NOS1177D编码eNOS多肽突变的NOS1177D。将重组载体Ad5NOS1177D转染进包装细胞，所形成的病毒是纯化斑，并进行两轮扩增。用第二轮扩增中得到的病毒在3L生物反应器中进行大规模的HEK293细胞的感染接种。然后用两轮CsCl梯度分离纯化所生成的病毒并用10mM Tris pH8.0、2mM MgCl2和4％蔗糖透析病毒。也用纯化的重组病毒的一部分测定HAEC的NO产生(见实施例3、5和7)。
Ad5EGFP是对照载体，它是编码报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒载体。用Collateral Therapeutics制备，然后在HEK293细胞中扩增，并用FPLC纯化。然后用PBS pH7.2和2％蔗糖透析所纯化的病毒。然后将所纯化的对照病毒的一部分储存在-80℃，用作随后实验的对照(见实施例5和7)。
实施例2eNOS多肽突变体在HEK293细胞中的活性的检测和测定为了检测和测定eNOS多肽突变体在HEK293细胞中的活性，用编码eNOS多肽突变体的质粒载体(如实施例1所描述)在HEK293细胞中输送和表达多肽突变体。首先将HEK293细胞放置在6孔板中，每孔有2ml生长培养基(Alpha MEM(Gibco 12561-056))，其中含有10％FBS(SeraCare)、2mM附加的L-谷氨酰胺和50μg/ml庆大霉素。当细胞为约75％汇合时，用编码T495A、Thr495D或T495V eNOS多肽突变体(如实施例中所描述的)、或编码野生型人(WT)eNOS(SEQ ID NO1)或编码两种多肽的质粒穿梭载体转染细胞。
通过混合8μg编码WT eNOS或突变型eNOS的质粒穿梭载体、60μl Lipofectamine 2000(Invitrogen)以及200μl OptiMEM(Gibco)进行转染，在室温下孵育30分钟后，将111μl混合液以及420μl OptiMEM添加到每个含有HEK 293细胞的孔中。在37℃孵育2.5小时后，将2ml生长培养基加入到每个孔中。
两天后(细胞孵育在37℃，5％CO2)，用化学发光法测定细胞所生成的NO，之后将细胞裂解并用下面所描述的ELISA检测法测定裂解物的eNOS蛋白成分。为了纠正不同质粒之间的转染效率的差异，将NO产生标准化为eNOS蛋白的量。
NO产生的测定去除培养基，用2ml NO分析缓冲液(5mM Na HEPES、140mMNaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、10mM葡萄糖、10mM CaCl2、5mML-精氨酸、pH7.5)将每个孔都洗涤两遍。然后用1ml含有100U/ml超氧化物歧化酶及40ng/ml VEGF的NO分析缓冲液取代上述缓冲液。用石蜡膜覆盖孔，在37℃孵育30分钟后，将细胞上方的0.8ml缓冲液注射到西门子NOA280化学发光法测定器中，根据厂家说明书测定NO。真实的NO气体作为标准。完成NO测定后，去除细胞上的残余缓冲液，在0.6ml裂解缓冲液(0.5％NP-40、50mM Tris-HCl pH7.5、1μg/ml胃酶抑素A、1μg/ml亮抑酶肽、5μg/ml抑肽酶、24μg/ml Pefabloc SC(Boehringer Mannheim))中裂解细胞并储存于-20℃。
eNOS蛋白的测定用每孔100μl含有5μg/ml包被抗体(兔多克隆抗eNOS抗体)的pH9.5的50mM碳酸钠缓冲液包被96孔ELISA板(Costar 3590)，并在4℃孵育过夜。从用与钥孔戚血蓝素连接的相应于人eNOS的599到614位残基的肽所接种的兔中收集多克隆抗体(Babco)，并用蛋白G琼糖脂(Amersham)纯化。用200μl/孔的0.5％I-Block(Tropix)的PBS+0.01％Tween 20封闭板，并在4℃孵育过夜。然后用每孔350μl PBS+0.5ml/LTween 20洗涤板三次。将含有eNOS的HEK293细胞裂解液加入到板中，用裂解缓冲液稀释5或10倍到终体积为60μl/孔，并在室温下孵育1.5到2个小时。然后用每孔350μl PBS+0.5ml/L Tween 20洗涤板三次。
如下加入检测抗体，一种单克隆抗eNOS抗体(Transduction LabsN30020)，它是如参考文献2所描述的铕标记的单克隆抗体每孔100μlWallac检测缓冲液中的125ng/ml铕标记的抗体(Wallac/PerkinElmer1244-111)。然后将板在室温下孵育1.5个小时。然后用每孔350μlPBS+0.5ml/L Tween 20洗涤板三次。然后加入每孔100μl Wallac强化溶液(Wallac/PerkinElmer 1244-105)。用板封闭剂覆盖板并在4℃储存过夜，然后混合10分钟后，在Wallac 1420 VICTOR2多标记计数器(PerkinElmer Life Sciences)中读取板，监测在615nm下所定时释放的荧光。(Aberle S.et al.，Nitric Oxide 1，226(1997)；Meurer J et al.，Methodsin Enzymology 359，433-444(2002))。
结果显示eNOS多肽突变体刺激HEK293细胞合成NO，与野生型eNOS比较，单突变体T495A和T495V、以及双突变体T495A+S1177D和T495V+S1177D刺激了NO产生水平的增加。
实施例3eNOS多肽突变体在HAE细胞中的活性的检测和测定将每孔350,000个人主动脉内皮细胞(HAEC)放置于6孔板中，每孔包括4ml含有10％FBS的EGM生长培养基(Cambrex)。将细胞培养在37℃、5％CO2中。第二天，往每孔中加入编码野生型或突变型eNOS(Thr495Ala、Thr495Asp、Thr495Val或Ser1177Asp)的腺病毒。与病毒孵育4个小时后，去除培养基并用2ml含有0.1％凝胶和30μM墨蝶呤(Sigma)的EBM生长培养基(Cambrex)替换。20个小时后，用化学发光法测定细胞所生成的NO，之后将细胞裂解并用下面所描述的ELISA检测法测定裂解物的eNOS蛋白成分。为了纠正带有不同eNOS突变体的不同的腺病毒构建体之间的转染效率的不同所造成的表达水平的差异，将NO产生标准化为eNOS蛋白的量。
结果显示eNOS多肽突变体刺激HAE细胞合成NO，与野生型eNOS比较，单突变体T495A和T495D刺激了NO产生水平的增加(图3)。这个研究的结果不同于在实施例2中所描述的结果，其中为了刺激NO的释放，用VEGF刺激细胞，而在实施例2所描述的研究中使用了钙离子载体。另外，腺病毒感染比用质粒DNA转染每个细胞生成了更多的eNOS蛋白(以及更多的一氧化氮)。因此，在本研究中的eNOS的大量表达可能造成了在eNOS多肽突变体中的所观察到的NO活性水平。
人主动脉内皮细胞含有内源性野生型eNOS，但是大量表达的突变型eNOS所生成的NO的量是内源性eNOS所生成的量的近20倍。在实施例2和3所描述的数据中，一氧化氮的产量被标准化为eNOS蛋白的量，使得eNOS突变体具有相同范围内的活性。在不同的eNOS多肽突变体、利用腺病毒载体和质粒载体以及不同细胞类型之间所测定到的NO产生的水平是归结于细胞内的其他限制性因素例如共因子的利用率是有可能的。因此，进一步测定eNOS多肽突变体在HAEC中的活性可以进一步地解释在不同的细胞类型中eNOS的表达和活性的作用。
实施例4eNOS-KO小鼠CLI模型的生成为了建立CLI的动物模型，将3-12个月大的野生型(WT)和eNOS缺陷(eNOS-KO)雄性小鼠进行股动脉的单侧手术切除(见下面的材料和方法)。在手术前、和手术后1、4、7、10、14、21和28天用激光多普勒灌注显像(LDPI)系统测定后肢浅表血流的变化(图4)。在手术后1、5和10天进行缺血肢体的定量血管造影。在WT小鼠中，在闭塞后第一周，血流显著减少，但是在第28天血流恢复到缺血前基础水平的80％。然而，在eNOS-KO小鼠中，没有出现后肢血流的恢复(图4)并伴有缺血肢体的坏死(图5)。用经验证的血管造影积分指数测定大的侧突动脉的数目，在第10天时，WT(C57B1/6)的积分指数是eNOS-KO小鼠的2.6倍(图6)。到了手术后第28天，因为坏死肢体的自动截肢(autoamputation)，eNOS-KO小鼠已经丢失了它们的缺血后肢。相反的，没有一只野生型小鼠表现出肢体坏死的征象。
这些结果证实内皮起源的NO在缺血肢体的血管发生以及组织灌注上的重要作用。
CLI模型的改进缺血损伤的严重性表现出依赖于动脉切除的部位和长度，也依赖于股静脉是否完整或被去除。切除全部股动脉和静脉造成eNOS-KO小鼠的整个肢体的严重缺血及快速丢失。单独去除股动脉(保留完整的股静脉)引起更为渐进的肢体缺血。单独节段性切除股动脉造成类似于人CLI的更少广泛的缺血性坏死(足趾或远端肢体丢失)(图7)。
这个模型随后已经被用于研究发明对血流及肢体挽救的作用。
年龄对CLI的影响利用上述的CLI模型，我们观察到血流的恢复及缺血性损伤的程度是重要地依赖于动物的年龄。当进行股动脉的节段性切除时，血流恢复不良和缺血性坏死的程度在较年长动物中比在较年轻的eNOS-KO小鼠中要严重的多。3个月大的eNOS-KO小鼠表现得与WT对照组完全一样。在第14天观察到血流的完全恢复，且没有大体病理的变化。6个月大的动物的血流恢复明显不良以及足趾的营养的变化，在一些病例中造成足的丢失(图8)。在11-12个月大的小鼠中，其足在手术后马上出现变色以及小鼠在手术后第一天快速地发生进行性坏死，它在第10天造成90％动物的肢体的丢失(图9)。
因为腿丢失的原因，所以不能在所有的实验组中评价一些实验终点例如定量的血管造影或LDPI血流。在这些情况中，通过在手术后第1、4、7、10、14、21和28天计数动物的残余足趾及腿来测定治疗的疗效。
基因输送的优化在一些研究中，用质粒DNA(pDNA)联合电穿孔将基因输送到细胞内。进行研究以优化1)DNA浓度；2)注射的体积、部位和次数；3)电穿孔条件；4)与手术相关的治疗持续时间；5)用透明质酸酶预处理(图10和11)。
在WT小鼠中用含有报告基因萤光素酶的质粒pLuc优化基因输送，并通过在注射后第4天测定内收肌匀浆的萤光素酶活性来测定基因输送。也用pNOS224(含有NOS1177D基因的质粒)在eNOS-KO小鼠中测定了最佳方案。在这些实验中，用Western印迹和eNOS特异性ELISA测定了eNOS水平(图12)。
实施例5NOS1177D治疗在eNOS-KO小鼠CLI模型中的疗效A.在6个月大eNOS-KO小鼠中预防坏死并增加血流在这个研究中使用了6个月大雄性eNOS-KO小鼠。在节段性切除股动脉后，小鼠被随机地分成了两个不同的治疗组(每组n＝8只)。在手术后第3天在大腿的两个部位(内收肌和四头肌)，用空载体注射一个组，用pNOS224(含有NOS1177D基因)联合电穿孔处理另一组。在手术后第1、4、7、10、14、21和28天进行LDPI血流测定及获得腿的照片。在研究结束时，因为缺血性坏死的原因，空载体治疗组(8/8)比pNOS1177D处理动物(4/8)具有显著更高的腿丢失率(p＜0.05)。
在第28天，处死动物并收集肢体进行治疗作用的组织形态学评价。在研究结束时，空载体治疗组(8/8)比pNOS1177D处理动物(4/8)具有显著更多的腿丢失(p＜0.05)(图13)。另外，在pNOS治疗动物中观察到了对溃疡愈合的好处。
B.11-12个月大eNOS-KO小鼠的肢体挽救用11-12个月大eNOS-KO小鼠进行第二个研究。因为这个年龄组中的缺血损伤的严重性以及快速发展，所以修改了基因输送方案。在手术当天在三个位点(包括内收肌、四头肌、腓肠肌)注射质粒DNA，并在载体注射前20分钟在基因输送位点用透明质酸酶预处理肌肉。在空载体组中，到手术后第10天，因为严重的坏死以及自动截肢，所有的动物都丢失了它们的缺血后肢。相反的，在pNOS1177D治疗组中，LDPI测定的血流有显著的改善以及缺血性坏死的严重度被明显减轻，并且挽救了所有的肢体(图15、16和18-21)。
方案中的这些变化造成了基因表达的明显提高(图17)。
C.结论综上所述，在手术性后肢缺血后，用NOS1177D治疗eNOS-KO小鼠增加了血流并减少/预防了缺血性坏死，并挽救了肢体。这些结果证实了一种概念，就是在疾病状态下内源性NO的利用度是严重不良的，NOS基因输送有治疗意义。
实施例6无eNOS遗传学缺陷小鼠的新的重症肢体缺血模型的建立以及测定eNOS基因治疗对其的疗效在雄性成年斯普拉-道来小鼠中建立采用结扎并去除股内和股外动脉以及所有供应大腿区域的侧支的新的CLI模型，测定了NOS1177D在此动物模型中的疗效，该动物模型是无eNOS缺陷模型(图22)。图22和23说明了在手术后第1、4、10、17和28天小鼠CLI模型的大体病理的改变。
此外，建立了CLI小鼠模型的动脉生成的积分方法。图24说明了小鼠CLI模型的正常肢体(左侧图像)以及缺血肢体(右侧图像)的血管造影，以及图25说明了小鼠CLI模型的正常肢体(左侧图像)以及缺血肢体(右侧图像)的动脉生成的血管造影积分。为了定量动脉生成，在正常和缺血肢体的大腿内侧区域都绘制三条直线，直线从血管造影图像的股骨的内1/4、中间、以及外1/4开始，两个对治疗(例如有或无eNOS基因治疗)不清楚的分离的研究者分别计算出跨过这些线的动脉的总的数目。为了将差异最小化，血管造影积分被表达为左侧后肢对右侧后肢的总的动脉数目的比值。
手术及eNOS基因治疗方案小鼠被分成两组并在手术后马上在三个位点(内收肌、四头肌-股内肌、腓肠肌)肌肉内注射500μl PBS的1×1011个病毒颗粒，每个缺血后肢分三次注射总共3×1011个病毒颗粒。9只注射Ad5EGFP(如实施例1所示)的小鼠作为阴性对照，9只注射Ad5NOS1177D(如实施例1所示)的小鼠作为治疗组。用激光多普勒灌注显像(LDPI)测定基因转移后第1、4、7、10、14和21天的血流恢复。在相同时间对手术后肢照相以评价缺血的组织损伤。在治疗结束时，进行血管造影。
在接受NOS1177D的小鼠中，血流从基因治疗后第1天的手术前水平的31％恢复到第10天的57％。在接受EGFP对照基因的对照动物中，后肢血流只表现出很小的恢复(第1天的30％对第10天的37％)，在两组之间的第10天的p＝0.0226(图25)。
在图26中显示了NOS治疗组的根据大体病理分级I-V的坏死积分。结果说明NOS1177D基因输送造成了与增加eNOS表达倾向相关的对缺血性坏死的有效预防(在第10天，NOS处理组的积分为1.89，对照组为2.89，p＝0.014)(图27)。
此外，在基因转移后第14天进行的下后肢的动脉造影证实在Ad5NOS1177D处理小鼠中比Ad5EGFP处理组具有更多的侧突血管(血管造影积分为1.21对0.88，p＝0.0147)(图28)。
因此，结果说明在小鼠CLI模型中的eNOS基因治疗可以预防治疗后肢的缺血性坏死，并且这种作用与体内eNOS多肽突变体表达的增加相关。
材料和方法小鼠后肢手术在所有实验中使用eNOS-KO雄性小鼠(Jackson Laboratory，BarHarbor，ME)，3-12个月大，重20到55g。在手术过程以及激光多普勒测定肢体灌注中，用1.5％异氟烷将动物麻醉。进行手术干预以生成小鼠的单侧的后肢缺血。在股动脉上方的左侧后肢的上端部分切开一个皮肤切口(2mm)。分离出股动脉的近端部分，并结扎所有的侧支。结扎并切除股动脉和股静脉，以诱导最严重的缺血性损伤。在其它情况下，分离并切除股动脉但不处理股静脉，或只处理动脉的一段(见图“1”)。用手术钉关闭所覆盖的皮肤。
激光多普勒灌注显像(LDPI)分析小鼠的后肢血流用LDPI测定缺血(左)和正常(右)后肢的灌注。去除后肢的毛。在开始显像前，将小鼠放置于37℃的加热板中，以将温度差异最小化。对于每一个所描述的时间点，我们用LDPI进行腿的相同区域的连续测定。为了将包括环境光线和温度的变量最小化，将灌注表示为左侧对右侧后肢灌注的比值。测定灌注分析手术前；手术后即刻；以及在麻醉下手术后第4、7、10、14、21和28天。
小鼠骨骼肌基因输送手术3天后，用1.5％异氟烷将小鼠麻醉，并将50μl PBS中的80μgpNOS224或空质粒载体肌肉内注射到手术后肢的大收肌和四头肌中，随后用双规型电极(200V/cm，20ms，1Hz，8脉冲)进行电穿孔。
对于透明质酸酶的预处理，将50μl PBS中的20单位酶注射到大收肌、四头肌和腓肠肌中，2小时后，再将50μl PBS中的80μg pNOS224或空质粒载体注射到每个肌肉的相同部位，随后用双规型电极(200V/cm，20ms，1Hz，8脉冲)进行电穿孔。
对于腺病毒注射，将50μl注射体积的1×1011个病毒颗粒注射到大收肌中。
用于转染效率研究的小鼠骨骼肌匀浆化切断肌肉部分并储存在-80℃，直到进行Western、ELISA或酶活性分析。将组织切成丁，并在含有25mM Tris pH 7.g、10％甘油、0.2％NP40、罗氏蛋白酶抑制剂微片剂(含有1mM EDTA和丝氨酸及半胱氨酸蛋白酶抑制剂)的裂解缓冲液中用Kinematic polytron匀浆器将其匀浆化。也加入酶活性的共因子4μM FAD、FMN和BH4、3mM DTT、3mM CaCl2、0.125μM钙调蛋白。绝大多数内收肌重25到75mg。用eppendorf离心机在最高速离心5-10分钟后，收集上清并利用Duall毛玻璃匀浆器用50到75μl裂解缓冲液将碎片再次匀浆化。在第二次离心后，混和两次上清液。第三次离心形成终体积为250到750μl，终浓度为每ml 100mg肌肉。
eNOS特异性ELISA用R&D体系(cat#DEN00)的特异性ELISA试剂盒测定eNOS蛋白的浓度。通过加入100μl检测稀释液激活所捕获的抗体。每个孔中加入50到100μl肌肉匀浆或标准eNOS。在室温下慢慢混和板2个小时或在-4℃下储存过夜。用R&D体系的洗涤缓冲液将每个孔洗涤三次。加入200μl结合有辣根过氧化物酶的抗体2个小时。充分洗涤后，加入200μl显色试剂。30分钟后用0.5N硫酸终止反应并在450nm下读数。用标准eNOS所提供的标准曲线计算出eNOS浓度。
NOS活性检测将60μl每种肌肉匀浆或标准液与20μl含有NADPH、精氨酸和14C-精氨酸的反应混合物在37℃混和1小时。NADPH的终浓度是0.2mM，5μC14C-精氨酸为20μM。将反应物过滤通过悬浮于含有2mMEDTA及EGTA的0.1M乙酸钠pH5.2缓冲液的AG 50W-树脂以终止反应。在Wallac Micro Beta中用Microscint-40计数产物14C-瓜氨酸。
用于测定不同NOS异构体的小鼠骨骼肌裂解液的Western印迹SDS-PAGE对于每个样本，将30μl肌肉匀浆加入到10μl含有100mM二硫苏糖醇的4x样本缓冲液中(Invitrogen Cat.No.NP0007)。在100℃加热7到8分钟后，将每个样本加样到10％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶上(BMAPAGEr Cat.No.59102)。在所需要的地方，加入1μl含有重组人eNOS的HEK细胞裂解液作为阳性对照。将预先染色的蛋白标记物(10μlInvitrogen LC5725)也加入到在凝胶的一个电泳道中。在Berlex介质制备部门所提供的1x Laemmli跑胶缓冲液中，130V(恒压)下跑胶1.5个小时。
印迹到硝酸纤维素膜利用Novex/Invitrogen装置(装置被预先浸泡在转移缓冲液中)在20V(恒压)下2个小时，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上(转移缓冲液＝Berlex介质制备部门所提供的100ml 10x转移缓冲液+200ml甲醇+700ml水)。在印迹之后，将硝酸纤维素膜储存于20ml TBS+5％脱脂奶粉中4℃过夜。(TBS＝0.02M Tris-HCl、0.12M NaCl、pH7.5)。
利用抗体检测蛋白(所有步骤都在室温下进行)将印迹在第一抗体(抗eNOS或抗bNOS小鼠单克隆抗体，用TBS+0.1％Tween 20+5％脱脂奶粉稀释1∶2000，BD/Transduction Labs)中孵育1小时15分钟。然后将印迹按如下洗涤在TBS+0.1％Tween 20中10分钟洗涤一次以及5分钟洗涤两次)。然后将印迹在第二抗体中(结合有过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG，Chemicon Intl.AP308P或Roche1814168，用TBS+0.1％Tween 20+5％脱脂奶粉稀释1∶3000)孵育1小时。如上述的洗涤加上在TBS(无Tween)中的附加的5分钟洗涤后，将印迹在ECL试剂(Amersham Pharmacia RPN2106)中孵育1小时。然后用莎兰包装膜将印迹盖上，并将印迹暴露于Amersham Pharmacia超细ECL(RPN 1674A)1到5分钟，就形成了胶片。
内皮NO的释放(NO分析)将每孔350,000个HAEC放置于6孔板中，每孔包括4ml含有10％FBS的Clonetics生长培养基(EGM)。第二天，往每孔中加入编码野生型或突变型eNOS(在Gly2和/或Serl177位置)的腺病毒。与病毒孵育4个小时后，去除培养基并用2ml含有0.1％凝胶和30μM墨蝶呤的Clonetics生长培养基(EBM)替换。第二天早晨，用2ml新鲜的有或无100μg/ml氧化LDL(Intracel RP-047)的EBM-凝胶-墨蝶呤取代培养基。6个小时后，去除培养基，用2ml NO分析缓冲液(5mM Na HEPES、140mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、10mM葡萄糖、10mMCaCl2、5mM L-精氨酸、pH7.5)将每个孔洗涤两次。然后用1ml含有100U/ml超氧化物岐化酶和40ng/ml VEGF的NO分析缓冲液替换上述的缓冲液。用石蜡膜覆盖孔，在37℃孵育30分钟后，将细胞上方的0.8ml缓冲液注射到西门子NOA280化学发光法测定器中进行NO的测定。完成NO测定后，去除细胞上的残余缓冲液，在0.3ml裂解缓冲液中裂解细胞。在-20℃下储存过夜后，用eNOS ELISA分析裂解液(每种5到20μl)的eNOS蛋白。为了校正在不同的突变体腺病毒之间的表达水平的差异，将一氧化氮的合成标准化为eNOS蛋白的量。
质粒构建体pGL3-controlSV40启动子/增强子(Promega)驱动该质粒的萤火虫萤光素酶基因的表达。质粒骨架为pGL3-基本骨架。
pcDNA3.1/eNOS224pcDNA3.1的CMV启动子驱动eNOS224基因的表达并编码eNOS多肽突变体S1177D。
pcDNA3.1/hygro是pcDNA3.1d(Promega)的对照质粒。
形态学分析在手术后第28天处死已经进行左股动脉结扎以模拟PAOD的eNOS-KO小鼠。将其后肢剥皮、固定并在脱钙溶液中放置2天，然后以系统随机方式将其切块用于治疗疗效的形态学评价。简言之，在髋关节处将腿脱关节，并按4mm间隔切片。将所有的切片放置在单个盒中，将其脱水，并包埋，其中每个切片的横向切面为切块的切割面。切出5微米厚的切片并用苏木精和伊红(H&E)染色，利用C.A.S.T.立体系统进行形态学评价。
治疗和未治疗腿都表现出相似类型的病理改变。最一致的改变是肌纤维的丢失以及脂肪细胞取代了肌容积。这个改变在大的肌肉组中始终存在，并且通常与任何活动性的肌肉退化的证据无关。然而，在一些情况中，仍存在被在替代的脂肪细胞周围以及退化的肌纤维周围的大量的急性和慢性的炎性细胞浸润所证实的活动性的肌肉破坏。在显微镜下很容易区分出正常形态的肌肉区域、脂肪替代组织区域以及炎性细胞浸润的区域。分别定量这些组织在每个玻片上所占据的面积。在玻片上的所有其它的区域(例如骨、皮肤、结缔组织等)在分类上都被组织在一起并标记为“其它”。将这些区域的每一个区域的体积计算为对每条腿的总体积的百分比。用ANOVA比较两个组的这些立体研究的结果(图21)。
在下面的参数上具有统计学显著差异的改变eNOS治疗肢体的总的体积要显著地多于空载体治疗肢体，但与未手术(对照)肢体无差异。空载体治疗组的健康肌肉的体积％也要比eNOS载体组明显的少。相应地，与eNOS治疗肢体比较，空载体治疗肢体中的替代脂肪的量与之无差异。空白组的炎症的数目也增加了，但这还没有达到显著差异(P＝0.0525)。
这些改变说明肌纤维在股动脉结扎后马上丢失，且脂肪组织替代了所丢失的肌纤维。然而在一些区域，甚至脂肪组织都不能得到足够血流的支持，以致持续地表现为活动的炎性细胞浸润所证实的组织坏死。eNOS治疗改善了这些病理改变。
序列表<110>舍林股份公司<120>以野生型或突变型eNOS对重症肢体缺血的基因治疗<130>52339AWOM1<150>US 60/403,637<151>2002-08-16<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1203<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Gly Asn Leu Lys Ser Val Ala Gln Glu Pro Gly Pro Pro Cys Gly1 5 10 15Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu Cys Gly Lys Gln Gly Pro Ala20 25 30Thr Pro Ala Pro Glu Pro Ser Arg Ala Pro Ala Ser Leu Leu Pro Pro35 40 45Ala Pro Glu His Ser Pro Pro Ser Ser Pro Leu Thr Gln Pro Pro Glu50 55 60Gly Pro Lys Phe Pro Arg Val Lys Asn Trp Glu Val Gly Ser Ile Thr65 70 75 80Tyr Asp Thr Leu Ser Ala Gln Ala Gln Gln Asp Gly Pro Cys Thr Pro85 90 95Arg Arg Cys Leu Gly Ser Leu Val Phe Pro Arg Lys Leu Gln Gly Arg100 105 110Pro Ser Pro Gly Pro Pro Ala Pro Glu Gln Leu Leu Ser Gln Ala Arg115 120 125Asp Phe Ile Asn Gln Tyr Tyr Ser Ser Ile Lys Arg Ser Gly Ser Gln130 135 140Ala His Glu Gln Arg Leu Gln Glu Val Glu Ala Glu Val Ala Ala Thr145 150 155 160Gly Thr Tyr Gln Leu Arg Glu Ser Glu Leu Val Phe Gly Ala Lys Gln165 170 175
Ala Trp Arg Asn Ala Pro Arg Cys Val Gly Arg Ile Gln Trp Gly Lys180 185 190Leu Gln Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys Arg Ser Ala Gln Glu Met Phe195 200 205Thr Tyr Ile Cys Asn His Ile Lys Tyr Ala Thr Asn Arg Gly Asn Leu210 215 220Arg Ser Ala Ile Thr Val Phe Pro Gln Arg Cys Pro Gly Arg Gly Asp225 230 235 240Phe Arg Ile Trp Asn Ser Gln Leu Val Arg Tyr Ala Gly Tyr Arg Gln245 250 255Gln Asp Gly Ser Val Arg Gly Asp Pro Ala Asn Val Glu Ile Thr Glu260 265 270Leu Cys Ile Gln His Gly Trp Thr Pro Gly Asn Gly Arg Phe Asp Val275 280 285Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Pro Asp Glu Pro Pro Glu Leu Phe Leu290 295 300Leu Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val Pro Leu Glu His Pro Thr Leu305 310 315 320Glu Trp Phe Ala Ala Leu Gly Leu Arg Trp Tyr Ala Leu Pro Ala Val325 330 335Ser Asn Met Leu Leu Glu Ile Gly Gly Leu Glu Phe Pro Ala Ala Pro340 345 350Phe Ser Gly Trp Tyr Met Ser Thr Glu Ile Gly Thr Arg Asn Leu Cys355 360 365Asp Pro His Arg Tyr Asn Ile Leu Glu Asp Val Ala Val Cys Met Asp370 375 380Leu Asp Thr Arg Thr Thr Ser Ser Leu Trp Lys Asp Lys Ala Ala Val385 390 395 400Glu Ile Asn Val Ala Val Leu His Ser Tyr Gln Leu Ala Lys Val Thr405 410 415Ile Val Asp His His Ala Ala Thr Ala Ser Phe Met Lys His Leu Glu420 425 430
Asn Glu Gln Lys Ala Arg Gly Gly Cys Pro Ala Asp Trp Ala Trp Ile435 440 445Val Pro Pro Ile Ser Gly Ser Leu Thr Pro Val Phe His Gln Glu Met450 455 460Val Asn Tyr Phe Leu Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Asp Pro Trp465 470 475 480Lys Gly Ser Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe485 490 495Lys Glu Val Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr500 505 510Val Met Ala Lys Arg Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Gly Ser Glu Thr515 520 525Gly Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Gln Leu Gly Arg Leu Phe Arg Lys530 535 540Ala Phe Asp Pro Arg Val Leu Cys Met Asp Glu Tyr Asp Val Val Ser545 550 555 560Leu Glu His Glu Thr Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn565 570 575Gly Asp Pro Pro Glu Asr Gly Glu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Met Glu580 585 590Met Ser Gly Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gln His Lys Ser595 600 605Tyr Lys Ile Arg Phe Asn Ser Ile Ser Cys Ser Asp Pro Leu Val Ser610 615 620Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Gly625 630 635 640Ala Leu Gly Thr Leu Arg Phe Cys Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala645 650 655Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Ala Arg Ala Val Asp Thr Arg Leu Glu660 665 670Glu Leu Gly Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Asp Glu Leu675 680685Cys Gly Gln Glu Glu Ala Phe Arg Gly Trp Ala Gln Ala Ala Phe Gln
690 695 700Ala Ala Cys Glu Thr Phe Cys Val Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala705 710 715 720Arg Asp Ile Phe Ser Pro Lys Arg Ser Trp Lys Arg Gln Arg Tyr Arg725 730 735Leu Ser Ala Gln Ala Glu Gly Leu Gln Leu Leu Pro Gly Leu Ile His740 745 750Val His Arg Arg Lys Met Phe Gln Ala Thr Ile Arg Ser Val Glu Asn755 760 765Leu Gln Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala Thr Ile Leu Val Arg Leu Asp770 775 780Thr Gly Gly Gln Glu Gly Leu Gln Tyr Gln Pro Gly Asp His Ile Gly785 790 795 800Val Cys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Leu Val Glu Ala Leu Leu Ser Arg805 810 815Val Glu Asp Pro Pro Ala Pro Thr Glu Pro Val Ala Val Glu Gln Leu820 825 830Glu Lys Gly Ser Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Trp Val Arg Asp Pro835 840 845Arg Leu Pro Pro Cys Thr Leu Arg Gln Ala Leu Thr Phe Phe Leu Asp850 855 860Ile Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gln Leu Leu Arg Leu Leu Ser Thr Leu865870 875 880Ala Glu Glu Pro Arg Glu Gln Gln Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Asp885 890 895Pro Arg Arg Tyr Glu Glu Trp Lys Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu900 905 910Glu Val Leu Glu Gln Phe Pro Ser Val Ala Leu Pro Ala Pro Leu Leu915 920 925Leu Thr Gln Leu Pro Leu Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Val Ser Ser930 935 940Ala Pro Ser Thr His Pro Gly Glu Ile His Leu Thr Val Ala Val Leu945 950 955 960
Ala Tyr Arg Thr Gln Asp Gly Leu Gly Pro Leu His Tyr Gly Val Cys965 970 975Ser Thr Trp Leu Ser Gln Leu Lys Pro Gly Asp Pro Val Pro Cys Phe980 985 990Ile Arg Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro Pro Asp Pro Ser Leu Pro995 1000 1005Cys Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Phe Arg Gly1010 1015 1020Phe Trp Gln Glu Arg Leu His Asp Ile Glu Ser Lys Gly Leu Gln1025 1030 1035Pro Thr Pro Met Thr Leu Val Phe Gly Cys Arg Cys Ser Gln Leu1040 1045 1050Asp His Leu Tyr Arg Asp Glu Val Gln Asn Ala Gln Gln Arg Gly1055 1060 1065Val Phe Gly Arg Val Leu Thr Ala Phe Ser Arg Glu Pro Asp Asn1070 1075 1080Pro Lys Thr Tyr Val Gln Asp Ile Leu Arg Thr Glu Leu Ala Ala1085 1090 1095Glu Val His Arg Val Leu Cys Leu Glu Arg Gly His Met Phe Val1100 1105 1110Cys Gly Asp Val Thr Met Ala Thr Asn Val Leu Gln Thr Val Gln1115 1120 1125Arg Ile Leu Ala Thr Glu Gly Asp Met Glu Leu Asp Glu Ala Gly1130 1135 1140Asp Val Ile Gly Val Leu Arg Asp Gln Gln Arg Tyr His Glu Asp1145 1150 1155Ile Phe Gly Leu Thr Leu Arg Thr Gln Glu Val Thr Ser Arg Ile1160 1165 1170Arg Thr Gln Ser Phe Ser Leu Gln Glu Arg Gln Leu Arg Gly Ala1175 1180 1185Val Pro Trp Ala Phe Asp Pro Pro Gly Ser Asp Thr Asn Ser Pro1190 1195 1200
<210>2<211>37<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val1 5 10 15Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Val Met Ala20 25 30Lys Arg Val Lys Ala35<210>3<211>37<212>PRT<213>Bos taurus<400>3Ala Thr Lys Gly Ala Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val1 5 10 15Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Leu Met Ala20 25 30Lys Arg Val Lys Ala35<210>4<211>38<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys1 5 10 15Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met20 25 30Ala Lys Arg Val Lys Ala35<210>5<211>38<212>PRT<213>Rattus rattus<400>5
Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys1 5 10 15Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met20 25 30Ala Lys Arg Val Lys Ala35<210>6<211>37<212>PRT<213>Rattus rattus<400>6Asp Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Thr Val Leu1 5 10 15Val Lys Ala Val Phe Phe Ala Ser Val Leu Met Arg Lys Val Met Ala20 25 30Ser Arg Val Arg Ala35<210>7<211>37<212>PRT<213>Mus musculus<400>7Asn Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Arg Val Leu1 5 10 15Val Lys Val Val Phe Phe Ala Ser Met Leu Met Arg Lys Val Met Ala20 25 30Ser Arg Val Arg Ala35<210>8<211>37<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Asp Glu Lys Arg Arg Pro Lys Arg Arg Glu Ile Pro Leu Lys Val Leu1 5 10 15Val Lys Ala Val Leu Phe Ala Cys Met Leu Met Arg Lys Thr Met Ala20 25 30
Ser Arg Val Arg Val3权利要求
1.一种治疗重症肢体缺血(CLI)的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的一种编码哺乳动物eNOS多肽的多核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述的eNOS多肽是人eNOS多肽。
3.权利要求2的方法，其中所述的人eNOS多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO1。
4.权利要求3的方法，其中所述的eNOS多肽包括至少一个在相应于所述的人eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。
5.权利要求4的方法，其中所述的eNOS多肽包括在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上的一个突变。
6.权利要求4的方法，其中所述的eNOS多肽包括在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上的一个突变。
7.权利要求4的方法，其中所述的eNOS多肽包括在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上的第一个突变以及在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个突变。
8.权利要求4的方法，其中所述的eNOS多肽包括在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上的第一个突变、在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个突变、以及在相应于SEQ ID NO1的2位氨基酸残基的位置上的第三个突变。
9.权利要求6、7或8的方法，其中在相应于495位氨基酸残基的位置上的所述的突变是氨基酸取代成为Ala、Val、Leu、或Ile。
10.权利要求6、7或8的方法，其中在相应于1177位氨基酸残基的位置上的所述的突变是氨基酸取代成为Asp。
11.权利要求8的方法，其中在相应于2位氨基酸残基的位置上的所述的突变是氨基酸取代成为Ala。
12.权利要求4的方法，其中与参照eNOS多肽比较，所述的eNOS多肽的磷酸化是增强的或减弱的。
13.权利要求4的方法，其中与参照eNOS多肽比较，所述的eNOS多肽具有增强的与钙调蛋白的结合亲和力。
14.权利要求4的方法，其中与参照eNOS多肽比较，在Ca++-钙调蛋白介导的对所述的eNOS多肽的刺激中，Ca++依赖性被减弱。
15.权利要求4的方法，其中与参照eNOS多肽比较，所述的eNOS多肽具有增加的eNOS活性。
16.权利要求15的方法，其中所述的活性是产生NO。
17.权利要求15的方法，其中所述的活性是还原酶活性。
18.权利要求12、13、14、15、16或17的方法，其中所述的参照多肽的氨基酸序列是人eNOS的氨基酸序列或来源于人eNOS的氨基酸序列。
19.权利要求18的方法，其中所述的参照多肽的氨基酸序列是SEQ ID NO1或来源于SEQ ID NO1。
20.权利要求4的方法，其中所述的eNOS多肽的氨基酸序列与人eNOS的氨基酸序列基本上同源。
21.权利要求20的方法，其中所述的eNOS多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO1的氨基酸序列具有95-99％的序列相同性。
22.权利要求1或4的方法，其中所述的多核苷酸是一种重组载体，其包括编码所述的多肽的核酸序列并且所述的序列被可操纵地连接于至少一种调节序列，使得在细胞内表达所述的多肽。
23.权利要求22的方法，其中所述的核酸序列被可操纵地连接于一启动子。
24.权利要求23的方法，其中所述的重组载体是一种病毒载体。
25.权利要求24的方法，其中所述的病毒载体是一种腺病毒载体。
26.权利要求1或4的方法，其中所述的治疗包括调控所述患者的细胞内的eNOS活性。
27.权利要求26的方法，其中所述的细胞是内皮细胞。
28.权利要求26的方法，其中所述的细胞是骨髓来源的细胞。
29.权利要求1或4的方法，其中所述的方法进一步包括在施用所述的多核苷酸之前、之中或之后给所述的患者施用一种或多种血管生成因子。
30.权利要求29的方法，其中所述的血管生成因子选自由HGF、VEGF、FGF、内皮细胞生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、TGF-α、TGF-β、PDGF、TNA-α或IGF、Del-1所组成的血管生成因子的组。
31.权利要求1或4的方法，其中所述的施用包括将所述的多核苷酸回体引入到所述患者的细胞内。
32.权利要求1或4的方法，其中所述的施用包括将所述的多核苷酸输送至所述患者的患病组织内。
33.权利要求1或4的方法，其中所述的施用包括将所述的多核苷酸输送至所述患者的周围血管系统内。
34.权利要求33的方法，其中通过肌肉内注射或动脉内注射到所述患者的肢体肌肉内进行所述的输送。
35.一种治疗血管生成的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的一种编码eNOS多肽的多核苷酸，其中所述的eNOS多肽包括至少一个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。
36.一种改善微血管功能不全的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的一种编码eNOS多肽的多核苷酸，其中所述的eNOS多肽包括至少一个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。
37.一种治疗重症肢体缺血(CLI)的方法，包括给需要治疗的患者施用有效量的eNOS多肽，其中所述的eNOS多肽包括至少一个在相应于哺乳动物eNOS中的一个在哺乳动物细胞内被磷酸化的氨基酸残基的位置上的突变。
38.权利要求35、36或37的方法，其中所述的eNOS多肽包括在相应于SEQ ID NO1的495位氨基酸残基的位置上的一个突变，并且所述的突变是氨基酸取代成为Ala、Val、Leu、或Ile。
39.权利要求35、36或37的方法，其中所述的eNOS多肽包括在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上的一个突变，并且所述的突变是氨基酸取代成为Asp。
40.权利要求1、35、36或37的方法，其中所述的eNOS多肽包括i)在相应于495位氨基酸残基的位置上的第一个突变，并且所述第一个突变是氨基酸取代成为Ala、Val、Leu、或Ile；以及ii)在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个突变，并且所述的第二个突变是氨基酸取代成为Asp。
41.权利要求1、35、36或37的方法，其中所述的eNOS多肽包括i)在相应于495位氨基酸残基的位置上的第一个突变，并且所述第一个突变是氨基酸取代成为Ala、Val、Leu、或Ile；ii)在相应于SEQ ID NO1的1177位氨基酸残基的位置上的第二个突变，并且所述的第二个突变是氨基酸取代成为Asp；以及iii)在相应于SEQ ID NO1的2位氨基酸残基的位置上的第三个突变，并且所述的第三个突变是氨基酸取代成为Ala。
全文摘要
本发明提供了利用调控细胞内eNOS活性的eNOS多肽和多核苷酸来预防、诊断、以及治疗重症肢体缺血(CLI)的新方法。在本发明的方法中所使用的是野生型和突变型eNOS多肽、以及编码这些多肽的多核苷酸。本发明的eNOS突变型多肽至少有一个相应于哺乳动物eNOS的功能结构域的一个在细胞内被磷酸化的位点上的突变。
文档编号C12N15/09GK1688197SQ03819494
公开日2005年10月26日 申请日期2003年8月15日 优先权日2002年8月16日
发明者威廉·P.·多尔, 卡塔林·考泽, 钱虎声, 加博尔·鲁巴尼 申请人:舍林股份公司